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Diese
Erfindung betrifft eine Vorrichtung und ein Verfahren zur Durchführung elektrischer
Messungen an Zellen, Liposomen oder ähnlichen kleinen Objekten in
einem Medium. Die Erfindung betrifft insbesondere eine Vorrichtung
und ein Verfahren zur Durchführung
elektrophysiologischer Messungen an Zellen, Liposomen oder ähnlichen
kleinen Objekten in einem Medium.
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Elektrische
Messungen an kleinen Objekten wie beispielsweise Zellen, Liposomen
oder ähnlichen kleinen
Objekten, wie beispielsweise Membranfragmenten, wurden zuvor unter
Verwendung einer mit einem Elektrolyt gefüllten Mikropipette oder einer ähnlichen
Vorrichtung durchgeführt,
die in Kontakt mit dem Objekt gebracht wurde. Zwischen dem Objekt
und der Spitze der Mikropipette wird eine Dichtung ausgebildet,
so dass der Elektrolyt innerhalb der Pipette das Objekt kontaktiert.
Dadurch wird ein hoher elektrischer Widerstand in der Nähe der Dichtung erzielt
und die Messung erfolgt durch Beobachten des Stroms und des elektrischen
Potentials zwischen einer ersten Elektrode, die den Elektrolyt kontaktiert, und
einer zweiten Elektrode, die eine Flüssigkeit kontaktiert, in der
das Objekt schwimmt. Das herkömmliche
Verfahren beinhaltet eine delikate Manipulation, ist arbeitsintensiv
und neigt zu Ausfällen.
Die vorliegende Erfindung zielt darauf, dieses und andere Probleme
zu überwinden,
die mit gegenwärtig
existierenden Vorrichtungen und Verfahren verknüpft sind. Die WO 93/31503 offenbart
Vorrichtungen und Verfahren der "patch
clamp" Art, bei
denen im Wesentlichen ebene mikromechanisch bearbeitete Strukturen
verwendet werden, die eine Öffnung
aufweisen, die durch eine Zelle abgedichtet wird.
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Gemäß der vorliegenden
Erfindung sind eine Vorrichtung und ein Verfahren zur Durchführung elektrischer
Messungen an einem Objekt in einem Medium vorgesehen, wie sie in
den unabhängigen Ansprüchen definiert
sind, wobei das Objekt eine Zelle, ein Liposom oder ein ähnliches
kleines Objekt ist.
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Die
charakteristische Abmessung eines Kanals, durch den oder entlang
dessen ein Objekt hindurchtritt oder fließt, liegt in der Größenordnung
von 50 μm
und ist vorzugsweise kleiner als 25 μm. Die charakteristische Abmessung
einer Öffnung,
die durch das Objekt abgedichtet wird, liegt vorzugsweise in der
Größenordnung
von 10 Mikrometer und ist vorzugsweise kleiner als 5 Mikrometer.
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Die
Objekte oder Zellen werden in einer Flüssigkeit mitgeführt und
durch eine Pumpe oder Eigengewichtspeisung oder einen anderen geeigneten Flüssigkeitstransportmechanismus,
zum Beispiel durch Elektroosmose, in eine Kammer eingeführt.
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Das
Element, das von dem Objekt abdichtet wird, umfasst vorzugsweise
eine Öffnung,
durch die hindurch eine Flüssigkeit
das Objekt kontaktiert. Die Öffnung
weist vorzugsweise eine Form auf und besteht aus einem Material,
die es dem Objekt erlauben, ohne weiteres eine Dichtfläche um die Öffnung herum
abzudichten. Die Öffnung
ist insbesondere vorzugsweise ausgehöhlt oder konisch, um es dem Objekt
zu ermöglichen,
sich an die Öffnung
anzuformen, um sich an den Konus anzupassen. Die Fläche, die
das Objekt abdichten soll, ist vorzugsweise mit einem Material beschichtet,
das die Dichtung verbessern wird. Das Material ist vorzugsweise
eine Dünnschicht
aus Glas, zum Beispiel Borsilikatglas, die in dem Bereich der Öffnung aufgebracht
ist.
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Es
sind Elektroden vorgesehen, um einen Kontakt mit der Flüssigkeit
in einem zu der Öffnung führenden
Kanal und zu der das Objekt umgebenden Flüssigkeit auf der anderen Seite
der Öffnung
herzustellen. Bei einer bevorzugten Ausführungsform ist zumindest eine
dieser Elektroden in die Struktur integriert. Aus Gründen der Bequemlichkeit
werden die Kombinationen aus Öffnung
und Elektroden, wenn sie zur Impedanzmessung konfiguriert sind,
nachstehend als Testpositionen bezeichnet.
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Die
Mittel zum Messen der elektrischen Impedanz zwischen den Elektroden
sind dafür
ausgelegt, das Vorhandensein einer Zelle oder eines anderen Objekts
in der Nachbarschaft der Öffnung
zu erfassen und das Vorhandensein und die Qualität einer Dichtung zwischen dem
Objekt und des die Öffnung umgebenden
Bereichs sowie die elektrischen Eigenschaften des Objekts zu beobachten,
wenn es kontrollierten Mengen von chemischen Spezies in den Lösungen auf
beiden Seiten der Öffnung
ausgesetzt wird.
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Eine
Vielzahl der vorgenannten Testpositionen ist vorzugsweise als Matrix
angeordnet. Ein Vorteil einer solchen Matrix besteht darin, dass
auf viele Objekte parallel eingewirkt werden kann. Dies erhöht den Durchsatz.
Eine Matrix von Testpositionen kann auf einem Halbleitersubstrat,
wie zum Beispiel Silizium ausgebildet werden. Näherungsdetektoren, Elektroden
und Verarbeitungsmittel können
auf dem Substrat, zum Beispiel in einer anderen Schicht einer integrierten
Halbleiterstruktur, enthalten sein.
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Mittel
zum Lokalisieren jedes Objekts relativ zu einer Testposition können eine
mechanische oder elektrische Struktur umfassen. Ein Beispiel ist
ein Trog oder eine trogartige Struktur, die zum Beispiel durch Hinterätzen eines
Siliziumsubstrats ausgebildet werden kann und in der das Objekt
angeordnet ist. Am Austritt des Trogs kann ein Gitter oder eine Struktur
mit einer Siebwirkung platziert sein, um zwar den Durchtritt von
Fluid zu erlauben, aber zu verhindern, dass das Objekt den Trog
verlässt.
Vorzugsweise drängt
eine Druckdifferenz, die über
Substrat hinweg aufgebaut wird, Objekte in die trogartigen Strukturen
an jeder Testposition.
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Wenn
mehr Objekte lokalisiert werden, nimmt die Druckdifferenz zu, weil
weniger Tröge
verfügbar
sind, durch die Fluid fließen
kann. Die Druckdifferenz nimmt folglich zu. Dieser erhöhte Druck
tendiert dazu, Objekte in die Tröge
zu drängen,
wenn sie sich relativ einfach verformen. Vorzugsweise ist ein Mittel
vorgesehen, um eine Anzeige für
belegte Tröge
zu erhalten und diese Information zu verwenden, um die Druckdifferenz
zu reduzieren oder zu erhöhen.
Das Mittel kann eine Druckdifferenz-Messvorrichtung wie beispielsweise
ein Manometer sein, oder es könnte
eine serielle Prüfvorrichtung
sein, die die Testpositionen separat inspiziert.
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Die
Vorrichtung wird vorzugsweise mikromechanisch aus einem biokompatiblen
Material hergestellt. Die mikromechanisch hergestellte Vorrichtung kann
einen oder mehrere mikromechanisch hergestellte Kanäle umfassen.
Diese können
zum Beispiel durch Ätzen
von Silizium ausgebildet werden. Tröge oder Dichtungspositionen
können
sich an einem Ort in einem Fluidströmungskanal befinden.
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Die
Verwendung von Kanälen,
um die Objekte in die Testpositionen zu leiten, ist insoweit vorteilhaft,
als die Notwendigkeit für
präzise
Manipulationen durch einen Operator beseitigt wird. Die Fluidströmungsanordnungen
in der Vorrichtung sind vorzugsweise derart, dass die Objekte durch
den Fluidstrom zu den Testpositionen getragen werden und dort ohne
weiteren Antrieb innerhalb der Vorrichtung testbereit lokalisiert
werden. Optional können
jedoch andere Formen von Antrieben eingesetzt werden, zum Beispiel
ein elektrischer oder mechanischer Antrieb, zum Beispiel durch dielektrophoretische
Bewegung oder ein piezoelektrischer, mechanischer Antrieb.
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Der
Kanal ist vorzugsweise schmal und beträgt zum Beispiel zwischen dem
1 und 5-fachen des Durchmessers (der typischerweise etwa 5–20 μm betragen
kann) der zu testenden Objekte. Alternativ kann der Kanal oder Trog
relativ breit sein mit Ausnahme einer Verengung in dem Bereich,
an dessen Ort die Testposition liegt. Bei einer besonders bevorzugten
Ausführungsform
können
Fluidleitungen an einem Ort ausgebildet sein, der die Zellen oder
Objekte daran hindert, durch eine Öffnung an einer Testposition
gezwängt
zu werden. Die Leitung kann durch Hinterätzung oder auf eine andere
hier beschriebene Weise ausgebildet werden.
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Bei
einer mikromechanisch hergestellten Vorrichtung kann eine elektronische
Logik dazu verwendet werden, den Ort von Objekten an den Testpositionen
zu überwachen
und den Vorgang der Herstellung und Aufrechterhaltung der Abdichtung
zu steueren und dann die elektrischen Eigenschaften des Objekts
zu messen. Innerhalb eines Halbleitersubstrats können Logikschaltungen integriert
werden, zum Beispiel unter Verwendung von CMOS, DMOS oder bipolaren
Bauteilen, die in einer geeigneten Prozessfolge hergestellt werden.
Das Substrat bildet vorzugsweise auch einen Träger für mikromechanisch hergestellte
Kanäle.
Nachbearbeitungstechniken können
während
der Herstellung des Substrats verwendet werden, um elektronische
Komponenten mit Elektroden in Strömungskanälen oder an Testpositionen
zu verbinden.
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Das
Einfügen
von elektronischen Komponenten oder Logikschaltungen durch aktive
Substrattechnik ist elegant und von besonderem Nutzen, wenn eine
Matrix oder Matrizen von Testpositionen auf einem gemeinsamen Substrat
gemeinsam hergestellt werden. Es besteht die Möglichkeit, derartige Komponenten
oder Schaltungen durch Anfügen
zusätzlicher
mikroelektronischer Komponenten an das Substrat an geeigneten Positionen
zu ersetzen oder zu vermehren. Derartige Komponenten können durch
Oberflächenmontage,
Chipverbindung und Drahtanschluss, TAB-Bonding oder Flip-Chip-Bonding
befestigt werden. Die Befestigung von Vorrichtungen unter Verwendung
leitfähiger
Klebmittel wird besonders bevorzugt, da dies jegliche thermischen Beanspruchungen
minimiert, mit denen die Struktur während der Herstellung beaufschlagt
wird.
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Bevorzugte
Vorrichtungen und Befestigungsmittel werden durch Flächenmontage
(einschließlich der
Befestigung durch leitfähige
Klebstoffe) oder durch Drahtanschluss befestigt. Die vorgenannten Vorrichtungen
sind besonders bevorzugt, wenn das Substrat passiv ist oder Niederspannungsbauteile enthält. Analoge
Verarbeitungsschaltungen, Analog-Digital-Wandler, digitale Signalverarbeitungsvorrichtungen,
Mikrocomputer- oder Mikrokontrollerelemente und Kommunikationsvorrichtungen
können ebenso
auf dem Substrat integriert sein. Die letzteren Vorrichtungen umfassen
optische Kommunikationsvorrichtungen. Integration erleichtert den
Anschluss von Verarbeitungs- oder Steuerschaltungen an externe Prozessoren,
wie beispielsweise einen Mikroprozessor zur rückgekoppelten Ablaufsteuerung und/oder
Messung von elektrischen Parametern.
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Das
Verarbeitungsmittel reagiert optional auf eine externe Angabe über das
Vorhandensein oder den Zustand eines Objekts an der Testposition.
Die Angabe kann ihrerseits durch Bildverarbeitungsmittel erlangt
werden, wie beispielsweise ein Videomikroskopbild des Kanals, um
das Vorhandensein einer zu testenden Zelle zu erfassen.
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Integrierte
Komponenten oder Schaltungen und ein zugehöriger Trog oder Kanal oder
jede Testposition sind mit einer eindeutigen Adresse versehen und
es ist ein Kommunikationsmittel vorgesehen, das die Kommunikation
mit einem Mikroprozessor erlaubt. Die Kommunikation erfolgt vorzugsweise über eine
gemeinsame Verbindung oder einen Bus.
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Wenn
das Trägersubstrat
Silizium ist, besteht die Möglichkeit,
die Zellhandhabungsstrukturen durch Verwendung geeigneter Infrarotstrahlung durch
das Silizium hindurch zu beobachten. Bei einer derartigen Ausführungsform
muss beim Layout der Strukturen darauf geachtet werden, eine Blockierung des
Strahlungspfades zu verhindern. Ein Vorteil dieser Ausführungsform
besteht darin, dass die Vorrichtung kein Element verwenden muss,
das im normalen sichtbaren Band optisch durchlässig ist, sondern eines, das
infrarotdurchlässig
ist.
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Es
können
Mittel vorgesehen werden, um getestete Objekte aus den Testpositionen
zu entfernen. Ein derartiges Entfernen kann im Falle einer Zelle,
eines Liposoms oder eines Membranfragments durch Einführung eines
Mittels zum Auflösen
des Membranmaterials erzielt werden, das dann von der Dichtfläche entfernt
wird, wodurch nachfolgend eine Dichtung an der Dichtfläche ausgebildet
werden kann.
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In
Fällen,
in denen die Testvorrichtung elektrische Anschlüsse aufweist, die über oder
um sie herum geführt
werden, zum Beispiel in einem hochintegrierten aktiven Substrat,
kann es wünschenswert sein,
elektrische Schutzbänder
vorzusehen, die geeignet um Teile der Fluidhandhabungsstruktur angeordnet
sind, so dass jedes an das Fluid angelegte elektrische Feld so hinreichend
reduziert wird, dass eine minimale Störung und ein minimales Übersprechen
zwischen Messungen in verschiedenen Teilen des Aufbaus gegeben ist.
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Optische
Komponenten wie beispielsweise Wellenleiteroptiken können in
behandelte Schichten des Substrats integriert werden, die vorzugsweise auf
die gleiche Weise wie diejenigen gefertigt werden, die die Fluidkanäle bilden.
Derartige optische Komponenten können
Wellenleiter zum Abfragen der Zelle oder des Trägermediums in dem Fluidkanal
umfassen. Sie können
Kopplungen mit abklingendem Feld umfassen. Alternativ kommunizieren
optische Komponenten mit externen Signalverarbeitungsmitteln. Optische
Komponenten umfassen Strukturen die eine Schnittstelle zu faseroptischen
Elementen bilden, wie beispielsweise geätzte Silizium V-Nuten.
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Annordnungen
von Vorrichtungen können gemeinsame
externe Anschlüsse
für die
Zufuhr von Fluiden und Zellen und gemeinsame Stromversorgungen nutzen
und können
unter Verwendung geeigneter Videomikroskopiemittel parallel abgebildet
werden.
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Es
werden nun Ausführungsformen
der Erfindung nur im Sinne von Beispielen und unter Bezug auf folgenden
Figuren beschrieben werden:
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1 ist
ein Querschnitt einer ersten Ausführungsform einer Vorrichtung,
die eine Testposition im Detail zeigt;
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2 ist
ein Querschnitt einer zweiten Ausführungsform einer Vorrichtung,
die eine Testposition im Detail zeigt;
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3 ist
ein Querschnitt einer dritten Ausführungsform einer Vorrichtung,
die eine Testposition im Detail zeigt;
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4 ist
ein Querschnitt einer vierten Ausführungsform einer Vorrichtung,
die eine Testposition im Detail zeigt;
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5 zeigt
zwei schematische Querschnittsansichten von Öffnungen mit einer Form zur
verbesserten Abdichtung an der Testposition;
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6 ist
ein Querschnitt einer fünften
Ausführungsform
einer Vorrichtung, die eine Testposition im Detail zeigt;
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7 zeigt
im Querschnitt eine weitere Ausführungsform
der Erfindung, bei der der elektrische Kontakt mit den Testpositionen
mittels einer Elektrode hergestellt wird, die durch Automaten manipuliert wird;
und
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8 zeigt
einen Querschnitt durch eine weitere Ausführungsform der Erfindung, die
auf der Verwendung vorgeformten Gitterstruktur beruht.
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In
Bezug auf die Figuren werden aus Gründen der Einfachheit die verschiedenen
Ausführungsformen
und ihr Betrieb nur hinsichtlich des Testens von Zellen beschrieben
werden, wobei es sich versteht, dass dies in jedem Fall auch für das Testen
von anderen ähnlichen
kleinen Objekten gelten soll.
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1 zeigt
eine erste Ausführungsform
einer erfindungsgemäßen Testposition 10,
bei der ein Substrat 12 in sich einen Kanal 14 aufweist,
der sich in einer Öffnung 16 an
einem Ort öffnet,
an dem ein Objekt, wie beispielsweise eine Zelle, getestet werden
soll. Die Öffnung
steht mit einem Kanal 18 in Verbindung, entlang dessen
man Zellen strömen
lässt, um
den Testort zu erreichen. Um die Öffnung herum liegt eine Dichtungsfläche 20,
die optional mit einer Materialschicht 22 beschichtet ist,
um den Dichtungseffekt zu kontrollieren und ihn üblicherweise zu erhöhen, um
eine Dichtung mit sehr hohem Widerstand zwischen dem Kanal 14 und
dem Kanal 18 zu erzielen. Ein Beispiel für ein derartiges
Material ist eine Dünnschicht
aus Borsilikatglas. Für
den Fall, dass das Substrat 12 oder zumindest die obere
Schicht von 12, die der Öffnung am nächsten ist, aus einem Material
besteht, mit dem eine gute Dichtung hergestellt werden kann, kann
die Schicht 22 weggelassen werden. Alternativ könnte die
Schicht 22 ein Material sein, dass die erforderliche Dichtung
erzeugt, wenn es mit einem oder mehreren weiteren Materialien beschichtet
wird, die durch Kanal 14 oder Kanal 18 eingeführt werden.
Die Schicht 22 könnte
aus einem Material bestehen, das für eine spezifische Haftung für eine oder
mehrere Zellarten an einer gegebenen Position sorgt oder dies in
Kombination mit einer oder mehreren anderen chemischen Substanzen
bewirkt, die man entlang Kanal 14 oder Kanal 18 strömen lässt. In
den Kanälen 14 beziehungsweise 18 sind Elektroden 24 und 26 in
elektrischem Kontakt mit den Flüssigkeiten
vorgesehen und an eine (nicht gezeigte) elektrische Messvorrichtung
angeschlossen, um den Strom und die Spannung zwischen den Kanälen 14 und 18,
einschließlich
der Leitfähigkeit
einer beliebigen Zelle 30, die an der Testposition vorhanden
ist, zu messen. Im Betrieb nähern
sich Zellen der Testposition 10 entlang eines Einlasskanals 32,
wobei sie durch einen Flüssigkeitsstrom
bewegt werden, in dem sie zwischen dem Einlass 32 und dem
Auslass 34 mitgeführt
werden, oder durch ein anderes Mittel wie beispielsweise Dielektrophorese
oder Zentrifugalkräfte.
Für den
Fall, dass die Zellen mitgeführt werden,
könnte
die Bewegung der Flüssigkeit
zum Beispiel durch einen Volumenstrom als Reaktion auf eine Druckdifferenz
oder durch eine elektroosmotische Strömung erfolgen. Die Zelle wird
dann durch den Fluidstrom aus Kanal 18 zu Kanal 14 oder
durch andere Mittel an der Testposition lokalisiert, zum Beispiel
durch einen dielektrophoretischen Antrieb in einem inhomogenen Wechselfeld,
das zwischen einer Elektrode in Kanal 14 und einer zweiten
in Kanal 18 angelegt wird, oder zwischen einer oder mehreren Elektroden,
die in der Nähe
der Öffnung 16 lokalisiert sind,
und einer, die in Kanal 18 lokalisiert ist. Die Leitfähigkeit
zwischen Kanal 14 und Kanal 18 wird überwacht,
um das Vorhandensein der Zelle nahe der Öffnung 16 zu bestimmen
und die Lokalisierungskraft durch einen Rückkopplungsmechanismus zu regeln. Wenn
sie an der Öffnung
lokalisiert ist, wird eine zusätzliche
Lokalisierungskraft angelegt, so dass die Zellmembran die Dichtungsfläche 20 abdichtet.
Die Qualität
der Dichtung wird über
die Impedanz zwischen Kanal 14 und Kanal 18 überwacht
und die Lokalisierungskraft wird durch ein Rückkopplungsregelmittel aufrechterhalten
und/oder erhöht
bis eine hohe Impedanz (in der Größenordnung von einigen 10 Megaohm
oder mehr) erreicht ist, die anzeigt, dass sich eine gute Dichtung
ausgebildet hat. Es können
dann Messungen vorgenommen werden, zum Beispiel der elektrophysiologischen
Reaktion einer Zelle auf wechselnde Konzentrationen chemischer Substanzen,
die durch den Kanal 18 an der Zelle vorbeiströmen. Dieser
Testmodus wird in der Elektrophysiologie als "cell attached"-Modus bezeichnet. Alternativ könnte der
an der Öffnung 16 lokalisierte
Membranteil für
Ionen oder andere Spezies in der Flüssigkeit in Kanal 14 durchlässig gemacht
werden oder ganz entfernt werden, zum Beispiel durch einen Elektroporationsimpuls,
der zwischen den Elektroden in den Kanälen 14 und 18 angelegt
wird, durch Zufuhr eines chemischen Wirkstoffs zur Membran durch
Kanal 14, durch einen negativen Druckimpuls in Kanal 14 oder beliebige
andere Mittel. Dies ermöglicht
es, Messungen im "whole
cell"-Modus durchzuführen. Wie
Fachleute erkennen werden, können
weitere Varianten von Techniken der Elektrophysiologie und "patch clamping"-Experimente durch Variationen von Druckimpulsen
erzielt werden.
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Wenn
das Experiment beendet ist, kann die Zelle z. B. durch einen plötzlichen
positiven Druckimpuls in Kanal 14 oder durch Erhöhung der
Strömung in
Kanal 18 oder durch Einführen einer zellauflösenden Verbindung
entlang der Kanäle 14 oder 18 entfernt
werden. Restliches, an der Zelldichtungsfläche 20 haftendes Membranmaterial
könnte
durch Behandlung mit Protease oder anderen Membranlösungsmitteln
entfernt werden; im Rahmen des Standes der Technik ist es jedoch
bekannt, dass es schwierig ist, eine zweite gute Abdichtung auf
einer zuvor genutzten Dichtfläche
zu erzielen, selbst wenn diese gereinigt ist. Aus diesem Grund könnte das Dichtungsmaterial 22 im
Bereich 20 erneuert werden, indem zum Beispiel die Oberflächenschicht
aufgelöst oder
anderweitig modifiziert wird oder indem weiteres Material hinzugefügt wird,
das mit dem Dichtungsmaterial 22 zusammenwirkt, um die
Abdichtung zu bilden. Alternativ könnte die die Testposition 10 umfassende
Vorrichtung entsorgbar und nur zur Einmalverwendung gedacht sein.
Auch wenn in 1 nur eine einzige Position
gezeigt ist, versteht es sich, dass die Bereitstellung einer Vielzahl
derartiger Positionen in einer Vorrichtung wahrscheinlich ist. In
diesem Fall sind Mittel vorgesehen, um elektrische Messungen an
jeder Position separat durchzuführen.
Eine gemeinsame Elektrode könnte
in Kanal 14 vorgesehen sein und jede der Elektroden 26 in
den Kanälen 18 könnte elektrisch
von den anderen isoliert sein mittels einer Trennung der Lösungen in
den Kanälen
(zum Beispiel vermittels Luftabschirmungen oder durch Verwendung
vollständig
separater Kanäle).
Alternativ könnten
eine gemeinsame Elektrode 26 in einem gemeinsamen Kanal 18,
der zu jeder der Positionen führt,
und separate Kanäle 14 vorgesehen
werden, die jeweils mit einer separaten Elektrode versehen sind.
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2 zeigt
eine alternative Ausführungsform ähnlich der
in 1, wobei korrespondierende Komponenten die gleiche
Bezeichnung und Funktion haben. Die Testposition umfasst hier einen
Trog 40, in den der Zutritt der Zellen oder anderer Objekte
von oben erfolgt, wobei jeder Trog eine separate Elektrode 42 aufweist,
z. B. eine Ag/AgCl-Elektrode, die die Flüssigkeit in dem Trog kontaktiert.
Die Elektroden 42 sind mit Elektroniken außerhalb
des Chips mittels herkömmlicher
Leiterbahnen auf dem Chip und Drahtanschluss mit einem Kopfstück verbunden,
wie es in der herkömmlichen
Elektroniktechnologie bekannt ist. Zellen werden in Flüssigkeit
dem Trog zugeführt,
auf die Dichtungsfläche
gesaugt und elektrische Messungen wie oben beschrieben durchgeführt. Flüssigkeit
und Zellen könnten
zugeführt
werden, indem Zellen auf separate Flüssigkeitsäquivalente in jedem Trog verteilt werden
oder indem eine größere Zahl
von Zellen in Flüssigkeit
in einen (nicht gezeigten) gemeinsamen Verteiler oberhalb der Tröge abgegeben
werden und dann Flüssigkeit
durch den Kanal 14 abgesaugt wird, um den Flüssigkeitspegel
unter die Kante der Tröge
zu senken, wodurch die Lösungen
und die Kontakte in den Trögen isoliert
werden. Es sind elektrische Messmittel vorgesehen, um die Isolation
zwischen den verschiedenen Elektroden 42 zu erfassen und
so den richtigen Flüssigkeitsabsauggrad
zu bestimmen.
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3 zeigt
eine weitere Ausführungsform
einer Testposition, wobei die Testposition die Form eines Trogs
hat, in dem Zellen wie oben beschrieben immobilisiert werden, wobei
aber ein zusätzlicher oder
mehrere zusätzliche
Kanäle 50 vorgesehen sind,
die aus dem Trog führen,
um das Saugen der Zelle in den Trog aus einem Bereich darüber zu erleichtern,
wobei dieser Bereich entweder ein Einlasskanal wie bei der Ausführungsform
von 1 ist oder ein gemeinsamer Verteiler für Zellen
und Flüssigkeit wie
bei der Ausführungsform
von 2. Zusätzliche Kanäle 50 sind
besonders vorteilhaft, wenn die Öffnung 16 klein
ist und dadurch die Strömung
durch sie begrenzt. Kanäle 50 sind
auch vorteilhaft, um die Zelle mit inverser Strömung zu entfernen. Es ist ein
Kanal 52 vorgesehen, der vom Kanal 14 wegführt, wobei
der Kanal 52 als Saugsammelleitung wirkt, um auf die Zelle
einzuwirken und einen gemeinsamen elektrischen Kontakt mit der Unterseite
einer oder mehrerer Zellen herzustellen und den Zellen chemische
Wirkstoffe wie erforderlich zuzuführen. Die anderen Teile in 3 sind
in den 1 und 2 beschrieben, mit dem Unterschied,
dass die Elektrode 24 hier explizit an einem Ort im Saugkanal 52 gezeigt ist – dies könnte eine
Elektrode sein, die einer Anzahl von Zellen in einer matrixartigen
Vorrichtung gemeinsam ist – und
die Elektrode 26 die Oberseite jedes Trogs umgebend gezeigt
ist. Dies ist eine vorteilhafte Anordnung für Impedanzmessungen und zur
Verwendung eines höheren
Spannungspulses zwischen den Elektroden, um die Zellemembran im
Bereich der Öffnung 16 zu
elektroporieren, wie es für 1 beschrieben
ist. Diese Anordnung liefert auch ein sehr inhomogenes Feld in dem
Bereich der Öffnung
und erlaubt eine dielektrophoretische Wechselstrommanipulation der
Zelle unter Verwendung eines an die gleichen Elektroden angelegten
Felds.
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4 zeigt
eine weitere Ausführungsform wie
sie in 3 beschrieben ist, aber in Kombination mit der
Anordnung für
die Zufuhr von Zellen und Flüssigkeit,
wobei eine Isolation der Flüssigkeit
in den Trögen
folgt, wie sie für
die Ausführungsform
in 2 beschrieben ist. Wie für 2 beschrieben
ist, erfasst ein Steuermittel die Isolation der Elektroden 42 voneinander
und stellt damit den korrekten Pegel der Flüssigkeit in den Trögen ein.
Diese Ausführungsform
vermeidet ein Problem, das bei derjenigen von 2 angetroffen
werden könnte,
insoweit das Ansaugen der Flüssigkeit über die
Kanäle 50 unabhängig vom
Abdichten der Zelle an Kanal 14 erfolgen kann. Wenn die
Zelle in 2 abdichtet, kann keine weitere
Flüssigkeit
abgezogen werden.
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5 zeigt
eine Auswahl von Profilen, die bei der Dichtungsfläche Anwendung
finden könnten, die
die Öffnung
bei den obigen Ausführungsformen umgibt.
Das vorteilhafteste Profil wird von den Eigenschaften der getesteten
Zellen abhängen. 5a zeigt
ein Profil für
eine Zelle, die sich verformt und einfach Abdichtungen ausbildet. 5b zeigt
ein Profil für
eine Zelle, die dies weniger leicht tut. In beiden Fällen kann
Dichtungsmaterial 22 auf die Dichtungsfläche aufgebracht
werden und geeignet und wie oben für die Ausführungsform von 1 beschrieben
chemisch behandelt werden.
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6 zeigt
eine spezifische Konstruktionsweise der in 2 gezeigten
Ausführungsform,
bei der eine oder mehrere Testpositionen auf einem Siliziumchip
ausgebildet sind. Auf einem Siliziumsubstrat 70 ist eine Öffnungsstruktur 72 in
der Konfiguration einer invertierten Düse ausgebildet, die eine Öffnung 16 definiert.
Die Düsenstruktur
wird vorzugsweise von einer Membrane 71 aus einem Dielektrikum,
z. B. Siliziumnitrid, gebildet, die über dem Substrat 70 liegt.
Sie wird auf eine Weise hergestellt, die in unserer gleichzeitig
eingereichten Anmeldung [WO0020554] beschrieben ist. Auf der dem
Silizium gegenüberliegenden
Seite der Öffnungsstruktur
sind eine Reihe von Schichten 74 und 76 ausgebildet,
die zusammen einen Kanal 14 bilden, der in Verbindung mit
der Öffnung 16 steht.
Eine (nicht gezeigte) Elektrode 24 hat wie bei den früheren Ausführungsformen beschrieben
Kontakt mit der Flüssigkeit
in Kanal 14. Falls der Chip eine Vielzahl von Testpositionen
aufweist, kommt es in Betracht, dass der Kanal 14 und ebenso
die Elektrode 24 ihnen allen gemeinsam sind. Sie könnte außerhalb
des Chips angebracht sein oder auf dem Chip entweder in Kanal 14 oder
in Kontakt mit ihm integriert sein. Das Siliziumsubstrat ist so geätzt, dass
es einen Trog bildet, der mit der anderen Seite der Öffnungsstruktur
in Verbindung steht, wobei dann eine Fläche um die Öffnung herum, falls erforderlich,
mit einem Dichtungsmaterial 22 beschichtet ist, zum Beispiel
durch Aufsputtern einer Dünnschicht
aus Borsilikatglas. Eine Elektrode 42 wird durch Sputtern,
Galvanisierung oder anderes Aufbringen einer Schicht aus Silbermetall
entweder allein oder als Beschichtung auf einem darunter liegenden
Leiter ausgebildet; dem folgt ein Chlorierungsprozess, um eine Ag/AgCl-Elektrode
zu bilden. Die Elektrode 42 ist elektrisch mit einer (nicht
gezeigten) Leiterbahn verbunden und dadurch mit einem Kontakt, um
eine elektrische Verbindung außerhalb
des Chips auf herkömmliche
Weise herzustellen. Eine oder mehrere zusätzliche Kunststoffschichten 78 sind vorgesehen,
um den Trog 40 weiter abzugrenzen. Die Vorrichtung wird
wie für
die 1 und 2 beschrieben verwendet.
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7 zeigt
eine weitere Ausführungsform der
Erfindung, die eine Variante der in 6 gezeigten
Ausführungsform
ist, die die Abgabe von Flüssigkeit
und Zellen in den Trog und ihre Entfernung mittels einer oder mehrerer
Kapillaren zeigt, die auf einem Automatenkopf montiert sind. In 7 ist
ein kombiniertes Lösungszufuhr-
und Kontaktmittel 80 auf einem Automatenkopf montiert und
jeweils zu einem Trog aus einer Anzahl von aufeinanderfolgenden
Trögen
ausgerichtet, um Zellen abzugeben, Flüssigkeiten abzugeben und einen
Kontakt mit der Flüssigkeit
in dem Trog herzustellen. Das Mittel 80 umfasst eine Kapillare 82 zur
Lösungszufuhr
und eine Elektrode 86, vorzugsweise eine Ag/AgCl-Elektrode,
und eine optionale Kapillare 84 zur Lösungsabfuhr. Die Elektrode 86 ersetzt
die Elektrode 42 in der in 2 gezeigten
Ausführungsform.
Der Vorteil der Ausführungsform
in 7 besteht darin, dass durch eine Matrix von Lösungszufuhr-
und Kontaktmitteln 80 auf einfache Weise ein Kontakt mit
einer Vielzahl von Testpositiontrögen 40 auf einem Chip
hergestellt werden kann, ohne dass man Kontakte als Teil des Chips
ausführen
muss. Dies könnte
eine erhebliche Kosteneinsparung ergeben und daher die Verwendung
des Chips als Einmalartikel fördern.
Die Elektrode 86 könnte
vorzugsweise die Flüssigkeitszufuhrkapillare 82 kontaktieren,
anstatt direkt die Flüssigkeit im
Trog 40 zu kontaktieren. Dies würde eine kürzere Länge des zu verwendenden Elektrodendrahts
ermöglichen
und den Aufbau der Mittel 80 vereinfachen und möglicherweise
die Rauschempfindlichkeit der Vorrichtung verringern. Optional könnte Flüssigkeit dem
Trog zugeführt
und dann durch eine einzelne Kapillare 82 und vorzugsweise
durch eine zweite Kapillare 84 abgezogen werden oder es
ist ein gemeinsamer Abflusskanal vorgesehen, der demjeinigen ähnlich ist,
der mit dem Bezugszeichen 50 in 4 gezeigt
ist, um für
eine schnelle Entfernung von Flüssigkeit
um die getestete Zelle herum zu sorgen. Testsubstanzen können dann
nacheinander an die Zelle durch die Kapillare mittels eines Mehrwegeventils und
(nicht gezeigten) Probenentnahmesystem abgegeben werden. Alternativ
könnten
Substanzen wie bei einer herkömmlichen
Flüssigkeitshandhabungsautomatik
durch Ansaugen in die Kapillare 82 von einer Mikrotiterplatte
zur Zelle geliefert werden. In diesem Fall sind die Tröge vorteilhafterweise
so strukturiert, dass sie dem Abstand in einer herkömmlichen Mikrotiterplatte
entsprechen, zum Beispiel dem 96, 384 oder 1536 Trogformat, wobei
die Kunststofftrogeinfassungen 78 so gestaltet sind, dass
sie der Gestaltung bei den entsprechenden Platten entsprechen, wie
es in 7b für zwei benachbarte Testpositionen 10 gezeigt
ist. Es kommt in Betracht, dass eine Anzahl von parallel agierenden
Kapillar- und Kontaktmitteln 80 vorgesehen sind, wie bei
einer herkömmlichen
Mikrotiterplattenautomatik, mit dem Unterschied, dass die Kapillarmittel
hier nach der Abgabe mit der Lösung
in den Trögen
in Kontakt bleiben, um den elektrische Kontakt herzustellen.
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Das
Flüssigkeitsabgabe-
und Kontaktmittel könnte
eine Kapillar- und Kontaktanordnung sein, wie sie in 7c gezeigt
ist. In diesem Fall kann eine korrekte Abfolge von Ansaugungen und
Ansaugvolumina gewählt
werden, um die Wahrscheinlichkeit einer Kreuzkontamination zu reduzieren,
während
ein Kontakt zu der Flüssigkeit
in dem Trog hergestellt wird, und für kontinuierliche elektrische
Messungen zu sorgen, während
die Substanz der Zelle zugeführt wird.
Die Flüssigkeitszufuhr-
und Kontaktkapillare 88 besitzt eine Elektrode 86,
die so angebracht ist, dass sie Kontakt mit der Flüssigkeit
innerhalb der Kapillare hat, wobei ein elektrischer Kontakt zu einer
Messvorrichtung führt.
Das Volumen der Kapillare und die Position der Elektrode sind so,
dass der Elektrolyt den Kontakt 86 erreicht, wie in 7c gezeigt
ist, wenn das den Trog 40 einnehmende Volumen in der Kapillare
gehalten wird, die Kapillare aber das doppelte Volumen aufnehmen
kann. Zwei Äquivalente 94 und 96 entweder
der gleichen Lösung
oder von verschiedenen Lösungen
sind in 7c gezeigt und nehmen die Bereiche 90 beziehungsweise 92 der
Kapillare ein. Die Füllvorrichtung
kann entweder einen einzelnes (Bereich 90) oder ein doppeltes
Trogvolumen (Bereich 90 plus Bereich 92) in die
Kapillare einfüllen. Der
Betrieb der Ausführungsform
in 7a und 7c ist
wie folgt. Der Kanal 14 wird mit Elektrolyt gefüllt; dies
ermöglicht
es, dass dieser durch Kapillarwirkung Öffnung 16 füllen kann.
Dann wird ein doppeltes, Zellen enthaltendes Elektrolytvolumen angesaugt
und ein einfaches Volumen in den Trog gegeben. Der Kontakt zwischen
der Lösung
in dem Trog und in Kanal 14 wird überprüft und über den Kanal 14 eine
Saugwirkung angelegt bis eine Zelle in der Position gefangen ist.
Die Impedanz zwischen den Elektroden 24 und 86 wird überwacht,
um eine gute Abdichtung zu überwachen.
Bei einem Multipositionschip wird eine Vielzahl von Kapillaren 88 und
Messungen von Zellabdichtungen gleichzeitig verwendet. Diejenigen,
die gute Dichtungen bilden, werden für Tests verwendet, die anderen
werden ignoriert. Die Kapillare 88 wird dann entleert und
mit einem einfachen Volumen einer Testsubstanz gefüllt, gefolgt
von einem einfachen Volumen des Elektrolyts. Der Kontakt zu der
Zelle wird hergestellt, indem zuerst der Elektrolyt und dann die
Substanz dem Trog zugeführt wird.
Der Elektrolyt erzeugt eine Basislinie für die Zellparameter, und es
lässt sich
eine kontinuierliche Messung erzielen, während der Zelle die Substanz zugeführt wird.
Die Lösung
kann durch Ansaugen entfernt werden, dem ein Auswaschen des Trogs folgt,
bevor die nächste
Verbindung zugeführt
wird; alternativ wird die Lösung über einen
Abflusskanal an der Unterseite des Trogs entfernt, wie es oben beschrieben
ist. Die abgegebenen genauen Volumina sind so ausgelegt, dass die
Zelle in einem kleinen Volumen restlicher Lösung im Unterteils des Trogs
gehalten wird. Varianten des obigen Verfahrens können dazu verwendet werden,
um für
unterschiedliche Abfolgen der Einwirkung von Lösungen zu sorgen.
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8 zeigt
eine weitere Ausführungsform. Ein
Gitter 100 wird durch im Stand der Technik bekannte Techniken
erzeugt, zum Beispiel, durch Elektroplatierung um eine photostrukturierte
Matrix aus Photolackbereichen herum, oder durch Aufsputtern von
Material zwischen Photolackbereiche, dem ein Ablösevorgang folgt. Alternative
Gitter sind zum Beispiel solche, die von Agar Scientific Ltd., in
Stansted, UK, geliefert werden, wobei das Material 100 typischerweise
aus Kohlenstoff besteht, der auf einer größeren metallischen Trägerstruktur
getragen wird. Die Öffnungen
in dem Gitter sind vorzugsweise kreisförmig und der Abstand der Mittelpunkte
der Öffnungen
sind vorzugsweise größer als
zwei Öffnungsdurchmesser.
Wenn das Material, aus dem Gitter gefertigt ist, leitfähig ist,
dann wird eine Beschichtung 102 aufgebracht, um die Oberfläche isolierend
zu machen. Dies kann für
den Fall, dass das Gitter zum Beispiel aus Metall besteht, durch
Oxidation oder im allgemeinen Fall durch Sputtern oder eine andere Beschichtung
der Oberfläche
mit einem isolierenden, anhaftenden Beschichtung erfolgen, wie es
in der herkömmlichen
Elektronikfertigung bekannt ist. Eine Kunststoffschicht 104,
zum Beispiel aus photostrukturierbarem Epoxid des Typs 'SU8', wird dann auf das Gitter
unter Verwendung herkömmliche
Techniken strukturiert aufgebracht, um eine Anzahl von Trögen 40 auszubilden.
Wenn Probleme mit dem Entfernen des strukturierbaren Kunststoff
vom Kanal 14 auftreten, könnte ein Schritt eingesetzt
werden, bei dem entfernbarer Photoresist in dem Bereich der Tröge strukturiert
wird. Das Gitter kann so ausgelegt werden, dass die Öffnungen
so beabstandet sind, dass sie zum Abstand der Tröge passen. Alternativ könnten Gitter
verwendet werden, bei denen der Abstand der Öffnungen kleiner als der Abstand
der Tröge
ist; in diesem Fall werden die Öffnungen
in der Nachbarschaft der Tröge
mit einem strukturierten Kunststoff 104 gefüllt und
so blockiert. Das Gitter könnte
in der Tat einen zufälligen
Abstand aufweisen. Es ist notwendig, dass nur eine Öffnung in
jedem Trog vorhanden ist. Es kommt bei der Erfindung jedoch in Betracht,
dass in einem Teil der Tröge
mehr als eine vorhanden sein könnte,
und dass diese bei dem Vorgang der Ausbildung der Zellabdichtung
in jedem der Tröge
erkannt würde
und diese Tröge
ignoriert werden. Es ist vorgesehen, dass in das System ausreichende
Redundanz eingebaut wird, so dass eine geeignete Anzahl von Trögen mit
einer Öffnung
und erfolgreich abdichtender Zelle erzielt wird. Die Tröge sind
vorzugsweise mit einer Dichtungschicht 22 beschichtet und
Flüssigkeit,
zu testende Zellen und Substanzen werden dem Trog durch ein Kontakt-
und Flüssigkeitszufuhrmittel 80 zugeführt, wie
es zuvor beschrieben wurde. Zellabdichtungen werden durch Flüssigkeitskontakt
mit der Zellemembran ausgebildet, dem ein Ansaugen in den Sammelleiter 52 folgt.
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Das
Gitter 100 besteht vorteilhafterweise aus einem anorganischen
Material, so dass die Ausdehnungskoeffizienten der verschiedenen
Beschichtungen zueinander passen und die dichtungsfördernde Schicht 22 ohne
weiteres an der darunter liegenden Struktur haftet. Das Gitter 100 könnte jedoch
aus organischem Material bestehen, vorausgesetzt, das eine gute
Dichtfläche
für Zellen
ausgebildet werden kann. Vorausgesetzt, dass Temperaturabweichungen
vermieden werden können,
könnte
dies wie im Falle eines anorganischen Gitters auch durch Aufsputtern
einer Dünnschicht
aus Borsilikatglas auf die Oberfläche des Kunststoffgitters geschehen;
die Haftung zwischen der anorganischen Beschichtung und dem Kunststoff
könnte
zum Beispiel durch eine Plasmabehandlung des Kunststoffs vor der
Beschichtung verbessert werden, wie es im Rahmen des Standes der
Technik bei der Fertigung von Getränkebehälter bekannt ist. In diesem
Fall könnten
Kunststofffiltermembranen mit zufällig angeordneten Poren, zum Beispiel
eine 'Nucleopore' Filtermembran, verwendet werden.
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Obwohl
eine Vorrichtung mit einer einzelnen Testposition in einigen der
obigen Ausführunsgsformen
beschrieben wurde, versteht es sich, dass die Erfindung sowohl einzelne
als auch mehrfache Vorrichtungen betrifft, gegebenenfalls in einer
Matrix auf einem gemeinsamen Substrat und je nach Notwendigkeit
oder Vorteil mit separaten oder gemeinsamen Fluid- und Elektroverbindungen.