DE60120733T2

DE60120733T2 - Methode zur bildung von oligonucleotidbanken welche eine kontrollierte mutationsverteilung aufweisen

Info

Publication number: DE60120733T2
Application number: DE60120733T
Authority: DE
Inventors: M. Robert Belmont CALDWELL; Volker Palo Alto SCHELLENBERGER
Original assignee: Genencor International Inc
Current assignee: Danisco US Inc
Priority date: 2000-10-26
Filing date: 2001-10-12
Publication date: 2007-06-14
Anticipated expiration: 2021-10-13
Also published as: DK1328627T3; CA2426774A1; AU2002215346A1; EP1328627A2; DE60120733D1; WO2002034762A3; EP1328627B1; US6582914B1; WO2002034762A2; ATE330008T1

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG
A. Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft die Erzeugung von Bibliotheken von mutanten Nukleinsäuremolekülen aus einer Vorläufer-Nukleinsäurematrize oder -Matrizen. Die mutante Bibliothek ist dann für Selektions- oder Screening-Zwecke nützlich, um verbessertes Nukleinsäure-, Protein- oder Peptidprodukt zu erhalten. Genauer gesagt, sieht die vorliegende Erfindung ein neues Verfahren für die Erzeugung von kombinatorischen Mutationen vor.
B. Beschreibung des Stands der Technik
Die Entwicklung von Bibliotheken von Nukleinsäuren, welche verschiedene Kombinationen von mehreren oder vielen Mutanten oder Derivat-Sequenzen umfassen, ist kürzlich als ein wirkungsvolles Verfahren zur Ermittlung neuer Produkte mit verbesserten oder wünschenswerteren Merkmalen erkannt worden. Eine Anzahl von wirkungsvollen Verfahren zur Mutagenese ist entwickelt worden, welche bei iterativer Anwendung mit fokussiertem Screening zur Anreicherung der nützlichen Mutanten unter dem allgemeinen Begriff "gerichtete Evolution" bekannt sind.
Zum Beispiel ist kürzlich eine Vielzahl von in-vitro-DNA-Rekombinationsverfahren für den Zweck des Rekombinierens von mehr oder weniger homologen Nukleinsäuresequenzen zum Erhalten neuer Nukleinsäuren entwickelt worden. Beispielsweise sind Rekombinationsverfahren entwickelt worden, umfassend das Mischen einer Vielzahl von homologen, aber verschiedenen, Nukleinsäuren, das Fragmentieren der Nukleinsäuren und das Rekombinieren derselben unter Anwendung von PCR unter Bildung von chimären Molekülen. Zum Beispiel umfasst das U.S.-Patent Nr. 5 605 793 im Allgemeinen die Fragmentierung von doppelsträngigen DNA-Molekülen durch DNase I. Das U.S.-Patent Nr. 5 965 408 beruht im Allgemeinen auf dem Annealing von relativ kurzen statistischen Primern, um Gene anzuzielen und sie mit DNA-Polymerase zu verlängern. Jede dieser Offenbarungen beruht auf zur Polymerasekettenreaktion (PCR) ähnlichem Thermocyclieren von Fragmenten in Gegenwart von DNA-Polymerase, um die Fragmente zu rekombinieren. Andere Verfahren haben einen Vorteil aus dem Phänomen gezogen, welches als Template-Switching bekannt ist, das z. B. in Meyerhans, A., J.-P. Vartaanian und S. Wain-Hobson (1990) Nucleic Acids Res. 18, 1687–1891, beschrieben wird. Ein Nachteil dieser PCR-basierenden Rekombinationsverfahren ist jedoch, dass die Rekombinationspunkte dazu neigen, auf diejenigen Bereiche von relativ signifikanter Homologie beschränkt zu sein. Folglich wird, beim Rekombinieren von verschiedenartigeren Nukleinsäuren, die Häufigkeit der Rekombination drastisch verringert und begrenzt.
In vielen Zusammenhängen kann es wünschenswert sein, Bibliotheken von mutanten Molekülen zu entwickeln, die Mutationen mischen und kombinieren bzw. anpassen, die bekanntermaßen wichtig oder wegen funktioneller oder struktureller Daten interessant sind. Es sind mehrere Strategien in Richtung auf eine kombinatorische Mutagenese entwickelt worden. In Stemmer et al., Biotechniques, Band 18, Nr. 2, S. 194–196 (1995) verwenden die Autoren ihre "Gene Shuffling"-Methoden in Kombination mit einer Mischung von spezifisch entworfenen Oligonukleotid-Primern, um gewünschte Mutationen in das "Shuffling"-Schema einzubinden. In einem anderen Beispiel entwarfen Osuna et al., Gene, Band 106, S. 7–12 (1991), ein Experiment, in welchem synthetische DNA-Fragmente 50% Wildtyp-Codon und 50% einer äquimolaren Mischung von Codons für jede der 20 Aminosäuren an Positionen 144, 145 und 200 von EcoRI-Endonuklease umfassen. Die mutagenen Primer wurden zu einer Lösung von einzelsträngiger DNA-Matrize zugesetzt, und die Primer für die 144- und 145-Mutationen wurden getrennt von den Primern für die 200-Stelle verwendet. Die separaten Mischungen aus jedem Experiment wurden an die einzelsträngige Matrizen-DNA hybridisiert und eine Stunde lang mit PolIk-Polymerase verlängert. Die Fragmente wurden isoliert und ligiert, um ein Volllängenfragment mit Mutationen an allen drei Stellen herzustellen. Das Fragment wurde mit PCR amplifiziert und gereinigt und in einen Vektor kloniert. Obgleich Osuna vorhersagte, dass eine ausgewogene Verteilung von jeder der 20 Mutanten an jeder Position erhalten werden würde, waren die Autoren nicht in der Lage, zu bestätigen, ob die vorhergesagte Verteilung erreicht wurde. Tu et al., Biotechniques, Band 20, Nr. 3, S. 352–353 (1996), beschreibt ein Verfahren zur Erzeugung einer Kombination von Mutationen durch Verwenden mehrerer mutagener Oligonukleotide, welche in ein mutagenes Nukleotid inkorporiert werden durch eine einzige Primerverlängerungs-Runde, worauf Ligation folgte. Merino et al., Biotechniques, Band 12, Nr. 4, S. 508–509 (1992) beschreibt ein Verfahren für einzelne oder kombinatorische gerichtete Mutagenese, welches einen universellen Satz an Primern verwendet, komplementär zu den Bereichen, welche die Klonierungsregion der pUC/M13-Vektoren flankieren, die in dem Mutagenese-Schema für den Zweck der Optimierung des Ertrages an Mutanten verwendet wurden. In der PCT-Veröffentlichung Nr. WO 98/42728 (California Institute of Technology) werden mehrere Variationen über das Thema der Rekombination von verwandten Familien von Nukleinsäuren beschrieben. Insbesondere beschreiben die Autoren die Verwendung von definierten Primern in Kombination mit einer Rekombinations-basierenden Erzeugung von Diversität, wobei die definierten Primer verwendet werden, um Cross-over-Rekombination an Stellen anzuregen, welche anderweitig wahrscheinlich nicht Cross-over-Punkte sind.
Die WO 01/12802 beschreibt ein Verfahren zur Einführung von statistischen Mutationen von Einzel-Ziel-Polynukleotiden durch PCR, basierend auf der Verwendung von Primern mit Sequenzen, welche teilweise unbekannt sind. Es offenbart nicht die Produktion von Polynukleotiden mit gesteuerten Mutationen.
Ge und Rudolph (Biotechniques, 22(I): 28–30, 1997) und Ito et al., (Gene, 102: 67–70, 1991) offenbaren Verfahren zur Einführung von Punktmutationen in ein Polynukleotid unter Verwendung von vier kurzen Primersequenzen, in welchen die PCR-Reaktion unter Verwendung von getrennten Paaren von Primern in einer zweistufigen Reaktion ausgeführt wird.
Sandhu et al. (Biotechniques, 12(I): 14–16, 1992) beschreibt die Konstruktion von synthetischen Genen unter Verwendung von separaten Primerpaaren, um Fragmente herzustellen, welche dann unter Erzeugung eines Matrizengens zusammengebaut werden. Die Einführung von Mutationen wird nicht erörtert.
Die WO 98/42832 offenbart die Verwendung von Nukleinsäurematrizen, anstatt von Primern, um Mutationen in eine Produkt-Nukleinsäuresequenz in einer PCR-Reaktion einzuführen. In einer weiteren Ausführungsform werden Mutationen in eine Produkt-Nukleinsäuresequenz unter Verwendung von statistischen Primern, im Vergleich zur Verwendung von mutagenen Primern mit definierten Sequenzen, eingeführt.
Obschon es offensichtlich ist, dass eine Anzahl an Verfahren existiert, ist es wünschenswert, weitere und effizientere Verfahren zur Herstellung von Bibliotheken von mutanten Nukleinsäuren und insbesondere für kombinatorische Mutagenese zu entwickeln. Zum Beispiel erwachsen signifikante Vorteile aus der Fähigkeit, maßgeschneiderte mutante Nukleinsäurebibliotheken zu entwickeln, welche durch den Entwurf spezifische Vorbeeinflussungen in Richtung auf bestimmte Mutationen aufweisen. Darüber hinaus ist es wünschenswert, zusammenhängende bzw. benachbarte und nicht-benachbarte Mutationen in einer einfachen unkomplizierten Weise einzuführen, im Gegensatz zu vielen derzeitigen Verfahren für nicht-benachbarte kombinatorische Mutation, welche besonders umständlich sind.
In der vorliegenden Erfindung haben die Erfinder hierin ein Verfahren für die kombinatorische Mutagenese von Nukleinsäuren bestimmt, welches die Optimierung des Mutationsschemas basierend auf der Kenntnis der Funktion und/oder Struktur des Proteins gestattet, während noch eine signifikante Zahl an Mutanten mit dem Potenzial für ein drastisch verbessertes Leistungsverhalten entwickelt wird.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Gemäß der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zur Herstellung einer Bibliothek von mutanten Nukleinsäuremolekülen vorgesehen, umfassend die Schritte: (a) Erhalten einer Matrizennukleinsäure; (b) Herstellen eines Oligonukleotid-Primerpaares, entsprechend den Enden der Matrizennukleinsäure; (c) Herstellen von zwei mutagenen Oligonukleotidprimern, entsprechend einer ersten und einer zweiten gewünschten Mutation innerhalb der Matrizennukleinsäure; (d) Mischen der Oligonukleotidprimer, welche in den Schritten (b) und (c) hergestellt wurden; (e) Vereinigen der Mischung in Schritt (d) mit der Matrizennukleinsäure unter Bedingungen zur Erleichterung der Polymerasekettenreaktion, wobei die mutagenen Oligonukleotide in einer Konzentration vorhanden sind, welche niedriger als die Sättigungskonzentration ist.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Matrizennukleinsäure eine einzelne Nukleinsäure. In einer anderen bevorzugten Ausführungsform der Erfindung schließt die Mischung von Oligonukleotidprimern ferner nicht-mutagene Oligonukleotidprimer ein, welche einem oder beiden der ersten und zweiten Oligonukleotide entsprechen. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung werden die Primer in einem vordefinierten Verhältnis zugesetzt.
In einer anderen Ausführungsform der Erfindung umfasst die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung einer Bibliothek von mutanten Nukleinsäuremolekülen, umfassend die Schritte des Erhaltens einer Matrizennukleinsäure; Herstellens eines Oligonukleotidprimers, der einer ersten gewünschten Mutation innerhalb der Matrizennukleinsäure entspricht; Herstellens eines Oligonukleotidprimers, der einer zweiten gewünschten Mutation innerhalb der Matrizennukleinsäure entspricht; Mischen der Oligonukleotidprimer, welche in den vorausgehenden zwei Schritten hergestellt wurden; Vereinigen der Mischung in dem Schritt (d) mit der Matrizennukleinsäure unter Bedingungen zur Ermöglichung der Hybridisierung der Oligonukleotide mit der Matrizennukleinsäure, wobei die Oligonukleotide in einer Konzentration vorhanden sind, welche niedriger als Sättigungsniveau ist; Verlängern der Primer zur Erzeugung einer Bibliothek von mutanten Matrizennukleinsäuren unter Anwendung der Polymerase-Kette; Transformieren der mutanten Matrizennukleinsäure aus der Bibliothek in eine kompetente Wirtszelle; Exprimieren von Protein, entsprechend der mutanten Nukleinsäure, in der Wirtszelle; und Screenen der exprimierten Proteine nach gewünschten Merkmalen.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
Die 1 veranschaulicht eine typische PCR-Reaktion unter Verwendung von mehreren Primern.
Die 2 veranschaulicht eine PCR-Reaktion unter Verwendung derselben Primer wie in 2, jedoch ohne die Annahme von Rekombination (kein Megapriming). Wenn alle Reaktionen mit einer identischen Rate stattfinden würden, würde man erwarten, eine Mischung von drei Produkten zu erhalten, welche sämtlich Primersequenzen an ihren Enden enthalten. In Wirklichkeit wird die Rate der Bildung dieser drei Produkte von vielen Parametern abhängen.
Üblicherweise wird die Bildung von kurzen Produkten gegenüber der Bildung von Volllängensequenzen begünstigt, und es würde erwartet werden, dass eines oder beide der kürzeren Produkte die Produktmischung dominieren.
AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft Verfahren zur Einführung einer limitierten aber fokussierten Diversität in eine Nukleinsäuresequenz. Die hierin vorgesehenen Verfahren stellen mehrere signifikante Steuerungsebenen bereit, welche dem Experimentator gestatten können, die erhaltene Mutantenbibliothek basierend auf den spezifischen Bedürfnissen für das spezifische Experiment zu optimieren. Zum Beispiel wird die Kontrolle darüber, welche Positionen der Sequenz mutiert werden, und auch darüber, welche Nukleotide in jeder der mutagenisierten Positionen variiert werden, und das spezifische Verhältnis dieser Nukleotide, signifikante und wichtige Ebenen der Variation in einer gegebenen Nukleinsäurebibliothek gestatten. Darüber hinaus ist es möglich, die durchschnittliche Anzahl von Mutationen pro Klon in der resultierenden Bibliothek zu steuern.
Somit wird gemäß der vorliegenden Erfindung ein Verfahren zur Herstellung einer Bibliothek von mutanten Nukleinsäuremolekülen vorgesehen, welches die folgenden Schritte umfasst: (a) Erhalten einer Matrizennukleinsäure; (b) Herstellen eines Oligonukleotid-Primerpaares, entsprechend den Enden der Matrizennukleinsäure; (c) Herstellen eines ersten und eines zweiten mutagenen Oligonukleotid-Primers, wobei der erste Primer einer ersten gewünschten Mutation innerhalb der Matrizennukleinsäure entspricht, und der zweite Primer einer zweiten gewünschten Mutation innerhalb der Matrizennukleinsäure entspricht; (d) Mischen der Oligonukleotid-Primer, welche in den Schritten (b) und (c) hergestellt wurden; (e) Vereinigen der Mischung in dem Schritt (d) mit der Matrizennukleinsäure unter Bedingungen zur Erleichterung der Polymerasekettenreaktion, wobei die mutagenen Oligonukleotide in einer Konzentration vorhanden sind, welche niedriger als die Sättigungskonzentration ist. In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Matrizennukleinsäure eine einzelne Nukleinsäure. In einer anderen bevorzugten Ausführungsform der Erfindung schließt die Mischung von Oligonukleotid-Primern ferner nicht-mutagene Oligonukleotid-Primer ein, welche einem oder beiden der ersten und zweiten Oligonukleotide entsprechen. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung werden die Primer in einem vordefinierten Verhältnis zugesetzt.
Das Verfahren kann wahlweise die folgenden zusätzlichen Schritte umfassen: (f) Transformieren der mutanten Matrizennukleinsäure aus der Bibliothek in eine kompetente Wirtszelle; (g) Exprimieren von Protein, entsprechend der mutanten Nukleinsäure, in der Wirtszelle; und (h) Screenen der exprimierten Proteine nach gewünschten Merkmalen. In einer bevorzugten Ausführungsform werden die mutanten Matrizennukleinsäuren, vor der Transformation in eine geeignete Wirtszelle, in einen passenden Vektor ligiert.
In einer anderen bevorzugten Ausführungsform können in vitro-Expressions- und Screening-Verfahren für Selektion und/oder Screenen der mutanten Matrizennukleinsäuren angewandt werden. Solche Verfahren sind im Fachgebiet bekannt und werden beispielsweise beschrieben in Hanes, J., und A. Pluckthun (1997), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94, 4937–42.
Der Begriff "Matrizennukleinsäure", wie hierin verwendet, bezieht sich auf eine Nukleinsäure, für welche es gewünscht wird, eine Bibliothek von verwandten Nukleinsäuren zu entwickeln, deren Mitglieder veränderte oder modifizierte Merkmale im Vergleich zu der Matrizennukleinsäure aufweisen und/oder ein Protein kodieren, welches veränderte oder modifizierte Merkmale im Vergleich zu dem Protein aufweist, welches von der Matrizennukleinsäure kodiert wird. Jedwede Quelle von Nukleinsäure, in gereinigter oder nicht gereinigter Form, kann als die Matrizennukleinsäure verwendet werden, vorausgesetzt sie schließt die spezifische gewünschte Nukleinsäuresequenz ein. Daher kann das Verfahren zum Beispiel DNA oder RNA, einschließlich Boten-Messenger-RNA verwenden, wobei die DNA oder RNA einzelsträngig oder doppelsträngig sein kann. Darüber hinaus kann ein DNA-RNA-Hybrid, welches einen Strang von jedem enthält, verwendet werden. Eine Mischung von beliebigen dieser Nukleinsäuren kann ebenfalls verwendet werden, oder die Nukleinsäuren, hergestellt aus einer früheren Amplifikationsreaktion hierin unter Verwendung derselben oder anderer Primer, können derartig verwendet werden. Die zu amplifizierende spezifische Nukleinsäuresequenz kann nur ein Bruchteil eines größeren Moleküls sein oder kann anfänglich als ein diskretes Molekül vorhanden sein, so dass die spezifische Sequenz die gesamte Nukleinsäure ausmacht. Es ist nicht notwendig, dass die zu amplifizierende Sequenz anfänglich in einer reinen Form vorliegt; sie kann ein geringer Bruchteil einer komplexen Mischung sein, wie ein Abschnitt des Beta-Globingens, der in humaner Gesamt-DNA enthalten ist, oder ein Abschnitt von Nukleinsäuresequenz auf Grund eines besonderen Mikroorganismus, wobei der Organismus einen sehr geringen Bruchteil einer jeweiligen biologischen Probe ausmachen könnte. Die Matrizennukleinsäure kann mehr als eine gewünschte spezifische Nukleinsäuresequenz enthalten, welche gleich oder verschieden sein können. Deswegen besitzt, obgleich eine bevorzugte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung für die Herstellung einer Bibliothek aus einer spezifischen Nukleinsäuresequenz beschaffen ist, die vorliegende Erfindung ferner Nützlichkeit zur gleichzeitigen Erzeugung von Varianten von mehr als einer spezifischen Nukleinsäuresequenz. Die Nukleinsäure oder -säuren können aus einer beliebigen Quelle erhalten werden, zum Beispiel aus Plasmiden, wie pBR322, aus klonierter DNA oder RNA oder aus natürlicher DNA oder RNA aus einer beliebigen Quelle, einschließlich Bakterien, Hefe, Viren und höheren Organismen, wie Pflanzen oder Tieren. DNA oder RNA kann aus Blut, Gewebematerial, wie Chorionzotten oder Amionzellen, durch eine Vielzahl an Techniken extrahiert werden, wie denjenigen, welche beschrieben werden von Maniatis et al., Molecular Cloning: A Labortory Manual, (New York: Cold Spring Harbor Laboratory, 1982), S. 280–281. Das vorliegende Verfahren kann jede spezifische Nukleinsäuresequenz mutagenisieren. Es ist lediglich notwendig, dass eine ausreichende Anzahl von Basen in hinreichendem Detail bekannt sind, so dass wenigstens zwei mutagene Oligonukleotid-Primer hergestellt werden können, welche an die gewünschte Sequenz an gewünschten Positionen entlang der Sequenz hybridisieren werden, und dass zwei Oligonukleotid-Primer hergestellt werden können, welche den entgegengesetzten Enden der Matrizennukleinsäure entsprechen. Unter Verwendung von Primern, wie hierin beschrieben, kann ein Verlängerungsprodukt, synthetisiert von einem Primer, wenn es von seiner Matrize (Komplement) getrennt wird, als eine Matrize für die Verlängerung des anderen Primers zu einer Nukleinsäure von definierter Länge dienen. Je größer die Kenntnis über die Basen am relevanten Abschnitt der Sequenz, desto größer kann die Spezifität der Primer für die Zielnukleinsäuresequenz sein, und umso größer ist die Effizienz des Verfahrens.
In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst die Matrizennukleinsäure entweder eine einzelne Nukleinsäure oder, alternativ dazu, eine Vielzahl von verwandten Nukleinsäuren. Wenn eine Vielzahl von verwandten Nukleinsäuren verwendet wird, kann die Vielzahl von Nukleinsäuren aus einem Satz von natürlichen Homologen für ein gegebenes Nukleotid abgeleitet werden, und das Verfahren der Erfindung umfasst das Mischen der natürlichen Homolog-Matrizennukleinsäuren mit mutanten und gegebenenfalls nicht-mutanten Oligonukleotid-Primern. Es ist ebenfalls möglich, Mutanten einer einzelnen Nukleinsäure zu erzeugen, wobei die Mutanten als die Vielzahl von Matrizennukleinsäuren verwendet werden. In dieser Ausführungsform der Erfindung wird das inhärente Merkmal von PCR, Homologe unter Erzeugung von chimären Molekülen zu rekombinieren, durch weitere Mutationen wegen der Gegenwart der mutagenen Oligonukleotide ergänzt.
Alternativ dazu, und besonders bevorzugt, ist die Ausführungsform der Erfindung, worin eine einzelne Nukleinsäure als die Matrize verwendet wird. Im Gegensatz zu Strategien, umfassend die Verwendung einer Familie von verwandten Nukleinsäuren in PCR, um eine statistische Rekombination von chimären Molekülen zu bewirken, gestattet diese Ausführungsform dem Experimentator, die gewünschten Mutationen in einer gesteuerten Weise exakter zu verteilen. Dieses Ergebnis ist möglich, weil die inhärente Rekombination zwischen identischen Matrizenmolekülen keine Varianten einführen wird. Anstatt dessen werden die Varianten in der resultierenden Bibliothek lediglich aufgrund von Mutationen erzeugt, welche von den mutagenen Oligonukleotid-Primern und von der statistischen Inkorporation von Nukleotiden, welche während einer typischen PCR-Reaktion stattfindet, beigesteuert werden. Wie hierin verwendet, bedeutet eine "einzelne Nukleinsäure" eine Matrizennukleinsäure, welche in der Reaktion eingeschlossen wird, ohne signifikante Sequenzvariation. Obgleich eine einzelne Nukleinsäurematrize Nukleinsäuren von variierenden Längen umfassen kann oder geringfügige Mutanten- oder Derivat-Kontaminanten aufweisen kann, wird die für Matrizenmoleküle verwendete einzelne Nukleinsäure für praktische Zwecke eine im Wesentlichen homogene Sequenz umfassen. Das Vorliegen von verschieden langen Matrizen wird innerhalb der Definition von "einzelne Nukleinsäure" in Betracht gezogen, z. B. können verkürzte oder trunkierte Versionen einer identischen Sequenz vorhanden sein.
Der Begriff "Primer", wie hierin verwendet, bezieht sich auf ein Oligonukleotid, egal, ob natürlich vorkommend, wie in einem gereinigten Restriktionsverdau oder synthetisch hergestellt, welches in der Lage ist, als ein Initiationspunkt der Synthese zu wirken, wenn es unter Bedingungen gebracht wird, bei welchem die Synthese eines Primerverlängerungsproduktes, welches zu einem Nukleinsäurestrang komplementär ist, induziert wird, d. h. in Gegenwart von Nukleotiden und eines Mittels zur Polymerisation, wie DNA-Polymerase, und bei einer geeigneten Temperatur und pH. Der Primer ist vorzugsweise, für eine Maximum-Effizienz bei der Amplifikation, einzelsträngig, kann aber alternativ doppelsträngig sein. Falls doppelsträngig, wird der Primer zuerst behandelt, um seine Stränge zu trennen, bevor er verwendet wird, um Verlängerungsprodukte herzustellen. Vorzugsweise ist der Primer ein Oligodesoxyribonukleotid. Der Primer muss genügend lang sein, um die Synthese von Verlängerungsprodukten in Gegenwart des Mittels zur Polymerisation zu primen. Die exakten Längen der Primer werden von vielen Faktoren abhängen, einschließlich Temperatur und Primer-Quelle. Zum Beispiel enthält, abhängig von der Komplexität der Zielsequenz, der Oligonukleotidprimer typischerweise 15–25 oder mehr Nukleotide, obwohl er weniger oder mehr Nukleotide enthalten kann. Kurze Primermoleküle erfordern im Allgemeinen kühlere Temperaturen, um ausreichend stabile Hybridkomplexe mit Matrize zu bilden. Die Oligonukleotidprimer der Erfindung können unter Anwendung jedes geeigneten Verfahrens hergestellt werden, wie zum Beispiel den obenstehend beschriebenen Phosphotriester- und Phosphodiesterverfahren, oder automatisierten Ausführungsformen davon. In einer solchen automatisierten Ausführungsform werden Diethylphosphoramidite als Ausgangsmaterialien verwendet und können synthetisiert werden, wie beschrieben von Beaucage et al., Tetrahedron Letters (1981), 22: 1859–1862. Ein Verfahren zum Synthetisieren von Oligonukleotiden auf einem modifizierten festen Träger ist beschrieben im U.S.-Patent Nr. 4 458 055. Es ist auch möglich, einen Primer zu verwenden, welcher aus einer biologischen Quelle (wie einem Restriktionsendonuklease-Verdau) isoliert worden ist.
Die Primer hierin werden ausgewählt, um "im Wesentlichen" komplementär zu den verschiedenen Strängen jeder zu amplifizierenden, spezifischen Sequenz zu sein. Dies bedeutet, dass die Primer ausreichend komplementär sein müssen, um mit ihren jeweiligen Strängen zu hybridisieren. Deshalb muss die Primersequenz nicht die exakte Sequenz der Matrize reflektieren. Zum Beispiel kann ein nicht-komplementäres Nukleotidfragment an das 5'-Ende des Primers angeheftet werden, wobei der Rest der Primersequenz komplementär zu dem Strang ist. Typischerweise und vorzugsweise werden, jedoch, die nicht-komplementären Nukleotide in der Mitte des Primers liegen. Somit können nicht-komplementäre Basen oder längere Sequenzen in den Primer eingestreut werden, vorausgesetzt, dass die Primersequenz ausreichend Komplementarität mit der Sequenz des zu amplifizierenden Stranges aufweist, um damit zu hybridisieren und dadurch eine Matrize für die Synthese des Verlängerungsprodukts des anderen Primers zu bilden.
Die Begriffe "mutagener Primer" oder "mutagenes Oligonukleotid" (hierin austauschbar verwendet) beziehen sich beabsichtigtermaßen auf Oligonukleotid-Zusammensetzungen, welche einem Abschnitt der Matrizensequenz entsprechen und welche in der Lage sind, daran zu hybridisieren. Im Hinblick auf mutagene Primer wird der Primer der Matrizennukleinsäure nicht exakt entsprechen, wobei die Fehlpaarung oder Fehlpaarungen in dem Primer verwendet werden, um die gewünschte Mutation in die Nukleinsäurebibliothek einzuführen. Wie hierin verwendet, bezieht sich "nicht-mutagener Primer" oder "nicht-mutagenes Oligonukleotid" auf Oligonukleotid-Zusammensetzungen, welche der Matrizennukleinsäure exakt entsprechen werden. In einer Ausführungsform der Erfindung werden nur mutagene Primer verwendet. In einer anderen bevorzugten Ausführungsform der Erfindung werden die Primer so entworfen, dass für wenigstens eine Region, an welcher ein mutagener Primer eingeschlossen worden ist, auch nicht-mutagener Primer in der Oligonukleotid-Mischung eingeschlossen wird. Durch Zugeben einer Mischung von mutagenen Primern und nicht-mutagenen Primern, entsprechend mindestens einem der mutagenen Primer, ist es möglich, eine resultierende Nukleinsäure-Bibliothek zu erzeugen, in der eine Vielzahl von kombinatorischen Mutationsmustern präsentiert wird. Wenn es beispielsweise gewünscht wird, dass einige der Mitglieder der mutanten Nukleinsäurebibliothek ihre Vorläufersequenz an bestimmten Positionen beibehalten, während andere Mitglieder an solchen Stellen mutant sind, sehen die nicht-mutagenen Primer die Fähigkeit vor, ein spezifisches Niveau von nicht-mutanten Mitgliedern innerhalb der Nukleinsäurebibliothek für einen gegebenen Rest zu erhalten. Die Verfahren der Erfindung verwenden mutagene und nicht-mutagene Oligonukleotide, welche im Allgemeinen zwischen 10–50 Basen lang, weiter bevorzugt etwa 15–45 Basen lang sind. Es kann jedoch notwendig sein, Primer zu verwenden, welche entweder kürzer als 10 Basen oder länger als 50 Basen sind, um das gewünschte Mutagenese-Ergebnis zu erhalten. In Hinsicht auf entsprechende mutagene und nicht-mutagene Primer, ist es nicht notwendig, dass die entsprechenden Oligonukleotide von identischer Länge sind, sondern lediglich, dass es eine Überlappung in der Region gibt, welche der hinzuzufügenden Mutation entspricht.
Primer können in einem vordefinierten Verhältnis gemäß der vorliegenden Erfindung zugesetzt werden. Wenn es zum Beispiel gewünscht wird, dass die resultierende Bibliothek ein signifikantes Niveau an einer bestimmten spezifischen Mutation und einen geringeren Gehalt an einer anderen Mutation an der gleichen oder einer unterschiedlichen Stelle aufweist, ist es, durch Justieren der Menge an zugesetztem Primer, möglich, die gewünschte vorbeeinflusste Bibliothek herzustellen. Alternativ dazu ist es durch Zugeben von geringeren oder größeren Mengen an nicht-mutagenen Primern möglich, die Häufigkeit einzustellen, mit der die entsprechende(n) Mutation(en) in der mutanten Nukleinsäurebibliothek erzeugt werden.
"Benachbarte Mutationen" bedeutet Mutationen, welche innerhalb desselben Oligonukleotid-Primers präsentiert werden. Zum Beispiel können benachbarte Mutationen zueinander angrenzend oder naheliegend sein, jedoch werden sie in die resultierenden mutanten Matrizennukleinsäuren durch denselben Primer eingeführt werden.
"Nicht-benachbarte Mutationen" bedeutet Mutationen, welche in getrennten Oligonukleotid-Primern präsentiert werden. Zum Beispiel werden nicht-benachbarte Mutationen in die resultierenden mutanten Matrizennukleinsäuren durch getrennt hergestellte Oligonukleotid-Primer eingeführt werden.
Die Begriffe "Amplifikation" oder "Amplifizieren" oder grammatikalische Äquivalente davon, wie hierin verwendet, bedeuten die Herstellung von zusätzlichen Kopien einer Nukleinsäuresequenz, und dies wird im Allgemeinen unter Verwendung der Polymerase-Kettenreaktion (PCR) ausgeführt. PCR-Technologien sind im Fachgebiet gut bekannt (siehe z. B. siehe Dieffenbach und Dveksler in "PCR Primer, A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Press, Princeton, N.Y.).
Die Konzentration von mutagenen und entsprechenden nicht-mutagenen Primern ist ein wichtiges Merkmal der Erfindung. Spezifisch gesagt, beinhaltet die Erfindung die Verwendung der mutagenen Oligonukleotide in relativ niedrigen Konzentrationen im Vergleich zu denjenigen, welche in herkömmlichen PCR-Techniken verwendet werden, d. h. bei "einer Konzentration, welche niedriger als der Sättigungsspiegel ist". Mit "Sättigungsspiegel" meinen die Anmelder, dass alle der mutagenen und entsprechenden nicht-mutagenen Primer in limitierenden Mengen im Vergleich zu anderen Reaktionsausgangsprodukten zugesetzt werden. Zum Beispiel wird eine typische PCR-Reaktion in Sambrook, J., E. F. Fritsch und T. Maniatis, Molecular cloning: a laboratory manual, Band 2, S. 14–18 [1989], beschrieben. Die darin beschriebene Reaktion verwendet 0,2 mM jedes dNTP, was zu einer Gesamtkonzentration an dNTPs von 0,8 mM führt. Unter Verwendung dieser Mischung zum Synthetisieren eines Produktes von 1 kb Länge werden 2000 Mol Nukleotide erfordert, um 1 Mol PCR-Produkt zu synthetisieren. Folglich kann eine Reaktionsmischung, enthaltend 0,8 mM dNTPs, eine theoretische Ausbeute von 0,4 μM PCR-Produkt ergeben. In der Praxis wird die Ausbeute wesentlich niedriger sein, weil ein Bruchteil der dNTPs hydrolysiert wird, während die Reaktion und andere Nebenreaktionen Nukleotide aufnehmen. Darüber hinaus limitieren andere Faktoren, wie Pufferkapazität und Enzymaktivität, die Ausbeute einer PCR-Reaktion. In diesem Beispiel verwendet der Autor Primer bei Konzentrationen von 1 μM. Eines von jeden Primermolekülen wird für die Bildung eines Moleküls PCR-Produkt erfordert. Folglich führt diese Konzentration an Primern zu einer theoretischen Ausbeute von 1 μM PCR-Produkt, eine Menge, welche wesentlich höher als die theoretische Ausbeute ist, basierend auf der Konzentration von dNTPs. Somit beinhaltet eine typische PCR-Reaktion die Verwendung von Primern in signifikant größerer Konzentration im Verhältnis zu den verwendeten dNTPs mit einem Ergebnis, dass die Primer während der Reaktion nicht vollständig aufgebraucht werden. Aus diesen Gründen ist es ein wichtiges Merkmal der Erfindung, Primer in relativ niedrigen Konzentrationen zu verwenden, um zu gewährleisten, dass die Primer in der anschließenden PCR-Reaktion aufgebraucht werden. Auf diese Weise werden im Wesentlichen alle der zugegebenen Primer in PCR-Produkte eingebaut, bevor andere Komponenten der Reaktionsmischung limitierend werden.
Die optimale Konzentration der Mischung an Primern im Hinblick auf dNTP- und Matrizen-Konzentrationen wird häufig von den spezifischen Reaktionsbedingungen abhängen, kann aber unter Anwendung von Routineexperimenten bestimmt werden, welche durchaus innerhalb der Fähigkeiten des Durchschnittsfachmanns auf dem Gebiet liegen. Zum Beispiel kann eine solche optimale Konzentration experimentell bestimmt werden durch Ausführen einer Reihe von Parallelreaktionen unter Verwendung verschiedener Konzentrationen der Primermischung. Typischerweise wird die optimale Primerkonzentration in einem solchen Bereich liegen, dass die Produktkonzentration hoch genug ist, um durch ein Agarosegel detektiert zu werden, aber dass das Zusetzen von höheren Konzentrationen von Primermischung zu höheren Konzentrationen an Produkt führt, wodurch festgestellt wird, dass die Primerkonzentration der limitierende Faktor in der Reaktion ist. Es wurde beispielsweise von den Anmeldern hierin erfahren, dass eine Konzentration an dNTPs von 0,2 mM eine Gesamtkonzentration an Primern im Bereich von 0,01 bis 0,2 μM vorschreiben wird, wobei ansonsten standardmäßige PCR-Bedingungen angewandt werden, wie beschrieben in Sambrook et al., siehe oben. Allerdings ist die vorliegende Erfindung nicht auf absolute Konzentrationen begrenzt, und Variationen sind möglich, welche aus den Spezifika der PCR-Reaktionsbedingungen und ihrem Effekt auf die Komponenten-Reagenzien in der Reaktion resultieren. Anstattdessen bedeutet, in der vorliegenden Erfindung, eine "Konzentration, niedriger als Sättigung", dass die Oligonukleotid-Primer, welche zu dem kombinatorischen Mutagenese-Schema beitragen, während der PCR-Reaktion aufgebraucht werden.
Das PCR-Verfahren ist im Fachgebiet gut bekannt und wird beispielsweise beschrieben in den U.S.-Patenten Nr. 4 965 188; 4 683 195; 4 683 195; 5 968 730; 5 066 584 und 4 683 202. Die folgenden Beschreibungen der PCR-Reaktion erfolgen zu Veranschaulichungszwecken, so dass die Anwendung der vorliegenden Erfindung besser verstanden wird, und mit ihnen wird nicht beabsichtigt, bezüglich der Vielfalt an Techniken einschränkend zu sein, welche im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung angewandt werden können. Wie dem Fachmann auf dem Gebiet bekannt, kann das PCR-Verfahren die thermostabile Polymerase verwenden, welche in U.S.-Patent Nr. 4 889 818 beschrieben wird. Im Allgemeinen beinhaltet die vorliegende Erfindung die Anwendung der Polymerase-Kettenreaktion zur Herstellung von mutanten Nukleotidbibliotheken. In der Polymerase-Kettenreaktion, wie verwendet in der vorliegenden Erfindung, wird Reaktionsprodukt in exponentiellen Mengen in Bezug auf die beteiligte Anzahl von Reaktionsschritten hergestellt, in Hinsicht auf mindestens eine spezifische Nukleinsäuresequenz, vorausgesetzt, dass (a) die Enden der erforderlichen Sequenz in hinreichendem Detail bekannt sind, so dass Oligonukleotide synthetisiert werden können, welche an diese hybridisieren werden, und (b) dass wenigstens ausreichend Sequenz, entsprechend den mutagenen Oligonukleotid-Primern, verfügbar ist. Das Produkt der Kettenreaktion wird ein diskreter Nukleinsäuredoppelstrang mit Termini sein, welche den Enden der verwendeten spezifischen Primer entsprechen.
Die spezifische Nukleinsäuresequenz-Bibliothek wird durch Verwendung der Nukleinsäurematrize hergestellt. Wenn die Nukleinsäurematrize zwei Stränge enthält, ist es notwendig, die Stränge der Nukleinsäure zu trennen, bevor sie als die Matrize verwendet werden kann, entweder als einen separaten Schritt oder gleichzeitig mit der Synthese der Primerverlängerungsprodukte. Die Strangtrennung kann durch jedwedes geeignete denaturierende Verfahren bewerkstelligt werden, einschließlich physikalischer, chemischer oder enzymatischer Mittel. Ein physikalisches Verfahren zur Trennung der Stränge der Nukleinsäure beinhaltet das Erwärmen der Nukleinsäure, bis sie vollständig (> 99%) denaturiert ist. Typische Hitzedenaturierung kann eine Temperatur im Bereich von etwa 80°C bis 105°C während Zeitdauern im Bereich von etwa 1 bis 10 Minuten beinhalten. Die Strangtrennung kann auch durch ein Enzym aus der Klasse von Enzymen induziert werden, welche als Helicasen bekannt sind, oder das Enzym RecA, welches Helicase-Aktivität aufweist und bekanntermaßen in Gegenwart von riboATP DNA denaturiert. Die zur Trennung der Stränge von Nukleinsäuren mit Helicasen geeigneten Reaktionsbedingungen werden beschrieben von Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology, Band XLIII "DNA: Replication and Recombination" (New York: Cold Spring Harbor Laboratory, 1978), B. Kuhn et al., "DNA Helicases", S. 63–67, und Techniken zur Verwendung von RecA werden übersichtsmäßig aufgeführt in C. Radding, Ann. Rev. Genetics, 16: 405–37 (1982).
Wenn die ursprüngliche Nukleinsäure, enthaltend die zu mutagenisierende und amplifizierende Sequenz, einzelsträngig ist, wird ihr Komplement durch Zusetzen von einem oder zwei Oligonukleotid-Primern dazu synthetisiert. Wenn ein passender Einzelprimer zugesetzt wird, wird ein Primer-Verlängerungsprodukt in Gegenwart des Primers, eines Mittels zur Polymerisation und der nachstehend beschriebenen vier Nukleotide synthetisiert. Das Produkt wird teilweise komplementär zu der einzelsträngigen Nukleinsäure sein und wird mit dem Nukleinsäurestrang unter Bildung eines Doppelstrangs von ungleich langen Strängen hybridisieren, welche dann in Einzelstränge getrennt werden können, wie obenstehend beschrieben, um zwei einzelne getrennte komplementäre Stränge herzustellen. Alternativ dazu können zwei passende Primer zu der einzelsträngigen Nukleinsäure zugesetzt werden, und die Reaktion kann ausgeführt werden. In der vorliegenden Erfindung wird es bevorzugt, die mutagenen Primer innerhalb eines anderen Satzes von Primern, welche dem Ende der Matrize entsprechen, zu verschachteln. Beispielsweise ist ein Satz von Primern, welche nicht zur Einführung von Mutationen beabsichtigt sind, entworfen, um den 5'- und 3'-Enden der Matrize zu entsprechen, und mutagene Primer oder gemischte mutagene und nicht-mutagene Primer werden entworfen, die komplementär zur Sequenz zwischen den zwei Endprimern sind.
Wenn die ursprüngliche Nukleinsäure die zu amplifizierende Sequenz darstellt, werden die hergestellten Primerverlängerungsprodukt(e) vollständig komplementär zu den Strängen der ursprünglichen Nukleinsäure sein und werden damit hybridisieren unter Bildung eines Doppelstrangs von gleich langen Strängen, die in einzelsträngige Moleküle zu trennen sind.
Wenn die komplementären Stränge der Nukleinsäure oder -säuren getrennt werden, ungeachtet dessen, ob die Nukleinsäure ursprünglich doppel- oder einzelsträngig war, werden die Stränge ohne Weiteres als eine Matrize zur Mutagenese und zur Synthese von zusätzlichen Nukleinsäuresträngen verwendet. Diese Synthese kann unter Verwendung jedweden geeigneten Verfahrens durchgeführt werden. Sie findet im Allgemeinen in einer gepufferten wässrigen Lösung, vorzugsweise bei einem pH-Wert von 7–9, am stärksten bevorzugt etwa 8, statt. Die Primer liegen in einer niedrigeren als Sättigungskonzentration vor.
Die Desoxyribonukleosidtriphosphate dATP, dCTP, dGTP und dTTP werden der Synthesemischung ebenfalls in angemessenen Mengen zugegeben, und die resultierende Lösung wird auf etwa 90°–100°C während etwa 10 Sekunden bis 10 Minuten, vorzugsweise 1 bis 4 Minuten lang, erwärmt. Nach dieser Erwärmungsperiode wird die Lösung auf 20°C–40°C abkühlen gelassen, was für die Primer-Hybridisierung bevorzugt wird. Zu der abgekühlten Mischung wird ein Mittel zur Polymerisation zugegeben, und die Reaktion wird unter im Fachgebiet bekannten Bedingungen stattfinden gelassen. Diese Synthesereaktion kann von Raumtemperatur bis zu einer Temperatur, über welcher das Mittel zur Polymerisation nicht länger effizient funktioniert, stattfinden.
Das Mittel zur Polymerisation kann jedwede(s) Verbindung oder System sein, welche(s) wirksam ist, um die Synthese von Primer-Verlängerungsprodukten zu bewerkstelligen, einschließlich Enzymen. Geeignete Enzyme für diesen Zweck schließen zum Beispiel E. coli-DNA-Polymerase I, Klenow-Fragment von E. coli-DNA-Polymerase I, T4-DNA-Polymerase, andere verfügbare DNA-Polymerasen, reverse Transkriptase und andere Enzyme ein, einschließlich wärmestabiler Enzyme, welche die Kombination der Nukleotide in der korrekten Weise zur Bildung der Primer-Verlängerungsprodukte erleichtern werden, welche komplementär zu jedem Nukleinsäurestrang sind. Im Allgemeinen wird die Synthese am 3'-Ende jedes Primers initiiert und in der 5'-Richtung entlang des Matrizenstranges voranschreiten, bis die Synthese endigt, wodurch Moleküle von unterschiedlichen Längen hergestellt werden. Es können jedoch Mittel vorliegen, welche die Synthese am 5'-Ende initiieren und in der anderen Richtung voranschreiten, wobei dasselbe Verfahren, wie obenstehend beschrieben, angewandt wird.
Der neu synthetisierte Strang und sein komplementärer Nukleinsäurestrang bilden ein doppelsträngiges Molekül, welches in den nachfolgenden Schritten des Verfahrens verwendet wird. Im nächsten Schritt werden die Stränge des doppelsträngigen Moleküls unter Anwendung einer beliebigen der obenstehend beschriebenen Verfahrensweisen getrennt, um einzelsträngige Moleküle bereitzustellen.
Die Schritte der Strangtrennung und Verlängerungsproduktsynthese können so oft wie nötig wiederholt werden, um die gewünschte Menge der spezifischen Nukleinsäuresequenz herzustellen. Wie nachstehend in größerer Ausführlichkeit beschrieben wird, wird die Menge der hergestellten spezifischen Nukleinsäuresequenz sich in einer exponentiellen Weise akkumulieren.
PCR, wie verwendet in der vorliegenden Erfindung, kann in einer stufenartigen Weise durchgeführt werden, wobei nach jedem Schritt neue Reagenzien zugesetzt werden, oder simultan, wobei alle Reagenzien am anfänglichen Schritt zugegeben werden, oder teilweise stufenweise und teilweise simultan, wobei frisches Reagenz nach einer gegebenen Zahl von Schritten zugegeben wird. Wenn ein Verfahren zur Strangtrennung, wie Hitze, angewandt wird, welches das Mittel zur Polymerisation inaktivieren wird, wie im Falle eines hitzelabilen Enzyms, dann ist es notwendig, dass Mittel zur Polymerisation nach jedem Strangtrennungsschritt wieder nachzufüllen. Das simultane Verfahren kann eingesetzt werden, wenn eine Anzahl an gereinigten Komponenten, einschließlich eines enzymatischen Mittels, wie Helicase, für den Strangtrennungsschritt verwendet wird. In der simultanen Verfahrensweise kann die Reaktionsmischung, zusätzlich zu den Nukleinsäuresträng(en), enthaltend die gewünschte Sequenz, das strangtrennende Enzym (z. B. Helicase), eine angemessene Energiequelle für das strangtrennende Enzym, wie rATP, die vier Nukleotide, die Oligonukleotid-Primer in molarem Überschuss und das induzierende Mittel, z. B. Klenow-Fragment von E. coli-DNA-Polymerase I, enthalten. Wenn Hitze für die Denaturierung in einem simultanen Verfahren verwendet wird, kann ein hitzestabiles induzierendes Mittel, wie eine thermostabile Polymerase, verwendet werden, welche bei einer erhöhten Temperatur, vorzugsweise 65°C–90°C, abhängig vom induzierenden Mittel, arbeitet, bei welcher Temperatur die Nukleinsäure aus Einzel- und Doppelsträngen im Gleichgewicht bestehen wird. Für kleinere Längen an Nukleinsäure können niedrigere Temperaturen von etwa 50°C verwendet werden. Die obere Temperatur wird von der Temperatur, bei welcher das Enzym zerfallen wird, oder der Temperatur, über welcher ein ungenügender Spiegel an Primerhybridisierung auftreten wird, abhängen. Ein derartiges hitzestabiles Enzym wird z. B. von A. S. Kaledin, et al., Biokhimiya, 45, 644–651 (1980), beschrieben. Jeder Schritt des Verfahrens wird sequenziell stattfinden, ungeachtet des anfänglichen Vorliegens aller Reagenzien. Zusätzliche Materialien können nach Bedarf zugegeben werden. Nachdem die passende Zeitdauer verstrichen ist, um die gewünschte Menge der spezifischen Nukleinsäuresequenz herzustellen, kann die Reaktion durch Inaktivieren der Enzyme in einer beliebigen bekannten Weise oder Trennen der Komponenten der Reaktion angehalten werden.
Die exponentielle Natur der PCR-Reaktion wird wie folgend demonstriert. Doppelsträngige DNA, welche die gewünschte Sequenz enthält, ist aus komplementären Strängen aufgebaut und wird als die Nukleinsäure verwendet. Während des ersten und jedem nachfolgenden Reaktionszyklus wird die Verlängerung jedes Oligonukleotid-Primers auf der Ursprungsmatrize ein neues ssDNA-Molekülprodukt von unbestimmter Länge herstellen, welches mit nur einem der Primer aufhört. Diese Produkte, hierin nachstehend bezeichnet als "lange Produkte" oder "Mega-Primer", werden in einer linearen Weise angesammelt; d. h. die Menge, welche nach einer beliebigen Zahl an Zyklen vorhanden ist, wird proportional zu der Zahl an Zyklen sein.
Die so hergestellten langen Produkte werden als Matrizen für einen oder den anderen der Oligonukleotid-Primer während anschließender Zyklen wirken und werden Moleküle der gewünschten Sequenz erzeugen. Diese Moleküle werden ebenfalls als Matrizen für einen oder den anderen der Oligonukleotid-Primer fungieren, wodurch weiteres gewünschtes Produkt hergestellt wird, und somit kann eine Kettenreaktion aufrechterhalten werden, welche zur Ansammlung von gewünschtem Produkt bei einer exponentiellen Rate relativ zur Anzahl von Zyklen führen wird.
Durch Oligonukleotid-Hybridisierungen gebildete Nebenprodukte, welche anders sind als diejenigen, welche beabsichtigt werden, sind nicht selbst-katalytisch (außer in seltenen Fällen) und akkumulieren sich somit bei einer linearen Rate.
Die Schritte dieses Verfahrens können unendlich wiederholt werden, wobei sie lediglich von der Menge an Primern, dem Mittel zur Polymerisation (Polymerase) und den vorhandenen Nukleotiden begrenzt werden. Die Menge an Original-Nukleinsäure bleibt im gesamten Verfahren konstant, weil sie nicht repliziert wird. Die Menge der langen Produkte steigt linear, weil sie lediglich von der Original-Nukleinsäure hergestellt werden. Die Menge der spezifischen Sequenz steigt exponentiell. Somit wird die spezifische Sequenz die vorherrschende Spezies werden. Dies wird in der folgenden Tabelle veranschaulicht, welche die relativen Mengen der theoretisch nach n Zyklen vorhandenen Spezies anzeigt, wobei eine 100%ige Effizienz bei jedem Zyklus angenommen wird:
Tabelle 1 Anzahl von Strängen nach 0–n Zyklen
Wenn eine einzelsträngige Nukleinsäure als die Matrize verwendet wird, wird nur ein langes Produkt pro Zyklus gebildet.
Die hierin beschriebene Erfindung erfordert, dass die PCR-Reaktion mit mehreren Primern voranschreitet. Dies gestattet, dass viele Reaktionen parallel stattfinden. Während die Reaktion für jeden der vielen Primer andauert, gibt es gewisse Faktoren, welche eine Vorbeeinflussung in Richtung auf eine oder mehrere der Primer-initiierten Reaktionen im Vergleich zu anderen Primer-initiierten Reaktionen verursachen. Zum Beispiel werden die Konzentration der verschiedenen Oligonukleotid-Primer, die Effizienz und spezifische Kinetik von Hybridisierung zwischen einem Oligonukleotid-Primer gegenüber einem anderen Oligonukleotid-Primer, die Konzentration an freiem Nukleotid und/oder Polymerase und die Reaktionsbedingungen alle das Ausmaß bewirken, zu welchem gewisse Oligonukleotid-Primer in der PCR-Reaktion gegenüber anderen bevorzugt werden. Als ein Beispiel werden Reaktionen unter Beteiligung von relativ kurzen und hoch-komplementären Oligonukleotid-Primern, im Gegensatz zu Mega-Primer- oder Langes-Produkt-Reaktionen unter Beteiligung von relativ längeren und weniger komplementären Oligonukleotid-Primern, begünstigt. Darüber hinaus werden Reaktionen, welche zu der Bildung von relativ kurzen Sequenzen führen werden, im Allgemeinen gegenüber Reaktionen begünstigt, welche zu der Bildung von längeren Produkten führen. Die Größenordnung der begünstigten Reaktion wird signifikant durch die Tatsache erhöht, dass PCR, während der Anfangszyklen, zu einer exponentiellen Amplifikation von Reaktionsprodukten führt. Wenn ein besonderes Paar von Primern messbar eine größere Effizienz in Hinsicht auf die Reaktionskinetik aufweist, wird die Amplifikation dieses Primerpaars gegenüber anderen Paaren an Primern in der Mischung rasch in der Reaktionsmischung dominieren. Als ein Ergebnis kann die exponentielle Amplifikation sogar kleiner Unterschiede in der Reaktionsrate zu dramatisch unterschiedlichen Produktverhältnissen führen. Im Kontext der Herstellung von kombinatorischen Bibliotheken forcieren die resultierenden Produktverhältnis-Diskrepanzen eine Reaktionsprodukt-Vorbeeinflussung bzw. -Neigung, welche zu einem Versagen führen wird, eine repräsentative Bibliothek von Nukleotidmatrizen-Mutanten zu entwickeln.
Die Bildung von Sequenzen, welche interne Primersequenzen enthalten, wie Sequenzen 9–12 in 1, erfordert ein Annealing zwischen Intermediatprodukten (langes Produkt oder Megaprimer), welche während früherer Zyklen der Reaktion gebildet wurden. Ein Beispiel ist die Bildung von Sequenz 9 in der 1, welche das Annealing zwischen Sequenz 7 und Sequenz 5 erfordert. Reaktionen unter Beteiligung von Megaprimern (d. h. langen Produkten) können nur während der letztgenannten Zyklen der Reaktion auftreten, und man würde erwarten, dass ihre Produkte in der Endproduktmischung selten sind. Im Gegensatz dazu zeigt die 2 PCR-Produkte, welche gebildet werden können, wenn es, anstelle von Mega-Priming, eine besondere Kombination an Primern ist, die die erhaltenen Reaktionsprodukte steuert.
In dem Verfahren der Erfindung werden relativ niedrige Konzentrationen an Oligonukleotid-Primern im Vergleich zu Standard-PCR-Techniken verwendet. Wenn ein jeweiliger Primer sehr effizient während der frühen Zyklen der PCR reagieren kann, dann wird er rasch aus der Reaktionsmischung entleert. Als ein Ergebnis werden Reaktionen, welche Primer mit günstigem Reaktionskinetiken beteiligen, sich während der letztgenannten Zyklen der Reaktion verlangsamen. Als eine Konsequenz werden andere Reaktionen, welche weniger effiziente Reaktionskinetiken oder Megaprimer beteiligen, während der letzteren Zyklen der PCR dominieren. Somit führt die Verwendung von Primern in relativ geringen Konzentrationen zu einer relativ gleichmäßigen Verteilung von Mutationen in der resultierenden Bibliothek und begünstigt die Bildung von langen Sequenzen, welche mehr als zwei Oligo-abgeleitete Mutationen enthalten.
Während einer PCR-Reaktion verändern sich die Bedingungen fortwährend, was letztendlich zu einem Stopp der DNA-Amplifikation führt. Zum Beispiel werden Trinukleotide und Primer aufgebraucht, der pH-Wert kann sich ändern, oder die DNA-Polymerase kann Aktivität verlieren. Für die vorliegende Erfindung ist es wichtig, dass die zugegebenen mutagenen und nicht-mutagenen Oligonukleotide im Wesentlichen aufgezehrt sind, bevor andere Reaktionsparameter den Fortschritt der DNA-Amplifikation terminieren. Daher müssen die Oligonukleotid-Primer bei weniger als einer Sättigungskonzentration zugegeben werden.
Bedingungen, welche gestatten, dass ein Primer auf einer Matrize verlängert wird, schließen im Allgemeinen einen Polymerase, Nukleotide und einen geeigneten Puffer ein. Polymerasen zur Verwendung in PCR können entweder thermostabile oder nicht-stabile Polymeraseenzyme sein. Vorzugsweise ist die verwendete Polymerase eine thermostabile Polymerase, wie die pfu-DNA- Polymerase (Stratagene), die Taq-Polymerase, Phage-T7-Polymerase, Phage-T4-Polymerase, DNA-Polymerase I und andere bekannte Polymerasen, die im Fachgebiet bekannt sind, welche nützlich bei der Primer-Verlängerung sind. Wenn das DNA-Molekül zur Mutagenese relativ lang ist, wie ganze Operons oder große Gene, ist es nützlich, eine Mischung von thermostabilen DNA-Polymerasen zu verwenden, worin eine der DNA-Polymerasen 5'-3'-Exonuklease-Aktivität besitzt, und der anderen DNA-Polymerase 5'-3'-Exonuklease-Aktivität fehlt. Eine Beschreibung, wie man lange Regionen von DNA unter Verwendung dieser Polymerase-Mischungen amplifiziert, kann, neben anderen Stellen, im U.S.-Patent Nr. 5 436 149 gefunden werden.
Somit wird, in einer Ausführungsform, mindestens ein Matrizenfragment mit einer Vielzahl von Primern unter zur Verlängerung der Primer geeigneten Bedingungen umgesetzt, wobei die Vielzahl an Primern Wildtyp- und mutagene Primer umfassen, wobei mindestens einer der Wildtyp-Primer einem mutagenem Primer in Hinsicht auf den Ort der Hybridisierung auf der Nukleinsäurematrize entspricht. Vorzugsweise wird der(die) Verlängerungs-Zyklus oder -Runde mindestens 2-mal, weiter bevorzugt bis zu 5-mal, weiter bevorzugt bis zu 10-mal und am stärksten bevorzugt bis zu 100-mal oder mehr wiederholt. Die Zyklen des Zusammenlagerns, des Denaturierens und erneuten Zusammenlagerns werden während einer hinreichenden Dauer reiteriert, um ein Volllängen-Gen zu erzeugen.
In einer Ausführungsform behalten Proteinprodukte, kodiert von Nukleinsäuren in der Bibliothek, die gemäß der Erfindung erzeugt wurde, ihre Funktion wie in dem Wildtypprotein, wie katalytische Aktivität, aber besitzen eine veränderte Eigenschaft in Hinsicht auf irgendein gewünschtes Merkmal. Im Allgemeinen sind die Verfahren der Erfindung nützlich für die Erzeugung von neuen mutanten Nukleinsäurebibliotheken. Die mutanten Nukleinsäuren können nützliche Proteine kodieren, wie neue Rezeptoren, Liganden, Antikörper und Enzyme. Diese mutanten Nukleinsäuren können auch untranslatierte Regionen von Genen, und translatierte Regionen von Genen, Introns, Exons, Promotor-Regionen, Enhancer-Regionen, Terminator-Regionen, Erkennungssequenzen und andere regulatorische Sequenzen für Gen-Expression umfassen.
Somit ermöglichen die Verfahren der Erfindung die Bildung von mutanten Nukleinsäuren im Bereich von 50–100 bp bis zu mehreren Mbp. Die mutante Nukleinsäurebibliothek der Erfindung kann in einen Vektor kloniert, propagiert und hinsichtlich einer Spezies oder ersten Subpopulation mit einer gewünschten Eigenschaft gescreent werden. Dies führt zur Identifizierung und Isolierung, oder Anreicherung, von mutanten Nukleinsäuren, welche Polypeptide kodieren, die eine gewünschte Eigenschaft erworben haben.
Die mutanten Nukleinsäuren aus der Bibliothek können ferner Assays unterzogen werden, welche hinsichtlich gewünschter Merkmale in der Nukleinsäure oder in einem von der Nukleinsäure kodierten Polypeptid screenen. Darüber hinaus kann die mutante Nukleinsäure in einen Vektor zu einem beliebigen Zeitpunkt nach der Erzeugung der mutanten Matrizennukleinsäure-Bibliothek kloniert werden. Wie obenstehend umrissen, sieht die Erfindung mutante Nukleinsäure-Bibliotheken vor, wobei die Nukleinsäuren Polypeptide kodieren. Die Bibliothek von mutanten Nukleinsäuren wird mindestens ein Polypeptid kodieren, welches mindestens eine Eigenschaft aufweist, die unterschiedlich von der gleichen Eigenschaft der entsprechenden Sequenz oder des entsprechenden natürlich vorkommenden Polypeptids ist. Auf die hierin beschriebenen Eigenschaften kann man auch als biologische Aktivitäten Bezug nehmen.
Der Ausdruck "Eigenschaft" oder grammatikalische Äquivalente davon im Kontext einer Nukleinsäure, wie hierin verwendet, beziehen sich auf ein beliebiges Charakteristikum oder Merkmal einer Nukleinsäure, welches selektiert oder detektiert werden kann. Diese Eigenschaften schließen, ohne jedoch darauf eingeschränkt zu sein, eine Eigenschaft, welche die Bindung an ein Polypeptid beeinflusst, eine Eigenschaft, welche auf eine Zelle vermittelt wird, die eine jeweilige Nukleinsäure umfasst, eine Eigenschaft, welche Gen-Transkription beeinflusst (z. B. Promotorstärke, Promotorerkennung, Promotorregulierung, Enhancer-Funktion), eine Eigenschaft, welche RNA-Prozessierung beeinflusst (z. B. RNA-Splicing, RNA-Stabilität, RNA-Konformation und posttranskriptionale Modifikation), eine Eigenschaft, welche Translation beeinflusst (z. B. Spiegel, Regulierung, Bindung von mRNA an ribosomale Proteine, posttranslationale Modifikation), ein. Zum Beispiel kann eine Bindungsstelle für einen Transkriptionsfaktor, Polymerase, regulatorischen Faktor etc. von einer Nukleinsäure verändert werden, um gewünschte Merkmale zu erzeugen oder unerwünschte Merkmale zu identifizieren.
Der Ausdruck "Eigenschaft" oder grammatikalische Äquivalente davon im Kontext eines Polypeptids, wie hierin verwendet, beziehen sich auf ein beliebiges Charakteristikum oder Merkmal eines Polypeptids, welches selektiert oder detektiert werden kann. Diese Eigenschaften schließen, ohne jedoch darauf eingeschränkt zu sein, oxidative Stabilität, Substratspezifität, katalytische Aktivität, Wärmestabilität, alkalische Stabilität, pH-Aktivitätsprofil, Beständigkeit gegenüber proteolytischem Abbau, Km, kcat, Kcat/km-Verhältnis, Proteinfaltung, Induzieren einer Immunantwort, Fähigkeit zur Bindung an einen Liganden, Fähigkeit zur Bindung an einen Rezeptor, Fähigkeit, sezerniert zu werden, Fähigkeit, auf der Oberfläche einer Zelle präsentiert zu werden, Fähigkeit zur Oligomerisierung, Fähigkeit zum Signalisieren, Fähigkeit zum Stimulieren von Zellproliferation, Fähigkeit zum Inhibieren von Zellproliferation, Fähigkeit zum Induzieren von Apoptose, Fähigkeit, durch Phosphorylierung oder Glycosylierung modifiziert zu werden, Fähigkeit zur Behandlung von Krankheit, ein.
Wie hierin verwendet, besitzt der Ausdruck "Screening" seine übliche Bedeutung im Fachgebiet und ist im Allgemeinen ein mehrstufiges Verfahren. Im ersten Schritt wird eine mutante Nukleinsäure oder ein variantes Polypeptid davon vorgesehen. Im zweiten Schritt wird eine Eigenschaft der mutanten Nukleinsäure oder des Varianten-Polypeptids bestimmt. Im dritten Schritt wird die bestimmte Eigenschaft mit einer Eigenschaft der entsprechenden Vorläufer-Nukleinsäure, mit der Eigenschaft des entsprechenden natürlich vorkommenden Polypeptids oder mit der Eigenschaft des Ausgangsmaterials (z. B. der anfänglichen Sequenz) für die Erzeugung der mutanten Nukleinsäure verglichen.
Dem Fachmann auf dem Gebiet wird es offensichtlich sein, dass das Screening-Vorgehen zum Erhalten einer Nukleinsäure oder eines Proteins mit einer veränderten Eigenschaft von der Eigenschaft des Ausgangsmaterials abhängt, dessen Modifikation durch die Erzeugung der mutanten Nukleinsäure beabsichtigerweise erleichtert wird. Der Fachmann wird es deshalb richtig einschätzen, dass die Erfindung nicht auf irgendeine spezifische Eigenschaft, nach welcher gescreent werden soll, beschränkt ist, und dass die folgende Beschreibung von Eigenschaften lediglich veranschaulichende Beispiele aufführt. Verfahren zum Screening hinsichtlich einer beliebigen besonderen Eigenschaft sind im Allgemeinen im Fachgebiet beschrieben. Zum Beispiel kann man Bindung, pH, Spezifität etc. vor und nach Mutation messen, wobei eine Änderung auf eine Abwandlung hinweist. Vorzugsweise werden die Screens in einer Hochdurchsatz-Art durchgeführt, wobei das gleichzeitige Screenen mehrerer Proben eingeschlossen ist, einschließlich, ohne aber darauf eingeschränkt zu sein, Assays unter Verwendung von Chips, Phagen-Display und mehreren Substraten und/oder Indikatoren.
Eine Änderung in der Substratspezifität wird als ein Unterschied zwischen dem kcat/Km-Verhältnis des Vorläuferproteins und demjenigen der Variante davon definiert. Das kcat/Km-Verhältnis ist im Allgemeinen ein Maß von katalytischer Effizienz. Im Allgemeinen wird das Ziel darin bestehen, Varianten von Vorläuferproteinen mit größerem (numerisch großem) kcat/Km-Verhältnis für ein gegebenes Substrat im Vergleich zu jenem des natürlich vorkommenden Proteins zu erzeugen, wodurch die Verwendung des Proteins zur wirkungsvolleren Einwirkung auf ein Zielsubstrat ermöglicht wird. Es kann jedoch wünschenswert sein, die Effizienz zu verringern. Eine Erhöhung im kcat/Km-Verhältnis für ein Substrat kann von einer Reduktion im kcat/Km-Verhältnis für ein anderes Substrat begleitet werden. Dies ist eine Verschiebung in der Substratspezifität, und Varianten von natürlich vorkommenden Proteinen, welche solche Verschiebungen aufzeigen, besitzen Nützlichkeit, falls das natürlich vorkommende Protein unerwünscht ist, z. B. zur Verhinderung einer unerwünschten Hydrolyse eines besonderen Substrates in einer Mischung von Substraten. Km und kcat werden gemäß bekannten Verfahrensweisen gemessen.
Eine Änderung in der oxidativen Stabilität wird durch eine mindestens etwa 10%ige oder 20%ige, weiter bevorzugt mindestens 50%ige Erhöhung der Enzymaktivität bei Exposition an verschiedene oxidierende Bedingungen verdeutlicht. Derartige oxidierende Bedingungen schließen, ohne jedoch darauf eingeschränkt zu sein, Exposition des Proteins an das organische Oxidationsmittel Diperdodecansäure (DPDA) ein. Die oxidative Stabilität wird durch bekannte Vorgehensweisen gemessen.
Eine Veränderung in der alkalischen Stabilität wird durch eine mindestens etwa 5%ige oder größere Erhöhung oder Verringerung (vorzugsweise Erhöhung) in der Halbwertszeit der enzymatischen Aktivität einer Variante eines natürlich vorkommenden Proteins im Vergleich zu jener des natürlich vorkommenden Proteins verdeutlicht. Im Falle z. B. von Subtilisinen kann alkalische Stabilität als eine Funktion von autoproteolytischem Abbau von Subtilisin bei alkalischem pH, z. B. 0,1 M Natriumphosphat, pH 12, bei 25°C oder 30°C, gemessen werden. Im Allgemeinen wird alkalische Stabilität durch bekannte Vorgehensweisen gemessen.
Eine Änderung in der Wärmestabilität wird durch eine mindestens etwa 5%ige oder größere Erhöhung oder Verringerung (vorzugsweise Erhöhung) in der Halbwertszeit der katalytischen Aktivität einer Variante von natürlich vorkommenden Protein bei Exposition an eine relativ hohe Temperatur und neutralen pH, im Vergleich zu derjenigen des natürlich vorkommenden Proteins, verdeutlicht. Im Falle z. B. von Subtilisinen kann die Wärmestabilität gemessen werden als eine Funktion von autoproteolytischem Abbau von Subtilisin bei erhöhten Temperaturen und neutralem pH, z. B. 2 mM Calciumchlorid, 50 mM MOPS, pH 7,0, bei 59°C. Im Allgemeinen wird Wärmestabilität durch bekannte Vorgehensweisen gemessen.
Rezeptorvarianten werden beispielsweise experimentell in in vivo- und in in vitro-Assays getestet und überprüft. Geeignete Assays schließen, ohne jedoch darauf eingeschränkt zu sein, z. B. Untersuchung ihrer Bindungsaffinität an natürliche Liganden und an Hochaffinitätsagonisten und/oder -antagonisten ein. Zusätzlich zu zellfreien biochemischen Affinitätstests werden quantitative Vergleiche angestellt, wobei kinetische und Gleichgewichts-Bindungskonstanten für den natürlichen Liganden an den natürlich vorkommenden Rezeptor und an die Rezeptorvarianten verglichen werden. Die kinetische Assoziationsrate (K_on) und Dissoziationsrate (K_off) und die Gleichgewichtsbindungskonstanten (K_d) können unter Anwendung von Oberflächen-Plasmon-Resonanz auf einem BIAcore-Instrument unter Befolgung der Standardvorgehensweise in der Literatur [Pearce et al., Biochemistry 38: 81–89 (1999)] bestimmt werden. Für die meisten hierin beschriebenen Rezeptoren ist die Bindungskonstante zwischen einem natürlichen Liganden und seinem entsprechenden natürlich vorkommenden Rezeptor in der Literatur gut dokumentiert. Vergleiche mit den entsprechenden natürlich vorkommenden Rezeptoren werden angestellt, um die Empfindlichkeit und die Spezifität der Rezeptorvarianten auszuwerten. Es wird erwartet, dass Bindungsaffinität an natürliche Liganden und Agonisten vorzugsweise relativ zum natürlich vorkommenden Rezeptor ansteigt, wohingegen Antagonisten-Affinität abnehmen sollte. Rezeptorvarianten mit höherer Affinität zu Antagonisten im Verhältnis zu den nicht natürlich vorkommenden Rezeptoren können ebenfalls durch die Verfahren der Erfindung erzeugt werden.
In ähnlicher Weise werden Ligandenvarianten zum Beispiel experimentell in in vivo- und in in vitro-Assays getestet und überprüft. Geeignete Assays schließen, ohne jedoch darauf eingeschränkt zu sein, z. B. Untersuchung ihrer Bindungsaffinität an natürliche Rezeptoren und an Hochaffinitätsagonisten und/oder -antagonisten ein. Zusätzlich zu zellfreien biochemischen Affinitätstests, werden quantitative Vergleiche unter Vergleich von kinetischen und Gleichgewichtsbindungskonstanten für den natürlichen Rezeptor an den natürlich vorkommenden Liganden und an den Ligandenvarianten angestellt. Die kinetische Assoziationsrate (K_on) und Dissoziationsrate (K_off) und die Gleichgewichtsbindungskonstanten (K_d) können unter Verwendung von Oberflächen-Plasmon-Resonanz auf einem BIAcore-Instrument unter Befolgung der Standardvorgehensweise in der Literatur [Pearce et al., Biochemistry 38: 81–89 (1999)] bestimmt werden. Für die meisten hierin beschriebenen Liganden ist die Bindungskonstante zwischen einem natürlichen Rezeptor und seinem entsprechenden natürlich vorkommenden Liganden in der Literatur gut dokumentiert. Vergleiche mit den entsprechenden natürlich vorkommenden Liganden werden vorgenommen, um die Empfindlichkeit und Spezifität der Ligandenvarianten auszuwerten. Es wird erwartet, dass Bindungsaffinität an natürliche Rezeptoren und Agonisten vorzugsweise im Verhältnis zu dem natürlich vorkommenden Liganden ansteigt, wohingegen Antagonisten-Affinität abnehmen sollte. Ligandenvarianten mit höherer Affinität zu Antagonisten relativ zu den nicht natürlich vorkommenden Liganden können ebenfalls durch die Verfahren der Erfindung hergestellt werden.
Mit "Protein" werden hierin wenigstens zwei kovalent verknüpfte Aminosäuren gemeint, welche Proteine, Polypeptide, Oligopeptide und Peptide einschließen können. Das Protein kann ein natürlich vorkommendes Protein, eine Variante eines natürlich vorkommenden Proteins oder ein synthetisches Protein sein. Das Protein kann aus natürlich vorkommenden Aminosäuren und Peptidbindungen oder synthetischen peptidomimetischen Strukturen, im Allgemeinen abhängig von dem Verfahren zur Synthese, aufgebaut sein. So bedeutet "Aminosäure", in einer Ausführungsform, sowohl natürlich vorkommende als auch synthetische Aminosäuren. Zum Beispiel werden Homophenylalanin, Citrullin und Norleucin für die Zwecke der Erfindung als Aminosäuren betrachtet. "Aminosäure" beinhaltet auch Iminosäurereste, wie Prolin und Hydroxyprolin. Die Seitenketten können entweder in der (R)- oder (S)-Konfiguration vorliegen. In der bevorzugten Ausführungsform sind die Aminosäuren in der (S)- oder L-Konfiguration. Stereoisomere der zwanzig herkömmlichen Aminosäuren, unnatürliche Aminosäuren, wie α,α-disubstituierte Aminosäuren, N-Alkylaminosäuren, Milchsäure und andere unkonventionelle Aminosäuren können ebenfalls geeignete Komponenten für Proteine der vorliegenden Erfindung sein. Beispiele von unkonventionellen Aminosäuren, schließen, ohne aber darauf eingeschränkt zu sein, Folgende ein: 4-Hydroxyprolin, γ-Carboxyglutamat, ε-N,N,N-Trimethyllysin, ε-N- Acetyllysin, O-Phosphoserin, N-Acetylserin, N-Formylmethionin, 3-Methylhistidin, 5-Hydroxylysin, ω-N-Methylarginin und andere ähnliche Aminosäuren und Iminosäuren. Wenn nicht natürlich vorkommende Seitenketten verwendet werden, können Nicht-Aminosäure-Substituenten eingesetzt werden, beispielsweise zur Verhinderung oder Verlangsamung von in vivo-Abbauereignissen. Proteine, welche nicht natürlich vorkommende Aminosäuren einschließen, können synthetisiert, oder, in einigen Fällen, durch rekombinante Verfahren hergestellt werden; siehe van Hest, et al., FEBS Lett. 428: (1–2) 68–70 (1998); und Tang et al., Abstr. Pap. Am. Chem. S218: U138-U138 Teil 2 (1999). Eingeschlossen innerhalb dieser Definition sind Proteine, deren Aminosäuresequenz um eine oder mehrere Aminosäuren verändert ist, wenn mit der Sequenz eines natürlich vorkommenden oder Vorläufer-Proteins verglichen wird.
Ein "Varianten-Protein", wie hierin verwendet, bedeutet ein Protein, welches von einem Vorläuferprotein abgewandelt ist. Im Kontext der vorliegenden Erfindung bedeutet dies, dass die Nukleinsäurematrize, vermittels der Anwendung der vorliegend beschriebenen Erfindung, auf eine solche Weise modifiziert wird, dass das dadurch exprimierte Protein in Bezug auf die Sequenz verändert wird. Durch Anwenden der vorliegenden Erfindung wird daher eine Bibliothek von mutanten Nukleinsäuren aus den Matrizennukleinsäure(n) entwickelt, und diese Bibliothek wird anschließend kloniert und hinsichtlich exprimierter Proteinaktivitäten gescreent, um nützliche Variantenproteine zu detektieren. Im Allgemeinen bedeutet dies, dass das Protein modifizierte Eigenschaften in einer beliebigen Weise besitzt.
Die Nukleinsäuren können aus irgendeiner Anzahl von eukaryotischen oder prokaryotischen Organismen oder aus Archaebakterien sein. Nukleinsäuren aus Säugetieren schließen, ohne jedoch darauf eingeschränkt zu sein, Nagetiere (Ratten, Mäuse, Hamster, Meerschweinchen etc.), Primaten, Landwirtschafts-Tiere (einschließlich Schafe, Ziegen, Schweine, Kühe, Pferde etc.) und Menschen ein. Andere geeignete Beispiele von eukaryotischen Organismen schließen Pflanzenzellen, wie Mais, Reis, Weisen, Baumwolle, Sojabohnen, Zuckerrohr, Tabak und Arabidopsis; Fisch, Algen, Hefe, wie Saccharomyces cerevisiae; Aspergillus, Trichoderma, Penicillium, Fusarium und andere filamentöse Pilze; und Gewebekulturzellen von Vogel- oder Säuger-Quellen ein. Ebenfalls bevorzugt werden Nukleinsäuren aus prokaryotischen Organismen. Geeignete Beispiele von prokaryotischen Organismen schließen gramnegative Organismen und grampositive Organismen ein. Spezifisch eingeschlossen sind Enterobacteriaciae, Bacteria, Pseudomonas, Micrococcus, Corynebacteria, Bacillus, Lactobacilli, Streptomyces und Agrobacterium. Polynukleotide, welche Proteine und Enzyme codieren, die aus extremophilen Organismen isoliert wurden, einschließlich, ohne aber darauf eingeschränkt zu sein, Hyperthermophilen, Psychrophilen, Psychrotrophen, Halophilen, Barophilen und Acidophilen, sind nützliche Quellen von Nukleinsäuren. Solche Enzyme können bei Temperaturen über 100°C in terrestrischen heißen Quellen und Tiefsee-Wärmeschlöten, bei Temperaturen unter 0°C in arktischen Gewässern, in der gesättigten Salzumgebung des Toten Meeres, bei pH-Werten um ungefähr 0 in Kohlelagerstätten und geothermischen schwefelreichen Quellen oder bei größeren pH-Werten als 11 in Klärschlamm funktionieren.
Die Proteine können intrazelluläre Proteine, extrazelluläre Proteine, sezernierte Proteine, Enzyme, Liganden, Rezeptoren, Antikörper oder Abschnitte davon sein.
Die Matrizennukleinsäure kann die Gesamtheit oder einen Teil eines Enzyms kodieren. Mit "Enzym" wird hierin ein beliebiges einer Gruppe von Proteinen gemeint, welches eine chemische Reaktion katalysiert. Enzyme schließen, ohne aber darauf eingeschränkt zu sein (i) Oxidoreduktasen; (ii) Transferasen, umfassend Transferase, welche Ein-Kohlenstoff-Gruppen transferiert (z. B. Methyltransferasen, Hydroxymethyl-, Formyl- und verwandte Transferasen, Carboxyl- und Carbamoyltransferasen, Amidinotransferasen), Transferasen, welche aldehydische oder ketonische Reste transferieren, Acyltransferasen (z. B. Acyltransferasen, Aminoacyltransferasen), Glycosyltransferasen (z. B. Hexosyltransferasen, Pentosyltransferasen), Transferasen, welche Alkyl- oder verwandte Gruppen transferieren, Transferasen, welche stickstoffhaltige Gruppen transferieren (z. B. Aminotransferasen, Oximinotransferasen), Transferasen, welche phosphorhaltige Gruppen transferieren (z. B. Phosphotransferasen, Pyrophosphotransferasen, Nukleotidyltransferasen), Transferasen, welche schwefelhaltige Gruppen transferieren (z. B. Schwefeltransferasen, Sulfotransferasen, CoA-Transferasen), (iii) Hydrolasen, umfassend Hydrolasen, die auf Esterbindungen einwirken (z. B. Carbonsäureesterhydrolasen, Thioesterhydrolasen, Phosphorsäuremonoesterhydrolasen, Phosphorsäurediesterhydrolasen, Triphosphormonoesterhydrolasen, Schwefelsäureesterhydrolasen), Hydrolasen, welche auf Glycosylverbindungen einwirken (z. B. Glycosid-Hydrolasen, welche N-Glycosyl-Verbindungen hydrolysieren, S-Glycosyl-Verbindung hydrolysieren), Hydrolasen, die auf Etherbindungen einwirken (z. B. Thioether-Hydrolasen), Hydrolasen, welche auf Peptidbindungen einwirken (z. B. α-Aminoacyl-Peptidhydrolasen, Peptidyl-Aminosäure-Hydrolasen, Dipeptid-Hydrolasen, Peptidyl-Peptid-Hydrolasen), Hydrolasen, welche auf C-N-Bindungen, die von Peptidbindungen verschieden sind, einwirken, Hydrolasen, welche auf Säureanhydridbindungen einwirken, Hydrolasen, welche auf C-C-Bindungen einwirken, Hydrolasen, die auf Halogenidbindungen einwirken, Hydrolasen, welche auf P-N-Bindungen einwirken, (iv) Lyasen, umfassend Kohlenstoff-Kohlenstoff-Lyasen (z. B. Carboxy-Lyasen, Aldehyd-Lyasen, Ketosäure-Lyasen), Kohlenstoff-Sauerstoff-Lyasen (z. B. Hydro-Lyasen, sonstige Kohlenstoff-Sauerstoff-Lyasen), Kohlenstoff-Stickstoff-Lyasen (z. B. Ammoniak-Lyasen, Amidin-Lyasen), Kohlenstoff-Schwefel-Lyasen, Kohlenstoff-Halogenid-Lyasen, andere Lyasen, (v) Isomerasen, umfassend Racemasen und Epimerasen, cis-trans-Isomerasen, intramolekulare Oxidoreduktasen, intramolekulare Transferasen, intramolekulare Lyasen, sonstige Isomerasen, (vi) Ligasen oder Synthetasen, umfassend Ligasen oder Synthetasen, welche C-O-Bindungen bilden, welche C-S-Bindungen bilden, welche C-N-Bindungen bilden, welche C-C-Bindungen bilden, ein.
Carbonylhydrolasen sind Enzyme, welche Verbindungen hydrolysieren, die O=C-X-Bindungen umfassen, worin X Sauerstoff oder Stickstoff ist. Sie schließen Hydrolasen, z. B. Lipasen und Peptidhydrolasen, z. B. Subtilisine oder Metalloproteasen, ein. Peptidhydrolasen schließen α-Aminoacylpeptid-Hydrolase, Peptidylamino-Säure-Hydrolase, Acylamino-Hydrolase, Serincarboxypeptidase, Metallocarboxy-Peptidase, Thiol-Proteinase, Carboxylproteinase und Metalloproteinase ein. Serin-, Metallo-, Thiol- und saure Proteasen sind eingeschlossen, ebenso wie Endo- und Exoproteasen.
In einer anderen Ausführungsform der Erfindung codiert die Matrizennukleinsäure die Gesamtheit oder einen Teil eines Rezeptors. Mit "Rezeptor" oder grammatikalischen Äquivalenten wird hierin ein proteinartiges Molekül gemeint, welches eine Affinität für einen Liganden aufweist. Beispiele von Rezeptoren schließen, ohne jedoch darauf eingeschränkt zu sein, Antikörper, Zellmembranrezeptoren, komplexe Kohlenhydrate und Glycoproteine, Enzyme und Hormonrezeptoren ein.
Zelloberflächenrezeptoren scheinen in zwei allgemeine Klassen einteilbar zu sein: Typ 1- und Typ 2-Rezeptoren. Typ 1-Rezeptoren besitzen im Allgemeinen zwei identische Untereinheiten, welche entweder kovalent oder anderweitig miteinander assoziiert sind. Sie sind im Wesentlichen vorgeformte Dimere, sogar in der Abwesenheit von Ligand. Die Typ 1-Rezeptoren schließen den Insulinrezeptor und den Rezeptor für IGF (insulinartiger Wachstumsfaktor = insuline like growth factor) ein. Die Typ 2-Rezeptoren liegen jedoch im Allgemeinen in einer monomeren Form vor und verlassen sich auf die Bindung von einem Liganden an jedes von zwei oder mehreren Monomeren, was zu Rezeptoroligomerisierung und Rezeptoraktivierung führt. Typ 2-Rezeptoren schließen den Wachstumshormonrezeptor, den Leptin-Rezeptor, den LDL(low density lipoprotein)-Rezeptor, den GCSF(Granulocyten-koloniestimulierender Faktor)-Rezeptor, die Interleukinrezeptoren, einschließlich Rezeptoren von IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-11, IL-12, IL-13, IL-15, IL-17 etc., EGF(epidermaler Wachstumsfaktor)-Rezeptor, EPO(Erythropoitin)-Rezeptor, TPO(Thrombopoietin)-Rezeptor, VEGF(vaskulärer endothelialer Wachstumsfaktor)-Rezeptor, Rezeptor von PDGF (Blutplättchen-abgeleiteter Wachstumsfaktor; A-Kette und B-Kette), Rezeptor von FGF (basischer Fibroblastenwachstumsfaktor), T-Zell-Rezeptor, Transferin-Rezeptor, Prolactin-Rezeptor, Rezeptor von CNF (ciliärer neurotropher Faktor), Rezeptor von TNF (Tumornekrosefaktor), Fas-Rezeptor, Rezeptor von NGF (Nerven-wachstumsfaktor), Rezeptor von GM-CSF (Granulocyten/Macrophagen-koloniestimulierender Faktor), Rezeptor von HGF (Hepatocyten-Wachstumsfaktor), Rezeptor von LIF (Leukämieinhibierender Faktor), TGFα/β-Rezeptor (transformierender Wachstumsfaktor α/β), Rezeptor von MCP (Monocyten-Chemoattractant-Protein) und Interferonrezeptoren (α, β und γ) ein. Weiterhin eingeschlossen sind T-Zell-Rezeptoren, MHC(Haupthistokompatibilitäts-Antigen)-Klasse I- und -Klasse II-Rezeptoren und Rezeptoren für die natürlich vorkommenden Liganden, welche nachstehend aufgeführt werden.
In einer Ausführungsform der Erfindung codiert die Matrizennukleinsäure die Gesamtheit oder einen Teil eines Liganden. Mit "Ligand" oder grammatikalischen Äquivalenten wird hierin ein proteinartiges Molekül gemeint, das zur Bindung an einen Rezeptor in der Lage ist. Liganden schließen, ohne jedoch darauf eingeschränkt zu sein, Cytokine, IL-1ra, IL-1, IL-1a, IL-1b, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-8, IL-10, IFN-β, INF-γ, IFN-α-2a; IFN-α-2B, TNF-α; CD40-Ligand (chk), humanes Fettleibigkeitsprotein Leptin, GCSF, BMP-7, CNF, GM-CSF, MCP-1, Makrophagenmigration-inhibierenden Faktor, humanen Glycosylierungs-inhibierenden Faktor, humanen Rantes, humanes Makrophagen-Entzündungsprotein 1β, hGH, LIF, humane Melanomwachstum-stimulatorische Aktivität, Neutrophilen-aktivierendes Peptid-2, CC-Chemokin MCP-3, Blutplättchenfaktor M2, Neutrophilen-aktivierendes Peptid 2, Eotaxin, Stromazellenabgeleiteten Faktor-1, Insulin, IGF-I, IGF-II, TGF-β1, TGF-β2, TGF-β3, TGF-α, VEGF, sauren FGF, basischen FGF, EGF, NGF, BDNF (Gehirn-abgeleiteter neurotropher Faktor), CNF, PDGF, HGF, GCDNF (Gliazellen-abgeleiteter neurotropher Faktor), EPO, andere extrazelluläre Signalübermittlungs-Einheiten, einschließlich, ohne darauf eingeschränkt zu sein, Hedgehog Sonic, Hedgehog Desert, Hedgehog Indian, hCG; Koagulationsfaktoren einschließlich, ohne aber darauf eingeschränkt zu sein, TPA und Faktor VIIa, ein.
In einer Ausführungsform der Erfindung codiert die Matrizennukleinsäure die Gesamtheit oder einen Teil eines Antikörpers. Der Begriff "Antikörper" oder grammatikalische Äquivalente, wie hierin verwendet, beziehen sich auf Antikörper und Antikörperfragmente, welche die Fähigkeit beibehalten, an das Epitop zu binden, welches der intakte Antikörper bindet, und schließen polyklonale Antikörper, monoklonale Antikörper, chimäre Antikörper, Anti-Idiotyp (Anti-ID)-Antikörper ein. Vorzugsweise sind die Antikörper monoklonale Antikörper. Antikörperfragmente schließen, ohne jedoch darauf eingeschränkt zu sein, die komplementaritätsbestimmenden Regionen (CDRs), Einzelketten-Fragment-Variablen (scfv), die variable Region der schweren Kette (VH), die variable Region der leichten Kette (VL) ein.
Informationen in Hinsicht auf Nukleinsäuresequenzen und Aminosäuresequenzen für Enzyme, Rezeptoren, Liganden und Antikörper sind ohne Weiteres aus zahlreichen Publikationen und mehreren Datenbanken verfügbar, wie diejenige vom National Center for Biotechnology Information (NCBI).
Varianten-Proteine der vorliegenden Erfindung werden durch Screening selektiert. Ein derartiges Screening kann durchgeführt werden durch Klonieren der Nukleinsäuren aus der Bibliothek in geeignete Wirtszellen. Im Allgemeinen erfordert das Screening die Insertion der hierdurch produzierten Mutanten-Nukleinsäuren in Vektoren und die Klonierung derartiger Vektoren in eine geeignete Wirtszelle zur Expression von Protein, welches geassayt werden kann. Es folgt eine Erörterung, welche die Entwicklung von Klonen von Wirtszellen betrifft, die zum Screening von Varianten-Proteinen hinsichtlich nützlicher Eigenschaften oder, alternativ dazu, zur Expression einer ausgewählten Nukleinsäure verwendet werden können, welche unter Anwendung der hierin beschriebenen Verfahren entwickelt und als eine bevorzugte Nukleinsäure zur Herstellung wünschenswerter Proteine isoliert wird.
Unter Verwendung der mutanten Nukleinsäuren der vorliegenden Erfindung, welche Variantenproteine codieren, kann eine Vielzahl von Expressionsvektoren hergestellt werden. Die Expressionsvektoren können entweder selbst-replizierende extrachromosomale Vektoren oder Vektoren, welche in ein Wirtsgenom integrieren, sein. Im Allgemeinen schließen diese Expressionsvektoren transkriptionelle und translationale regulatorische Nukleinsäure, funktionsfähig verknüpft an die das Varianten-Protein codierende Nukleinsäure, ein. Der Begriff "Kontrollsequenz" oder grammatikalische Äquivalente davon, wie hierin verwendet, bezieht sich auf DNA-Sequenzen, welche notwendig für die Expression einer funktionsfähig verknüpften codierenden Sequenz in einem besonderen Wirtsorganismus sind. Die Kontrollsequenzen, welche für Prokaryoten geeignet sind, schließen zum Beispiel einen Promotor, gegebenenfalls eine Operatorsequenz und eine Ribosomen-Bindungsstelle ein. Eukaryotische Zellen verwenden bekanntermaßen Polyadenylierungssignale und Enhancer. In einer Ausführungsform der Erfindung werden die Kontrollsequenzen durch Verwendung der hierin beschriebenen Verfahren erzeugt.
Nukleinsäure wird "funktionsfähig verknüpft", wenn sie in eine funktionelle Beziehung mit einer anderen Nukleinsäuresequenz gebracht wird. Zum Beispiel wird DNA für eine Prä-Sequenz oder einen sekretorischen "Leader" funktionsfähig an DNA für ein Polypeptid verknüpft, wenn sie als ein Prä-Protein exprimiert wird, welches an der Sekretion des Polypeptids teilnimmt; ein Promotor oder Enhancer wird funktionsfähig an eine codierende Sequenz verknüpft, wenn er die Transkription der Sequenz beeinflusst; oder eine Ribosomenbindungsstelle wird funktionsfähig an eine codierende Sequenz verknüpft, wenn sie so positioniert wird, dass Translation erleichtert wird. Im Allgemeinen bedeutet "funktionsfähig verknüpft", dass die zu verknüpfenden Nukleinsäuresequenzen aneinander angrenzend sind, und, im Falle eines sekretorischen Leaders, aneinandergrenzend und im Leseraster sind. Allerdings müssen Enhancer nicht angrenzend sein. Die Verknüpfung wird bewerkstelligt durch Ligation an zweckmäßigen Restriktionsstellen. Wenn solche Stellen nicht existieren, werden synthetische Oligonukleotid-Adaptoren, Linker oder Rekombinationsverfahren gemäß der herkömmlichen Praxis verwendet. Die transkriptionelle und translational regulatorische Nukleinsäure wird im Allgemeinen für die Wirtszelle passend sein, welche verwendet wird, um das Fusionsprotein zu exprimieren; zum Beispiel werden vorzugsweise transkriptionelle und translationale regulatorische Nukleinsäuresequenzen aus Bacillus verwendet, um das Fusionsprotein in Bacillus zu exprimieren. Zahlreiche Typen von passenden Expressionsvektoren und geeignete regulatorische Sequenzen sind im Fachgebiet für eine Vielzahl von Wirtszellen bekannt. In einer Ausführungsform der Erfindung werden die Kontrollsequenzen funktionsfähig an eine andere Nukleinsäure verknüpft, indem die hierin beschriebenen Verfahren angewandt werden.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird, wenn eine natürlich vorkommende sekretorische Sequenz zu einem niedrigen Spiegel an Sekretion eines Variantenproteins führt, ein Austausch der natürlich vorkommenden sekretorischen Leader-Sequenz gewünscht. In dieser Ausführungsform wird eine nicht-verwandte sekretorische Leader-Sequenz funktionsfähig an eine Variantenprotein-codierende Nukleinsäure verknüpft, was zu einer erhöhten Proteinsekretion führt. Somit ist jedwede sekretorische Leader-Sequenz, welche zu einer gesteigerten Sekretion des Variantenproteins im Vergleich zur Sekretion des natürlich vorkommenden Proteins und seiner sekretorischen Sequenz führt, erwünscht. Geeignete sekretorische Leader-Sequenzen, welche zur Sekretion eines Proteins führen, sind im Fachgebiet bekannt. In einer anderen bevorzugten Ausführungsform wird eine sekretorische Leader-Sequenz eines natürlich vorkommenden Proteins oder eines Variantenproteins durch im Fachgebiet bekannte Techniken entfernt, und eine anschließende Expression führt zur intrazellulären Akkumulation des exprimierten Proteins.
Im Allgemeinen können die transkriptional und translational regulatorischen Sequenzen, ohne jedoch darauf eingeschränkt zu sein, Promotorsequenzen, ribosomale Bindungsstellen, transkriptionelle Start- und Stop-Sequenzen, Translations-Start- und -Stop-Sequenzen sowie Enhancer- oder Aktivator-Sequenzen einschließen. In einer bevorzugten Ausführungsform schließen die regulatorischen Sequenzen einen Promotor und transkriptionelle Start- und Stoppsequenzen ein. Promotorsequenzen codieren entweder konstitutive oder induzierbare Promotoren. Die Promotoren können entweder natürlich vorkommende Promotoren oder Hybridpromotoren sein. Hybridpromotoren, welche Elemente von mehr als einem Promotor kombinieren, sind ebenfalls im Fachgebiet bekannt und sind in der vorliegenden Erfindung brauchbar. In einer bevorzugten Ausführungsform sind die Promotoren starke Promotoren, die eine hohe Expression in Zellen, insbesondere Säugerzellen, gestatten, wie der STAT- oder CMV-Promotor, insbesondere in Kombination mit einem regulatorischen Tet-Element.
Darüber hinaus kann der Expressionsvektor zusätzliche Elemente umfassen. Zum Beispiel kann der Expressionsvektor zwei Replikationssysteme aufweisen, wodurch es ihm ermöglicht wird, in zwei Organismen aufrechterhalten zu werden, zum Beispiel in Säuger- oder Insektenzellen zur Expression und in einem prokaryotischen Wirt zur Klonierung und Amplifikation. Fernerhin, für integrierende Expressionsvektoren, enthält der Expressionsvektor mindestens eine Sequenz, die homolog zu dem Wirtszellengenom ist, und vorzugsweise zwei homologe Sequenzen, welche das Expressionskonstrukt flankieren. Der integrierende Vektor kann auf einen spezifischen Ort in der Wirtszelle gerichtet sein durch Auswählen der passenden homologen Sequenz zum Einschluss in den Vektor. Konstrukte für integrierende Vektoren sind im Fachgebiet durchaus bekannt. Darüber hinaus enthält der Expressionsvektor, in einer bevorzugten Ausführungsform, ein selektierbares Marker-Gen, um die Selektion von transformierten Wirtszellen zu gestatten. Selektionsgene sind im Fachgebiet gut bekannt und werden mit der verwendeten Wirtszelle variieren.
Die Nukleinsäuren werden in die Zellen, entweder allein oder in Kombination mit einem Expressionsvektor eingebracht. Mit "eingebracht in" oder grammatikalischen Äquivalenten wird hierin gemeint, dass die Nukleinsäure auf eine Weise in die Zellen eintritt, welche geeignet für eine anschließende Expression der Nukleinsäure ist. Das Verfahren zur Einführung wird in großem Maße von dem angezielten Zelltyp vorgeschrieben, wie nachstehend erörtert wird. Beispielhafte Verfahren schließen CaPO₄-Präzipitation, Liposomenfusion, Lipofectin^®, Elektroporation, virale Infektion etc. ein. Die Nukleinsäuren können stabil in das Genom der Wirtszelle integrieren oder können entweder vorübergehend oder stabil im Zytoplasma existieren (d. h. durch die Verwendung von herkömmlichen Plasmiden, unter Verwendung von standardmäßigen regulatorischen Sequenzen, Selektionsmarkern etc.).
Die Proteine der vorliegenden Erfindung werden durch Kultivieren einer Wirtszelle, die entweder mit einem Expressionsvektor, enthaltend das Protein codierende Nukleinsäure, oder mit der das Protein codierenden Nukleinsäure allein transformiert wurde, unter den angemessenen Bedingungen zum Induzieren oder Verursachen der Expression des Proteins hergestellt. Die zur Proteinexpression angemessenen Bedingungen werden mit der Auswahl des Expressionsvektors und der Wirtszelle variieren, und werden vom Fachmann auf dem Gebiet durch routinemäßige Experimente leicht festgestellt. Zum Beispiel wird die Verwendung von konstitutiven Promotoren im Expressionsvektor eine Optimierung des Wachstums und der Proliferation der Wirtszelle erfordern, wohingegen die Verwendung eines induzierbaren Promotors die passenden Wachstumsbedingungen für eine Induktion erfordert. In einigen Ausführungsformen ist darüber hinaus die Zeitgebung der Ernte bedeutsam. Zum Beispiel ist das in Insektenzell-Expressionssystemen verwendete Baculovirus ein lytisches Virus, und daher kann die Ernte-Zeitwahl ausschlaggebend für den Produktertrag sein.
Geeignete Wirtszellen schließen Hefe, Bakterien, Archaebacteria, Pilze und Insekten- und Tierzellen, einschließlich Säugerzellen, ein. Von besonderem Interesse sind Drosophila melanogaster-Zellen, Saccharomyces cerevisiae und andere Hefen, E. coli, Bacillus, SF9-Zellen, C129-Zellen, 293-Zellen, Neurospora, Trichoderma, Aspergillus, Fusarium, Streptomyces, BHK, CHO, COS, Pichia pastoris etc.
In einer Ausführungsform werden die Proteine in Säugerzellen exprimiert. Säugerexpressionssysteme sind ebenfalls im Fachgebiet bekannt und schließen retrovirale Systeme ein. Ein Säuger-Promotor ist jedwede DNA-Sequenz, fähig zum Binden von Säuger-RNA-Polymerase und Initiieren der stromabwärts verlaufenden (3') Transkription einer codierenden Sequenz für das Fusionsprotein zu mRNA. Ein Promotor wird eine transkriptionsinitiierende Region, welche üblicherweise proximal zum 5'-Ende der codierenden Sequenz platziert ist, und eine TATA-Box, welche üblicherweise 25–30 Basenpaare stromaufwärts der Transkriptionsinitiationsstelle lokalisiert ist, aufweisen. Die TATA-Box weist angenommenermaßen die RNA-Polymerase II an, eine RNA-Synthese an der korrekten Stelle zu beginnen. Ein Säuger-Promotor wird ebenfalls ein stromaufwärts gelegenes Promotor-Element (Enhancer-Element) enthalten, welches typischerweise innerhalb von 100 bis 200 Basenpaaren stromaufwärts der TATA-Box lokalisiert ist. Ein stromaufwärts gelegenes Promotor-Element bestimmt die Rate, bei der Transkription initiiert wird und kann in beiden Orientierungen wirken. Von besonderer Verwendung als Säugerpromotoren sind die Promotoren aus Säugetierviren-Genen, da die viralen Gene oft hoch-exprimiert werden und ein breites Wirtsspektrum aufweisen. Beispiele schließen den SV40-Early-Promotor, Maus-Mammary-Tumorvirus-LTR-Promotor, Adenovirus-"major late"-Promotor, Herpes simplex-Virus-Promotor und den CMV-Promotor ein.
Typischerweise sind Transkriptions-Terminations- und Polyadenylierungs-Sequenzen, welche von Säugerzellen erkannt werden, regulatorische Regionen, welche 3' zum Translations-Stop-Codon lokalisiert sind und somit, gemeinsam mit den Promotorelementen, die codierende Sequenz flankieren. Der 3'-Terminus der reifen mRNA wird durch ortsspezifische posttranslationale Spaltung und Polyadenylierung gebildet. Beispiele für Transkriptionsterminator- und Polyadenylierungs-Signale schließen diejenigen ein, welche aus SV40 abgeleitet sind.
Die Verfahren zur Einbringung exogener Nukleinsäure in Säugerwirte sowie andere Wirte sind im Fachgebiet gut bekannt und werden mit der verwendeten Wirtszelle variieren. Techniken schließen Dextran-vermittelte Transfektion, Calciumphosphat-Präzipitation, Polybrenevermittelte Transfektion, Protoplastenfusion, Elektroporation, virale Infektion, Einkapselung der Polynukleotid(e) in Liposomen und direkte Mikroinjektion der DNA in Zellkerne ein.
Wie vom Fachmann richtig eingeschätzt werden wird, kann der Typ von in der vorliegenden Erfindung verwendeten Säugerzellen in breitem Maße variieren. Grundsätzlich können jedwede Säugerzellen verwendet werden, wobei Maus-, Ratten-, Primaten- und Menschen-Zellen besonders bevorzugt werden, obwohl, wie es von jenen im Fachbereich Erfahrenen richtig eingeschätzt werden wird, Modifikationen des Systems durch Pseudotypisierung ermöglichen, alle eukaryotischen Zellen zu verwenden, vorzugsweise höhere Eukaryoten. Wie es nachstehend vollständiger beschrieben wird, kann ein Screening so angesetzt werden, dass die Zellen einen selektierbaren Phänotyp beim Vorhandensein eines bioaktiven Peptids aufzeigen. Wie nachstehend vollständiger beschrieben, sind Zelltypen, welche in einer breiten Auswahl an Krankheitszuständen beteiligt sind, besonders nützlich, so lange ein geeignetes Screening entworfen werden kann, um die Selektion von Zellen zu gestatten, welche einen veränderten Phänotyp als Konsequenz des Vorhandenseins eines Peptids innerhalb der Zelle aufzeigen.
Folglich schließen geeignete Säugerzelltypen, ohne jedoch darauf eingeschränkt zu sein, Tumorzellen aller Typen (insbesondere Melanom, myeloide Leukämie, Karzinome der Lunge, Brust, Eierstöcke, Colon, Niere, Prostata, Pankreas und Hoden), Cardiomyocyten, endotheliale Zellen, epitheliale Zellen, Lymphozyten (T-Zelle und B-Zelle), Mastzellen, Eosinophile, Gefäß-Intima-Zellen, Hepatozyten, Leukozyten einschließlich mononukleärer Leukozyten, Stammzellen, wie hämopoietische, neurale, Haut-, Lungen-, Nieren-, Leber- und Myozyten-Stammzellen (zur Verwendung beim Screening hinsichtlich Differenzierungs- und Dedifferenzierungs-Faktoren), Osteoklasten, Chondrozyten und andere Bindegewebszellen, Keratinozyten, Melanozyten, Leberzellen, Nierenzellen und Adipozyten ein. Geeignete Zellen schließen auch bekannte Forschungszellen ein, einschließlich, ohne jedoch darauf eingeschränkt zu sein, Jurkat-T-Zellen, NIH3T3-Zellen, CHO, COS etc.; siehe den ATCC-Zelllinienkatalog, welcher hierin ausdrücklich als Bezugsstelle einbezogen wird.
In einer Ausführungsform können die Zellen darüber hinaus gentechnisch verändert sein, d. h. sie enthalten exogene Nukleinsäure, welche von den mutanten Nukleinsäuren der Erfindung verschieden ist.
In einer bevorzugten Ausführungsform werden die Proteine in bakteriellen Systemen exprimiert. Bakterielle Expressionssysteme sind im Fachgebiet gut bekannt. Ein geeigneter bakterieller Promotor ist jedwede Nukleinsäuresequenz, fähig zur Bindung bakterieller RNA-Polymerase und zur Initiierung der stromabwärts verlaufenden (3') Transkription der codierenden Sequenz des Proteins zu mRNA. Ein bakterieller Promotor besitzt eine Transkriptionsinitiations-Region, welche üblicherweise proximal zum 5'-Ende der codierenden Sequenz platziert ist. Diese Transkriptionsinitiations-Region schließt typischerweise eine RNA-Polymerase-Bindungsstelle und eine Transkriptionsinitiations-Stelle ein. Sequenzen, welche Stoffwechselweg-Enzyme codieren, stellen besonders brauchbare Promotorsequenzen zur Verfügung. Beispiele schließen Promotorsequenzen, welche abgeleitet sind von Zucker-metabolisierenden Enzymen, wie Galactose, Lactose und Maltose, und Sequenzen, welche von biosynthetischen Enzymen abgeleitet sind, wie Tryptophan, ein. Promotoren aus Bakteriophagen können ebenfalls verwendet werden und sind im Fachgebiet bekannt. Darüber hinaus sind auch synthetische Promotoren und Hybridpromotoren nützlich; zum Beispiel ist der tac-Promotor ein Hybrid der trp- und lac-Promotorsequenzen. Darüber hinaus kann ein bakterieller Promotor natürlich vorkommende Promotoren von nicht-bakteriellem Ursprung einschließen, welche die Fähigkeit aufweisen, bakterielle RNA-Polymerase zu binden und Transkription zu initiieren.
Zusätzlich zu einer funktionierenden Promotorsequenz ist eine wirkungsvolle Ribosomen-Bindungsstelle wünschenswert. In E. coli wird die Ribosomen-Bindungsstelle als die Shine-Delgarno(SD)-Sequenz bezeichnet und schließt ein Initiationscodon und eine 3–9 Nukleotide lange Sequenz ein, die 3–11 Nukleotide stromaufwärts des Initiations-Codons lokalisiert ist.
Der Expressionsvektor kann auch eine Signalpeptid-Sequenz einschließen, welche für die Sekretion des exprimierten Proteins in Bakterien sorgt. Die Signalsequenz codiert typischerweise ein Signalpeptid, aufgebaut aus hydrophoben Aminosäuren, welche die Sekretion des Proteins aus der Zelle steuern, wie es im Fachgebiet gut bekannt ist. Das Protein wird entweder in das Wachstumsmedium (grampositive Bakterien) oder in den periplasmatischen Raum, der zwischen der inneren und äußeren Membran der Zelle (gramnegative Bakterien) lokalisiert ist, sezerniert. Zur Expression in Bakterien werden üblicherweise bakterielle sekretorische Leader-Sequenzen, welche an die mutante Nukleinsäure funktionsfähig verknüpft sind, bevorzugt.
In einer bevorzugten Ausführungsform werden die Proteine der Erfindung in Bakterien exprimiert und/oder werden auf der Bakterienoberfläche präsentiert. Geeignete bakterielle Expressions- und Display-Systeme sind im Fachgebiet bekannt [Stahl und Uhlen, Trends Biotechnol. 15: 185–92 (1997); Georgiou et al., Nat. Biotechnol. 15: 29–34 (1997); Lu et al., Biotechnology 13: 366–72 (1995); Jung et al., Nat. Biotechnol. 16: 576–80 (1998)].
Der bakterielle Expressionsvektor kann auch ein selektierbares Marker-Gen einschließen, um die Selektion von bakteriellen Stämmen zu ermöglichen, welche transformiert worden sind. Geeignete Selektions-Gene schließen Gene ein, welche die Bakterien resistent gegen Arzneimittel, wie Ampicillin, Chloramphenicol, Erythromycin, Kanamycin, Neomycin und Tetracyclin, machen. Geeignete Marker schließen auch biosynthetische Gene, wie diejenigen in den Histidin-, Tryptophan- und Leucin-Biosynthesewegen, ein.
Diese Komponenten werden zu Expressionsvektoren zusammengefügt. Expressionsvektoren für Bakterien sind im Fachgebiet gut bekannt und schließen, unter anderem, Vektoren für Bacillus subtilis, E. coli, Streptococcus cremoris und Streptococcus lividans ein.
Die bakteriellen Expressionsvektoren werden in bakterielle Wirtszellen unter Anwendung von im Fachgebiet gut bekannten Techniken transformiert, wie Calciumchloridbehandlung, Elektroporation und anderen.
In einer Ausführungsform werden Proteine in Insektenzellen hergestellt. Expressionsvektoren für die Transformation von Insektenzellen und insbesondere Expressionsvektoren auf Baculovirus-Basis sind im Fachgebiet gut bekannt.
In einer anderen bevorzugten Ausführungsform werden Proteine in Hefezellen hergestellt. Hefe-Expressionssysteme sind im Fachgebiet gut bekannt und schließen Expressionsvektoren für Saccharomyces cerevisiae, Candida albicans und C. maltosa, Hansenula polymorpha, Kluyveromyces fragilis und K. lactis, Pichia guillerimondii und P. pastoris, Schizosaccharomyces pombe und Yarrowia lipolytica ein. Bevorzugte Promotorsequenzen zur Expression in Hefe schließen den induzierbaren GAL1,10-Promotor, die Promotoren von Alkoholdehydrogenase, Enolase, Glucokinase, Glukose-6-Phosphat-Isomerase, Glyceraldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase, Hexokinase, Phosphofructokinase, 3-Phosphoglycerat-Mutase, Pyruvatkinase und des sauren Phosphatase-Gens ein. Selektierbare Hefe-Marker schließen ADE2, HIS4, LEU2, TRP1 und ALG7, welches Resistenz gegen Tunicamycin vermittelt; das Neomycin-Phosphotransferase-Gen, welches Resistenz gegen G418 vermittelt; und das CUP1-Gen, welches ein Wachstum von Hefe in Gegenwart von Kupferionen gestattet, ein.
In einer bevorzugten Ausführungsform werden die Proteine der Erfindung in Hefe exprimiert und/oder werden auf der Hefeoberfläche präsentiert. Geeignete Hefe-Expressions- und -Display-Systeme sind im Fachgebiet bekannt (Boder und Wittrup, Nat. Biotechnol. 15: 553–7 (1997); Cho et al., J. Immunol. Methods 220: 179–88 (1998); welche alle ausdrücklich als Bezugsstelle einbezogen sind). Der Oberflächen-Display im Ciliaten Tetrahymena thermophila wird von Gaertig et al., Nat. Biotechnol. 17: 462–465 (1999), beschrieben.
In einer Ausführungsform werden Proteine in Viren hergestellt und/oder werden auf der Oberfläche der Viren präsentiert. Expressionsvektoren für die Proteinexpression in Viren und für den Display sind im Fachgebiet gut bekannt und im Handel erhältlich (siehe Übersichtsartikel von Felici et al., Biotechnol. Annu. Rev. 1: 149–83 (1995)). Beispiele schließen, ohne aber darauf eingeschränkt zu sein, M13 (Lowman et al. (1991) Biochemistry 30: 10832–10838 (1991); Matthew und Wells (1993) Science 260: 1113–1117; Stratagene); fd (Krebber et al., (1995) FEBS Lett. 377: 227–231); T7 (Novagen, Inc.); T4 (Jiang et al., Infect. Immun. 65: 4770–7 (1997); Lambda (Stolz et al., FEBS Lett. 440: 213–7 (1998)); "Tomato Bushy Stunt Virus" (Joelson et al., J. Gen. Virol. 78: 1213–7 (1997)); Retroviren (Buchholz et al., Nat. Biotechnol. 16: 951–4 (1998)) ein. In einer anderen Ausführungsform werden die Proteine der Erfindung in vitro hergestellt, wie zum Beispiel in Patnaik, R. et al. (1998) Biotechniques 24: 862–868.
Darüber hinaus können die Proteine der Erfindung ferner an andere Proteine fusioniert werden, falls gewünscht, zum Beispiel zur Erhöhung der Expression oder zur Erhöhung der Stabilität. Sobald hergestellt, können die Proteine kovalent modifiziert werden. Ein Typ von kovalenter Modifikation schließt das Umsetzen von angezielten Aminosäuren eines Proteins mit einem organischen Derivatisierungsmittel ein, das fähig ist, mit ausgewählten Seitenketten oder den N- oder C-terminalen Resten eines Proteins zu reagieren. Eine Derivatisierung mit bifunktionellen Mitteln ist beispielsweise nützlich zur Vernetzung eines Proteins an eine wasserunlösliche Trägermatrix oder Oberfläche zum Einsatz in dem Verfahren zur Reinigung von Anti-Protein-Antikörpern oder Screening-Assays, wie es nachstehend vollständiger beschrieben wird. Üblicherweise verwendete Vernetzungsmittel schließen z. B. 1,1-Bis(diazoacetyl)-2-phenylethan, Glutaraldehyd, N-Hydroxysuccinimidester, zum Beispiel Ester mit 4-Azidosalicylsäure, homobifunktionelle Imidoester, einschließlich Disuccinimidylestern, wie 3,3'-Dithiobis(succinimidylpropionat), bifunktionelle Maleimide, wie Bis-N-maleimido-1,8-octan und Mittel, wie Methyl-3[(p-azidophenyl)dithio]propioimidat ein.
Andere Modifikationen schließen die Desamidierung von Glutaminyl- und Asparaginyl-Resten zu den entsprechenden Glutamyl- bzw. Aspartylresten, Hydroxylierung von Prolin und Lysin, Phosphorylierung von Hydroxylgruppen von Seryl- oder Threonyl-Resten, Methylierung der "-Aminogruppen von Lysin-, Arginin- und Histidin-Seitenketten [T. E. Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties, W. H. Freeman & Co., San Francisco, S. 79–86 (1983)], Acetylierung des N-terminalen Amins und Amidierung einer beliebigen C-terminalen Carboxylgruppe ein.
Ein anderer Typ von kovalenter Modifikation des Proteins, welcher innerhalb des Umfangs dieser Erfindung eingeschlossen ist, umfasst das Verändern des nativen Glycosylierungsmusters des Variantenproteins oder des entsprechenden natürlich vorkommenden Proteins. "Verändern des nativen Glycosylierungsmusters" wird für die Zwecke hierin beabsichtigtermaßen das Deletieren eines oder mehrerer Kohlenhydrat-Einheiten, welche in einem Protein gefunden werden, und/oder das Hinzufügen einer oder mehrerer Glycosylierungsstellen, welche in dem jeweiligen Protein nicht vorhanden sind, bedeuten.
Das Hinzufügen von Glycosylierungsstellen zu einem Protein kann durch Verändern von dessen Aminosäuresequenz bewerkstelligt werden. Die Veränderung kann beispielsweise durch die Addition von oder Substitution mit einem oder mehreren Serin- oder Threoninresten an dem Protein (für O-verknüpfte Glycosylierungsstellen) vorgenommen werden. Die Aminosäuresequenz kann wahlweise durch Veränderungen auf der DNA-Ebene, insbesondere durch Mutieren der DNA, welche das Protein codiert, an vorgewählten Basen, abgewandelt werden, so dass Codons erzeugt werden, welche zu den gewünschten Aminosäuren translatiert werden.
Andere Mittel zur Erhöhung der Anzahl von Kohlenhydrateinheiten auf dem Protein bestehen in der chemischen oder enzymatischen Kopplung von Glycosiden an das Polypeptid. Solche Verfahren werden im Fachgebiet beschrieben, z. B. in WO 87/05330, veröffentlicht am 11. September 1987, und in Aplin und Wriston, CRC Crit. Rev. Biochem., S. 259–306 (1981).
Die Entfernung von Kohlenhydrateinheiten, welche auf dem Protein vorhanden sind, kann chemisch oder enzymatisch oder durch Mutationsubstitution von Codons, welche Aminosäure reste codieren, die als Ziele für Glycosylierung dienen, bewerkstelligt werden. Chemische Deglycosylierungstechniken sind im Fachgebiet bekannt und beschrieben, zum Beispiel von Hakimuddin et al., Arch. Biochem. Biophys., 259: 52 (1987), und von Edge et al., Anal. Biochem., 118: 131 (1981). Die enzymatische Spaltung von Kohlenhydrateinheiten auf Polypeptiden kann durch die Verwendung einer Vielzahl von Endo- und Exoglycosidasen erreicht werden, wie beschrieben von Thotakura et al., Meth. Enzymol., 138: 350 (1987).
Ein weiterer Typ von kovalenter Modifikation eines Proteins umfasst die Verknüpfung des Proteins an eines einer Vielzahl von nicht-proteinartigen Polymeren, z. B. Polyethylenglycol, Polypropylenglycol oder Polyoxyalkylene, auf die Weise, welche dargestellt wird in den U.S.-Patenten Nr. 4 640 835; 4 496 689; 4 301 144; 4 670 417; 4 791 192 oder 4 179 337.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird das Protein nach der Expression gereinigt oder isoliert. Die Proteine können in einer Vielzahl von Weisen, welche dem Fachmann auf dem Gebiet bekannt sind, isoliert oder gereinigt werden, abhängt davon, welche anderen Komponenten in der Probe vorhanden sind. Standardmäßige Reinigungsverfahren schließen elektrophoretische, molekulare, immunologische und chromatographische Techniken ein, einschließlich Ionenaustausch-, hydrophobe, Affinitäts- und Umkehrphasen-HPLC-Chromatographie und Chromatofokussierung. Zum Beispiel kann das Protein unter Anwendung einer standardmäßigen Anti-Bibliothek-Antikörper-Säule gereinigt werden. Ultrafiltrations- und Diafiltrations-Techniken, in Verbindung mit Proteinkonzentrierung, sind ebenfalls brauchbar. Für eine allgemeine Anleitung hinsichtlich geeigneter Reinigungstechniken, siehe Scopes, R., Protein Purification, Springer-Verlag, NY (1982). Der notwendige Grad an Reinigung wird abhängig von der Verwendung des Proteins variieren. In einigen Fällen kann keine Reinigung erforderlich sein.
Alternativ dazu ist es möglich, Varianten-Nukleinsäuren aus einer Population durch eine Vielzahl von Selektionsverfahren zu isolieren. Diese Verfahren können die Anreicherung der Nukleinsäure selbst oder des einen oder der mehreren Proteine, welche von dieser Nukleinsäure codiert werden, beinhalten. Eine Selektion kann auf einem Wachstumsvorteil basieren, welcher von einer Mutanten-Nukleinsäure oder von einem oder mehreren Proteinen, welche von dieser Nukleinsäure codiert werden, vermittelt wird. Alternativ dazu kann die Selektion auf der Bindung von DNA oder ihrem codierten Protein an einen Liganden von Interesse unter Anwendung von Display-Methoden, wie Ribosomen- oder Phagen-Display, basieren, welche im Fachgebiet gut bekannt sind.
Mit den folgenden Beispielen wird beabsichtigt, bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung zu veranschaulichen, und mit ihnen wird nicht beabsichtigt, die Erfindung in irgendeiner Weise zu beschränken, da die Erfindung von den Patentansprüchen definiert wird.
BEISPIEL
HERSTELLUNG EINER KOMBINATORISCHEN MUTATIONSBIBLIOTHEK VON EINER SUBTILISIN-MATRIZE
Das folgende Experiment wurde entworfen, um eine Bibliothek von Mutanten in einer Subtilisin-Matrize zu erzeugen, wobei mutagene Oligonukleotide verwendet wurden, welche 12 unterschiedliche Mutationen repräsentieren. Die Mutationen, welche den mutagenen Oligonukleotiden zugeordnet sind, werden in der Tabelle 2 gezeigt.
Alle mutagenen Oligonukleotide wiesen eine Länge von 27 bp auf. In der Mitte besaßen sie das Codon für die neue Aminosäure, welches von 12 bp auf dem 5'-Ende und 12 bp auf dem 3'-Ende flankiert war. Eine Beispiel-Oligonukleotidsequenz ist N62D: entsprechend dem Oligonukleotid ACTCAAGATGGGGATGGGCATGGCACG (SEQ ID Nr.: 1), wobei das unterstrichene Codon die Mutation bereitstellt. Eine PCR wurde unter Verwendung eines Subtilisin codierenden Gens, das aus Bacillus lentus abgeleitet war, als Matrize durchgeführt. Eine äquimolare Mischung von 12 mutagenen und zwei externen nicht-mutagenen Oligonukleotiden wurde als Primer zugegeben. Die Gesamtkonzentration an Oligonukleotiden belief sich auf 125 nM (ungefähr 9 nM für jeden Primer). Die Endkonzentrationen des Restes der Reaktionskomponenten waren wie folgend: 1 × XL-Puffer II (PE Applied Biosystems), 0,2 mM dNTPs, 1,1 mM Mg(OAc), 1 μl 1:100-verdünnte Mini-Präp-Plasmid-DNA, 4 Units rTth-DNA-Polymerase XL, alles in einem Endvolumen von 100 μl. Die PCR wurde durch Ausführen von 30 Zyklen von 94°C, 15 s; 30°C, 60 s; 68°C, 60 s, durchgeführt. Das resultierende Produkt wurde als Matrize für eine weitere PCR-Runde unter Verwendung von lediglich den zwei äußeren nicht-mutagenen Primern bei einer Endkonzentration von 1,25 μm verwendet. Schließlich wurde das Produkt kloniert und in kompetenten Bacillus subtilis transformiert.
Acht Klone wurden statistisch aus der resultierenden Bibliothek gewählt, und die DNA-Sequenz wurde bestimmt.
Mutationen, welche in der gewählten kleinen Probe erhalten wurden, sind in der Tabelle 3 aufgeleistet.
Mutationen, welche unterstrichen sind, resultieren aus den mutagenen Oligonukleotiden. Mehrere der Klone enthalten zusätzliche Mutationen, welche wahrscheinlich nicht-spezifische PCR-Mutationen repräsentieren. Wie gezeigt in der Tabelle 3, wurden Mutationen in den ausgewählten Klonen in einer statistischen kombinatorischen Verteilung eingeführt. Neun der zwölf Mutationen wurden mindestens einmal unter den sequenzierten Klonen beobachtet. Alle außer einem der selektierten Klone enthalten mehrere Mutationen, was die Effektivität des Verfahrens zur Erstellung einer kombinatorischen Mutations-Strategie aufzeigt.
SEQUENZAUFLISTUNG

Claims

Verfahren zur Herstellung einer Bibliothek von mutanten Nukleinsäuremolekülen, umfassend: (a) Erhalten einer Matrizennukleinsäure; (b) Herstellen eines Oligonukleotid-Primerpaares, entsprechend den Enden der Matrizennukleinsäure; (c) Herstellen eines ersten und eines zweiten mutagenen Oligonukleotid-Primers, wobei der erste Primer einer ersten gewünschten Mutation innerhalb der Matrizennukleinsäure entspricht und der zweite Primer einer zweiten gewünschten Mutation innerhalb der Matrizennukleinsäure entspricht; (d) Mischen der Oligonukleotid-Primer, welche in den Schritten (b) und (c) hergestellt wurden; (e) Vereinigen der Mischung in Schritt (d) mit der Matrizennukleinsäure unter Bedingungen zur Erleichterung der Polymerasekettenreaktion, wobei die mutagenen Oligonukleotide in einer Konzentration vorhanden sind, welche niedriger als die Sättigungskonzentration ist, wobei eine Sättigungskonzentration bedeutet, dass die mutagenen und nicht-mutagenen Primer in limitierenden Mengen im Vergleich zu anderen Reaktions-Ausgangsprodukten zugesetzt werden.
Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei die Matrizennukleinsäure im wesentlichen aus einer einzelnen Nukleinsäure besteht.
Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei die Mischung aus Schritt (d) ferner nicht-mutagene Oligonukleotide umfasst, welche einem oder beiden der mutagenen Oligonukleotidprimer von Schritt (c) entsprechen.
Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei die Matrizennukleinsäure ein gewünschtes Proteinprodukt codiert.
Verfahren gemäß Anspruch 4, wobei das Proteinprodukt ein Enzym, Hormon, Impfstoff, Antikörper, Ligand oder Rezeptor umfasst.
Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei die mutagenen Oligonukleotidprimer im Schritt (c) in einem vordefinierten Verhältnis zugesetzt werden, so dass die resultierende Nukleinsäurebibliothek vorbeeinflusst wird.
Verfahren gemäß Anspruch 6, wobei die mutagenen Oligonukleotidprimer im Schritt (c) mit entsprechenden nicht-mutagenen Oligonukleotidprimern in einem vordefinierten Ver-hältnis kombiniert werden, so dass die resultierende Nukleinsäurebibliothek vorbeeinflusst wird.
Verfahren gemäß Anspruch 4, ferner umfassend die folgenden Schritte: (f) Transformieren der mutanten Matrizennukleinsäure aus der Bibliothek in eine kompetente Wirtszelle; (g) Exprimieren von Protein, entsprechend der mutanten Nukleinsäure, in der Wirtszelle; (h) Screenen der exprimierten Proteine nach gewünschten Merkmalen.
Verfahren von Anspruch 8, worin die Transformation im Schritt (f) unter Anwendung von direkter Transformation der Produkte von Schritt (e) durchgeführt wird.
Verfahren gemäß Anspruch 2, ferner umfassend die Schritte des: (f) Translatierens der mutanten Matrizennukleinsäure aus der Bibliothek in vitro, um ein exprimiertes Protein zu erhalten; (g) Screenens der exprimierten Proteine nach gewünschten Merkmalen.