DE60032235T2

DE60032235T2 - Ribonukleinsäurederivate

Info

Publication number: DE60032235T2
Application number: DE60032235T
Authority: DE
Inventors: Simon Andrew GOLDSBOROUGH
Original assignee: Cyclops Genome Sciences Ltd
Current assignee: Cyclops Genome Sciences Ltd
Priority date: 1999-04-30
Filing date: 2000-05-02
Publication date: 2007-11-15
Anticipated expiration: 2020-05-03
Also published as: EP1196631B1; AU4589000A; AU4767300A; DE60041442D1; US20050272679A1; ATE421583T1; WO2001094626A1; WO2000075302A3; EP1177281B1; US20050074753A1; ATE347616T1; US20030039985A1; WO2000075302A2; AU4588000A; WO2000075306A2; AU4767400A; EP1177281A2; WO2000066605A3; US6794140B1; DE60032235D1

Description

BEREICH DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf Polynukleotide, Modifikation von Ribonukleinsäure (RNA) zur Bildung von Polynukleotiden und die Verwendungen von solchen Polynukleotiden.
Hintergrund der Erfindung
RNA dient als eine essenzielle Komponente für jede moderne biologische Studie. Es stellt ein Rohmaterial für medizinische Diagnostik, Schaffung von Medikamenten, Produktion rekombinanter Proteine, Bioinformatik und nahezu jeden Bereich dar, der die pharmazeutischen und biotechnologischen Industrien betrifft.
RNA ist eine essenzielle und universelle Komponente für alle Organismen. Es gibt drei Haupttypen von RNA, dieses sind die Messenger-RNA (mRNA), die Transfer-RNA (tRNA) und die ribosomale RNA (rRNA), wobei die letztere der am häufigsten vorkommende Typ ist. Zusätzlich kodieren einige Viren ihre Gene in der Form von RNA, wie beispielsweise die Retroviren, von denen HIV ein Beispiel für einen Typ ist. Andere RNA-Formen umfassen kleine infektiöse RNA-Schleifen, die Viroide genannt werden, von denen PSTV ein Beispiel darstellt. RNA hat viele unterschiedliche Funktionen, wie beispielsweise in der Herstellung von Proteinen und der Speicherung von genetischer Information. Die Fähigkeit von RNA, diese Funktionen auszuführen, hängt ab von ihrer Zusammensetzung und ihren Sequenzen.
mRNA wird aus einer DNA-Matrize durch ein Verfahren natürlich hergestellt, was als Transkription bekannt ist. Es macht weniger als 5 % der gesamten RNA in einer Zelle aus und existiert in hunderten von tausenden von Formen, abhängig von seiner Sequenz, jedoch haben nahezu alle eukaryotischen mRNA eine 5'-CAP-Struktur und einen 3'-Poly(A)⁺-Schwanz, wobei der letztere als ein wesentliches Merkmal für die Reinigung von mRNA aus der Masse der zellulären RNA dient. Es gibt geschätzte 500.000 mRNA-Moleküle in einer durchschnittlichen Säugerzelle. Sie enthält den Kodierabschnitt für ein Protein und ist entscheidend, um die Funktion eines Gens zu verstehen.
Alle RNA-Moleküle sind lineare Makromoleküle, die zusammengesetzt sind aus wiederholt vorkommenden Monomeren (Ribonukleotiden), die eine Base umfassen, einen Ribosezucker und ein Phosphat. Es gibt vier Hauptbasen: Uracil, Cytosin, Guanin und Adenin; die Reihenfolge, in welcher diese miteinander verbunden sind, die Sequenz, führt zu vielen der einzigartigen Eigenschaften von RNA.
RNA unterscheidet sich chemisch von DNA auf zwei hauptsächliche Weisen. Zum einen enthält es Uracil anstatt von Thymin, und zum zweiten weist RNA eine 2'-OH-Gruppe an dem Ribosezucker anstatt von 2'-H auf, die an dem Desoxyribosezucker von DNA (siehe 1a) zu finden sind.
Bei natürlicher RNA ist das 2'-Kohlenstoffatom an die zwei anderen Kohlenstoffatome (C1' und C3') gebunden, ein Wasserstoffatom und ein Sauerstoffatom, welche Teile einer Hydroxylgruppe bilden (hier als die 2'-OH-Gruppe genannt). Die 2'-OH-Gruppe stattet RNA mit vielen seiner einzigartigen Eigenschaften, wie seine Struktur, Reaktivität und Instabilität, aus. Die 2'-OH-Gruppe kann ebenfalls bei der Spaltung der Phosphodiester-Bindungen zwischen Ribonukleotiden dienen, die zu Kettenspaltung und somit zu RNA-Abbau (siehe 1b) führt.
Wenn RNA für irgendeine Anzahl von üblichen Laborpraktiken verarbeitet wird, führt seine inherente Instabilität zu beachtlichen technischen und experimentellen Schwierigkeiten. Beispielsweise wird das Messen der Häufigkeit und der Größe einer speziellen mRNA-Spezies häufig als wesentlich erachtet, um die Funktion eines Gens zu verstehen. Wenn diese spezielle mRNA bei der Untersuchung abgebaut wird, selbst, wenn dies nur zu einem geringen Ausmaß erfolgt, wird es unmöglich, solche Messungen zuverlässig oder exakt auszuführen. Ein anderes Beispiel wäre die Synthese einer cDNA-Kopie von einer mRNA, wobei Abbau der mRNA jede Möglichkeit ausschließt, eine vollständige und repräsentative cDNA zu erhalten. Solche cDNA-Kopien werden als wesentliche experi mentelle Werkzeuge angesehen, da sie eine vollständige und exakte Charakterisierung des Gens beispielsweise hinsichtlich seines Expressionsmusters und der Lokalisierung der Chromosomen gestatten. Ferner ist die cDNA wesentlich, um rekombinantes Protein herzustellen.
Das Schützen der RNA vor Abbau, während ihre biologische Aktivität erhalten bleibt, ist eine wesentliche Aufgabe für jeden Wissenschaftler oder Techniker. Die Schwierigkeit der Entfernung der Nuklease-Aktivität aus der RNA und die Leichtigkeit, diese zufällig einzuführen, verhindert jedoch häufig die erfolgreiche RNA-Verarbeitung für alle, ausgenommen derjenigen mit der höchsten Erfahrung. Die Kosten- und Zeitbetrachtung des RNA-Transports und der -Lagerung, die Sterilisation des Kits, der Erwerb von Einwegplastikware, das Ausbilden des Personals, und wiederholt fehlgeschlagene Experimente sind ein signifikanter Bestandteil jedes Laborbudgets.
Der bedeutsamste Aspekt der Reinigung von RNA ist der, den Abbau durch RNasen zu verhindern. RNasen können aus drei Quellen eingeführt werden: (1) aus intrazellulären Quellen auf Grund der Übertragung aus der Experimentprobe, (2) aus externen Quellen wie Sekreten der Haut des Wissenschaftlers und (3) gereinigten RNasen, die für die DNA-Reinigung verwendet werden. RNasen sind wirklich allgegenwärtig; sie können in Fingerspitzensekreten, Staub, Mikroben, nahezu in allen biologischen Materialien gefunden werden, und sogar leichte Kontamination wird unvermeidlich, zu RNA-Abbau führen. Erledigen des Problems ist die übliche Verwendung hochkonzentrierter RNase in vielen DNA-Reinigungskits.
Es gibt zwei Hauptmittel, durch welche die 2'-OH-Gruppe der Ribonukleotide modifiziert werden kann, (a) enzymatisch und (b) chemisch. Die enzymatische Modifikation der 2'-OH-Gruppe erwächst aus hochspezifischen Enzym-katalysierten Reaktionen. Beispielsweise modifiziert die Ribonukleotidreduktase das Monomer Ribonukleosiddiphosphat, wohingegen ein ganzes RNA-Molekül nicht als ein Substrat erkannt wird. Ein weiteres Beispiel ist die Methyltransferase, welche ein ganzes RNA-Molekül als ein Substrat verwendet, jedoch nur wenige 2'-OH-Gruppen pro Molekül modifiziert.
Die chemische Synthese von RNA und DNA ist gut bekannt und viele Firmen bieten auf den Kunden zugeschnittene RNA- und DNA-Synthesen an (zum Überblick siehe Eaton, (1995), Annu. Rev. Biochem. 64, 837). Es existiert eine bemerkenswerte Sammlung von publizierten Arbeiten, welche die unterschiedlichen Näherungen an ihre Synthese beschreiben (zum Nachschlagen siehe: Usman und Cedergreen (1992) TIBS 17:334). Schutzgruppen wurden besprochen (Greene und Wuts (1991), Protective Groups in Organic Synthesis, 2. Ed., Wiley Interscience). Der bestbekannte Weg zur Darstellung von 2'-modifizierten Ribopyrimidinen ist der durch die Einführung von Nukleophilen in den korrespondierenden 2,2'-Anhydropyrimidin-Vorläufer. Diese Reaktion ist beschränkt auf die Darstellung von 2'-Halogeniden, 2'-Aziden, 2'-Thiolaten (Moffatt, (1979) in: Nucleoside Analogues, Edition Walker, pp. 71-163, NY, Plenum., Townsend, (1988) Chemistry of Nucleosides and Nucleotides, pp 59-67, NY, Plenum), 2'-Azido-(Verheyden, et al., (1971) J. Org. Chem. 36:250) und 2'Amino-Ribonukleoside (Wagner, et al., (1972) J. Org. Chem 37:1876). Methylierung der 3',5'-geschützten Vorläufer ergibt 2'-O-Methyl-Ribonukleoside (Sproat, et al., (1991) Oligonucleotides and Analogues: A Practical Approach, Edition F. Eckstein, pp 49-86, NY. Oxford Univ. Press), und ebenfalls 2'-O-Alkyl- und 2'-O-Allyl-Derivate wurden dargestellt (Sproat, (1991) Nucleic Acids Res. 19:733, Lesnik, et al., (1993) Biochemistry. 32, 7832). Andere Modifikationen schließen 2'-Methyl (Matsuda, et al., (1991) J. Med.I Chem. 34:234), 2'-Phenyl-, 2'-Alkyl-Ribonukleoside (Schmit (1994) Synlett. 234), 2'-azetylierte (Imazawa, et al., (1979), J. Org. Chem. 44:2039), 2'-Fluor-, 2'-Trifluormethyl-(Schmit, (1994) Synlett. 241), 2'-Merkapto-(Imazawa, et al., (1975) Chem. Pharm. Bull. 23:604) und 2'-Thio-Ribonukleoside (Divakar, et al., (1990) J. Chem. Soc. Perkin Trans. 1.969). 2'-Fluor-, 2'-O-Methyl-, 2'-O-Propyl- und 2'-O-Pentyl-Nukleotide wurden jeweils in Oligoribonukleotide inkorporiert (Cummins, (1995) Nucleic Acid Research 23:2019). In jedem Fall sind die Substrate und Produkte nicht polymerisiert, das heißt, sie existieren als einzelne Monomere und nicht in der Polyribonukleotid-(RNA-) Form.
Praktische Anwendungen solcher 2'-modifizierten Ribonukleotide und Polyribonukleotide umfassen antivirale Aktivität (Wohlrab, et al., (1985) Biochem.y Biophys. Acta 824:233), Inhibierung des Bakterienwachstums (Salowe, et al., (1987) Biochem. 26:3408) und Antisense-Oligonukleotide (Pieken, et al., (1991) Science 253:314). Die US 5859221 beschreibt 2'-modfizierte Oligonukleotide, welche die Aktivität von DNA und RNA modulieren. Iribarren et al. beschreiben in PNAS 87:7747-7751 (1990) die Verwendung von 2=O-Alkyl-Oligoribonukelotiden als Antisense-Sonden. Es wurde gezeigt, dass 2'-O-Methoxyethyl-Austausch der 2'-OH-Gruppe bevorzugte Konformationen zur Verbesserung der Bindung an eine Ziel-RNA bereitstellen kann. Wissenschaftliche Anwendungen umfassen das Entwickeln neuer Liganden durch das SELEX-(systematische Evolution von Liganden durch Exponentialanreicherung) Verfahren (Gold, et al., (1995) Annu. Rev. Biochem. 64:763) und Ribozym-Forschung (Uhlenbeck, et al., (1987) Nature 328:596). Die Modifikation der 2'-OH-Gruppe als Forschungswerkzeug wurde besprochen (Heidenreich, (1993) FASEB J., 7:90) Viele der 2'-modifizierten Ribonukleotidtriphosphate (Amersham International, Buckinghamshire, UK) oder Polymere (Midland Certified Reagent Company, Texas, USA) sind im Handel erhältlich. Sproat in J. Biotech. 41:221-238 (1995) hat ferner die Chemie und Anwendungen von Oligonukleotid-Analogen besprochen und erwähnt 2'-Modifikation von Mononukleotiden.
Es wurden Verfahren, die geeignet sind zur Modifzierung der 5'-OH- und 3'-OH-Gruppen von Desoxyribose entwickelt, um die DNA-Oligonukleotidsynthese zu erleichtern. So bildet beispielsweise Essigsäureanhydrid in der Gegenwart von N-Methylimidazol und Tetrahydrofuran, was als das "Capping"-Reagenz bezeichnet wird, und allgemein in nahezu allen automatisierten DNA-Synthetisierungsvorrichtungen heutzutage verwendet wird. Andere Anwendungen für Essigsäureanhydrid wurden gefunden, beispielsweise bei der Darstellung von L-Nukleosid-Dimeren (Weis, Infernationale Patenfanmeldung, WO 97/11087).
Studien chemischer Modifikation werden routinemäßig ausgeführt, um Protein-RNA-Interaktionen (Jones et al., (1994) in RNA Isolation and Analysis. Bios. Oxford; Hecht (1996) Bioorganic Chemistry Nucleic Acids, Oxford University Press) zu analysieren. Chemische Modifikation wird für gewöhnlich mit Diethylpyrokarbonat durchgeführt (Green et al., (1995) J. Mol. Biol. 247:60), was die Purinbase oder Hydrazin modifiziert, welche Pyrimidine spaltet. Für DNA-Footprinting-Untersuchungen wird die Ethylnitro-Harnstoffbehandlung verwendet, um die Phosphate zu modifizieren, was zu Ethylphosphotriester-Bildung führt (Siebenlist and Gilbert (1980) Proc. Nat'l. Acad. Sci. 77:122; Green et al., (1995) J. Mol. Biol. 247:60). Alternativ kann DNA mit Dimethylsulfat behandelt werden, was zur Alkylierung an der Base führt (Carey (1989) J. Biol. Chem. 264:1941).
Über Modifikation der RNA-Ketten unter Verwendung chemischer Reaktionen wurde in unterschiedlichen Artikeln berichtet. Spezifisch modifizierende Chemikalien, welche verwendet wurden, umfassen Dimethylsulfat, was zu Basenmodifikation führt (Bollack et al., (1965) Bull. Soc. Chim. Biol. 47:765-784), N-Chlorsuccinimid führt zur Basenmodifikation und RNA-Abbau (Duval und Ebel, (1967) Bull. Soc. Chim. Biol. 49:1665-1678; Duval und Ebel, (1966) C.R. Acad. Sc. Paris t. 263:1773 series D), N-Bromsuccinimid (Duval und Ebel, (1965) Bull. Soc. Chim. Biol. 47:787-806), Diazomethan führt zu Methylierung der Base, und Phosphat bewirkt Zusammenbruch der RNA (Kriek und Emmelot, (1963) Biochemistry 2:733), Carbodiimid führt zu Basenmodifikation (Augusti-Tocco and Brown (1965) Nature 206:683), Alkylhalogenide führen zu Basen- und Phosphatmodifikation (Ogilvie et al., (1979) Nucleic Acids Res. 6:1695), und Allylbromid führt zu Guaninmodifikation und Kettenabbau (Bollack und Ebel, (1968) Bull. Soc. Chim. Biol. 50:2351-2362). Es wurde berichtet, dass die Verwendung von Essigsäureanhydrid in DMF zu Acylierung von Cytosin führt (Keith und Ebel (1968) C.R. Acad. Sc. Paris t. 266:1066 series D). Methylsulfat wurde verwendet, um die Basen einer RNA-Matrize zu modifizieren (Louisot et al., (1968) Annales de L'Institut Pasteur, 98). Die Ergebnisse solcher chemischer Modifikationsreaktionen von RNA sind daher Abbau, Basen- und/oder Phosphatmodifikation.
Eine andere Arbeit hat die Acylierung der Base Uridin von tRNA (Glu) unter Verwendung von Benzoesäure-Anhydrid gezeigt, aber nicht die 2'-OH-Gruppen (Cedergreen et al., (1973) Biochem. 12:4566-4570). Cedergreen zeigte mit der Verwendung von Benzoesäure-Anhydrid, Phthalsäureanhydrid, N-Benzoylimidazol und Acetylimidazol, dass es nur eine Hauptstelle der Modifikation an tRNA gibt und dass ein Molekül Anhydrid mit einem Molekül an tRNA reagiert. Die Autoren schließen, dass die Acylierung an der Basenkomponente geschieht.
Die freie Amino-Funktion der Base ist häufig N-acyliert, wenn das Nukleotid oder Nukleosid mit einem Anhydrid, wie beispielsweise Essigsäureanhydrid, oder einem Säurechlorid in wasserfreiem Pyridin behandelt wird. In der Tat wird dieses Verfahren häufig verwendet, um die Amino-Gruppe der Nukleoside zu schützen (Brimacombe et al., (1968) Czech. Chem. Commn. 33:2074); Saneyoshi (1968) Chem. Pharm. Bull. 16:1400; Cedergreen et al., (1971) 49:730; Amarnath and Broom., (1977) Chem. Rev. 77:183). Ferner wurde gezeigt, dass RNA, die mit Essigsäureanhydrid in Dimethylformamid behandelt wurde, spezifisch an der Cytosinbase modifiziert wird, und nicht an der 2'-OH-Gruppe (Keith und Ebel, (1968) Biochim. Biophys. Acta. 166:16-28). Es ist gut bekannt und weithin berichtet, dass Ribonukleotide in Pyridinlösung ausschließlich die Base acetylieren.
Die Arbeit von Chang und Lee (Biochemistry (1981) 20:2657) zeigten die Methylierung von RNA unter Verwendung von Methylmethansulfonat. Sechs Methylierungsstellen wurden identifiziert, 5 an der Base und eine an dem Phosphat.
Dieser Hauptteil an Arbeiten, zusammen genommen, suggeriert stark, dass chemische Behandlung von Nukleinsäuren wahrscheinlich zu der Modifikation entweder von den Basen oder des Phosphats mit oder ohne RNA-Abbau führen würde. Dies ist nicht überraschend, wenn man die chemische Reaktivität dieser Gruppen betrachtet. Das Erhalten von 2'-OH-regiospezifischer Modifikation von RNA ist die Grundlage dieser Erfindung.
(2'-Azido-2'-Desoxyuridylsäure) wurde dargestellt (Torrence, (1972) J. Amer. Chem. Soc. 94:3638:3639). Pyridin-katalysierte quantitative Beispiele von Acetylierung sind beschrieben für 3'-Hydroxynukleotide (Weber und Khorana, (1972) J. Mol. Biol. 72:219; Zhdanov und Zhenodarova, (1975) Synthesis 222).
Das Acetylierungsverfahren wurde zuerst von Khorana und Kollegen beschrieben (Stuart und Khorana (1963) J. Biol. Chem. 85:2346), die die terminate 3'-OH-Gruppe der Desoxyribonukleotide und Oligonukleotide mit Essigsäureanhydrid acetylierten. Es wurde keine Modifikation der Basen beobachtet, da die Acetylierung in der Gegenwart von stark basischen Lösungsmitteln wie Pyridin oder Tributylamin durchgeführt wurde (Michelson und Grunberg-Manago, (1964) Biochem. Biophys. Acta, 91:92).
Acetylierung eines tRNA-Moleküls wurde unter Verwendung von Essigsäureanhydrid durchgeführt. Eine Änderung in der Sekundärstruktur wurde berichtet (Knorre, et al., (1965) Biokhimiya 30:1218). Modifikation von 30 % der 2'-OH-Gruppen von tRNA wurde als für die Zerstörung der Sekundärstruktur verantwortlich gefunden. Weitere Arbeiten derselben Wissenschaftler zeigten, dass variable Acetylierungsniveaus von tRNA (Knorre, et al., (1966) Biokhimya 31:1181) und Polyribo-Oligonukleotiden (Knorre, et al., (1967) Biochim. Biohpys. Acta 142:555) durch die Verwendung von Essigsäureanhydrid und N,N-Dimethylformamid erzielt werden könnten. Es wurde ebenfalls gezeigt, dass acetyliertes Poly(U) seine Fähigkeit zur Bindung von Wasserstoff mit Poly(A) verlor. Acetylierte Formen von Poly(U) und Poly(A) wurden als nahezu unfähig beschrieben, um die Polypeptidsynthese in einem zellfreien System durchzuführen (Knorre, et al., (1967) Molekul. Biol. 1:837).
In jüngerer Zeit wurde in einer Publikation beschrieben, dass mRNA aus einem zellfreien Transkriptionssystem als ein Substrat zur Acetylierung verwendet wurde (Ovodov und Alakhov, (1990) FEBS 270:111). Acetylierung von 70-75 % der 2'-OH-Gruppen wurde als erhalten angegeben unter Verwendung des Verfahrens von Knorre et al. Die Ergebnisse, die in der Publikation gezeigt wurden, suggerieren jedoch das Gegenteil. 19 zeigt keine Änderung des Molekulargewichts und indiziert, dass tatsächlich keine Modifikation stattgefunden hat.
Xin und Wang berichten in "Antisense and Nucleic Acid Drug Development" 8:459-468 (1998) über die Verwendung von FDNB, um Oligoribonukleotide von 19 oder 20 Nukleotiden Länge zu modifizieren.
Zusammenfassung der Erfindung
Nach einem ersten Aspekt stellt die vorliegende Erfindung ein Polynukleotid von zumindest 1000 Nukleotiden Länge, umfassend mRNA, rRNA oder virale RNA, bereit, wovon mehr als 25 % der Riboseringe kovalent an der 2'-OH-Position modifiziert sind. Die Erfin dung erstreckt sich nicht auf Polynukleotide, die nur aus DNA bestehen oder Verwendungen von Polynukleotiden, die nur aus DNA bestehen.
Gemäß einem zweiten Aspekt stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Darstellung eines modifizierten Polynukleotids von zumindest 1000 Nukleotiden Länge bereit, welches (i) das Kontaktieren von RNA in einem Reaktionsmedium umfasst, umfassend Polyribonukleotide von zumindest 1000 Nukleotiden Länge, mit einem Reaktionspartner, der fähig ist zur kovalenten Modifizierung der 2'-OH-Position des Riboserings der RNA; (ii) Reagieren der RNA mit den Reaktionspartnern zur Darstellung modifizierter Polynukleotide unter Bedingungen, um kovalente Modifikationen von mehr als 25 % der 2'-OH-Positionen der Riboseringe zu erzielen; und (iii) optional Abtrennen der modifizierten Polynukleotide aus dem Reaktionsmedium, wobei das Reaktionsmedium zumindest 20 % v/v-organisches Lösungsmittel umfasst, und das Reaktionssystem in der Lage ist, die kovalente Modifikation in einer Stunde oder weniger zu erreichen. Die RNA kann mRNA, tRNA, rRNA, virale RNA, synthetische RNA sowie chemisch synthetisierte oder in vitro transkribierte Formen sein, oder jede andere Form von RNA, wie beispielsweise hnRNA und viroide RNA. The RNA kann eine Mischung unterschiedlicher Typen von RNA sein und kann in einzel- oder doppelsträngiger Form vorliegen, linear oder ringförmig sein und sogar interne Bereiche von Sekundärstrukturen umfassen, wie die für gewöhnlich in tRNA, mRNA und viraler RNA gefundenen. Gemäß der vorliegenden Erfindung hat ein Oligonukleotid grundsätzlich eine Sequenzlänge von bis zu 80 Basen und ein Polynukleotid hat grundsätzlich eine Sequenzlänge von mehr als etwa 80, vorzugsweise mehr als etwa 100 Basen. Eine bevorzugte Länge für ein Polynukleotid ist 1000 Basen.
Die mRNA kann eine Kappe und/oder einen PolyA-Schwanz haben oder nicht. Die mRNA oder virale RNA, die in der vorliegenden Erfindung verwendet wird, ist vorzugsweise natürlich vorkommend. Eine natürlich vorkommende RNA gemäß der vorliegenden Erfindung umfasst typischerweise eine Nukleotidsequenz, welche in der Natur vorkommt und welche grundsätzlich ein Polypeptid kodiert, welches biologische Aktivität aufweist, oder eine solche Nukleotidsequenz, welche modifiziert ist, beispielsweise, um auf einigen Wegen die biologische Aktivität des hierdurch kodierten Polypeptids zu ändern. Während die natürlich vorkommende RNA vorzugsweise durch Transkription aus einer geeigneten Matrize erhalten wird, wobei sie selbst für gewöhnlich natürlich vorkommt, kann in manchen Fällen die natürlich vorkommende RNA synthetisch erhalten werden. mRNA gemäß der vorliegenden Erfindung umfasst keine einfachen Homopolynukleotide (PolyA, PolyU, PolyG und PolyC), welche synthetisch erzeugt werden können, biologisch jedoch nicht funktionell sind.
Wie nachfolgend detaillierter beschrieben, können andere Schritte des Verfahrens (iv) die Verwendung der modifizierten RNA als eine Matrize umfassen, um einen zweiten Komplementärstrang an RNA oder DNA zu produzieren (4), und (v) Ligieren geeigneter DNA-Fragmente, wie beispielsweise eines Plasmidvektors an die Enden des Moleküls, um es zu klonen und fortzupflanzen. Ein wichtiger Aspekt dieser Erfindung ist die Modifikation von mRNA und viraler RNA, da es ein Hauptinteresse der Wissenschaft ist und als ein gutes Beispiel für die aufgezählten Probleme bei der Verarbeitung von RNA dient. Die Erfindung stellt ferner Verfahren zum Erhalten intakter Kopien von mRNA vollständiger Länge und anderer Typen von RNA bereit, die aus zellulären Quellen isoliert sind, die eine gesteigerte Stabilität bezüglich der Bedingungen zeigen, die andernfalls einen Hauptanteil der unmodifizierten RNA zerstören würden.
Modifikation an der 2'-OH-Position ist vorzugsweise im Wesentlichen regiospezifisch. Daher gibt es vorzugsweise im Wesentlichen keine Modifikation an den Basen, Phosphordiesterbindungen und/oder jeder anderen Position innerhalb der RNA-Kette, ausgenommen der 5'-OH- und 3'-OH-Gruppen. Auf diese Weise behält das Polynukleotid wichtige Eigenschaften der RNA. Vorteilhaft ist beispielsweise das Polynukleotid vorzugsweise modifiziert, so dass ein Einzelstrang des Polynukleotids durch eine Nukleinsäure-Polymerase reproduzierbar ist, um einen zweiten Strang an Polynukleotid komplementär zu dem Einzelstrang zu erzeugen.
Das Ausmaß der Modifikation an der 2'-OH-Position an den Riboseringen ist nicht besonders begrenzt und kann gemäß der Anwendung des modifizierten Polynukleotids variieren. Grundsätzlich kann das Polynukleotid so modifiziert sein, dass ein Anteil der Riboseringe an der 2'-OH-Position modifiziert ist, wobei die Modifikation vorzugsweise ausreichend ist, um das Polynukleotid gegen Nukleaseabbau zu schützen, insbesondere gegen zelluläre Endonukleasen und/oder intrazelluläre Konzentrationen an Nukleasen. Das beanspruchte Polynukleotid der vorliegenden Erfindung weist zumindest 25 % seiner Riboseringe an der 2'-OH-Position modifiziert auf. In anderen Ausführungsbeispielen der vorliegenden Erfindung sind vorzugsweise zumindest 25 %, stärker bevorzugt zumindest 50 % und sogar noch stärker bevorzugt zumindest 75 % der Riboseringe kovalent modifiziert. Bei den am meisten bevorzugten Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung sind zumindest 80 %, stärker bevorzugt 85 % der Riboseringe an der 2'-OH-Position kovalent modifiziert, darüber hinausgehend sind 90 % stärker bevorzugt und am meisten bevorzugt sind zumindest 95 % der Riboseringe kovalent an der 2'-OH-Position modifiziert.
Messen des prozentualen Anteils der Modifikation an RNA
Auf Grund der polymeren Natur von RNA ist es schwierig, ihr Molekulargewicht bei über 100 Nukleotiden unter Verwendung der Massenspektrometrie zu messen, da ein großer Anteil an RNA-Abbau während des analytischen Verfahrens erfolgt. Es wurden jedoch RNA (tRNA) bis zu 142 Nukleotiden (Nordhoff et al., (1993) Nucleic Acids Res. 21:3347; Gruic-Sovulj et al., (1997) Nucleic Acids Res. 25:1859; Tolson und Nicholson (1998) Nucleic Acids Res. 26:446) und doppeltsträngige DNA bis zu 500 Basenpaaren (Bai et al. (1995) Rapid Comm. Mass Spectrom. 9:1172; Taranenko et al., (1998) Nucleic Acids Res. 26:2488; Ausdall und Marshall (1998) Anal. Biochem. 256:220) unter Verwendung der MALDI-Massenspektrometrie gemessen (zum Nachschlagen siehe Smith (1996) Nat. Biotech. 14:1084; Murray (1996) J. of Mass Spectrom. 31:1203). Phosphat (Schuette et al., (1995) J. Pharm. Biomed. Anal. 13:1195; Sinha et al., (1994) Nucleic Acids Res. 22:3119) und chemisch modifizierte Oligonukleotide (Potier et al., (1994) Nucleic Acids Res. 22:3895) wurden ebenfalls unter Verwendung von Massenspektrometrie gemessen.
Obwohl es eine Molekulargewichtsbegrenzung auf einige Hunderte von Nukleotiden gibt, wenn Massenspektrometrie verwendet wird, stellt sie ein einfaches automatisiertes Mittel zur exakten Bestimmung des exakten Molekulargewichts und daher des Prozentanteils der Modifikation eines Polynukleotids bereit. Die Optimierung ist auf eine Anzahl von Faktoren gestützt, wie beispielsweise dem Typ der ausgeführten Massenspektrometrie (electro-spray, MALDI-TOF, etc.), auf dem Verfahren, welches zur Reinigung der modi fizierten RNA bei der Modifikationsreaktion verwendet wird, der Größe der Polynukleotide, der verwendeten Ionisierungsmatrix, dem Verfahren, welches zur Entfernung von Kationen aus der RNA verwendet wird, positive oder negative Ionenmodi und der verwendeten Spannungsstärke (Fenn et al., (1989) Science 246:64). Kapillar-Hochleistungs-Flüssigchromatographie kann vor der Massenspektrometrie der RNA auf Grund von Entsalzungs- und anderen Reinigungsschritten verwendet werden, da diese nicht vor der Ionisierung notwendig sind (Taniguchi und Hayashi (1998) Nucleic Acids Res. 26:1481).
Um das Molekulargewicht und somit den Prozentanteil an Modifikation von Polynukleotiden, die aus Tausenden von Nukleotiden bestehen, zu messen, wird eine andere Vorgehensweise verlangt. In bestimmten Situationen, wenn es vorzuziehen ist, dass der Prozentanteil der Modifikation der Polynukleotide unter Verwendung präziserer Mittel gemessen wird, kann ein Abbauschritt, gefolgt von einem analytischen Prozess, eingesetzt werden. Es wird erwartet, dass der Abbau des modifizierten Polynukleotids unter Verwendung chemischer oder enzymatischer Mittel, abhängig von dem verwendeten Verfahren, die 2'-OH-Modifikation an den Ribosezucker gebunden lassen wird und daher erlaubt, dass das Ausmaß der durchzuführenden Modififation mittels Massenspektrometrie oder Hochleistungsflüssigchromatographie (HPLC) ermittelt wird. HPLC und Gaschromatographieanalysen von Nukleotiden wurden beschrieben (Gehrke und Patel (1977) J. Chromat. 130:103; Iwase et al., (1975) J. Chromat. 106:213; Kemp et al., (1982) J. Chromat. 241:325).
Um den Prozentanteil von modifizierten Nukleotiden zu bestimmen, sollte Abbau des Polynukleotids auf die Modifikationsreaktion folgen. Es wurden Verfahren beschrieben bezüglich enzymatischer Spaltungsmethoden unter Verwendung von Ribonukleasen RNase T1, RNase A, RNase U2, RNase PhyM, RNase CL3, Nuklease S7 und Cusativin, chemische Spaltungsverfahren unter Verwendung von Schwefelsäure (Jones et al., (1994) RNA Isolation and Analysis, chapter 3, Bios Scientific Publishers, Oxford) und physikalische Verfahren unter Verwendung von Post-Source-Decay (Hahner et al., (1997) Nucleic Acids Res. 25:1957; Taniguchi und Hayashi (1998) Nucleic Acids Res. 26:1481; Kirpekar et al., (2000) RNA 6:296).
Es muss verstanden werden, dass die 2'-OH-Modifikation den Abbau des Polynukleotids hemmen kann. Es sollte jedoch durch empirische Bestimmung der Empfindlichkeit der modifizierten RNA bezüglich eines Bereichs von Bedingungen in den meisten Fällen möglich sein, die Bedingungen auszuwählen, die für Kettenspaltung geeignet sind. Es wurde beispielsweise gefunden, dass acetylierte RNA schnell durch Nuklease BaI 31 gespalten wird. Während Alkali acetylierte RNA spaltet, kommt dies ebenfalls bei Acetylspaltung vor, und sofern nicht die Menge an gespaltenen Acetylgruppen durch Massenspektrometrie gemessen wird (siehe den Abschnitt mit der Überschrift "Massenspektrometrie von isotopisch markierter RNA"), werden acetylierte Nukleotide nicht detektiert. Beispielsweise kann die saure Spaltung der modifizierten Polynukleotide zur basensensitiven Modifizierung verwendet werden, während Basenspaltung für säuresensitive Modifikationen verwendet werden kann. Es muss ebenfalls verstanden werden, dass andere Abbauprodukte wie Dinukleotide, Trinukleotide etc. ebenso geeignet sein können, um den Prozentanteil der Modifikation der Polynukleotide zu messen. Ob es das Nukleotid, Dinukleotid oder größere Fragmente sind, die gemessen werden, es ist in jedem Fall das Verhältnis der Anzahl von Fragmenten, welche eine Modifikation tragen, verglichen mit der Anzahl von Fragmenten, die keine Modifikation tragen, was den Prozentanteil ergibt.
Andere Verfahren, die in der Lage sind, hochmolekulargewichtige RNA zu messen, wie beispielsweise analytisches Ultrazentrifugieren, um Sedimentationskoeffizienten zu finden (Svedberg-Einheiten), sind ungenau, verlangen hohe Mengen an Ausgangsmaterial und sind abhängig von der Konformation der RNA (zum Nachschlagen siehe Jones et al., (1994) RNA Isolation and Analysis, chapter 3, Bios Scientific Publishers, Oxford). Trotz dieser Nachteile kann analytisches Ultrazentrifugieren unter Verwendung denaturierender Saccharose oder isokinetischer Gradienten nützlich sein, um sehr große Molekulargewichtsänderungen bei reichlich vorhandenen RNA-Proben zu messen.
Es ist nun eher üblich, das Molekulargewicht von Polynukleotiden unter Verwendung elektrophoretischer Trennung in Polyacrylamid oder Agarosegelen zu messen. Detaillierte Beschreibungen der Vorbereitung, Verwendung und Handhabung von Elektrophoresegelen sind beschrieben in unterschiedlichen Publikationen (Sambrook et al., (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, CSH; Jones (1995) Gel Electrophoresis: Nucleic Acids Essential Techniques, Wiley). Denaturierende Gele werden nicht-denaturierenden Gelen vorgezogen, weil diese die konformativen Eigenschaften verringern und damit ein Mittel bereitstellen, um das wahre Molekulargewicht der linearen Polynukleotide zu messen (Jones (1995) Gel Electrophoresis: Nucleic Acids Essential Techniques, page 47, Wiley). Es gibt eine Vielzahl von Denaturierungsmitteln, die verwendet werden können, wie beispielsweise DMSO (50-90 %-ig), Glyoxal (10-30 %-ig), Formaldehyd (3 %-ig w/v), Formamid (50-98 %-ig), Wärme (60-80 °C), Methylquecksilberhydroxid (3-5 mM), Natriumiodacetat (10 mM), 2-Pyrrolidon (5 %-ig) und Harnstoff (6-8 mM). Es ist bekannt, dass nichtvollständige Denaturierung des Polynukleotids zu abweichender Migration führt, so dass mehr als eine denaturierende Bedingung verlangt sein kann, wie beispielsweise 8-molarem Harnstoff + 5% Pyrrolidon, oder 8-molarem Harnstoff, laufen gelassen bei 60 °C (Rosenblum et al., (1997) Nucleic Acids Res. 25:3925). Kapillarelektrophorese stellt ein exzellentes Mittel zur Durchführung solcher Molekulargewichtsbestimmungen dar und es wurden geeignete Verfahren beschrieben für RNA (Engel und Dieguez-Lucena (1993) Nucleic Acids Res. 21:759).
Vergleichende Messungen von Polynukleotidmigration zwischen unterschiedlichen Gelen sind schwierig, weil die durchwanderte Strecke abhängig von dem verwendeten Puffer, der Gelkonzentration und der Temperatur ist. Daher ist es bevorzugt, dass Vergleiche mit sowohl Molekulargewichtsstandard und Probenpolynukleotiden in demselben Gel durchgeführt werden. Es ist ferner bekannt, dass bestimmte Prozentsätze der Siebmatrix, so wie Polyacrylamid oder Agarose, optimal für bestimmte Längen von Nukleinsäuren sind, und oberhalb eines bestimmten Prozentsatzes von Acrylamid oder der Länge von Polynukleotid (der Ausschlussgrenze) Trennung als eine Funktion der Länge nicht vonstatten geht. Daher sollten Messungen des Molekulargewichts innerhalb solcher bekannter Grenzen durchgeführt werden (Sambrook et al., (1989) Molecular Cloning: Laboratory Manual, CSH; Jones (1995) Gel Electrophoresis: Nucleic Acids Essential Techniques, Wiley).
Es wurde festgestellt, dass bei Verwendung eines 20 cm 6-molaren Harnstoff-5-%-igen-Polyacrylamidgels, eine 250 Nukleotid-acetylierte RNA etwa 20 mm von der nichtmodifizierten Form als ein dichtes Band läuft. Daher sollte die Messung des Ausmaßes an Modifikation von kleineren modifizierenden Gruppen als Acetyl (42 Daltons) ausführbar sein. Die acetylierte RNA läuft im Vergleich zu RNA-Größenmarkern ebenfalls an einer Position, von der 100 %-ige Modifikation vorausgesagt wird.
Es ist ebenfalls übliche Praxis, in der Lage zu sein, in einem denaturierenden sequenzierenden Gel DNA-Polynukleotide zu trennen, die sich nur so wenig als 1 Nukleotid bei einer Gesamtlänge von 500 Nukleotiden unterscheiden, d. h., bei 0,2 % oder weniger Unterschied bezüglich der Länge (Sambrook et al., (1989) Molecular Coning: A Laboratory Manual, CSH). Es ist daher vernünftig zu erwarten, dass genaue Messungen bezüglich des Molekulargewichts von RNA-Polynukleotiden in ihren modifizierten und nicht-modifizierten Formen gemacht werden können, wenn die modifizierende Gruppe groß ist, beispielsweise 28 Daltons für Formyl und 42 Daltons für Acetyl. Die Messung des Prozentanteils an Modifikation mit anderen modifizierenden Gruppen kann ebenfalls möglich sein, vorausgesetzt, dass das Molekülmassenwachstum als ein Ergebnis der Modifikation ausreichend ist. Beispielsweise sollte die Halogenierung der 2'-OH-Gruppe leicht für Chlor-(35,4 Dalton) und Brom-(79,9 Dalton) Substitution der 2'-OH-Gruppe gemessen werden können.
Die Berechnung des Prozentsatzes an Modifikation kann durchgeführt werden durch Messung der Migration bekannter RNA-Größenmarkern in einem Gel, wie beispielsweise einem 6M-Harnstoff-5-%-igen-Acrylamid-Sequenziergel, und Auftragen der Migration (in mm) gegen das Molekulargewicht (in Daltons), um eine Standardkurve zu erhalten. Weil die exakten Molekulargewichte all der Marker bekannt sind, ist es direkt möglich, die Beziehung zwischen der Mobilität im Gel gegen die bekannten Molekulargewichte von jedem Marker aufzutragen. Die prozentuale Modifikation für eine RNA bekannter Länge mit einer bekannten Masse der modifizierenden Gruppe kann dann leicht durch Vergleich mit dieser Standardkurve berechnet werden.
Ein alternatives Mittel zur Bestimmung des Prozentanteils der Modifikation ist es, einen radioaktiv markierten Reaktionspartner zu verwenden, wie beispielsweise einen 14C- oder 3H-sauren Anhydrid zum Modifizieren von RNA und dann das molare Verhältnis der radioaktiven Acetylgruppen zu Nukleotiden in einer bekannten Menge an RNA-Probe zu be stimmen. Falls das molare Verhältnis 1:1 ist, sind 100 % der 2'-OH-Gruppen modifiziert. Es muss verstanden werden, dass radioaktive Isotopen in eine große Vielfalt von Reaktionspartnern eingebunden sein können.
Regiospezifität der Reaktion kann bestimmt werden, indem eine identische Sequenz an DNA (oder vorzugsweise einer einsträngigen DNA, die Uracil als Ersatz für Thymin trägt) identischen Reaktionsbedingungen unterzogen wird, wie sie für RNA verwendet wurden.
Es wird erwartet, dass die DNA nicht wesentlich modifiziert wird, wie gemessen wurde durch Einbeziehung von Radioaktivität, Gelelektrophoresemobilität, Massenspektrometrie, HPLC oder jedem anderen analytischen Mittel, welches verwendet wurde, falls die Reaktion regiospezifisch für die 2'-OH-Gruppe ist.
Die Modifikation an der 2'-OH-Position kann derart sein, dass das gesamte OH der 2'C des Riboserings durch eine Gruppe R eines Reaktionspartners ersetzt wird, wie in 2'-R, oder durch OR, mit 2'-OR, wobei die -O-Gruppe aus der 2'-OH-Gruppe herstammen kann, aber nicht muss. Entsprechend ist der Substituent an der 2'-OH-Position in diesem Rall R oder entsprechend OR. Ein Ziel der Modifikation ist es, das Molekül in einem erheblichen Ausmaß vor Abbau zu schützen. Der Abbau kann ein Ergebnis der Nukleasen, Metallionen und/oder hohen Temperaturen sein, von hohem pH-Wert oder anderen chemischen oder physikalischen Bedingungen.
Für den Fachmann wird es offensichtlich sein, dass multiple Typen von Substituenten existieren, welche geeignet sind, diese Erfindung auszuführen. Eine Gruppe an Acylsubstituentenbeispielen (5a) ist hier zur Verdeutlichung gegeben, wobei das Acyl mit dem 2'-Sauerstoff wie in 2'-O-COR verbunden ist, wobei R allein aus Kohlenstoff-, Sauerstoff- und Wasserstoffatomen in einer linearen Kettenanordnung bestehen kann, wie in -COCH₂CH₂CH₂CH₃, in einer verzweigten Kettenanordnung wie in -COC(CH₃)₃ oder in einer Ringstruktur wie in COC₆H₅. Es muss ferner verstanden werden, dass Wasserstoff durch andere Atome ersetzt werden kann wie in -COCH₂Cl oder -COCF₃, und dass Kohlenstoffatome mit einem weiteren Kohlenstoffatom durch eine oder mehrere Bindungen verbunden werden können, wie in dem Crotonat -COCH₂CH=CHCH₃, oder ein oder mehrere Sauerstoffatome wie in dem Ether -COCH₂CH₂OCH₃ oder Karbonat -COOCH₂CH₃ oder einer Kombination von beiden. Ferner können andere Atome wie Stickstoff, Silizium und Schwefel ebenso vorhanden sein. Ein einzelnes RNA-Molekül kann mehr als einen Typ von Substituenten an jeder seiner 2'-OH-Positionen tragen, wodurch gemischte Substituenten-RNA-Ketten erzeugt werden.
Die modifizierten Riboseringe können an der 2'-OH-Position eine Vielzahl von Substituenten tragen. Substituenten können die Formel OR haben, wobei R ausgewählt wird aus: C1-C10 Alkyl, C1-C10 Alkenyl, C1-C10 Alkynyl, C1-C10 Haloalkyl, C1-C10 Aminoalkyl, C1-C10 Haloalkoxyalkyl, C1-C10 Aminoalkoxyalkyl, C6-C14 Aryl, C6-C14 Alkylaryl, C6-C14 Arylalkyl, C6-C14 Arylalkenyl, C1-C10 Alkanoyl, C1-C10 Alkenoyl, C1-C10 Haloalkanoyl, C1-C10 Dihaloalkanoyl, C1-C10 Trihaloalkanoyl, C2-C10 Haloformylalkanoyl, C1-C10 Aminoalkanoyl, C6-C14 Arylalkanoyl, C6-C14 Arylalkenoyl, C1-C10 Alkoxyalkanoyl, C6-C14 Aryloxyalkanoyl, C6-C14 Alkylarylalkanoyl, C1-C10 Azidoalkanoyl, C1-C10 Carboxyalkanoyl, C1-C10 Carboxyalkenoyl, C1-C10 Carboxyalkynoyl, C6-C14 Haloarylalkanoyl, C6-C14 Aminoarylalkanoyl, C7-C15 Alkylaminoarylalkanoyl, C1-C10 Haloalkenoyl, C1-C10 Haloalkynoyl, C1-C10 Alkylsilanyl, C3-C10 Trialkylsilanyl, C1-C10 Alkoxycarbonyl, C3-C18 Alkylthioalkoxyalkoxycarbonyl, C1-C10 Alkenyloxycarbonyl, C3-C18 Alkoxyalkoxyalkyl, C2-C12 Alkoxyalkyl, C2-C12 Alkylthioalkyl, C1-C10 Alkylsulfonyl, C12-C28 Diarylphosphon;
In diesem Fall wird R vorzugsweise ausgewählt aus: Methyl, Ethyl, Vinyl, Allyl, Ethynyl, 2-Chlorethyl, 2-Aminoethyl, Ethyloxyethyl, Methoxymethyl, Methylthiomethyl, Methoxyethoxymethyl, (2-Chlorethyl)oxyethyl, (2-Aminoethyl)oxyethyl, Phenyl, 4-Methylphenyl, Benzyl, Cinnamyl, Formyl, Acetyl, Propanoyl, Butanoyl, Pentanoyl, Hexanoyl, Heptanoyl, Octanoyl, Nonanoyl, Pivaloyl, Isobutanoyl, Isopentanoyl, Carboxyacetyl, Chloroformylnonanoyl, 3-Carboxypropanoyl, 4-Aminobutanoyl, 4-Chlorbutanoyl, Chloracetyl, Dichloracetyl, Trifluoracetyl, Trichloracetyl, 3-Azidopropanoyl, 4-AzidoButteryl, Acryloyl, Propionoyl, Crotonoyl, Benzoyl, Diphenylacetyl, Phenoxyacetyl, Methoxyacetyl, Methoxycarbonyl, 2-(Methylthiomethoxy)ethoxycarbonyl, Vinyloxycarbonyl, 4-Methylbenzoyl, 4-Chlorobenzoyl, 2-Methylaminobenzoyl, 2-Aminobenzoyl, 4-Aminobenzoyl, 4-Nitrobenzoyl, Cinnamoyl, Silanyl, Trimethylsilanyl, Triethylsilanyl, Tripropylsilanyl, Triisopropylsilanyl, t-Butyldimethylsilanyl, 2-Chlorophenyl, (4-nitrophenyl)phosphono und Methylsulfonyl. Alternativ kann der Substituent R' sein, wobei R' ausgewählt ist aus: Methyl, Ethyl, Vinyl, Allyl, Ethynyl, t-Butyl, 2-Chloroethyl, 2-Aminoethyl, Ethyloxyethyl, Phenyl, Benzyl, Fluoro, Chloro, Bromo, Iodo, Amino.
Vielerlei Reaktionspartner oder Reaktionspartnerkombinationen können verwendet werden, optional in der Gegenwart eines Katalysators, um diese Substituenten zur Verfügung zu stellen, wie in den nachstehenden Beispielen detaillierter beschrieben wird. Vorteilhaft umfasst der Reaktionspartner ein Säureanhydrid, ein Säurechlorid, eine Carboxylsäure, ein Acylzyanid, ein N-Acylimidazol, ein Alkoxyalkylhalogenid, ein Alkylthioalkylhalogenid, ein Alkoxyalkoxyalkylhalogenid, ein Trialkylsilanhalogenid oder ein Trialkylsilanimidazol, wobei jeder von diesen Reaktionspartnern an einer Acylierungsreaktion, Silylierung (5b) oder Alkoxyalkylierung (5c) mit der RNA teilnimmt. Unter diesen Reaktionsbedingungen kann das Reaktionsmedium ferner einen Acylierungskatalysator umfassen. Beispielsweise kann, wenn der Reaktionspartner ein Säureanhydrid umfasst, dieser mit der RNA in der Gegenwart eines Katalysators wie eines Fluoridions oder eines Aminopyridins zur Reaktion gebracht werden. Als ein weiteres Beispiel kann, wenn der Reaktionspartner ein Säurechlorid oder N-Acylimidazol umfasst, der Reaktionspartner mit der RNA in der Gegenwart eines Aminopyridins abreagiert werden. Als ein weiteres Beispiel kann dies, wenn der Reaktionspartner eine Carboxylsäure umfasst, mit der RNA in der Gegenwart eines Dehydrierungsmittels oder eines Katalysators, wie beispielsweise eines Isozyanidkatalysators, abreagiert werden. Ein bevorzugter Aminopyridin-Katalysator ist Dimethylaminopyridin (DMAP). Wenn die RNA formyliert werden muss, wird vorzugsweise ein Katalysator zugefügt, besonders wenn das eingesetzte Lösungsmittel THF ist, um die Reaktionsgeschwindigkeit zu steigern. Zwei geeignete Katalysatoren für diesen Aspekt der Erfindung sind Dimethylaminopyridin (DMAP) mit 5 mg/ml oder bevorzugter, 1-Methylimidazol mit 160 mg/ml. Von beiden Katalysatoren ist bekannt, dass sie Acylierungsreaktionen fördern (siehe Bull. Soc. Chem. Fr. (1973) 1021). Mischungen von DMAP (5 mg/ml) und 1-Methylimidazol (160 mg/ml) können eingesetzt werden, vorzugsweise in THF. Es gibt eine reiche Gasproduktion, wenn 1-Methylimidazol als der Formylierungskatalysator verwendet wird. Keine Gasproduktion wird beobachtet, wenn DMAP als der Katalysator dient. Andere Acylierungskatalysatoren, wie beispielsweise Aminopyridine (4-Pyrrolidinopyridin, 2-Hydroxypyridin), Tributylphosphin, können ebenso in diesem Hinblick der vorliegenden Erfindung verwendet werden.
Alternativen zu DMAP, 4-Pyrrolinopyridin- und 1-Methylimidazolkatalysatoren zur Acylierungsreaktion unter Verwendung von Säureanhydriden sind TaCl₅ (Chandrasekhar, et al., (1998) Tetrahedron Lett. 39:3263), TMSOTf (Procopiou et al., (1998) J. Org. Chem. 63:2342), Sc(OTf)₃ (Zhao et al., (1998) J. Org. Chem. 63:7559), Bu₃P (Vedejs et al., (1993) J. Am. Chem. Soc. 115:3358), COCl₂ (Iqbal und Srivastava, (1992) J. Org. Chem. 57:2001), Montmorillonit K-10, KSF (Li et al., (1997) Chem. Comm. 1389) und Cu(OTf)₂ (Saravanan und Singh (1999) Tetrahedron Lett. 40:2611).
Verschiedene Enzyme sind in der Lage, Acylgruppen zu übertragen, wie beispielsweise Acetyl oder Benzoat aus einem geeigneten Donormolekül, wie beispielsweise Vinylacetat bzw. Vinylbenzoat an einen Alkohol. Solche Enzyme können in der vorliegenden Erfindung eingesetzt werden. Andere aktivierte Acyldonoren umfassen Isoprenylalkanoate, Oximester, symmetrische Anhydride oder gemischte Carboxylsäure-Kohlensäure-Anhydride (Guibé-Jampel et al. (1996) Tetrahedron 52:4397). Solche Enzyme umfassen Lipasen wie diejenigen, die aus Pseudomonas fluorescens (Boaz. (1989) Tetrahedron Lett. 30:2061), Candida cylindracea (Holla (1989) Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 28:220), Schweinepangreaslipase (Guibé-Jampel et al. (1996) Tetrahedron 52:4397) und Mucor miehei. Solche Acylierungsreaktionen können entweder in wässrigem oder organischem Lösungsmittel wie beispielsweise Tetrahydrophoran, Pyrridin, durchgeführt werden. Organische Lösungsmittel können daher nutzbringend sein, dass sie in der Lage sind, einen weiten Bereich an Molekülen zu lösen (Ciuffreda et al. (1999) Biorg. Med. Chem. Lett. 9:1577).
Esterasen wie beispielsweise Lipasen aus Candida albicans, Candida cylindracea oder Pankreaslipase vom Schwein können sowohl Acylgruppen addieren oder entfernen (Hennen et al., (1988) J. Org. Chem. 53:4939; Kloosterman et al., (1987) Tetrahedron Lett. 28:2989). Enzymatische Hydrolyse kann herbeigeführt werden in wässriger Lösung durch Mischen acylierfer RNA-Substrate mit geeigneten Esterasen in einer wässrigen gepufferten Lösung, einer wässrig-organischen oder organischen Lösung.
Vorteile der enzymatischen gegenüber der chemischen Deacylierung (3) sind zunächst die, dass die Puffer und der pH kompatibel mit anderen Enzymen wie den reversen Transkriptasen sind, und zweitens, dass Deacylierung mit Ammoniak beispielsweise zum Abbau der RNA-Kette führen kann, falls das Ammoniak nicht entfernt oder neutralisiert wird. Im Gegensatz würde bei der folgenden enzymatischen Deacylierung die RNA-Kette intakt bleiben und fähig sein, revers transkribiert zu werden. In der Tat kann die enzymatische Deacylierung, gekoppelt mit einem zweiten Enzym, ein stabiles System für die Analyse von RNA bereitstellen. Beispielsweise ist, obwohl acetylierte RNA grundsätzlich eine schlechte Matrize für reverse Transkriptase ist, sie gegen die Aktivität von Nukleasen geschützt. Durch Verbinden eines Enzyms, welches für die Deacetylierung geeignet ist, wie eine Esterase, mit einer reversen Transkriptase in demselben Reaktionsgefäß, kann es möglich sein, die Deprotektionsreaktion der RNA so zu koppeln, dass die RNA dann sofort in eine cDNA-Form kopiert wird. Daher liegt die RNA nicht für eine bedeutende Zeitspanne in einer deprotektierten Form vor. Darüber hinaus kann es von der teilweise deprotektierten RNA erwartet werden, dass ihr die Sekundärstruktur fehlt, was dazu führt, dass cDNA-Formen von voller Länge angefertigt werden.
Es wird bevorzugt, dass die RNA modifiziert wird durch Einführung einer Formylgruppe, einer Silylgruppe, einem Halogen oder einer Gruppe, die eine Ethergruppe umfasst, an der 2'-OH-Position. Modifikation unter Verwendung dieser Gruppen wird nachfolgend detailliert diskutiert.
Die Formylgruppe (-COH) kann in die 2'-OH-Position der RNA auf gleiche Weise eingeführt werden wie bei der Acetylierung, trotzdem können alle konventionellen Formylierungsagenzien und -bedingungen angewandt werden, sofern die verlangte Modifikation der RNA nicht nachteilig beeinflusst ist. Es gibt einige Mittel (siehe T.W. Greene: (1991) Protective Groups in Organic Synthesis, 2^nd edition, Wiley Interscience), um Formylgruppen einzuführen, wie beispielsweise unter der Verwendung der Ameisensäure (Ringold et al., (1956) J. Am. Chem. Soc. 78:816; Hughes et al., (1949) J. Chem. Soc. 3347), von N-Formylimidazol (Staab et al., (1962) Ann. 655:95), Ameisensäureanhydrid oder Essigsäure-Ameisensäureanhydrid (Reber et al., (1954) Helv. Chim. Acta. 37:45; Zemlicka et al., Collecf. Czech. Chem. Commun. 27:2784). All diese Reagenzien können in der vorliegenden Erfindung verwendet werden, der Reaktionspartner Ameisensäureanhydrid (C₂H₂O₃) anders als Essigsäureanhydrid (C₄H₆O₃) jedoch ist eher instabil und neigt dazu, bei Zimmertemperatur schnell abgebaut zu werden. Daher wird Essigsäure-Ameisensäureanhydrid (C₃H₄O₃), welches stabiler ist als Ameisensäureanhydrid, vorzugsweise verwendet, um die Formylierungsreaktion durchzuführen (zum Nachschlagen siehe Strazzolini et al., (1990) Tetrahedron 46:1081).
Essigsäure-Ameisensäureanhydrid ist nicht leicht erhältlich und kann dargestellt werden wie folgt, im Wesentlichen nach Fieser und Fieser, (nach Muramatsu et al., (1965) Bull. Chem. Soc. Japan. 38:244). 10 g von Natriumformiatkristallen (Aldrich) werden zu einem feinen Pulver gemahlen unter Verwendung von Mörser und Pistill und dann mit 8,3 ml wasserfreiem Ether (Sigma) gemischt. Der Ether wurde durch Mischen von 5 g Molekularsieb mit 40 ml von Diethylether und Überlassen der Mischung bei Raumtemperatur für eine Stunde, ehe der Ether dekantiert wurde, getrocknet. Zu der Natriumformiatethermischung wurden 8,87 ml Acetylchlorid (Sigma) in kleinen Mengen über 5 Minuten zugegeben, wobei die Temperatur bei 22 °C in einem Wasserbad gehalten wurde. Ein leichter Überschuss von Natriumformiat stellt sicher, dass das gesamte Acetylchlorid verbraucht wurde. Die Reaktion wurde mit einem Magnetrührer 5 Stunden und 30 Minuten lang bei 22 °C gemischt und dann unter Unterdruck in einen Destillierkolben filtriert. Der Filter wurde einmal mit 30 ml wasserfreiem Ether gewaschen und beide Etherfraktionen vereinigt. Der Ether wurde unter einem 10-20 mm Quecksilbervakuum unter Verwendung einer Wasserpumpe entfernt, und dann wurde das Essigsäure-Ameisensäureanhydrid-Produkt bei 22 °C destilliert und gesammelt, indem der Dampf über eisgekühltes Glas geleitet wurde. Erwärmen der Reaktionsmischung auf 50 °C während des Destillationsverfahrens führte zu einem Produkt, das vollständig unreaktiv war, möglicherweise aufgrund des thermolabilen Charakters von Essigsäure-Ameisensäureanhydrid. Es wurde festgestellt, dass das Produkt, welches in dem Destillationskolben verblieb, teilweise reaktiv war, es war jedoch weniger rein als das destillierte Produkt. Daher war es die geeignetste Darstellungsweise, bei Raumtemperatur unter 10-20 mm Hg zu destillieren und das Destillat auf Eis aufzufangen. Der gereinigte Reaktionspartner kann mindestens 3 Monate lang bei 4 °C, oder 6 Monate lang bei -80 °C in einem abgedichteten Lagerungsgefäß ohne auffälligen Verlust der Aktivität gelagert werden.
Ein alternatives Formylierungsreagenz ist Benzoesäure-Ameisensäureanhydrid. Benzoesäure-Ameisensäureanhydrid kann dargestellt werden, indem entweder 6 Moläquivalente (1 ml) an Ameisensäure mit 1 (1 g) oder 2 Moläquivalenten (2 g) an Benzoesäureanhydrid 15 Minuten lang bei 22 °C gemischt werden.
Acylgruppen, einschließlich Formyl- und Acetylgruppen, können, wenn verlangt, aus der RNA in einer Deprotektionsreaktion entfernt werden. Daher kann es, obwohl Acetylierung die RNA mit einem hohen Grad an Stabilität ausstattet, unter bestimmten Umständen vorzuziehen sein, dass die Acylgruppe vor der Verwendung entfernt wird. Dies kann sinnvoll sein beispielsweise bei verringerter Hybridisierungsstabilität während der Northern-Blot-Analyse. Sowohl saure als auch basische Bedingungen führen zu einer Spaltung der Esterbindung, vorsichtige Titration der Menge an Säure oder Base, die hinzugefügt wird, ist notwendig, falls das RNA-Polymer nicht durch die vorliegende Säure oder Base gespalten werden soll. Beispielsweise wird Hinzufügen von NaOH zu acetylierter RNA den Acetylester schnell spalten und die ursprüngliche 2'-OH-Gruppe wiederherstellen, welche dann ein Zielmolekül für basenkatalysierte Spaltung darstellt. In diesem Beispiel wird die Deprotektion unmittelbar gefolgt durch die Polynukleotidspaltung, falls nicht die Menge an hinzugefügter Base ausreichend ist, um die Acetylgruppe zu spalten und die hergestellte Essigsäure zu neutralisieren. Erfolgreiche basenkatalysierte Deprotektion wurde unter Verwendung von NaOH und Ammoniumhydroxid (NH₄OH) erreicht. Es würde erwartet werden, dass andere Basen wie KOH oder KHCO₂ zu einem ähnlichen Ergebnis führen.
Alternativen zur säure- und basenkatalysierten Esterspaltung umfassen Kaliumzyanid, welches ein milder Umesterungskatalysator ist (Plattner et al., (1972) J. Am. Chem. Soc. 94:8613). Vorzugsweise wird die RNA in KCN mit 60 mM oder weniger inkubiert, da größere Konzentrationen unter manchen Umständen sowohl zu Acetylspaltung und dem Zerfall des Polynukleotids führen. Es wird ebenfalls bevorzugt, dass die KCN-Konzentration 1 mM oder mehr beträgt, da niedrigere Konzentrationen in manchen Fällen das Acetyl nicht spalten oder zu RNA-Spaltung führen. Folgende KCN-katalysierte Acetylspaltung ist besonders bevorzugt: Zu 5-20 ng von acetyliertem RNA in 1 μl Wasser werden 9 μl Methanol und KCN bis zu einer Endkonzentration von 10-40 mM hinzugefügt. Die Reaktion wird 15-30 Minuten lang bei 22 °C inkubiert. Unter diesen Bedingungen kann vollständige Deacetylierung mit einem Minimum an RNA-Polymerspaltung erzielt werden.
Chemische Stabilität von Acylgruppen ist teilweise abhängig von der elektronenziehenden Fähigkeit der Acylgruppe. Je stärker elektronenziehend die Acylgruppe ist, desto schwächer ist die Esterbindung. Es ist bekannt, dass beispielsweise das Chloracetat (ClH₂CO₂-R) näherungsweise 760 Mal labiler ist als das Acetat (CH₃CO₂-R) (Greene and Wuts. "Protective Groups in Organic Synthesis" 2^nd edition, Seite 92, Wiley Interscience). Es wurde festgestellt, dass RNA, die mit der Chloracetatgruppe an der 2'-OH-Position unter Verwendung von Chloressigsäureanhydrid in THF/DMAP modifiziert wurde, durch Ethanolfällung gereinigt werden kann, aber wenn es in Wasser steht bei 22 °C, neigt das Chloracetat dazu, spontan gespalten zu werden, was zur Ansäuerung der Lösung führt. Obwohl Halogenacetate, wie beispielsweise das Chloracetat, für viele Anwendungen zu instabil sein würden, wie beispielsweise als Protektion für Serumnukleasen, können sie für bestimmte Anwendungen wie das Northern Blotting oder reverse Transkription nützlich sein. Eine leicht gespaltene Acylgruppe kann vorzuziehen sein, weil es unwahrscheinlich ist, dass die verlangten Bedingungen zur Spaltung des Chloracetatesters ebenso RNA-Polymerspaltung bewirken würden.
Esterbindungen mit intermediärer Labilität zwischen dem Acetat und dem Chloracetat umfassen 3-Phenylpropionat und Methoxyacetat, welche 50 bzw. 20 Mal labiler sind als das Acetat (Greene and Wuts. "Protective Groups in Organic Synthesis" 2^nd edition, Seite 92, Wiley Interscience). Es ist daher möglich, extrem milde Deprotektionsreaktionen einzusetzen durch Verwendung elektronenziehender Acylgruppen, welche an die 2'-OH-Position gebunden sind.
Es wurde ebenso experimentell festgestellt, dass hog-leberesterase und Schweineleberesterase normalerweise nicht geeignet sind für die umfassende Deacetylierung modifizierter RNA. Darüber hinaus umfassen solche kruden Präparate von Esterase signifikante Konzentrationen an RNasen, welche die Verwendung von RNase-Inhibitoren wie dem RNasin nötig machen, um die Deacetylierung zu messen. Ein weiteres stärker bevorzugtes enzymatisches Deacetylierungsverfahren für modifizierte RNA verwendet das Enzym α-Chymotrypsin, welches den 3-Phenylpropionatester erkennt und bei 37 °C spaltet (Rigby, (1973) J. Org. Chem. 38:977).
Einige starke Acylierungsreagenzien wie das Acetylchlorid, mit verlängerter Reaktionszeit, können zu sowohl 2'-OH-Modifikation und einigen nicht regiospezifischer Acylierungen der Base führen (d. h., es bildet sich eine Amidbindung). Amidbildung an der RNA kann die biologischen Eigenschaften wie die Hybridisierung und die Matrizenaktivität verringern. Auf die Acylierungsreaktion folgend sollten jegliche Amidbindungen an der Base in einigen bevorzugten Ausführungsformen spezifisch entfernt werden, ohne dass die Esterbindungen an der 2'-OH-Position entfernt werden. Kupfer(II)-chlorid fördert in der Gegenwart von Glyoxal die chemoselektive Spaltung von Amiden über Ester (Singh und Ram, J. Org. Chem. (1994) 59:710). Es werden Temperaturen im Bereich von 0 °C bis 50 °C und pH-Werte im Bereich von 3,5-9 für diese Reaktion bevorzugt.
Viele Reagenzien sind in der Lage, Alkoholgruppen zu halogenieren, was zu dem Austausch des -OH gegen ein Halogenatom führt. Es wurde beispielsweise berichtet, dass das Fluoratom bezüglich Größe und Elektronegativität der 2'-OH-Gruppe entspricht und es würde daher erwartet, dass es von Nukleinsäurepolymerasen als eine geeignete Matrize erkannt wird. Ersatz der 2'-OH-Gruppe der RNA durch ein Halogenatom ist ein bevorzugter Aspekt der vorliegenden Erfindung. Vorzugsweise ist das Halogenatom Fluor, Chlor oder Brom. Die vorliegende Erfindung erreicht Halogenierung unter Verwendung eines nicht-katalysierten Systems, es kann jedoch jedes System oder Reagenz verwendet werden, vorausgesetzt, dass die Modifikation nicht nachteilig beeinflusst wird. Das RNA-Substrat wird vorzugsweise mit halogenierendem Reagenz in der Gegenwart eines organischen Lösungsmittels gemischt. Die besten Ergebnisse werden erzielt, wenn Wasser aus dem System ausgeschlossen wurde. Daher ist hinsichtlich dieses Aspekts der Erfindung die RNA vorzugsweise entweder in DMF, DMSO oder anderen geeigneten organischen Lösungsmitteln gelöst. In der Gegenwart von näherungsweise 5 % oder mehr an Wasser kann die Reaktion gehemmt sein. Es wurde gezeigt, dass halogenierte RNA, die chemisch oder durch In-vitro-Transkription unter Verwendung halogenierter Nukleotidtriphosphate synthetisiert wurde, eine größere Beständigkeit gegenüber Nukleasen aufweist.
Eine darüber hinaus bevorzugte Gruppe zur Modifizierung von RNA gemäß der vorliegenden Erfindung ist eine Gruppe, die einen Ether oder eine Thioethergruppe umfasst. Solche Gruppen umfassen Alkoxyalkylgruppen, Alkyltioalkylgruppen und Alkoxyalkoxyalkylgruppen. Bevorzugte Gruppen dieses Typs umfassen Methoxymethyl-, Methylthiomethyl-, Methoxyethyl-, Ethoxymethyl-, Ethoxyethyl-, Methoxymethoxymethyl-, Methoxymethoxyethyl-, Methoxyethoxymethyl-, Methoxyethoxyethyl-, Ethoxymethoxymethyl-, Ethoxymethoxyethyl-, Ethoxyethoxymethyl- und Ethoxyethoxyethylgruppen. Das Verfahren zum Einführen dieser Gruppe in die RNA ist nicht auf besondere Weise beschränkt. Vorzugsweise werden die korrespondierenden Halogenide (beispielsweise Chloride, Bromide oder Jodide) oder Imidazolderivate dieser Gruppen verwendet.
Es wurde gefunden, dass MEM-Chlorid ein besonders geeignetes Reagenz für die Einführung der Methoxyethoxymethyl-(MEM ist CH₃OCH₂CH₂OCH₂-O-R, wobei R das 2'-Kohlenstoffatom ist) Gruppe in der 2'-OH-Position der RNA ist. Es kann jedoch sorgfältige Auswahl von Lösungsmitteln erforderlich sein, so dass die Modifikation ohne RNA-Kettenabbau erfolgt. Beispielsweise können niedrige Konzentrationen von MEM-Chlorid in ein Tetrahydrofuran-(THF) Lösungsmittel keine messbare RNA-Modifikation ergeben, wohingegen Hinzufügen von mehr MEM-Chlorid zu RNA-Kettenspaltung führen kann, möglicherweise als ein Ergebnis von Säurebildung während der Reaktion. Demgegenüber können hohe Konzentrationen von MEM-Chlorid in N-Ethyldiisopropylamin (EDPA- oder Hunings-Base) erforderlich sein (4 μl MEM-Chlorid in 40 μl von EDPA), um der Basizität des Lösungsmittels entgegenzuwirken, andernfalls kann die RNA in EDPA allein schnell abgebaut werden. Es wird daher vorgezogen, Reaktionsbedingungen zu verwenden, welche nicht zu entweder säure- oder basenkatalysierter RNA-Spaltung führen. Eine Mischung von EDPA und THF stellt gute Reaktionsbedingungen für MEM-Modifikation bereit. Es ist bevorzugt, zwischen 5-25 %iges EDPA, vorzugsweise in THF, hinzuzufügen, mit 2,5 % v/v an MEM-Chlorid. Diese Reagenzien sind besonders effektiv für 2'-OH-Modifikation.
Andere Reagenzien, die geeignet sind, um RNA zu schützen, schließen Brommethylmethylether (BrCH₂OCH₃) und Chloromethylmethylsulfid (ClCH₂SCH₃) ein. Diese können verwendet werden unter gleichen Reaktionsbedingungen wie MEM-Cl.
Die Reaktion, welche die Ether- oder Thioethergruppen umfasst, ist nicht in besonderer Weise beschränkt, wird jedoch vorzugsweise ausgeführt bei 22 °C bis 60 °C bis zu drei Stunden lang. In manchen Fällen kann dies zu einigem RNA-Abbau führen, wobei in diesem Fall die Temperatur und/oder Reaktionszeit entsprechend verringert werden kann. Hinzufügen von mehr als 100 ng an RNA zu der Standardreaktion kann das Ausmaß an Modifikation auf eine Weise reduzieren, die näherungsweise proportional zu der Menge an zugefügter RNA ist. Es kann daher vorteilhaft sein, den Reaktionsmaßstab in manchen Fällen zu kontrollieren. Einige der MEM-modifizierten RNA neigen dazu, zu aggregieren und treten daher nicht in das Sequenziergel ein. Dieser Effekt wurde ebenfalls bei RNA gesehen, die mit Acylgruppen länger als 5 Kohlenstoffen modifiziert ist. Erhöhen der Reaktionszeit kann zu Umkehrung der Modifikation führen. Beispielsweise wenn die Reaktion über Nacht bei 22 °C inkubiert wird, gibt es weniger modifizierte RNA, verglichen mit einer Reaktion von 3 Stunden oder 30 Minuten. Ein minimales Reaktionsvolumen von 120 μl wird bevorzugt, weil gefunden wurde, dass in manchen Fällen, beispielsweise bei einer 40-μl-Reaktion, die Modifikation unvollständig sein kann.
Eine interessante Eigenschaft von MEM-Ethern ist ihre Empfindlichkeit gegenüber Lewis-Säurenkatalysatoren, wie beispielsweise ZnBr₂, MgCl₂, AlCl₃, FeCl₃, SnCl₄ und TiCl₄ (Tetrahedron Lett. (1976) 809, 4701, 4705). Dies hat interessante Konsequenzen bezüglich der reversen Transkription. Da die reverse Transkription 1,3 mM MnCl₂ oder 2,5 mM MgCl₂ enthält, können die MEM-Gruppen während der Reaktion gespalten werden, so dass das Enzym nicht-modifizierte oder teilweise MEM-modifizierte RNA-Matrizen kopiert. Beide, MnCl₂ und MgCl₂, werden allgemein für reverse Transkriptionsreaktionen verwendet, so dass keine wesentlichen Änderungen zu den Standardreak tionsbedingungen erforderlich sind, wenn MEM-modifizierte RNA als eine Matrize eingesetzt wird. MEM-modifizierte RNA würde ein einfaches Mittel bereitstellen, um die RNA-Matrize während Transport, Handhabung und Lagerung zu schützen, während Deprotektion spontan während der reversen Transkription erfolgt oder wann immer sie mit einem Lewis-Säurenkatalysator gemischt wird. Daher wird Modifikation mit MEM besonders bevorzugt hinsichtlich der reversen Transkriptionsaspekte der vorliegenden Erfindung.
Falls es wichtig ist, die MEM-Gruppe aus der modifizierten RNA ohne Kontaminierung durch die Metallionen (d. h. den Lewis-Säurenkatalysator) zu entfernen, können Festphasen Lewis-Säurenkatalysatoren verwendet werden, so dass auf die Deprotektion folgend, die RNA von dem Metallion einfach durch Abtrennen von der Festphase separiert werden kann (siehe Besprechung von Akelah und Sherrington (1981) Chem. Rev. 81:557). Dies kann von Bedeutung sein, wenn eine nachgeordnete Anwendung der RNA, wie etwa reverse Transkription, durch das Metallion inhibiert wird. Ein geeigneter Festphasen Lewis-Säurenkatalysator ist Aluminiumchloridpolystyrolharz.
Es ist in der vorliegenden Erfindung ebenso bevorzugt, dass die RNA durch Silylierung modifiziert wird. Die modifizierende Silylgruppe ist nicht auf besondere Weise eingeschränkt. Es gibt einen breiten Bereich an Silylgruppen, welche in der vorliegenden Erfindung verwendet werden können. Diejenigen, welche eine sperrige Silylgruppe tragen, wie beispielsweise Triphenylsilyl, können zu niedrigen Ausmaßen an 2'-OH-Gruppen-Modifikationen führen, auf Grund der sterischen Hinderung zwischen dem Reagenz und der RNA, wie beispielsweise den Basen. Diese Typen an Silylgruppen sind weniger bevorzugt. Bevorzugte Reagenzien sind diejenigen, welche kleinere Gruppen tragen, wie beispielsweise Trimethylsilyl, Triethylsilyl oder Tripropylsilyl und Triisopropylsilyl. Es ist jedoch bekannt, dass von diesen Serien die Trimethylsilylgruppe relativ instabil ist und daher, obwohl sie leicht mit der RNA reagieren kann und zu hohem Ausmaß an Modifikation führt, nicht besonders bevorzugt ist, da sie in manchen Fällen nicht ausreichend stabil sein kann, um RNA-Stabilität für Zwecke wie Handhabung und Lagerung zur Verfügung zu stellen. Die Wahl des Silylierungsreagenz ist abhängig von der Spezifität der Reaktion bezüglich der 2'-OH-Gruppe gegenüber anderen reaktiven Gruppen wie den Basen, ihrer sterischen Sperrigkeit und Stabilität (siehe Kapitel 8, Greene and Wuts "Protective Groups in Organic Synthesis" 2^nd edition, Wiley Interscience; siehe ebenfalls "Silylating Reagents" (1995) Fluka Chemie AG). Es sollte ebenfalls Schutz vor Nukleaseaktivität verleihen unter Erhalt einiger biologischer Eigenschaften der RNA sowie Hybridisierungs- oder Matrizenaktivität für Polymerasen. Alternativ kann, wenn die mit der Silylierungsgruppe modifizierte RNA ineffektiv ist als entweder eine Polymerasematrize oder als ein Hybridisierungspartner, die modifizierende Gruppe gespalten werden (so, dass die RNA deprotektiert wird) vor der Verwendung. Reagenzien, die in der Lage sind, Silylgruppen zu spalten, umfassen Fluoridionen (Stabilität: siehe Kapitel 2, Greene and Wuts. "Protective Groups in Organic Synthesis" 2^nd edition, Wiley Interscience; siehe ebenfalls "Silylating Reagents" (1995) Fluka Chemie AG).
Das organische Lösungsmittel, welches in dem Reaktionsmedium der vorliegenden Erfindung verwendet wird, umfasst vorzugsweise eine organische Base und kann ein organisches Lösungsmittel umfassen, in welchem die organische Base gelöst ist oder, in einem bevorzugten Ausführungsbeispiel, welches die organische Base selbst sein kann. Es wird bevorzugt, dass der Reaktionspartner in dem organischen Lösungsmittel löslich ist. In einem bevorzugten Ausführungsbeispiel enthält das Reaktionsmedium ferner Wasser. Auf diese Weise kann RNA, die modifiziert werden muss, bequem zu dem organischen Lösungsmittel als eine wässrige Lösung von RNA hinzugegeben werden. Typische organische Lösungsmittel umfassen Alkane, wie beispielsweise Hexan und Pentan, Pyridin, Acetonitril, Dimethylformamid, Dichloromethan, Aceton, Diethylether, Benzol, Chloroform, Ethylacetat, Leichtbenzin, Tetrahydrofuran, Kohlenstofftetrachlorid, Dichlorethan, Dioxan, Kohlenstoffdisulfid, Nitromethan, Dimethylsulfoxid, Hexamethylphosphorsäuretriamid und Toluol. Typische organische Basen umfassen Pyridin, Triethylamin, Trimethylamin, Diisopropylethylamin, N,N-Diethylanilin, N,N-Dimethylanilin, 1,5-Diazabicyclo(4,3,0)non-5-en (DBN), 1,8-Diazabicyclo(5,4,0)undec-7-en (DBU) und N-Methylmorpholin. Triethylamin (CH₃CH₂)₃N ist eine stärkere Aminbase als Pyridin, Anilin, Diethylamin oder Trimethylamin, aber weniger stark als Pyrrolidon. Es ist eine der stärksten Aminbasen. Eine bevorzugte organische Base, welche als ein Lösungsmittel wirkt, ist Triethylamin (TEA). Wenn ein Katalysator verwendet werden muss, ist es bequem, wenn der Katalysator ebenfalls in dem organischen Lösungsmittel gelöst werden kann. Das Wasser und das organische Lösungsmittel können unterschiedliche Phasen in dem Reaktionsmedium bilden. Beispielsweise können das Wasser und das organische Lösungsmittel miteinander unmischbar sein und Phasen bilden, welche sich beim Stehen voneinander abtrennen. Wenn es mehr als eine Phase gibt, kann die RNA mit dem Reaktionspartner unter Bedingungen von Phasentransferkatalyse abreagiert haben.
Die Mengen an Wasser und organischem Lösungsmittel können variiert werden und werden in einigem Ausmaß von dem besonderen organischen Lösungsmittel/der Base/dem Katalysatorsystem abhängen, welches verwendet wird. Vorteilhaft umfasst das Reaktionsmedium mindestens 50 % organisches Lösungsmittel, vorzugsweise zumindest 80 %, stärker bevorzugt zumindest 90 % und höchst bevorzugt zumindest 95 % v/v. Typischerweise liegt das Verhältnis von Wasser zu organischem Lösungsmittel in dem Bereich von 1:50 bis 1:10, vorzugsweise um 1:20.
Wenn die Modifikation Formylierung der RNA einschließt, wird das polare Lösungsmittel Tetrahydrofuran (THF) gegenüber dem basischen Lösungsmittel Triethylamin vorgezogen, weil festgestellt wurde, dass es weniger wahrscheinlich ist, dass es RNA-Kettenspaltung verursacht, wenn die Modifikationsreaktion eine verringerte Menge an Reaktionspartnern umfasst. Es ist gut bekannt, dass basische Bedingungen zu RNA-Spaltung führen, und RNA, die für länger als 5 Minuten in Triethylamin gelassen wurde, erleidet beträchtlichen Abbau. Dies ist jedoch kein Problem, wenn Reaktionspartnern wie Essigsäureanhydrid in Triethylamin verwendet werden, weil die Reaktion schnell abläuft, wodurch die RNA vor Spaltung geschützt wird. Es gibt einen deutlichen Vorteil, wenn Triethylamin durch Tetrahydrofuran als das Formylierungsreaktionslösungsmittel ersetzt wird, insbesondere, wenn 0,1 μl oder weniger an Essigsäureanhydrid pro 1 μg an RNA verwendet werden. Ein zusätzlicher Vorteil ist, dass RNA aus Tetrahydrofuran effektiver präzipitiert werden kann als aus Triethylamin, wodurch die Ausbeuten bei der Reinigung gesteigert werden. Pyridin, wenn es als das Lösungsmittel anstatt von THF oder TEA verwendet wird, führt dazu, dass die Reaktion viel träger abläuft, und es ist daher nicht bevorzugt.
Bei der Abwesenheit eines Katalysators beträgt die Reaktionszeit generell 20 bis 60 Minuten. In der Gegenwart des Katalysators läuft die Reaktion schneller ab und ist grundsätzlich innerhalb von 20 Sekunden abgeschlossen. Im Hinblick auf Formylierung, kann ein 20-μl-Reaktionsendvolumen mit 5 μl an Essigsäure-Ameisensäure-Anhydrid verwendet werden, um bis zu 1 μg an RNA zu formylieren, obwohl 100 % Formylierung nicht erreicht werden können, wenn die Reaktionszeiten nicht auf bis zu 1 Stunde verlängert werden. Ein geringeres Volumen (1 μl) an Essigsäure-Ameisensäure-Anhydrid kann verwendet werden, um 100 ng RNA zu modifizieren, falls die Reaktionszeiten auf eine Stunde verlängert werden. Reaktionszeiten von nur 5 Minuten können verwendet werden, falls 5 μl von Essigsäure-Ameisensäure-Anhydrid verwendet werden, um näherungsweise 100 ng von Substrat an RNA zu modifizieren.
Auf einer Volumen/Volumen-Basis wurde gefunden, dass das Verhältnis an Reaktionspartner zu Reaktionsmedium (insbesondere Essigsäureanhydridtriethylamin/DMAP) vorzugsweise im Bereich 1:200 bis 1:10 liegt, stärker bevorzugt um 1:20. Zu wenig Reaktionspartner ergibt eine Teilreaktion, und zu viel macht es schwierig, die Reaktion zu kontrollieren.
Unter bestimmten Umständen kann es vorteilhaft sein, vor Schritt (i) des Verfahrens der vorliegenden Erfindung einen Schritt der Protektion der exozyklischen Aminogruppe der Basen der RNA mit einer Schutzgruppe auszuführen. Nach Schritt (ii) kann ein Schritt der Deprotektion der exozyklischen Aminogruppen durch Entfernen der Schutzgruppe ausgeführt werden. Auf diese Weise werden unerwünschte Nebenreaktionen zwischen Reaktionspartnern und den exozyklischen Aminogruppen vermieden. Für Adenin kann die Schutzgruppe Benzoyl, N-Phenoacetyl oder N,N-Dimethylaminomethylen sein. Für Cytosin kann die Schutzgruppe Benzoyl sein. Für Guanin kann die Schutzgruppe Isobutyl, N-Phenoacetyl oder N,N-Dimethylaminomethylen sein. Es wurde herausgefunden, dass 18-Krone-6 ein nützliches Schutzagens ist, um die exozyklischen primären Aminogruppen vor Acylierung zu schützen, im Wesentlichen mittels Essigsäureanhydrid (Barrett & Lana, J.C.S. Chem. Commun. 471, 1978).
Gemäß einem Aspekt umfasst die RNA, welche modifiziert wird, eine RNA-Probe aus einem Zellextrakt. Die RNA-Probe kann eine RNA-Gesamtprobe sein oder eine gereinigte RNA, wie beispielsweise eine mRNA.
RNA wird generell gereinigt, um Genexpression zu untersuchen, die Größe und Struktur der mRNA zu bestimmen, die Genprodukte zu identifizieren, ihre Häufigkeit zu bestimmen und sie als eine DNA-Kopie zu klonen. Das Reinigen der intakten und vollständigen Kopien von RNA ist einer der ersten kritischen Schritte in vielen molekularbiologischen Protokollen, es ist ebenfalls noch einer der am schwierigsten erfolgreich durchzuführenden. Obwohl es beliebig viele Mittel gibt, mittels derer RNA gereinigt werden kann, involvieren alle Extraktionsverfahren vier Schritte: (1) Desaktivierung von Nukleasen, (2) Trennung von RNA aus Proteinen, (3) Trennung der RNA von anderen Makromolekülen und (4) Aufkonzentration der RNA. Um die mRNA-Fraktion von der Gesamt-RNA zu reinigen, ist ein weiterer Schritt involviert, das ist (5) die Trennung der Poly(A)-schwänzigen RNA von anderen Typen.
Die Wahl des Reinigungssystems hängt von einer Anzahl an Faktoren ab, wie beispielsweise der Quelle an RNA, ihrer Häufigkeit und ihrer Verwendungsbestimmung. Einer der bedeutendsten Aspekte bei der Isolierung von RNA ist es, jedem Abbau während des Verfahrens vorzubeugen. Alle Zellen enthalten Enzyme, die in der Lage sind, mRNA zu zerstören, sie heißen Ribonukleasen, welche entfernt oder schnell desaktiviert werden müssen während des Verfahrens der mRNA-Isolierung. Die allgegenwärtige Natur von "Nuklease" wird durch ihre Gegenwart in Sekreten von Fingerspitzen und Staub erklärt; Kontaminierung durch irgendeine dieser vorgenannten wird unvermeidlich zu RNA-Abbau führen. Die Instabilität von RNA macht es sehr schwierig, diese intakt zu isolieren, da sogar ein einzelner Bruch in der Kette dieses unmöglich macht.
RNasen (Enzyme, die in der Lage sind, RNA abzubauen) sind nicht notorisch schwierig zu desaktivieren, weil sie, anders als DNasen, keine Kofaktoren benötigen, hitzestabil sind und sich nach Denaturierung durch Hitze schnell neu falten. Einige Stoffe wie der Pankreas und die Milz enthalten besonders hohe Konzentrationen an RNasen. Im Gegensatz zu DNasen erfordern RNasen keine Metallionen, um aktiv zu werden, und können daher nicht desaktiviert werden durch Metall chelatisierende Substanzen wie EDTA.
Einige RNasen können ohne ein Metallion Aktivierung bewirken, da sie die 2'-OH-Gruppen statt dessen als reaktive Spezies verwenden. Einige RNasen sowie RNase A können Autoklavierungstemperaturen (120 °C) überleben, da das Polypeptid schnell neu faltet, um seine ursprüngliche aktive Struktur beim Abkühlen wieder anzunehmen. Dies ist kaum eine Eigenschaft von DNasen, welche dauerhaft durch Erhitzen auf moderate Temperaturen, wie etwa auf 65 °C, desaktiviert werden. Auf Grund der extremen Schwierigkeit der Desaktivierung von RNasen wurden verschiedene grobe Verfahren entwickelt. Diese umfassen die Verwendung eines Alkylierungsagens wie Diethylpyrocarbonat (DEPC), welche die aktive Site an RNase A dauerhaft modifiziert, oder Denaturierungsagenzien, wie beispielsweise Guanidinisothiocyanat. DEPC ist unglücklicherweise ein vermutetes Karzinogen. Andere kommerziell erhältliche RNase-Inhibitoren umfassen Ribonukleosidvanadylkomplex und Angiogenin bindendes Protein. Das vorgenannte Reagenz hat einen begrenzten Nutzen, da es die Mehrheit der Enzyme inhibieren wird, und das nachgenannte ist sehr teuer.
Eines der am häufigsten verwendeten Verfahren zur Reinigung von RNA ist das, welches auf Chirgwin et al., (1979) Biochemistry 18:5294-5299 und Chomczynski und Sacchi, (1987) Anal. Biochem. 162:156 basiert, und nützliche Beschreibungen, wie RNA korrekt gehandhabt werden kann, können in Sambrook et al., (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2nd Edition) Cold Spring Harbor University Press, Cold Spring Harbor, New York, gefunden werden. Viele Firmen bieten ferner RNA-Isolationskits an, wie beispielsweise MICRO FAST TRACK^TM von Invitrogen, PolyATract^® von Dynal, Norwegen, und TRIzol Reagent^TM von Gibco BRL von Gaithersburg, USA.
In einer Ausführungsform tragen zumindest einige der modifizierten Riboseringe an der 2'-OH-Position einen Substituenten, welcher mit einem Marker markiert ist. Nützliche Marker umfassen Fluoreszenz- oder radioaktive Marker genauso wie Liganden von Antikörpern oder anderen Proteinen, beispielsweise Biotin, oder spezifische Typen von Metallionen, wie beispielsweise Zinn. Verschiedene Verwendungen für markierte Oligonukleotide oder markierte Polynukleotide sind nachfolgend diskutiert.
Gemäß einem weiteren Aspekt stellt die vorliegende Erfindung ein Kit zur Modifikation eines Polynukleotids bereit, umfassend ein Polyribonukleotid von zumindest 1000 Nukleotiden Länge, wobei das Kit umfasst

(a) ein organisches Lösungsmittel; und
(b) ein Reaktionssystem, welches einen Reaktionspartner umfasst, der in der Lage ist, die 2'-OH-Position der Riboseringe des Polyribonukleotids von zumindest 1000 Nukleotiden Länge in der Gegenwart des organischen Lösungsmittels kovalent zu modifizieren, wobei das Reaktionssystem geeignet ist, die kovalente Modifikation in einer Stunde oder weniger zu erreichen. Das Kit kann verwendet werden, um ein Polynukleotid zu verwenden, welches bequemerweise eine wässrige Lösung umfasst. Alternativ kann das Polynukleotid in einem nichtwässrigen Lösungsmittel bereitstehen.

In einer weiteren Ausführungsform wird ein Verfahren zur Genexpressionsanalyse bereitgestellt, welches das Erhalten eines Polynukleotids aus zumindest 1000 Nukleotiden Länge umfasst, umfassend eine mRNA-Probe, die gemäß dem obigen Verfahren modifiziert ist, wobei die RNA-Probe aus einem Zellextrakt stammt. Das Polynukleotid wird beispielsweise durch Hybridisierungssondieren analysiert. Häufig verwendete Verfahren der Genexpressionsanalyse umfassen Nothern Blotting, RT-PCR, Dot Blotting und in-situ-Hybridisierung. Diese Verfahren erfordern mRNA in einer intakten Form, die geeignet ist, als Marker für Genexpression zu dienen. Durch Modifikation der 2'-OH-Gruppe in Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung wird das Ausmaß des Abbaus der mRNA reduziert.
Gemäß einem weiteren Aspekt stellt die vorliegende Erfindung die Verwendung eines Polynukleotids bereit, welches RNA von zumindest 1000 Nukleotiden Länge umfasst, wobei ein Teil der Riboseringe des Polynukleotids an der 2'-OH-Position als eine Sonde kovalent modifiziert sind. Die Sonde kann beispielsweise mit einem Fluoreszenz- oder radioaktiven Marker markiert sein. Die modifizierte mRNA kann beispielsweise als markierte Sonde für Hybridisierung dienen, was, beispielsweise, in "Biochip"-Anwendungen, die verwendet werden, um Genexpression zu untersuchen, Benutzung findet.
Gegenwärtig wird eine vollständige mRNA-Population in der Gegenwart eines radioaktiven Desoxynukleotidtriphosphats, wie einem 32p dATP, revers transkribiert, um eine markierte cDNA-Sonde zu erzeugen, welche dann zu dem "Biochip" hybridisiert wird. Bei dieser Erfindung, wie beschrieben in Beispiel V, kann die modifizierte mRNA selbst als die Sonde dienen. Sonden, die auf diese Weise hergestellt worden sind, würden sehr hohe spezifische Aktivitäten (cpm/μg RNA) haben und daher geeignet sein, sehr kleine Mengen an Ziel-DNA oder -RNA zu detektieren. Alternativ könnte fluoreszierende Silyl- oder Acylgruppen als Markierungsgruppen für RNA, wie beispielsweise als Isatosäure-Anhydrid verwendet werden (Horner, et al., (1985) J. Organomet. Chem. 282:175).
Gemäß einem weiteren Aspekt stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Replikation eines Polynukleotids bereit, was das Erhalten eines Polynukleotids, umfassend modifizierte RNA von zumindest 1000 Nukleotiden Länge und wie oben beschrieben, umfasst, und Replizieren der modifizierten RNA, um ein komplementäres Polynukleotid unter Verwendung einer Nukleinsäurepolymerase zu bilden. Weil Modifikation von RNA in Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung ein replizierbares Polynukleotid bereitstellt, welches für Verarbeitung im Labor relativ stabil ist, kann das Polynukleotid in einem Anwendungsbereich als ein Substitut für DNA verwendet werden. Das komplementäre Polynukleotid kann eine RNA, DNA oder Hybrid oder modifizierte Formen hiervon umfassen.
Das komplementäre Polynukleotid kann beispielsweise eine cDNA umfassen, und die Nukleinsäurepolymerase könnte eine DNA-Polymerase umfassen. Solche Polymerasen sind nachstehend im Detail diskutiert.
Das Kopieren von mRNA in cDNA ist ein wichtiges Verfahren, um vollständig repräsentative Kopien zur Verwendung in Anwendungen, umfassend cDNA-Klonen, DNA-Sequen zierung, Proteinproduktion für Medikamenten-Screeningprogramme, zu erhalten und um die Funktion eines speziellen Genes zu verstehen. Üblicherweise erfordern all diese die Aktivität reverser Transkriptase, was mit vielen damit verbundenen Problemen verknüpft ist, wie beispielsweise Inhibierung.
Die Synthese und das Klonen von cDNA schließt eine komplexe Reihe enzymatischer Schritte ein, um die mRNA in doppelsträngige DNA zu kopieren und diese in einen DNA-Vektor zu klonen. Wie hierin verwendet, bezieht sich der Begriff cDNA auf ein komplementäres DNA-Molekül, welches unter Verwendung eines Ribonukleinsäurestrangs (RNA) als Matrize synthetisiert worden ist. Es sind viele Annäherungsversuche zum cDNA-Klonen bekannt, die alle versucht haben, so viel wie möglich von der ursprünglichen Sequenz zu bewahren (Okayama und Berg, (1982) Mol. Cell. Biol. 2:161, Gubler und Hoffman, (1983) Gene 25:283).
Üblicherweise können Probleme bei einem oder mehreren der drei Stufen, 1) mRNA-Isolierung, 2) Synthese des ersten cDNA-Strangs oder 3) Synthese des zweiten Strangs aufkommen. Wenn das mRNA-Startmaterial abgebaut wird, sind unvollständige Formen der cDNA ein unvermeidliches Ergebnis. Es ist eine Anwendung der vorliegenden Erfindung, das mRNA-Molekül zu stabilisieren, um vollständige Kopien der mRNA zu isolieren. mRNA, die in Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung modifiziert wurde, kann als eine Matrize für reverse Transkriptase verwendet werden.
Eine cDNA von voller Länge zu erhalten, ist eine der schwierigsten, aber wichtigsten Aufgaben, um ein Gen zu charakterisieren. Am häufigsten werden cDNA-Datenbanken durch die vollständige Umkehrung eines mRNA-Pools in eine cDNA-Kopie erzeugt (Gubler und Hoffman (1983) Gene 25:263-269), der häufigste Ausgang ist jedoch, dass eine unvollständige Darstellung der Start-mRNA hergestellt wird.
Verfahren, um cDNA-Kopien von mRNA in voller Länge zu isolieren, umfassen: RACE (rapid amplification von cDNA-Enden), was 1988 erstmals als ein Verfahren zur Isolierung von cDNAs voller Länge unter Verwendung von PCR (Frohmann, et al., (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 8998-9002) beschrieben worden ist. Damit in Verbindung stehende Verfahren wurden berichtet (Schaefer, (1995) Anal. Biochem. 227:255-273). Obwohl diese Verfahren erfolgreich sein können, um die 5'- und 3'-Enden von einzelnen cDNA-Molekülen wiederaufzufinden, ist beträchtliches fachmännisches Können erforderlich und hängt es zu großen Teilen von der Häufigkeit der mRNA ab und kann nur eines nach dem anderen durchgeführt werden.
Das Verfahren zur Replikation des Polynukleotids gemäß der vorliegenden Erfindung kann ferner einen Schritt des Ligierens an einen Vektor eines einzel- oder doppelsträngigen Polynukleotids umfassen, der das Polynukleotid und das komplementäre Polynukleotid umfasst. Auf diese Weise können molekulare Klonungsverfahren unter der Verwendung modifizierter RNA gemäß der vorliegenden Erfindung vollendet werden.
Gemäß diesem Aspekt der vorliegenden Erfindung ist es bevorzugt, dass die RNA durch Formylierung modifiziert wird. Formylierte RNA dient als eine exzellente Matrize für reverse Transkriptase. Die optimalen Reaktionsbedingungen unterscheiden sich jedoch von denen, die für RNA verwendet werden. Der bedeutendste Unterschied ist das zweiwertige Metallkation, was in der Reaktion vorliegt. Obwohl MULV formylierte RNA in der Gegenwart von MgCl₂ revers transkribieren wird, beispielsweise mit entweder 2,5 oder 5 mM Endkonzentration, wird es vorgezogen, dass das Metallion Mangan ist. Von Mangan ist bekannt, dass es die Spezifität vieler DNA-Polymersen ändert, so dass deren Matrizenspezifität gelockert wird. Reverse Transkriptasen können beispielsweise leicht DNA-Matrizen kopieren, und die DNA-abhängigen DNA-Polymersen können RNA-Matrizen in der Gegenwart von Manganionen verwenden. Dies könnte die gesteigerte Matrizenaktivität von formylierten RNA in der Gegenwart von Manganionen erklären. Die Mn-Konzentration ist nicht in besonderer Weise beschränkt, die am meisten bevorzugte (optimale) Mn-Konzentration ist 1,2 bis 1,4 mM. Die Reaktion ist weniger effektiv (es wird weniger cDNA-Produkt detektiert) mit Puffern, die einen Überschuss von 3 mM oder weniger als 0,1 mM Mangan enthalten. Mischungen dieser beiden Typen von Metallionen können ebenfalls in der vorliegenden Erfindung verwendet werden, wie beispielsweise eine Mischung von 1 mM Mangan und entweder 0,5 oder 1 mM Magnesiumionen.
Eine endgültige Tris-HCl-Pufferkonzentration (pH 8,4 bei 22 °C) von 200 mM erzielt mehr cDNA-Produkt als die 50 mM, die in dem Produktprotokoll von Superscript II (Life Technologies, USA) spezifiziert sind. Weiteres Erhöhen der Tris-HCl-Konzentration auf 350 mM reduziert die cDNA-Ausbeute leicht.
Enzyme, die hinsichtlich dieses Aspekts der Erfindung erfolgreich verwendet werden können, umfassen Superscript II (Life Technologies), MULV RNase H⁺ (Promega), MULV RNase H^- (Promega), Expand (Roche Molecular Biochemicals) und HIV-1-reverse Transkriptase (Amersham Pharmacia). Eine Mischung von Superscript II und AMV (Invitrogen, USA) kann ebenfalls erfolgreich sein.
Formylierte BMV-RNA kann revers transkribiert werden in der Gegenwart von DMSO (beispielsweise 10 % DMSO), von welchem bekannt ist, dass es die Nukleinsäurensekundärstruktur reduziert, oder in einem Tris-HCl-Puffer mit einem pH-Wert von 7,5 (beispielsweise bei 22 °C) oder in KCl (beispielsweise 150 mM).
Gemäß einem weiteren Aspekt stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Darstellung eines doppelsträngigen Oligo- oder Polynukleotids aus einer Matrize bereit, welches das in Kontakt Bringen der Matrize mit einer Vielzahl von Mononukleotiden, umfassend UTP, dTTP und/oder dUTP, ATP und/oder dATP, GTP und/oder dGTP, und CTP und/oder dCTP, in der Gegenwart einer Nukleinsäurenpolymerase und optional eines Matrizen-Primers umfasst, unter Bedingungen, um die Mononukleotide zur Bildung eines Nukleinsäurenstrangs, der komplementär ist zu der Matrize, zu polymerisieren, wobei die Matrize Polyribonukleotid von zumindest 1000 Nukleotiden Länge, einen Teil der Riboseringe, deren Polyribonukleotide umfasst kovalent an der 2'-OH-Position modifiziert sind, um einen Substituenten zu tragen, welcher Replikation der Matrize durch die Nukleinsäurenpolymerase erlaubt.
Es wurde überraschenderweise festgestellt, dass, wenn die Riboseringe des Polyribonukleotids in Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung modifiziert sind, das Polyribonukleotid, welches hierdurch hergestellt wurde, in der Lage ist, als eine Matrize für eine oder mehrere einer Vielzahl von Nukleinsäurenpolymerasen zu fungieren.
Nukleinsäurenpolymerasen innerhalb des Schutzumfangs der vorliegenden Erfindung umfassen DNA-Polymerasen, RNA-abhängige Polymerasen und RNA-abhängige RNA-Polymerasen.
Unter den RNA-abhängigen DNA-Polymerasen sind Superscript^TM II (MMLV-reverse Transkriptase RNase H^-), MMLV-reverse Transkriptase, HIV-reverse Transkriptase, AMV-reverse Transkriptase, RAV-2-reverse Transkriptase, menschlicher T-Zellen-Leukämievirus vom Typ I (HTLV-I) reverse Transkriptase, Leukämievirus des Rindes (BLV), Rous-Sarcoma-Virus (RSV), Tth-DNA-Polymerase, Tfl-DNA-Polymerase, Bst-Polymerase, Taq-DNA-Polymerase, Thermoscript, C. therm.-Polymerase, Displaythermo-RT- oder Klenow-DNA-Polymerase.
Unter den DNA-abhängigen DNA-Polymerasen sind DNA-Polymerase I; -Klenow-Fragment; T4-DNA-Polymerase; T7-DNA-Polymerase; Taq-DNA-Polymerase, Tli-DNA-Polymerase, Pfu-DNA-Polymerase; Vent^TM-DNA-Polymerase; Deep Vent^TM-DNA-Polymerase; Bst-DNA-Polymerase; Tth, Pfu-Turbo^TM, Pfu(exo-), Pwo, Pyra^TM, Tfu, KlenTaq, Taq2000^TM, AmpliTaq-Stoffel-Fragment, SequenaseTM, Tma, Vent^®(exo-), Deep Vent^®(exo-) oder eine DNA-Polymerase, die aus Thermosipho africanus, Thermotoga maritima, Desulfurococcus mobilis, Methanobakterium thermoautotrophicum, Methanothermus fervidus, Pyrococcus furious, Pyrodictium ocultum, Sulfolobus acidocaldarius, S. solfataricus, Thermococcus litoralis oder Thermoplasma acidophilum gereinigt wurde.
Unter den RNA-abhängigen RNA-Polymerasen sind Q-Beta-Replikase und diejenigen, die aus E. coli-Phagen f2, R17, MS-2 oder Ø6 oder aus einer Virusfamilie ausgewählt aus den Bromoviridae, Flaviviridae, Picornaviridae, Potyviridae, Tobamovirus, Tombusviridae, Leviviren, Hepatitis C-ähnlichen Viren und Picornaviren oder aus Poliovirus, Gelbfiebervirus, Tabakmosaikvirus, Brommosaikvirus, Influenzavirus, Reovirus, Myxovirus, Rhabdovirus und Paramyxovirus gewonnen werden.
Nukleinsäurepolymerasen können in vier sich überlappende Gruppen eingeteilt werden. Der Einteilung wird der Typ der kopierten Matrize (RNA oder DNA) zugrunde gelegt, und der Typ an komplementärem Nukleinsäurestrang, der hergestellt wird (RNA oder DNA).
Obwohl die in vivo vorliegenden Nukleinsäurepolymerasen eigenständige Aktivitäten haben, ist die in-vitro-Spezifität für die Matrize und die Mononukleotidsubstrate weniger hoch. Als ein Beispiel, können in-vitro bestimmte DNA abhängige DNA-Polymerasen, wie beispielsweise Taq- und Tth-DNA-Polymerasen sich ebenfalls wie RNA-abhängige DNA-Polymerasen verhalten. Die Spezifität hängt teilweise von den Pufferbedingungen, der Gegenwart von Metallionen und dem Typ von vorliegendem Mononukleotidtriphosphat ab. Letztlich sind einige mutante Formen von Polymerasen bekannt (für ein Beispiel siehe: Gao et al., (1998) Proc. Natl. Acad. Sci (USA) 94:407), die weniger spezifisch sind im Hinblick auf die Kopien der Matrizenstränge und den Typus des hergestellten komplementären Strangs. Entsprechend erscheinen manche Enzyme in mehr als einer der oben genannten Aufzählungen.
Vorzugsweise wird das Polynukleotid modifiziert durch (i) in Kontakt bringen von RNA, die ein Polyribonukleotid von zumindest 1000 Nukleotiden Länge in einem Reaktionsmedium mit einem Reaktionspartner, der in der Lage ist, die 2'-OH-Position der Riboseringe der RNA kovalent zu modifizieren; (ii) reagieren Lassen der RNA mit den Reaktionspartnern, um modifiziertes Polynukleotid unter Bedingungen zur Erzielung einer kovalenten Modifikation eines Teils der 2'-OH-Positionen der Riboseringe herzustellen; und (iii) optional Abtrennen des modifizierten Polynukleotids aus dem Reaktionsmedium, wobei das Reaktionsmedium ein organisches Lösungsmittel umfasst.
Gemäß einem weiteren Aspekt stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Amplifizieren eines Polynukleotids bereit, welches umfasst:

(1) Zur Verfügung Stellen des Polynukleotids als eine Matrize, umfassend ein Polyribonukleotid von zumindest 1000 Nukleotiden Länge, einen Teil der Riboseringe, deren Polyribonukleotid kovalent modifiziert ist an der 2'-OH-Position;
(2) Herstellen eines doppelsträngigen Polynukleotids in Übereinstimmung mit dem oben genannten Verfahren aus der Matrize;
(3) Schmelzen jedes doppelsträngigen Polynukleotids, um Einzelstränge zu bilden;
(4) Annealing der Matrizen-Primer an den Einzelstrang, der die Nukleotidsequenz der Matrize hat, und Annealing eines zweiten Primers an den Strang, der zu dem vorgenannten komplementär ist, um Einzelstränge zu bilden, die Primer aufweisen;
(5) in Kontakt Bringen der mit Primer versehenen Einzelstränge mit der Vielzahl von Mononukleotiden in der Gegenwart der Nukleinsäurepolymerase, um doppelsträngige Polynukleotide zu bilden;
(6) optional Wiederholen der Schritte (3) bis (5), bis eine ausreichende Amplifikation erreicht ist; und
(7) Ernten der amplifizierten Polynukleotide in einzel- oder doppelsträngiger Form.

Dieses Verfahren wird typischerweise bei einer Polymerase-Kettenreaktion verwendet.
Gemäß einem weiteren Aspekt stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Amplifikation eines Polynukleotids bereit, welches umfasst:

(1) Bereitstellen des Polynukleotids als eine Matrize, umfassend ein Polyribonukleotid von zumindest 1000 Nukleotiden Länge, wobei ein Teil der Riboseringe der Polyribonukleotide kovalent an der 2'-OH-Position modifiziert ist;
(2) Amplifikation der Matrize mittels einer Nukleinsäurensequenz-basierten Amplifikation (NASBA), und
(3) Ernten des amplifizierten Polynukleotids in einzel- oder doppelsträngiger Form, wobei der Schritt der Amplifikation der Matrize das Herstellen aus der Matrize eines doppelsträngigen Polynukleotids in Übereinstimmung mit der oben dargelegten Methode umfasst.

Es wird ferner ein Verfahren zur Diagnose in einem Subjekt bereitgestellt, in dem eine Krankheit durch die Gegenwart oder Abwesenheit einer Zielnukleotidsequenz angezeigt wird, wobei das Verfahren umfasst:

(a) Erhalten einer Oligo- oder Polynukleotidprobe aus dem Subjekt;
(b) Amplifizieren des Oligo- oder Polynukleotids in Übereinstimmung mit einer der beiden der oben dargelegten Verfahren, um ein amplifiziertes Oligo- oder Polynukleotid zu bilden; und
(c) Analysieren des amplifizierten Oligo- oder Polynukleotids hinsichtlich der Zielnukleotidsequenz.

Das Subjekt kann ein Mensch, ein Tier oder eine Pflanze sein.
Gemäß einem weiteren Aspekt stellt die vorliegende Erfindung die Verwendung einer Nukleinsäurepolymerase für die Produktion eines Nukleinstrangs, der zu einer Matrize für die Nukleinsäurepolymerase komplementär ist, bereit, wobei die Matrize ein Polynukleotid umfasst, welches ein Polyribonukleotid von zumindest 1000 Nukleotiden Länge umfasst, wobei ein Teil der Riboseringe des Polyribonukleotids kovalent an der 2'-OH-Position modifiziert ist, um einen Substituenten zu tragen, welcher die Replikation der Matrize durch die Nukleinsäurepolymerase ermöglicht.
Die Nukleinsäurepolymerase kann irgendeine der Nukleinsäurepolymerasen sein, die oben definiert sind.
In einem weiteren Aspekt stellt die vorliegende Erfindung die Verwendung eines Polynukleotids von zumindest 1000 Nukleotiden Länge als eine Matrize für eine Nukleinsäurepolymerase bereit, wobei ein Teil der Riboseringe, deren Polyribonukleotide kovalent modifiziert sind an der 2'-OH-Position, um einen Substituenten zu tragen, welcher die Replikation der Matrize durch Nukleinsäurepolymerase ermöglicht.
Beide von diesen Verwendungen beziehen sich beispielsweise auf die reverse Transkription oder Verwendung in einer Polymerasekettenreaktion, einschließlich RT-PCR.
Gemäß einem weiteren Aspekt stellt die vorliegende Erfindung ein Kit zur Erzeugung eines Nukleinsäurenstrangs bereit, der komplementär ist zu einem Polynukleotid, welcher ein Polyribonukleotid von zumindest 1000 Nukleotiden Länge umfasst, wobei das Kit umfasst:

(a) eine Nukleinsäurepolymerase;
(b) ein Reaktionssystem zur Modifikation des Polynukleotids von zumindest 1000 Nukleotiden Länge, um eine Matrize zu bilden für die Nukleinsäurepolymerase, in welcher ein Teil der Riboseringe der Polyribonukleotide kovalent modifiziert ist an der 2'-OH-Position, um einen Substituenten zu tragen, welcher die Replikation der Matrize durch die Nukleinsäurepolymerase ermöglicht;
(c) optional eine Vielzahl von Mononukleotiden, welche umfassen UTP, dTTP und/oder dUTP, ATP und/oder dATP, GTP und/oder dGTP, und CTP und/oder dCTP; und
(d) optional einen Puffer für die Nukleinsäurepolymerase.

Typischerweise umfasst das Reaktionssystem:

(i) ein organisches Lösungsmittel, welches vorzugsweise eine organische Base umfasst, und
(ii) einen Reaktionspartner, der in der Lage ist, die 2'-OH-Position der Riboseringe des Polyribonukleotids in der Gegenwart des organischen Lösungsmittels kovalent zu modifizieren.

Das Kit kann für eine Vielzahl von Anwendungen einschließlich reverser Transkription verwendet werden, um, beispielsweise cDNA von vollständiger Länge, ein Kit zur Herstellung einer Matrize für SELEX, ein Kit für NASBA, ein Kit für RT-PCR, ein Kit für Ligasekettenreaktion, ein Kit für transkriptionsvermittelte Amplifikation, ein Kit für die Herstellung einer Matrize zum Sequenzieren, oder ein Zielmolekül für die Hybridisierung herzustellen.
Die Kits umfassen ferner geeignete Puffersysteme, die von der Verwendung abhängen, für welche das Kit eingesetzt werden soll, und von der Spezifität der Nukleinsäurepolymerase, welche verlangt ist.
Gemäß einem weiteren Aspekt stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Replikation eines Polynukleotids von zumindest 1000 Nukleotiden Länge bereit, welches umfasst:

(1) Bereitstellen des Polynukleotids als eine Matrize, umfassend ein Polyribonukleotid von zumindest 1000 Nukleotiden Länge, wobei ein Teil der Riboseringe des Polyribonukleotids kovalent modifiziert ist an der 2'-OH-Position;
(2) Herstellen eines doppelsträngigen Polynukleotids gemäß dem vorstehenden Verfahren aus der Matrize;
(3) Ligieren des doppelsträngigen Polynukleotids in einen Vektor; und
(4) Replizieren des Vektors in einen Wirt.

Gemäß einem weiteren Aspekt stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Replikation eines Polynukleotids von zumindest 1000 Nukleotiden Länge bereit, welches umfasst:

(1) Bereitstellen des Polynukleotids als eine Matrize, umfassend ein Polyribonukleotid von zumindest 1000 Nukleotiden Länge, wobei ein Teil der Riboseringe des Polyribonukleotids kovalent modifiziert ist an der 2'-OH-Position;
(2) Ligieren der Matrize in einen Vektor;
(3) Herstellen eines doppelsträngigen Polynukleotids in Übereinstimmung mit dem vorstehenden Verfahren aus der Matrize; und
(4) Replizieren des Vektors in einen Wirt.

Gemäß einem weiteren Aspekt stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Replizieren eines Polynukleotids von zumindest 1000 Nukleotiden Länge bereit, welches umfasst:

(1) Zur Verfügung Stellen des Polynukleotids als eine Matrize, umfassend ein Polyribonukleotid von zumindest 1000 Nukleotiden Länge, wobei ein Teil der Riboseringe des Polynukleotids kovalent modifiziert ist an der 2'-OH-Position;
(2) Herstellen eines doppelsträngigen Polynukleotids in Übereinstimmung mit dem vorstehenden Verfahren aus der Matrize;
(3) Erhalten des Nukleinsäurestrangs, der komplementär zu der Matrize ist, aus dem doppelsträngigen Polynukleotid;
(4) Ligieren des Nukleinsäurestrangs in einen Vektor; und
(5) Replizieren des Vektors in einen Wirt.

Gemäß jedem der vorstehenden Verfahren kann die gemäß der vorliegenden Erfindung modifizierte RNA in einem Klonungsarbeitsablauf verwendet werden.
Obwohl Klonen von DNA gut bekannt ist und häufig durchgeführt wird (Sambrook et al., (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, CSH), kann von der folgenden Änderung erwartet werden, dass sie das Klonen modifizierter RNA verbessert. Insbesondere würde erwartet, dass die folgenden Änderungen des Basisprotokolls längere cDNA-Einschübe ermöglichen würden.
Die RNA-Modifikationsreaktion (Beispiel 6 und andere) können ebenfalls zu der Modifikation der 5'-Phosphatgruppe des RNA-Substrats zusätzlich zu der 3'-OH-Gruppe und der 2'-OH-Gruppe führen. Im Fall der mRNA, welche eine gewöhnliche 5'Cap-Struktur hat, würde erwartet werden, dass die Cap ebenfalls modifiziert wird. Um das Klonen der modifizierten RNA in einen Vektor zu gestatten, ist es notwendig, sowohl die Cap und das 3'-terminale Nukleotid zu entfernen.
Alternativ für RNA-Stränge ohne Cap-Struktur kann direkte Entfernung der modifizierten 5'-Phosphatgruppe durchgeführt werden, entweder mittels alkalischer Phosphatase vom Shrimp oder vom Kalb, es wurde herausgefunden, dass acetylierte RNA mit einer 5'-Triphosphatstruktur, wie sie üblich ist für RNA-Polymerase, die aus synthetischen RNA-Strängen gewonnen wurde, dephosphoryliert werden kann unter Verwendung alkalischer Phosphatase vom Shrimp und rephosphoryliert werden kann mit T4-Polynukleotidkinase (Sambrook et al., (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, CSH).
Die Cap-Struktur wird für gewöhnlich entweder enzymatisch (Jones et al., (1994) in RNA Isolation and Analysis. Bios. Oxford p77) oder mittels einem chemischen Verfahren (Stahl et al., (1989) in Nucleic Acids Sequencing: A Practical Approach. IRL Press, Oxford p137) entfernt. Das 3'-modifizierte Nukleotid kann durch das kurze Aussetzen der 3'-Exonuklease, wie beispielsweise einer Schlangengift-Phosphordiesterase (Crotalus durissus) ent fernt werden. Alternativ könnten die 3'-Exonukleaseaktivitäten von T4-DNA-Polymerase oder Klenow-Fragment-DNA-Polymerase ausgenutzt werden.
Um die Bindung der einzelsträngigen Nukleinsäuren entweder in einen einzel- oder doppelsträngigen DNA-Vektor zu verbessern, könnte die folgende Vorgehensweise eingesetzt werden. Die T4-DNA-Ligase wird einzelsträngige Nukleinsäuren nicht binden, daher wird ein Bereich einer doppelsträngigen Nukleinsäure an jedem Ende der Klonungssite produziert. Das Restriktionsenzym Hga 1 produziert einen 5'-Überhang von 5 Nukleotiden und BstXI produziert eine 4 Nukleotide umfassende 3'-Erweiterung, und diese werden in Verbindung mit geeigneten Klonungsvektoren verwendet, um Ligationssites für den Einschub von einzelsträngigen Nukleinsäuren herzustellen. Die Einschübe können entweder mittels DNA-Ligase oder alternativ mit RNA-Ligase ligiert sein.
Eine doppelsträngige Form des Einschubs kann auf zwei Wegen erzeugt werden: zum einen durch Transformieren geeigneter E.coli-Wirte und Gestatten, dass die Wirtpolymerasen den zweiten Strang produzieren; und zum Zweiten in vitro durch Erstrecken von der freien 3'-OH-Gruppe des Vektors oder des Oligonukleotid-Primers mit Enzymen, wie beispielsweise AMV-reverser Transkriptase, T4-DNA-Polymerase, T7-DNA-Polymerase oder Klenow-Fragment-DNA-Polymerase. Addition eines einzelsträngigen DNA-bindenden Proteins kann die Wirksamkeit der Polymerisation verbessern. Nachfolgende Addition von T4- oder Tth-, Pfu-DNA-Ligase zu der Reaktion verbindet sich mit dem Vektor und fügt eine transformationssteigernde Wirksamkeit hinzu.
Es wird für den Fachmann offensichtlich sein, dass es viele alternative Verfahren gibt, um cDNA-Archive zu schaffen, wie beispielsweise diejenigen, die Oligo-dT verwenden, Random Primer, Linker, Adapter und RNaseH.
Geeignete E.coli-Wirte können solche umfassen, die eine reduzierte Nukleaseaktivität aufweisen, wie beispielsweise Mutanten für recB, recC, sbcB, nei, nfi, xth, nfo, hsd und/oder solche Genotypen, welche die Stabilität von Kloneinschüben erhöhen, wie beispielsweise recA, redJ, sbcC, umuC und uvrC.
Gemäß einem noch weiteren Aspekt stellt die vorliegende Erfindung eine Verwendung für ein Polynukleotid, umfassend mRNA oder virale RNA von zumindest 1000 Nukleotiden Länge zur Verfügung, wobei ein Teil der Riboseringe der Polynukleotide kovalent modifiziert sind in der 2'-OH-Position, für eine Hybridisierungsreaktion.
In Übereinstimmung mit diesem Aspekt der Erfindung wurde überraschend gefunden, dass RNA, die modifiziert ist in Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung, immer noch in der Lage ist, mit Nukleinsäure zu hybridisieren. Weil modifizierte RNA stabiler ist bezüglich Abbau als ihr unmodifiziertes Gegenstück, sind Probleme des Abbaus von RNA während und vor der Analyse vermieden. Es gibt nicht länger das Erfordernis, extreme Maßnahmen zu verwenden, um RNA-Abbau zu vermeiden, wie beispielsweise diejenigen, welche die Verwendung ultrasauberer Arbeitsumgebungen oder teure Inhibitoren von RNasen einschließen.
Typischerweise umfasst die Hybridisierungsreaktion eine Hybridisierung zwischen einer Sonde und einer Matrize, umfassend das modifizierte Polynukleotid, wobei die Sonde eine Mischung von Oligo- und Polynukleotiden wie diejenigen, die bei der Genexpressionsanalyse involviert sind, umfasst.
Alternativ kann die Hybridisierungsreaktion eine Hybridisierung zwischen einer Matrize und einer Sonde umfassen, einschließlich des modifizierten Polynukleotids.
Die Sonde oder die Matrize kann auf einer Festphase, wie beispielsweise einer Hybridisierungsmembran, einer Kugel, einem Partikel, einer Folie, einem Blatt, einem Gel, einem Mikrotiterstreifen, einer Röhre, einer Faser oder Kapillare immobilisiert sein.
Die Festphase kann aus Substanzen wie beispielsweise Nitrozellulose, Agarose, Acrylamid, Zellulose, Latex, Nylon, Polystyrol, Polycarbonat, Polypropylen, PVDF (Polyvinylidenfluorid), Polytetrafluroethylen, einem siliziumoxidbasierten Material, einem Glas, einer Metallverbindung, Gold, einem magnetischen Material oder einem paramagnetischen Material gefertigt sein.
Hybridisierungsreaktion kann ein Blotting-Verfahren umfassen, typischerweise unter Verwendung von irgendeiner der obigen festen Phasen.
Die Sonde oder die Matrize kann an ein anderes Molekül oder eine Gruppe von Molekülen gebunden sein. Es wird häufig gewünscht, dass die Sonde oder die Matrize mit einem Marker markiert ist, welcher ein fluoreszierender Marker, ein radioaktiver Marker, ein Enzym, eine Ligand oder eine Anlagerung als Marker sein kann. Fluoreszierende Marker für Kohlehydratmarkierungen sind in dem U.S.-Patent 6,048,707 beschrieben. Die Moleküle oder Gruppen von Molekülen können selbst den Marker umfassen in dem Sinn, dass die Gruppe von Molekülen in der Lage ist, eine detektierbare Reaktion zu verursachen oder in der Lage ist, eine detektierbare Einheit zu binden. Das Molekül oder die Gruppe von Molekülen kann ein Peptid, ein Polypeptid, wie einen Antikörper, ein Enzym, einen Affinitätspartner, wie beispielsweise ein Protein A oder Streptavidin, ein Rezeptorprotein, einen Liganden, wie beispielsweise Biotin, Dinitrophenyl, Digoxigenin, oder anderes, Hapten oder Lecitin oder einen Marker wie Fluorescin, Rhodamin, Texas-Rot, cy-5, TAMRA, oder einen pigmentierten chromogenen, chemilumineszenten oder gefärbten Marker umfassen.
Die Sonde kann eine verzweigte DNA-(bDNA-)Sonde umfassen.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform kann das Polynukleotid an ein drittes Molekül gebunden sein, wie beispielsweise an ein alkalisches Phosphatase-Antikörperkonjugat.
Polynukleotid kann ein Antisense-Mittel zur Verwendung in einer Antisense-Hybridisierungsreaktion, beispielsweise in vivo, umfassen.
In Übereinstimmung mit einer weiteren Verwendung hat das Polynukleotid eine spezifische Bindungsaffinität zu einem Liganden und die Hybridisierungsreaktion umfasst eine Hybridisierung zwischen dem Polynukleotid und einem Zielmolekül, welches den Liganden umfasst.
Typischerweise umfasst die RNA ein Ribozym.
Gemäß einem weiteren Aspekt, umfasst die Hybridisierungsreaktion eine Ligasekettenreaktion (LCR). LCR erfordert vier spezifische Oligonukleotide, DNA-Ligase und eine DNA-Matrize. Typischerweise ist sie auf die Hybridisierung von zwei matrizenspezifischen Oligonukleotiden, die nebeneinander liegen, angewiesen, so dass das 5'-Phosphat des einen an das 3'-OH des anderen angrenzt. Die zwei Oligonukleotide werden dann durch eine Ligase ligiert, und dieses ligierte Produkt dient selbst als eine Matrize für weitere Ligierungsrunden in der Gegenwart von zwei weiteren Oligonukleotiden, die komplementär zu den ersten beiden Oligonukleotiden sind. Weil die Initiierung von LCR nur hervorgerufen werden kann, wenn eine spezifische DNA-Matrize vorliegt, dient LCR als ein wirksames Mittel zur Untersuchung einer solchen Matrize. Gemäß der vorliegenden Erfindung umfasst die Matrize modifizierte RNA, wie vorstehend beschrieben.
Gemäß einem weiteren Aspekt umfasst die Hybridisierungsreaktion eine Nukleaseprotektionsuntersuchung, in welcher nicht-hybridisierte Polynukleotide typischerweise mit einer einzelsträngigen Nuklease, wie beispielsweise einer S1-Nuklease oder RNase T1 verdaut werden, und das verbleibende Polynukleotid wird analysiert, üblicherweise durch Genelektrophorese.
Nukleaseprotektionsuntersuchungen stellen hierdurch ein Mittel zur quantitativen mRNA-Häufigkeitsbestimmung zur Verfügung, und um die Positionen von Exonen, Intronen und 5'-Transkriptionsstartsites abzugleichen.
Gemäß einem weiteren Aspekt umfasst die Festphase einen Biochip. Wenn die Sonde, die typischerweise mit einem Marker markierte modifizierte RNA umfasst, kann eine Starter-mRNA-Population verwendet werden, um den Biochip direkt zu sondieren, folgend auf die Modifikation. Weil keine enzymatischen Schritte erforderlich sind, um den Marker zu inkorporieren, ist die Quantifizierung des mRNA-Transkripts verbessert. Alternativ kann das Zielmolekül die modifizierte RNA immobilisiert auf diskreten Orten des Biochips enthalten, oder, alternativ, auf diskreten Kugeln oder Partikeln. Auf Grund einer Verringerung des Abbaus der RNA wird die Genexpressionsanalyse verbessert.
Gemäß einem weiteren Aspekt wird die Sonde immobilisiert und umfasst Oligo-(dT), wodurch die Matrize von kontaminierenden Substanzen, wie beispielsweise DNA, gereinigt wird. Auf diese Weise kann mRNA, die beispielsweise in Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung modifiziert ist, aus der Masse der gesamten RNA und/oder DNA aussortiert werden mittels ihres Poly(A)-Schwanzes. Hybridisierung erfolgt zwischen dem modifizierten Poly(A) und dem immobilisierten Oligo(dT).
Die modifizierte RNA kann ebenfalls verwendet werden für Diagnosen, die auf der Gegenwart oder der Abwesenheit einer spezifizierten Nukleotidsequenz basieren.
Gemäß einem weiteren Aspekt wird ein Verfahren für die Hybridisierung eines Oligo- oder Polynukleotids mit einem modifizierten Polynukleotid, welches mRNA, rRNA oder virale RNA umfasst, bereitgestellt, wobei das modifizierte Polynukleotid eine Länge von zumindest 1000 Basen aufweist, und wobei ein Teil der Riboseringe des Polynukleotids kovalent modifiziert ist an der 2'-OH-Position, wobei das Verfahren das in Kontakt Bringens des Polynukleotids mit dem modifizierten Polynukleotid unter Hybridisierungsbedingungen umfasst.
Dieses Verfahren umfasst ferner vorteilhaft das Erhalten des modifizierten Polynukleotids von zumindest 1000 Nukleotiden Länge durch (i) in Kontakt Bringen einer mRNA, rRNA oder viralen RNA von zumindest 1000 Nukleotiden Länge in einem Reaktionsmedium mit einem Reaktionspartner, der geeignet ist, die 2'-OH-Position des Riboserings der RNA kovalent zu modifizieren; (ii) Reagieren der RNA mit dem Reaktionspartner, um modifiziertes Polynukleotid unter Bedingungen zum Erzielen kovalenter Modifikation eines Teils der 2'-OH-Positionen der Riboseringe herzustellen; und (iii) optional Abtrennen des modifizierten Polynukleotids aus dem Reaktionsmedium, wobei das Reaktionsmedium ein organisches Lösungsmittel umfasst. Vorzugsweise umfasst das Reaktionsmedium zumindest 20 % v/v an organischem Lösungsmittel, stärker bevorzugt zumindest 50 %, am meisten bevorzugt zumindest 80 %, am allermeisten zumindest 90 % und ganz besonders zumindest 95 % an organischem Lösungsmittel. Das organische Lösungsmittel umfasst vorzugsweise eine organische Base.
Gemäß einem weiteren Aspekt stellt die vorliegende Erfindung ein Kit zur Modifikation eines Polynukleotids, umfassend mRNA, rRNA oder virale RNA von zumindest 1000 Nukleotiden Länge zur Verwendung in einem Verfahren gemäß dem Anspruch 28 oder Anspruch 29 bereit, wobei das Kit umfasst

(a) ein organisches Lösungsmittel; und
(b) einen Reaktionspartner, der geeignet ist, die 2'-OH-Position der Riboseringe der mRNA, rRNA oder viralen RNA von zumindest 1000 Nukleotiden Länge in der Gegenwart des organischen Lösungsmittels kovalent zu modifizieren, wobei der Reaktionspartner mit einem Marker markiert ist.

In all den Aspekten der vorliegenden Erfindung kann Dialyse eingesetzt werden für Reinigungsschritte nach der Reaktion. Die Dialyse ist ein wohl bekanntes Verfahren, um Moleküle basierend auf ihrer Größe voneinander zu trennen. Auf Grund des grundsätzlich kleinen Volumens der Modifikationsreaktion (20-100 μl) wird es vorgezogen, spezialisierte Dialyseeinheiten zur Anwendung zu bringen (Mini Slide-A-Lyzer, Cat. 69550T, Pierce, USA), welche für diese Volumen geeignet sind. Membranen mit einem Molekulargewichtsgrenzwert unterhalb 3500 Daltons sind bevorzugt. Eine Dialyse bietet daher ein einfaches und geeignetes Mittel zur postreaktiven Reinigung bei der vorliegenden Erfindung.
Massenspektrometrie von isotopisch markierter RNA
MALDI-TOF-Massenspektrometrie stellt ein Mittel zum Messen der Masse von Molekülen innerhalb einer Fraktion von einem Dalton bereit. Es existieren isotopische Varianten für viele gewöhnliche Elemente, die in Biomolekülen gefunden werden, wie beispielsweise Stickstoff, Kohlenstoff und Wasserstoff. Obwohl einige Isotopen radioaktiv sind, sind viele eher stabil. Beispielsweise Deuterium ist eine isotopische Variante des Wasserstoffs mit einer Masse von 2 Daltons. Reagenzien, welche Deuterium (D) oder Kohlenstoff-13 (C-13) enthalten, wie beispielsweise Essigsäureanhydrid, sind kommerziell erhältlich und stellen daher ein einfaches Mittel bereit, um die 2'-OH-Gruppe der RNA mit einem isotopischen Marker zu modifizieren. Die Acetylgruppe (-COCH₃) hat beispielsweise eine Masse von 43 Daltons, wohingegen die deuterierte Form (-COCD₃) eine Masse von 46 Daltons hat. Die Differenz von 3 Daltons in der Masse pro Acetylgruppe wird sogar weit wichtiger, wenn sie mit der Gesamtanzahl von Acetylgruppen pro RNA-Molekül multipliziert wird. Beispielsweise würde ein RNA-Molekül von 1000 Nukleotiden eine Masse von 42.000 (-COCH₃) oder 45.000 (-COCD₃) Daltons mehr haben, als die nichtmodifizierte Form. Der Unterschied bezüglich der Masse zwischen den beiden Acetylformen stellt ein Mittel zum Markieren oder Taggen zweier Populationen von RNA-Molekülen bereit. Wenn sie gemischt werden, könnten die beiden acetylierten Formen der RNA identifiziert werden, weil jede von ihnen eine einzigartige Masse hätte. Derzeit werden Genexpressionsuntersuchungen durchgeführt mittels Markieren von cDNA-Kopien der mRNA mit Fluoreszenzgruppen, so dass cDNA aus Gewebe A rot ist und Gewebe B blau ist, die beiden cDNA-Populationen werden dann durchmischt und zu einer Biochip-cDNA oder Oligonukleotid-Zielsubstanz hybridisiert. Das Verhältnis von roter versus blauer hybridisierter cDNA zu jedem Zielmolekül stellt ein Mittel zur Messung der Genexpression in den beiden Gewebeproben bereit. Der Nachteil ist, dass es nötig ist, eine cDNA-Kopie der mRNA anzufertigen, ein Prozess, der unvermeidlich zu quantitativen Fehlern führt und dessen Empfindlichkeit durch die Anzahl von Fluroreszenzgruppen, die inkorporiert sind, begrenzt ist. Verwendung der mRNA selbst als die Sonde bietet viele Vorteile, nicht zuletzt hinsichtlich der Einfachheit, aber, weit wichtiger, weil Untersuchung quantitativ bleibt, da keine cDNA-Formen involviert werden. Bei diesem Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung können zwei Populationen von RNA, die aus den Geweben A und B stammen, wobei jede mit einer chemischen Gruppe modifiziert ist, die sich von der anderen durch zumindest ein isotopisches Atom an der 2'-OH-Gruppe unterscheidet, gemischt und dann zu einem Zielmolekül hybridisiert werden, so wie diejenigen, die gemeinhin für Biochips verwendet werden, und dann kann das Verhältnis jedes Typs von RNA bestimmt werden mittels Massenspektrometrie. Um Verfahren nachzuschlagen, welche Massenspektrometrie oder RNA-Abbau und Massenspektrometrie verwenden, siehe "Messen des Prozentanteils der Modifizierung von RNA".
Auf Grund der großen und variablen Größe der hybridisierten RNA, kann es schwierig sein, MALDI-TOF zu verwenden, um ihr Molekulargewicht zu bestimmen. Daher können zwei Typen von Abbau-Reaktionen verwendet werden, um ihre Größe zu verringern. Zum einen könnte die RNA mittels Nukleasen, wie beispielsweise BaI 31, abgebaut werden, welche sowohl RNA als auch acetylierte RNA abbauen kann. Das Ergebnis könnte eine Ansammlung von Monomerribonukleotiden sein, jedes mit einem Molekulargewicht, welches bestimmt ist durch die anhängende Acetylgruppe. Daher wird das Monomer ein Molekulargewicht von +42 oder +45 aufweisen.
Das exakte Verhältnis von jedem der Monomertypen gestattet die Bestimmung der Verhältnisse der ursprünglichen RNA aus den Geweben A oder B. Die Vorteile der Durchführung des Abbaus sind zweifach. Zum einen gibt es eine Vergrößerung des Signals, beispielsweise, falls die RNA, die untersucht wird, eine Länge von 1000 Nukleotiden umfasst, würde nach Abbau der relativen Konzentration des Analyten um das 1000fache anwachsen. Zum zweiten würde der Analyt eine vorbestimmte Größe aufweisen, abhängig von der Base, die an die Ribose angehängt ist. Daher würden aus jedem Abbauprozess vier Produktmonomere resultieren, welche U, C, G und A repräsentieren. Jedes von diesen würde in zwei Formen existieren, also würden insgesamt 8 Peaks aus jeder Abbaureaktion entstehen und ein Mittel bereitstellen, um die relativen Expressionsniveaus der Transkripte in Gewebe A und Gewebe B zu vergleichen.
Ein potenziell einfacheres Verfahren könnte es sein, beispielsweise, zwei Pools an RNA mit normalen oder isotopischen Formen von Acylgruppen zu acylieren, wie oben beschrieben, die Hybridisierung durchzuführen und sodann die Acylgruppen von der RNA zu spalten. Dieses Verfahren könnte dazu führen, dass die RNA abgebaut wird, muss aber nicht, und Abbau ist nicht von großer Bedeutung. Jede Anzahl von Verfahren könnte verwendet werden, um die Acylgruppen zu spalten (siehe T.W. Greene: (1991) Protective Groups in Organic Synthesis, 2^nd edition, Wiley Interscience), wie beispielsweise Ammoniak, Zyanid, Alkali oder eine Esterase. Im Fall von Ammoniak würde erwartet werden, dass das Produkt der Deacylierungsreaktion des normalen/deuterierten Acetyls oder der Formylgruppe Ammoniumacetat sein würde (MR 77,08 oder 80,08) oder Ammoniumformiat (MR 63,06 oder 66,06). Die relativen Mengen von entweder Ammoniumsalz für das Acetat (77,08 oder 80,08) oder Formiat (63,06 oder 66,06) würden proportional zu der Menge an RNA sein, die aus dem Gewebe A oder B stammt, welches hybridisiert worden ist zu der Biochip-cDNA oder dem Oligonukleotid-Zielmolekül.
Die vorliegende Erfindung kann verwendet werden für eine Anzahl weiterer Anwendungen, einschließlich Forschungsanwendungen und medizinische Anwendungen, wie nachstehend ausgeführt ist.
Forschungsanwendungen
RNA-Transport, -Handhabung und -Lagerung
Gereinigte RNA-Proben werden gegenwärtig in Trockeneis oder in einer getrockneten Form bei Raumtemperatur transportiert. Trockeneis ist sowohl voluminös, schwer und teuer zu transportieren, wohingegen getrocknete RNA schwierig vollständig in Wasser rückzulösen ist. RNA muss von erfahrenen Technikern gehandhabt werden, andernfalls besteht ein hohes Risiko der Kontamination durch Ribonuklease: Die Lagerung verlangt voluminöse und teure -80 °C-Gefrierapparate, um das Intaktbleiben der RNA sicherzustellen. RNA, die mit Acylgruppen modifiziert wurde, ist einige Tage oder länger bei 37 °C stabil (21) und ist sehr ribonukleaseresistent. Diese Eigenschaften machen aus modifizierter RNA ein attraktives Mittel um RNA zu transportieren, handzuhaben und zu verarbeiten.
Analyse der RNA-Struktur und -Funktion
In-situ-Hybridisierung
Das In-situ-Hybridisierungsverfahren beruht auf der Erhaltung der viralen und zellularen RNA, insbesondere mRNA, in einer intakten Form, um als ein Hybridisierungspartner für eine RNA-markierte Probe zu dienen. Bei Überprüfung der Lokalisierung der markierten Probe ist es möglich, bestimmte Gewebe oder Zellen zu identifizieren, in denen ein besonderes Gen exprimiert ist. Dieses Verfahren basiert auf sowohl der zellulären Ziel-RNA und darauf, dass die Sonden-RNA in einer im großen Maße intakten Form erhalten wird, andernfalls wird die Hybridisierung nicht erfolgen. Die Nützlichkeit für die vorliegende Erfindung kann in der Stabilisierung sowohl der Ziel- als auch der Sonden-RNA gefunden werden, indem, dass sie nicht abgebaut werden, was für nicht-modifizierte RNA üblich ist.

(1) Die Gewebeabschnitte, welche normalerweise die Ziel-RNA enthalten, könnten behandelt werden vor der Hybridisierung durch eine oder mehrere Reagenzien, wie in den Beispielen 1-32 beschrieben wurde. Anders als in den Beispielen 1-32 jedoch, würde die Ziel-RNA in einer ungereinigten Form in situ behandelt werden, mit anderen zellulären Komponenten, wie beispielsweise den Zellmembranen, DNA und Proteinen. Auf diese Weise wird die gesamte RNA-Population modifiziert und daher während des In-situ-Hybridisierungsprozesses stabilisiert.
(2) Die normale Form der Sonde, die für die In-situ-Hybridisierung verwendet wird, ist eine Ribosonde, die durch In-vitro-Transkription produziert wird und aus einer radioaktiven oder fluoreszierend markierten einzelsträngigen RNA zusammengesetzt ist. Solche Sonden unterliegen zu jedem Zeitpunkt während des In-situ-Verfahrens der Zerstörung. Auf die In-vitro-Transkriptionsreaktion folgend, könnte die Ribosonde in einer Weise, die in einem der Beispiele 1-32 beschrieben ist, behandelt werden, um sie gegen Zerstörung zu stabilisieren. Solche modifizierten Ribosonden würden ihre Fähigkeit zum Interagieren auf eine spezifische Weise mit der Ziel-RNA erhalten. Alternativ könnten solche modifizierten Ribosonden als Sonden für jede Anzahl von Hybridisierungsverfahren verwendet werden, wie beispielsweise Northern und Southern Blotting, Chrosome-Mapping-Sonden, oder jedes Verfahren, welches solche Sonden erfordert.

RNA-Analyseverfahren
Es wurden viele Verfahren entwickelt, wie beispielsweise Primer-Extension, S1-Nuklease-Mapping und das RNase-Protektions-Assay, welche auf intakter RNA als ein Substrat für die Analyse beruhen. Abbau der RNA führt zu fehlerhafter Bewertung der RNA-Abhängigkeit oder Lokalisierung der strukturellen Merkmale der mRNA, wie beispielsweise der 5'-Cap-Stelle. Die Modifikation der zu untersuchenden Start-RNA (Primer-Extension) oder der zu verwendenden Sonde für die Analyse (S1-Nuklease-Mapping) würde zu verbesserter Genauigkeit der Ergebnisse führen.
RNA-Molekülgewicht-Marker und Standards
Molekülgewichtmarker, welche aus RNA bestehen, finden vor allem bei der Kalibrierung von Northern Blots und anderen Verfahren Anwendung, welche die RNA gemäß ihrer Größe trennen, wie beispielsweise Massenspektrometrie. Für gewöhnlich werden RNA-Marker diskreter Größen durch eine In-vitro-Transkriptionsreaktion produziert. Solche RNA wird jedoch häufig während des Auftrennverfahrens abgebaut. In dieser Erfindung werden solche diskreten RNA-Moleküle auf eine solche Weise behandelt, dass ihre Intaktheit während des Auftrennverfahrens erhalten bleibt.
Gegenwärtig sind Nukleinsäurestandards für die Verwendung in Diagnosekits für RNA-Viren auf DNA- oder RNA-Kopien der interessierenden Sequenz beschränkt. Der Standard dient als eine interne Kontrolle für die Quantität, die Reinigungseffizienz und die Intaktheit der RNA. DNA-Standards sind keine guten internen Kontrollen, da sie nicht dieselben physikalischen Charakteristiken haben wie RNA, wohingegen RNA-Standards häufig abgebaut werden, entweder während des Transports oder während der Verarbeitung. Gemäß dieser Erfindung modifizierte RNA bleibt in ihrem geschützten Zustand während des Reinigungsverfahrens und es würde daher erwartet sein, dass sie weniger abgebaut wird. Sie ist ebenfalls während des Transports, der Lagerung, der Handhabung und, wenn sie mit Blut gemischt wird, geschützt, aber sie ist darüber hinaus während späterer Stufen der RNA-Reinigung und der cDNA-Synthese geschützt.
Sequenzierung
Es gibt zwei gewöhnliche Verfahren, um RNA zu sequenzieren, die Nukleaseverdauung und das Maxam-Gilbert-Verfahren. Das zweite Verfahren würde, bei Einsetzen der reversen Transkriptase, Nutzen ziehen aus einer modifizierten RNA, die stabilisiert ist, und würde erlauben, größere Mengen an cDNA und daher an Sequenzierungsprodukt herzustellen. MALDI-TOF-Analyse längerer Sequenzierungsprodukte ist gegenwärtig ernsthaft beschränkt durch den Abbau, der mit den DNA-Polynukleotiden abläuft. Es wurde festgestellt, dass RNA-Polynukleotide weniger anfällig sind für Abbau während MALDI-TOF-Analyse, als DNA (Nordhoff et al., (1993) Nucleic Acids Res. 21:3347). Modifizierte RNA-Kopien von RNA-Sequenzierungsprodukten könnten ein unempfindliches Material für Analysen zur Verfügung stellen. Es würde von solcher modifizierter RNA erwartet werden, dass sie während der Handhabung oder Ionisierung während MALDI-TOF-Analyse weniger abgebaut wird und daher verbesserte Ergebnisse bereitstellen würde.
Detektion von Polymorphien
Unterschiede bezüglich Sequenzen zwischen zwei oder mehr Polynukleotiden können detektiert werden durch Unterschiede in der Sekundärstruktur, die von Einzelsträngen angenommen wird. Änderungen in der Sequenz können die Sekundärstruktur der Nukleinsäure ändern, weil Haarnadeln und andere Bereiche von Basenpaaren empfindlich sind bezüglich solcher Änderungen (Hayashi (1991) PCR Methods and Applications 1:34). Es ist möglich, Veränderungen an Sekundärstrukturen zu detektieren und daher Sequenzänderungen unter Verwendung verschiedener Verfahren, wie beispielsweise der Einzelstrangkonformations-Polymorphie (SSCP), der denaturierenden Gelelektrophorese (DGGE) oder Spaltungsfragmentlängen-Polymorphie (CFLP^TM, U.S.-Patent 5,422,253). Es wird in jedem Fall ein Gel verwendet, um die markierte einzelsträngige Nukleinsäure zu detektieren. Obwohl einzelsträngige DNA häufig für solche Analysen verwendet wird, kann RNA ebenfalls verwendet werden (Brow et al., (1996) Focus, Life Technologies 18:2). Eine der Beschränkungen bezüglich der Verwendung von RNA war die Empfindlichkeit bezüglich des Abbaus während des Verfahrens, entweder während der Verarbeitung oder der Gelelektrophorese. Modifizierte RNA würde zwei Vorteile gegenüber nativer RNA anbieten. Zum einen kann sie leichter gehandhabt werden und es ist weniger wahrscheinlich, dass sie abgebaut wird. Zum zweiten ändern die 2'-Modifikationen die Sekundärstruktur des Polynukleotids in einer Weise, die für die Modifikation spezifisch ist. Beispielsweise nehmen Acetyl- und Benzoyl-modifizierte RNA unterschiedliche Sekundärstrukturen bezüglich einander oder bezüglich nativer RNA an. Daher würde modifizierte RNA neue Möglichkeiten für die Detektion von Mutationen, die auf der Struktur basieren, anbieten. Insbesondere könnte modifizierte RNA als ein neues Substrat für CFLP^TM-Spaltungsreaktionen verwendet werden, da es erwartet werden würde, dass Spaltungsmuster sich signifikant gegenüber nativer RNA ändern würden.
Medizinische Anwendungen
Modifizierte RNA kann mit einem Zielmolekül auf zwei bestimmte Weisen interagieren. Zum einen durch Wasserstoffbindungen (Basenpaarung) mit einem Hybridisierungspartner (z. B. Antisense-Oligonukleotide) oder, zum zweiten, auf Grund ihrer Sekundärstruktur (z. B. Aptamere). In jedem Fall kann die modifizierte RNA Nutzwert für die Therapeutik oder die Diagnostik finden.
Therapeutik
Jedwedes therapeutische Molekül (wie beispielsweise Antisense-Nukleinsäuren), das verabreicht wird, sollte idealerweise die folgenden Eigenschaften haben: (i) Es sollte resistent sein gegenüber In-vivo-Abbau, (ii) in der Lage sein, die Zellmembran zu passieren (beispielsweise lipophile Eigenschaften aufweisen), (iii) spezifisch und effizient mit dem Zielmolekül oder dem Zellmechanismus zu interagieren, (iv) eine niedrige Toxizität und Immunogenizität aufweisen. Durch sorgfältige Auswahl des Typs an RNA-Modifikation sollte es möglich sein, diese oder alle dieser Anforderungen zu erfüllen. Beispielsweise würde eine 2'-aliphatische Kette die lipophile Natur des Moleküls steigern, bei gleichzeitigem Verhindern des Abbaus durch RNasen und Erhalt der Fähigkeit, mit einem Zielmolekül zu interagieren.
Die Typen therapeutischer Moleküle, welche auf bestimmte Weise aus den 2'-Modifikationen von RNA Nutzen ziehen könnten, könnten inhibitorische Moleküle, wie beispielsweise Antisense-Nukleinsäuren und Aptamere, einschließen. Andere Typen könnten Moleküle mit katalytischer Aktivität, wie beispielsweise RNA-Enzymen (Ribozyme), oder RNA-kodierende spezifische Peptide, wie beispielsweise mRNA, für die Verwendung in der Gentherapie oder in Nukleinsäure-Impfstoffen sein.
Ribonuklease P
Ribonuklease P kann verwendet werden, um auf die Spaltung eines RNA-Moleküls abzuzielen, welches spezifische Sequenzen enthält (U.S.-Patent Nr. 5,168,053; WO 92/03566). Die Verwendung von Ribonuklease P umfasst die In-vitro-Analyse von Sequenzen und therapeutische Anwendungen. Diese sind jedoch durch die Leichtigkeit beschränkt, mit welcher die RNA abgebaut wird (PCT WO 93/01286). RNA, die an der 2'-OH-Position modifiziert ist gemäß dieser Erfindung, hat eine verbesserte Resistenz gegenüber Ribonuklease-Abbau und bietet daher Verbesserungen gegenüber derzeitiger Praxis.
Ribozyme
Eine katalytische RNA wird als ein Ribozym bezeichnet. Es ist in der Lage, verschiedene Reaktionen durchzuführen, wie beispielsweise die Eigenspaltung oder Spaltung einer definierten Sequenz in einer heterogenen RNA. In diesem Fall könnte die therapeutische Aktivität mit ihr verbunden sein, wenn sie beispielsweise das HIV-RNA-Genom spalten würde. Andere Aktivitäten umfassen das Binden an spezifische Liganden mit hoher Affinität. Ein In-vitro-Verfahren wurde geschaffen, um RNA-Moleküle mit spezifischen enzymatischen Funktionen auszuwählen. Modifikationen an der 2'-OH-Gruppe solcher RNA-Moleküle könnten diese mit größerer Stabilität gegenüber Nukleasen ausstatten, oder, in der Tat, mit neuer enzymatischer Funktion.
Antisense
Antisense sind Sequenzen, die komplementär zu dem Sense-Strang einer mRNA sind, und sie können aus RNA, DNA oder modifizierten Nukleinsäuren bestehen. Sie interferieren mit der normalen Regulation und Funktion von mRNA auf eine solche Weise, dass das Ausmaß einer Proteinsynthese verringert wird. Durch die Interaktion mit der Ziel-RNA ist die Proteintranslation physikalisch gehemmt, oder, die RNaseH-Aktivität wird getriggert, was zu der Zerstörung der Ziel-RNA führt. Solche Interferenz kann therapeutische Wirkungen haben, falls, beispielsweise, auf virale mRNA-Sequenzen abgezielt wird. Einige der theoretischen Vorteile einer solchen Antisense-Therapie sind deren hohe spezifische Bindung an Zielmoleküle und niedrige Toxizität.
Es könnte von modifizierten RNA-Antisense-Molekülen erwartet werden, dass sie eine erhöhte Aktivität aufweisen, verglichen mit natürlichen Nukleinsäuren, weil sie in vivo stabiler sind und/oder stärker lipophil sind, so dass sie leichter in die Zelle eintreten können.
Enzym-Inhibitoren und andere spezifische Bindungsinteraktionen
Die vorliegende Erfindung stellt ferner Verwendung eines Oligo- oder Polynukleotids bereit, welches eine spezifische Bindungsaffinität an einen Liganden zum spezifischen Binden an ein Zielmolekül, welches den Liganden umfasst, aufweist, wobei das Poly nukleotid RNA von zumindest 1000 Nukleotiden mit einer Länge größer als 25 % des Riboserings, der kovalent modifiziert ist in der 2'-OH-Position, umfasst.
RNA-Aptamere, die durch das SELEX-Verfahren ausgewählt worden sind, könnten in vivo verwendet werden, um die Aktivität von Schlüsselenzymen, die mit einem pathogenen Organismus verbunden sind, wie beispielsweise der reversen Transkriptase oder Proteasen von HIV, zu inhibieren. SELEX (systematische Evolution von Liganden durch Exponentialanreicherung) kann in der Theorie, durch Beginnen mit einem ausreichend großen Pool von Random-RNA-Sequenzen, verwendet werden, um RNA-Moleküle mit jeder Zahl von Spezifitäten auszuwählen. Beispielsweise kann RNA ausgewählt werden, die spezifisch auf den epidermalen Wachstumsfaktor (EGF) oder andere Hormone wirkt, und daher ein potenzielles therapeutisches Mittel bereitstellen, um die Aktivität solcher Hormone zu blockieren.
Während des SELEX-Verfahrens können 2'-NH₂-Gruppen, 2'-F-Gruppen, 2'-Methyl- und 2'-O-Methyl-Gruppen wie Ribonukleotide in die RNA-Kette durch T7-RNA-Polymerase aufgenommen werden. Siehe Gerard et al., (1974) Biochemistry 13:1632; Jellinek, et al., (1995) Biochemistry 34:11363; Pan, et al., (1995) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:11509; Green, et al., (1995) Chem. Biol. 2:683; Green, (1995) J. Mol. Biol. 247:60; Lin, et al., (1994) Nucleic Acids Res. 22:5229.
Es wurde gezeigt, dass das Einspritzen von doppelsträngiger RNA, welche komplementär ist zu zellulären mRNA-Sequenzen, in Tiere spezifisch mit der biologischen Aktivität der mRNA interferieren kann. Die Interterenzaktivität ist weit überlegen gegenüber jedem einzelsträngigen Sense von Antisense-RNA. Solche doppelsträngigen RNA-Interferenzmoleküle wurden als RNAi bezeichnet, (Tabara et al., (1998) Science 282:430-431; Kennerdell und Cartew, (1998) Cell 95:1017-1026). Als eine Alternative zu doppelsträngiger RNA, von welcher erwartet werden könnte, dass sie in einer zellulären Umgebung schnell abgebaut werden könnte, könnten modifizierte doppelsträngige RNA als RNAi-Moleküle verwendet werden. Von diesen würde erwartet werden, dass sie eine gleiche biologische Aktivität haben wie die nicht modifizierten Formen, aber dass sie für verlängerte Zeiträume aktiv sein würden, wodurch ihre Wirksamkeit verbessert würde.
Neben den wissenschaftlichen Anwendungen hält RNAi Versprechen für therapeutische und andere medizinische Anwendungen.
Diagnostik
Modifizierte RNA kann in einer markierten Form (beispielsweise radioaktive oder fluoreszierende Markierungen) als eine Sonde für Monitorgenaktivität verwendet werden, einschließlich der folgenden Anwendungen, "Biochip"-Diagnostik, RT-PCR,. Northern und Southern Blotting, RNase-Protektion oder andere Anwendung, wobei spezifische Basepaarung zwischen der Sonde und dem Zielmolekül verlangt wird.
Bedeutende diagnostische Anwendungen umfassen die Reinigung und Detektion von infektiösen Agenzien aus biologischen Proben, wie beispielsweise Blut oder zerebralem Spinalfluid. Diese infektiösen Agenzien, wie beispielsweise Viren mit RNA-Genomen, werden bevorzugt. Es gibt viele medizinisch bedeutende RNA-Viren, wie beispielsweise HCV, HiV, Polio, japanisches Enzephalitis-Virus, Gelbfieber, Frühjahr-Sommer-Enzephalitis, Dengue-Fieber und West-Nil-Virus. Modifizieren der 2'-OH-Gruppen einzelsträngiger oder doppelsträngiger RNA-Viren stellt eine zusätzliche Stabilität zur Verfügung, wodurch die Wahrscheinlichkeit eines zufälligen Abbaus des Analyts während der Verarbeitung verringert wird, und stellt ein direktes Mittel zum Einführen eines Markers zur Verfügung, um die Analyse zu unterstützen. Es würde ebenfalls ein Mittel bereitstellen; um die virale RNA aus einem Körperfluid zu reinigen und dann nachfolgend zu detektieren, als Teil eines diagnostischen Tests oder eines Kits.
Damit verbundene Verwendungen umfassen die Detektion von Virustranskripten, welche wichtige diagnostische Indikatoren für latente Virusinfektion sind. Beispielsweise wird ein DNA- oder RNA-Virus, welches in das Genom des Wirts integriert ist als eine DNA-Kopie, RNA-Transkripte erzeugen. Solche Transkripte zeigen die Gegenwart eines aktiven oder funktionalen Viralgenoms an. Beispiele schließen HIV-, ein RNA-Virus, oder Polyomavirus, ein DNA-Virus, ein. Modifizierte RNA-Kopien dieser Transkripte könnten als Indikatoren dienen sowohl von der Gegenwart des Virus' als auch von seiner Aktivität. Ein spezifisches Beispiel schließt das Detektieren der Gegenwart einer auf HIV folgenden antiviralen Medikamententherapie ein, wobei Bluttiter des Virus' unter detektierbare Niveaus fallen können. In diesem Fall ist ein zuverlässiges Mittel, um latente Infektion zu detektieren, die Quantifizierung der Anzahl von HIV-Transkripten, die durch chromosomale Kopien innerhalb der infizierten Wirtzellen erzeugt werden.
Markierte RNA mit neuen Funktionen, wie beispielsweise Aptamere, welche wie monoklonalen Antikörpern an spezifische Liganden binden können, können als Sonden verwendet werden, um die speziellen Liganden innerhalb, beispielsweise, einer Zelle oder eines Gewebes zu lokalisieren. Medizinisches Imaging würde eine solche Anwendung für diese Technologie sein. Geeignete modifizierte RNA, welche einen Tumormarker beispielsweise binden kann, würde bei der Lokalisierung von Krebszellen im Körper helfen oder als ein frühzeitiger Indikator von Krebs dienen.
Testen von Mikroorganismen
Detektieren von rRNA-Sequenzen wird häufig in einem diagnostischen Verfahren verwendet, um pathologische Bakterien, wie beispielsweise Mykobakterien, zu identifizieren. Die rRNA-Sequenz wird revers transkribiert und unter Verwendung von rRNA-spezifischen Primern und den dem ersten Strang cDNA, der durch eine von verschiedenen Verfahren amplifiziert worden ist, wie beispielsweise der Polymerasekettenreaktion (PCR), Eisenach et al., (1990) Journal of Infectious Diseases 161:977-981, 1990, Nukleinsäuresequenz-basierte Amplifikation (NASBA), (U.S.-Pat. Nr. 5,409,818), transkriptionsmediierter Amplifikation (TMA) (WO 88/10315) oder isothermale Amplifikation, Ligasekettenreaktion (LCR) (Iovannisci et al., (1993) Molecular and Cellular Probes 7:35-43) Strangverschiebungsamplifikation (Spargo et al., (1993) Molecular and Cellular Probes 7:395-404) und Q-Beta-Replikase (An et al., (1995) Journal of Clinical Microbiology 33:860-867). Es wird offensichtlich sein, dass die Stabilisierung oder immobilisierung der rRNA durch 2'-OH-Modifikation die Detektion unter Verwendung irgendeines dieser Verfahren verbessern wird, da die rRNA mit geringerer Wahrscheinlichkeit abgebaut wird, entweder während der Reinigung aus der klinischen Probe oder während dem Transport, der Handhabung und der reversen Transkription.
Unterschiedliche Publikationen beschreiben die Verwendung von rRNA als ein diagnostisches Werkzeug für die Detektion von Pathogenen, wie beispielsweise Mykobakte rium und Helicobacter (Oksanen et al., (1999) J. Pedatr. Gastroenterol. Nutr. 3:252; Kurabachew et al., (1998) J. Clin. Microbiol. 36:1352; Wondimu and Ryon. (1992) J. Clin. Microbiol. 30:2295, U.S. Pat. No. 5,925,518). Diese Verfahren beruhen alle auf der reversen Transkription von rRNA, gefolgt von einem Detektionsschritt, welcher die Hybridisierung mit einer Sonde einschließen kann, oder, noch üblicher, einen Amplifikationsschritt wie PCR oder NASBA.
Es würde von der Stabilisierung der rRNA durch 2'-OH-Modifikation vor der reversen Transkription erwartet werden, dass sie zwei Wirkungen hat. Zum einen, würde, da die rRNA einen großen Anteil an Sekundärstruktur aufweist, Modifikation mit, beispielsweise, Acylierungsreagenzien potenzielle Blöcke für reverse Transkription reduzieren, und, zum zweiten, würde die rRNA mit geringerer Wahrscheinlichkeit zufällig während der Verarbeitung abgebaut werden, weil sie in einer nukleaseresistenten Form vorliegt. Es würde erwartet werden, dass diese Effekte die Empfindlichkeit und Reproduzierbarkeit der Detektion von Pathogenen verbessern würde.
Die Erfindung wird nun detaillierter beschrieben, allerdings lediglich beispielhaft unter Bezug auf die folgenden Beispiele und die beigefügten Zeichnungen, in denen:
1a die Ribose-Ringe von RNA und DNA zeigt;
1b den Mechanismus der RNA-Strangspaltung zeigt;
2 die RNA zeigt, die an der 2'-OH Position modifiziert ist;
3 die RNA-Maskierung und -Demaskierung zeigt;
4 chemische Modifikation und Polymerisation des zweiten Strangs der RNA zeigt;
5a, b und c Acylierung, beziehungsweise Silylierung und Alkyletherbildung aus RNA zeigen;
6 die Bildung eines 2'-Chlorsubstituenten an RNA zeigt;
7 die Bildung eines 2'-Levulinats aus RNA zeigt;
8 eine TBAF-katalysierte Austauschreaktion von Silyl für Hydroxyl zeigt;
9 eine Fluorid-Ion katalysierte Austauschreaktion von Silyl für Hydroxyl zeigt;
10 ein Sequenziergel zeigt, das eine erhöhte Stabilität der gemäß der Erfindung modifizierten RNA darlegt;
11 ein Schema der PCR und reversen Transkription unter Verwendung der gemäß der Erfindung modifizierten RNA zeigt;
12 einen Vergleich der Hybridisierungseigenschaften von modifizierter und nicht modifizierter RNA zeigt;
13 die Ergebnisse des Agarosegel- und Northern Blotting zeigt, wobei modifizierte und nicht modifizierte RNA verglichen werden;
14 das gelelektrophoretische Migrationsverhalten von modifizierter und nicht modifizierter RNA vergleicht;
15 das gelelektrophoretische Verhalten von mit Buttersäure- und Pentansäure-Anhydrid modifizierter RNA zeigt;
16 das gelelektrophoretische Verhalten von RNA zeigt, die in Gegenwart oder Abwesenheit eines Katalysators acetyliert wurde;
17 das gelelektrophoretische Verhalten von RNA zeigt, die über verschiedene Reaktionsdauern acetyliert wurde;
18 das gelelektrophoretische Verhalten der RNA zeigt, die in Gegenwart oder Abwesenheit des Katalysators modifiziert wurde;
19 das gelelektrophoretische Verhalten von RNA zeigt, die gemäß des Stands der Technik behandelt und gemäß der Erfindung modifiziert wurde;
20 ein Diagramm der RNA oder der modifizierten RNA zeigt, die unter zunehmend strengeren Waschbedingungen hybridisiert bleiben;
21 ein Diagramm des Prozentsatzes an RNA oder modifizierter RNA zeigt, die nach einer steigenden Anzahl von Tagen bei 37 °C zurückbleibt; und
22 die Ergebnisse der Durchführung der von Wang et al. beschriebenen Verfahren zeigt.
Beispiel 1
Acylierung der Gesamt-RNA, gefolgt von mRNA-Auswahl
Das Verfahren zur Modifikation von mRNA könnte eines von mehreren sein. Jedoch ist ein bevorzugtes Verfahren wie folgt. Das Gewebe, wie zum Beispiel 1g eines Skelettmuskels der Maus, wird zerlegt und sofort in flüssigem Stickstoff schockgefrostet und dann unter flüssigem Stickstoff mit einem Mörser und einem Stößel zermahlen.
Weitere Gewebe- und Zellzerstörung wird dann mit Standardmitteln durchgeführt, wie zum Beispiel die Homogenisierung unter Verwendung eines Waring-Mischers (Waring Commercial of Gateshead, England), in Gegenwart von Guanidin Isothiocyanat und Phenol, gewerblich erhältlich als TRIzol Reagenz (Gibco BRL). Alternativ können Gewebekulturzellen aus einer 3,5 cm dicken Kulturgewebescheibe in 1 ml von TRIzol Reagenz homogenisiert werden, indem sie wiederholt durch eine Pipette geführt werden. Anschließend an eine 5 minütige Inkubation bei Raumtemperatur werden 0,2 ml Chloroform pro 1 ml TRIzol Reagenz zugefügt und 15 Sekunden lang geschüttelt. Nach Zentrifugieren bei 12.000 g 15 Minuten lang bei 4 °C wird die obere wässrige Phase entfernt und mit 0,5 ml Isopropanol pro 1 ml TRIzol Reagenz in einem frischen Gefäß vermischt. Die Proben wurden 10 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubiert und wieder bei 12.000 g 10 Minuten lang bei 4 °C zentrifugiert. Der Niederschlag wurde mit 1 ml 75 %igem Ethanol pro 1 ml TRIzol Reagenz gewaschen, trocknen gelassen und in 0,2 ml Wasser wieder aufgelöst. Die gesamte RNA-Lösung, die aus 1-5 mg tRNA, rRNA und mRNA Fraktionen besteht, wird dann zu 4 ml Tetrahydrofuran hinzugefügt, das (12 mg; 98 μmol) 1-Methylimidazol als Katalysator enthält, und dann wurden 200 μl (1,96 mmol) Essigsäure-Ameisensäure-Anhydrid zugefügt und lebhaft über Eis 1 Minute lang gemischt, danach wurde die Reaktion bei Raumtemperatur 2 Minuten lang ablaufen gelassen. Die Reaktion wurde dann beendet, indem 3 Reaktionsvolumina Ethanol zugefügt wurden, gefolgt von 5 sekündigem Mischen mit einem Rührer. Die modifizierte RNA wurde aus den Reaktionspartnern und dem Lösungsmittel unter Verwendung eines von mehreren Verfahren entfernt. Das bevorzugte Verfahren war, die modifizierte RNA durch Hinzufügen von Natriumchlorid ethanolisch bis zu einer Endkonzentration von 0,3 M auszufällen, und Schleudern in einer Zentrifuge 15 Minuten lang bei 14.000 g bei 4 °C (Sambrook et al., (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, CSH.) oder mittels Microcon-50 Spin-Column-Reinigung (Amicon, USA) wie beschrieben, oder durch ein weiteres Verfahren, das eine solche Reinigung gestattet. Die modifizierte RNA kann dann für eine beliebige Anzahl von Anwendungen verwendet werden, wie zum Beispiel für Northern Blotting oder für mRNA Reinigung. Der Ablauf der mRNA Reinigung aus der gesamten acylierten Fraktion wird nun beschrieben.
Die acylierte mRNA-Fraktion wird aus der acylierten Gesamt-RNA mittels des Poly(A)-Schwanzes, der allen mRNA Molekülen gemeinsam ist, getrennt. Ein PolyATract^® Isolierungssystem von Promega, USA, wurde wie folgt verwendet. Ein Milligramm der gesamten RNA wird in ein Endvolumen von 2,43 ml Wasser verdünnt und bei 65 °C 10 Minuten lang inkubiert. Dann werden 10 μl der biotinylierten-oligo (dT) Sonde mit 60 μl von 20 × SSC zu der RNA-Lösung hinzugefügt und auf Raumtemperatur über 30 Minuten abkühlen gelassen. Der biotinylierte-oligo (dT) Sonden-mRNA-Komplex wurde vermischt mit 0,5 ml (0,5 × SSC) von paramagnetischen Streptavidin-Partikeln und 10 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubiert, dann in 0,1 × SSC (4 × 1,5 ml) gewaschen. Die mRNA-Fraktion wurde dann eluiert, indem der biotinylierte-oligo (dT) Sonden-mRNA Komplex in 1 ml Wasser vermischt wurde, die Partikel entfernt wurden und die wässrige Phase aufgefangen wurde. Die so hergestellte acylierte mRNA ist für Anwendungen geeignet, die cDNA Archiv-Synthese, Northern Blotting und in vitro Proteintranslation einschließen, aber nicht auf diese beschränkt sind. Eine Ausbeute von 30 μg mRNA aus 1 mg Gesamt-RNA Startmaterial wird erwartet.
Beispiel 2
Acylierung von gereinigter mRNA
Eine Gewebeprobe, wie zum Beispiel 1g vom Skelettmuskel einer Maus, wird unmittelbar in flüssigem Stickstoff schockgefrostet und dann unter flüssigem Stickstoff mit einem Mörser und Stößel zermahlen, danach in ein 10 ml Zentrifugengefäß übertragen. Weitere Gewebe- und Zellzerstörung wird dann mit Standardgeräten durchgeführt, wie zum Beispiel die Homogenisierung unter Verwendung eines Waring-Mischers (Waning Commercial, Gateshead, England), in Gegenwart von Guanidin-Isothiozyanat und Phenol, gewerblich erhältlich als TRIzol Reagenz von Gibco BRL. Anschließend an eine 5 minütige Inkubation bei Raumtemperatur wurden 0,2 ml Chloroform pro 1 ml TRIzol Reagenz zugefügt und 15 Sekunden lang geschüttelt. Nach Zentrifugieren bei 12.000 g 15 Minuten lang bei 4 °C wird die obere wässrige Phase entfernt und mit 0,5 ml Isopropanol pro 1 ml TRIzol Reagenz in einem frischen Gefäß vermischt. Die Proben wurden 10 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubiert und wieder bei 12.000 g 10 Minuten lang bei 4 °C zentrifugiert. Der die gesamte RNA-Fraktion enthaltende Niederschlag wurde mit 1 ml 75 %-igem Ethanol pro 1 ml TRIzol Reagenz gewaschen, trocknen gelassen und in 0,2 ml Wasser wieder rückgelöst.
Die mRNA-Fraktion wird aus der nicht-polyadenylierfen RNA durch eine beliebige Anzahl an Verfahren, wie zum Beispiel dem PolyATract^® Isolierungssystem von Promega, USA, abgetrennt, das wie folgt verwendet wurde. Ein Milligramm der Gesamt-RNA wird in einem Endvolumen von 2,43 ml Wasser verdünnt und bei 65 °C 10 Minuten lang inkubiert. Dann werden 10 μl biotinylierte-oligo (dT) Sonde mit 60 μl von 20 × SSC zu der RNA-Lösung hinzugefügt und auf Raumtemperatur über 30 Minuten abkühlen gelassen. Der biotinylierte-oligo (dT) Sonden-mRNA Komplex wurde mit 0,5 ml (0,5 × SSC) von paramagnetischen Streptavidin-Partikeln vermischt und 10 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubiert, danach in 0,1 × SSC (4 × 1,5 ml) gewaschen. Die mRNA-Fraktion wurde dann eluiert, indem der biotinylierte-oligo (dT) Sonden-mRNA Komplex in 0,2 ml Wasser gemischt wurde, die Partikel mit dem Magnetfeld-Stativ entfernt wurden und die wässrige Phase aufgefangen wurde.
Zu 0,1-1 μg mRNA in 1 μl Wasser wurden 20 μl Triethylamin hinzugefügt, das eine katalytische Menge (60 μg; 490 nmol) 4-Dimethylaminopyridin (DMAP) enthält, und dann wurde 1 μl (9,8 μmol) Essigsäureanhydrid hinzugefügt. Die Lösung wurde lebhaft unter Verwendung eines Rührers 5 Sekunden lang vermischt, und die Reaktion wurde 60 Sekunden lang bei Raumtemperatur (22 °C) ablaufen gelassen. Die Reaktion wurde dann durch Hinzufügen von 3 Reaktionsvolumina Ethanol oder Methanol beendet, gefolgt von 5-sekündigen Mischen mit einem Rührer. Die modifizierte RNA wurde aus den Reaktionspartnern und dem Lösungsmittel entfernt, indem eines von mehreren Verfahren verwendet wurde. Das bevorzugte Verfahren war, die Mischung auf ein Endvolumen von 400 μl Wasser zu verdünnen, was dann einer Centricon-50 Spin-column (Amicon, USA) zugeführt und 15 Minuten lang bei 3.000g zentrifugiert wurde, oder bis der Filter trocken war. Der Filter wurde dann durch Hinzufügen von 400 μl Wasser gewaschen und wieder 15 Minuten lang bei 3.000g geschleudert. Die modifizierte RNA wurde wieder gewonnen, indem die Schale, die den Filter enthält, in ein frisches Zentrifugengefäß ausgeleert wurde und dies wieder 60 Sekunden lang bei 3.000 g geschleudert wurde. Die erhaltenen Volumina lagen typischerweise bei 5-15 μl und die erhaltene Ausbeute bei >95 %.
Beispiel 3
Halogenid-Ion-katalysierte Acetylierungsreaktion
Die Spezifität und die Menge der mRNA-Acetylierung kann durch die Zugabe von Halogenid-Ionen wie zum Beispiel Fluorid-Ionen verbessert werden. Zwischen 100 ng bis 1000 ng gereinigte mRNA wurde mit einer Lösung vermischt, die 30 nmol Tetrabutyl-Ammoniumfluorid (TBAF) oder Tetrabutyl-Ammoniumiodid (TBAI), 10 μmol Essigsäureanhydrid und Tetrahydrofuran (THF) oder Triethylamin (TEA), das dazu dient, das Lösungsmittel auf ein Endvolumen von 20 μl zu bringen, enthält. Die Reaktion wird 2 bis 30 Minuten lang bei Raumtemperatur ablaufen gelassen. Alternativ können Pivalinsäure-Anhydrid oder Benzoesäure-Anhydrid das Essigsäureanhydrid als Acyl-Donor ersetzen (Beaucage und Ogilvie, (1977) Tetrahedron Lett., 1691). Alternativ wurden 10 μl eines der Acylierungsr eagenzien, Essigsäure-Ameisensäure-, Propansäure-Buttersäure-, Pentansäure, Hexansäure-, Heptansäure-, Oktansäure- oder Benzoesäure Anhydride an Stelle des Essigsäureanhydrids hinzugefügt. Alle anderen Reaktions- und Reinigungsverfahren waren identisch. Die nicht abreagierten Komponenten wurden entweder durch Ethanolausfällung (Sambrook et al., (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, CSH) oder mittels Microcon-50 Spin-Column-Reinigung (Amicon, USA) wie beschrieben entfernt.
Beispiel 4
Aminopyridin-katalysierte Acylierungsreakion
Beschrieben wird die katalytische Acylierung von Alkoholen mit einem Säure-Anhydrid, wobei Triethylamin und der hypernukleophile Acylierungskatalysator Aminopyridin, wie zum Beispiel 4-Pyrrolidinopyridin, involviert sind. Zu einer Lösung von 1 μg RNA in 1 μl Wasser wurden 60 μg 4-Pyrrolidinopyridin in 20 μl Triethylamin (TEA) hinzugefügt, und danach wurden 10 μmol eines Säureanhydrids, wie zum Beispiel Essigsäure-Ameisensäure-, Essigsäure-, Propansäure-, Buttersäure-, Pentansäure, Hexansäure-, Heptansäure-, Oktansäure- oder Benzoesäure-Anhydrid, hinzugefügt. Die Reaktion wurde vermischt, und sie wurde bei Raumtemperatur ablaufen gelassen, bis die Acetylierung vollständig war (2 bis 30 Minuten), (Hofle und Steglich, (1972) Synthesis 619; Steglich und Hofle, (1969) Tetrahedron Lett. 4727; Hassner, et al., (1978) Tetrahedron 34:2069). Überschüssige Reaktionskomponenten wurden entweder durch ethanolische Ausfällung (Sambrook et al., (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, CSH) oder mittels Microcon-50 Spin-Column-Reinigung (Amicon, USA) wie beschrieben entfernt.
Beispiel 5
Markieren von RNA mit einer fluoreszierenden oder radioaktiven Gruppe
Die modifizierende Chemikalie, die verwendet wird, um mit der 2'-OH-Gruppe zu reagieren, könnte einen radioaktiven Marker, wie zum Beispiel 14C, Tritium, (3H), oder einen fluoreszierenden Marker, wie zum Beispiel Fluorescein oder Rhodamin, als ein Mittel umfassen, das Molekül an multiplen Positionen zu markieren. Geeignete markierte Reaktionspartner schließen 14C- oder 3H-Essigsäure-Anhydrid ein und werden wie folgt verwendet. Zu 1 μg mRNA wurden 20 μl Triethylamin hinzugefügt, das (60 μg; 490 nmol) DMAP und 500 μCi von 14C (100-124 μCi/mmol) Essigsäureanhydrid (Amersham, UK) enthält.
Die nicht abreagierten Komponenten einschließlich des radiomarkierten Essigsäureanhydrids wurden entweder durch Ethanolausfällung (Sambrook et al., (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, CSH), oder mittels Microcon-50 Spin-Column-Reinigung (Amicon, USA) wie beschrieben entfernt. Die spezifische Aktivität der markierten RNA wird durch TCA Ausfällung quantifiziert. Die gereinigte radiomarkierte mRNA ist für vielfältige Zwecken wie zum Beispiel als Hybridisierungssonde geeignet.
Beispiel 6
DMAP-katalysierte Acylierungsreaktionen
Zu 0,1-1 μg mRNA in 1 μl Wasser wurden 20 μl Triethylamin hinzugefügt, die eine katalytische Menge (60 μg; 490 nmol) 4-Dimethylaminopyridin (DMAP) enthalten, und dann wurde 1 μl (10 μmol) Essigsäureanhydrid hinzugefügt. Die Lösung wurde lebhaft unter Verwendung eines Rührers 5 Sekunden lang vermischt, und die Reaktion wurde 60 Sekunden lang bei Raumtemperatur (22 °C) ablaufen gelassen. Die Reaktion wurde dann durch Zugabe von 3 Reaktionsvolumina Ethanol oder Methanol beendet, gefolgt von 5 Sekunden langem Mischen mit einem Rührer. Die modifizierte RNA wurde aus den Reaktionspartnern und dem Lösungsmittel unter Verwendung eines von mehreren Verfahren entfernt. Das bevorzugte Verfahren war, die Mischung auf ein Endvolumen von 400 μl Wasser zu verdünnen, welches dann einer Centricon-50 Spin-Column (Amicon, USA) zugeführt wurde und 15 Minuten lang bei 3.000g zentrifugiert wurde, oder bis der Filter trocken war. Der Filter wurde dann durch Zugabe von 400 μl Wasser gewaschen und wieder 15 Minuten lang bei 3.000g geschleudert. Die modifizierte RNA wurde wiedergewonnen, indem die Schale, die den Filter enthält, in ein frisches Zentrifugengefäß ausgeleert wurde und erneut 60 Sekunden lang bei 3.000g geschleudert wurde. Die erhaltenen Volumina lagen typischerweise bei 5-15 μl und die erhaltene Ausbeute bei >95 %.
Alternative acylierende Reaktionspartner wurden mit dem gleichen Protokoll verwendet, außer dass ein Maximum von 200 μg RNA pro Reaktion verwendet wurde. In jedem Fall wurden 10 μmol des acylierenden Reaktionspartners aus der Liste Essigsäure-Ameisensäure-, Propansäure-, Buttersäure-, Pentansäure-, Hexansäure-, Heptansäure-, Oktansäure- oder Benzoesäure-Anhydride anstelle des Essigsäureanhydrids hinzugefügt. Alle anderen Reaktions- und Reinigungsverfahren waren identisch.
Beispiel 7
Chloressigsäure-Anhydrid-Reaktionen
Zu 0,1-1 μg mRNA in 1 μl Wasser wurden 20 μl Triethylamin hinzugefügt, die eine katalytische Menge (60 μg; 490 nmol) 4-Dimethylaminopyridin (DMAP) enthalten, und dann wurde 1 μl (4,8 μmol) Chloressigsäure-Anhydrid hinzugefügt. Die Lösung wurde lebhaft unter Verwendung eines Rührers 5 Sekunden lang vermischt, und die Reaktion wurde 60 Sekunden lang bei Raumtemperatur (22 °C) ablaufen gelassen. Die Reaktion wurde dann durch Zugabe von drei Reaktionsvolumina Ethanol oder Methanol beendet, gefolgt von 5 sekündigem Mischen mit einem Rührer. Die modifizierte RNA wurde aus den Reaktionspartnern und dem Lösungsmittel unter Verwendung eines von mehreren Verfahren entfernt. Das bevorzugte Verfahren war, die Mischung auf ein Endvolumen von 400 μl Wasser zu verdünnen, was dann einer Centricon-50 Spin-Column (Amicon, USA) zugeführt wurde, und 15 Minuten lang bei 3.000g zentrifugiert wurde, oder bis der Filter trocken war. Der Filter wurde dann durch Zugabe von 400 μl Wasser gewaschen und wieder 15 Minuten lang bei 3.000g geschleudert. Die modifizierte RNA wurde wiedergewonnen, indem die Schale, die den Filter enthält, in ein frisches Zentrifugengefäß ausgeleert wurde und 60 Sekunden lang bei 3.000g geschleudert wurde. Es ist zu bemerken, dass die Chloressigsäure-Modifikation in Wasser bei Raumtemperatur labil ist, daher wird die Lagerung in angesäuerten Lösungen, wie zum Beispiel pH 3-6, bei -80 °C bevorzugt. Chloressigsäure-modifizierte RNA kann nicht detektiert werden, indem herkömmliche Harnstoff-Acrylamid Sequenziergel e verwendet werden.
Beispiel 8
DMAP-katalysierte Säurechloridreaktionen
Zu 0,1-1,0 μg mRNA in 1 μl Wasser wurden 20 μl Triethylamin hinzugefügt, das eine katalytische Menge (60 μg; 490 nmol) 4-Dimethylaminopyridin (DMAP) enthält, und dann wurde 1 μl (3,5 μmol) einer Lösung aus 25 %igem Acetylchlorid in Toluol hinzugefügt. Die Lösung wurde dann lebhaft unter Verwendung eines Rührers 5 Sekunden lang vermischt und die Reaktion wurde 60 Sekunden lang bei Raumtemperatur (22 °C) ablaufen gelassen. Die Reaktion wurde dann durch Zugabe von 3 Reaktionsvolumina Ethanol oder Methanol beendet, gefolgt von 5-sekünigem Mischen mit einem Rührer. Die modifizierte RNA wurde aus den Reaktionspartnern und dem Lösungsmittel unter Verwendung eines von mehreren Verfahren entfernt. Das bevorzugte Verfahren war, die Mischung zu einem Endvolumen von 400 μl Wasser zu verdünnen, was dann einer Centricon-50 Spin-Column (Amicon, USA) zugeführt wurde und 15 Minuten lang bei 3.000g zentrifugiert wurde, oder bis der Filter trocken war. Der Filter wurde dann durch Zugabe von 400 μl Wasser gewaschen und wieder 15 Minuten lang bei 3.000g geschleudert. Die modifizierte RNA wurde wiedergewonnen, indem die Schale, die den Filter hält, in ein frisches Zentrifugengefäß ausgeleert wurde und 60 Sekunden lang bei 3.000g geschleudert wurde. Die erhaltenen Volumina lagen typischerweise bei 5-15 μl und die erhaltene Ausbeute >95 %. Entweder Halogenessigsäure-Anhydrid, Dihalogenessigsäure- oder Trihalogenessigsäureanhydrid oder Halogenacetyl-, Dihalogenacetyl- oder Trihaloacetylchlorid oder -bromid können auch als Ersatz für Chloracetyl-Anhydrid verwendet werden. Die Gegenwart von mehr als einem Halogenatom in der Acetylgruppe steigert jedoch dessen Labilität erheblich.
Beispiel 9
Kondensationsreaktionen zwischen Carboxylsäure und RNA
Um den Veresterungsprozess zu fördern, werden Dehydrierungsmittel, wie zum Beispiel N,N'-Dicyclohexylcarbodiimid (DCC), verwendet. 1 μg mRNA (6 pmol) wurde in 10 nmol Carboxylsäure gelöst, die 11 nmol Dicyclohexylcarbodiimid (DCC), 1 nmol 4-Pyrrolidinopyridin enthält, und es wurde Ether oder Dichlormethan hinzugefügt, um das Endvolumen auf 50 μl zu bringen. Die Reaktion wurde bei Raumtemperatur ablaufen gelassen, bis die Veresterung vollständig war (20 Min-6 Std). Die verwendeten Carboxylsäuren können Benzoesäure, Essigsäure, Diphenylessigsäure und Mesitonsäure (Hassner and Alexanian, (1978) Tetrahedron Letters 4475). Die Nukleinsäurefraktion der Reaktion wurde entweder durch Ethanolausfällung (Sambrook et al., (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, CSH) oder mittels Microcon-50 Spin-Column-Reinigung (Amicon, USA) wie beschrieben gereinigt. Um die Löslichkeit der RNA zu verbessern, kann sie in 10 μl entweder von Dimethylformamid oder Dimethylsulphoxid gelöst werden, bevor sie der Reaktion zugefügt wird.
Beispiel 10
t-Butyl-Isocyanid-katalysierte Acylierung mit Carboxylsäure
Die Verwendung von Isonitril-Reaktionspartnern wie zum Beispiel t-Butyl-Isocyanid bei der Veresterung von Alkoholen mit Carboxylsäuren (Rehn und Ugi, (1977) J. Chem. Research (M) 1501-1506). Es wurden 3,5 μg mRNA (6 pmol) in einer Lösung, die 5 nmol Carboxylsäure, 15 nmol t-Butyl-Isocyanid und entweder Ether oder Dichlormethan enthält, gelöst, um das Endvolumen auf 50 μl zu bringen. Die Reaktion wurde bei Raumtemperatur ablaufen gelassen, bis die Veresterung vollständig war (ungefähr 3 Std.). Die verwendeten Carboxylsäuren können Essigsäure, Diphenylessigsäure und Mesitonsäure sein, sind aber nicht auf diese beschränkt. Die Nukleinsäurenfraktion der Reaktion wurde entweder durch Ethanolausfällung (Sambrook et al., (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, CSH) oder mittels Microcon-50 Spin-Column-Reinigung (Amicon, USA) wie beschrieben gereinigt. Um die Löslichkeit der RNA zu verbessern, kann sie in 10 μl entweder von Dimethylformamid oder Dimethylsulphoxid gelöst werden, bevor sie der Reaktion zugegeben wird.
Beispiel 11
Verwendung von Phenoxyacetylchlorid-Reaktionspartner
RNA (1 μg; 6 pmol) in 1 μl Wasser wurden zu 20 μl THF, das 10 μmol Phenoxyacetylchlorid enthält, hinzugefügt. Die Reaktion wurde bei Raumtemperatur 30 Minuten lang ablaufen gelassen (siehe Tetrahedron Lett. (1968) 4273). Die Nukleinsäurefraktion der Reaktion wurde dann entweder durch Ethanolausfällung (Sambrook et al., (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, CSH) oder mittels Microcon-50 Spin-Column-Reinigung (Amicon, USA) wie beschrieben gereinigt. Die Reaktion ist schematisch in 9 gezeigt. Um die Löslichkeit der RNA zu verbessern, kann sie in 10 μl entweder von Dimethylformamid oder Dimethylsulphoxid gelöst werden, bevor sie der Reaktion zugegeben wird.
Beispiel 12
Verwendung von Levulinsäure-Reaktionspartnern
1 μg (1,7 pmol) RNA wurde in 10 μl Dimethylformamid aufgelöst, und dann wurde Dioxan, das 3,4 nmol Levulinsäure, 3,4 nmol DCC und 100 μg DMAP enthält, hinzugefügt und vermischt. Die Reaktion wurde 24 Stunden lang bei Raumtemperatur ablaufen gelassen (Tetrahedron Lett. (1982) 2615). Die nicht umgesetzten Komponenten wurden aus der levulinierten Ester RNA entweder durch Ethanolausfällung (Sambrook et al., (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, CSH) oder mittels Microcon-50-Reinigung Spin-Column (Amicon, USA) wie beschrieben entfernt. Die Reaktion ist schematisch in 7 gezeigt.
Die levulinierte Gruppe kann anschließend durch zwei alternative Verfahren entfernt werden. Verfahren (1). Durch die Zugabe von 47,7 μg Natriumborhydrid (NaBH₄) zu einer 50 μl Lösung, die 10 μl Wasser und 40 μl Dioxan und die levulinierte Ester RNA enthält. Der pH-Wert wird durch Zugabe von Essigsäure auf 5 eingestellt, und die Reaktion wird bei Raumtemperatur 6 Stunden lang ablaufen gelassen. Verfahren (2). 1 μg der levulinierten RNA wurde mit 10 μl von 10 mM Hydrazinhydrad in Pyridin-Essigsäure (4:1 vol/vol) behandelt (van Boom und Burgers, Tetrahedron Letters (1976) 4875). In beiden Fällen wurde die mRNA durch Ethanolausfällung wiedergewonnen (Sambrook et al., (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, CSH). Um die Löslichkeit der RNA zu verbessern, kann sie in 10 μl entweder von Dimethylformamid oder Dimethylsulphoxid gelöst werden, bevor sie der Reaktion zugefügt wird.
Beispiel 13
TBAF-katalysierter Austausch von Silyl- zu Hydroxyl
Die Reaktion führt zu dem direkten Austausch einer 2'-O-Silylgruppe mit der ursprünglichen Hydroxylgruppe, wenn sie in Gegenwart eines Fluoridions durchgeführt wird. Zwischen 100 ng bis 1000 ng von silylierter mRNA in 10 μl Dimethylformamid wurden mit einer Lösung vermischt, die 150 nmol Tetra-(n-butyl)-Ammoniumfluorid (TBAF) und Tetrahydrofuran (THF) enthält, das als das Lösungsmittel dient, um das Endvolumen auf 50 μl zu bringen. Die Reaktion wird 24 Stunden lang bei Raumtemperatur ablaufen gelassen. Die nicht abreagierten Komponenten wurden entweder durch Ethanolausfällung (Sambrook et al., (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, CSH) oder mittels Microcon-50 Spin-Column-Reinigung (Amicon, USA) wie beschrieben entfernt. Die Reaktion ist schematisch in 8 gezeigt.
Beispiel 14
TEA·3HF-katalysierter Austausch von Silyl- zu Hydroxyl
Die Reaktion führt zu einem direkten Austausch einer 2'-O-Silylgruppe mit einer Hydroxylgruppe, wenn sie in Gegenwart von TEA·3HF durchgeführt wird. Zwischen 100 ng und 1000 ng silylierter (TBDMS) mRNA in 10 μl Dimethylformamid wurden mit 50 μl reinem Triethylamin-tris-Hydrofluorid (TEA·3HF) vermischt. Die Reaktion wird 14 Stunden lang bei Raumtemperatur ablaufen gelassen (Sproat, et al., (1995) Nucleosides and Nucleosides 14:255). Die nicht abreagierten Komponenten wurden entweder durch Ethanolausfällung (Sambrook et al., (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, CSH) oder mittels Microcon-50 Spin-Column-Reinigung (Amicon, USA) wie beschrieben entfernt.
Beispiel 15
Fluridion-katalysierter Austausch von Silyl- zu Hydroxyl
Die Reaktion führt zu dem direkten Austausch einer 2'-O-Silylgruppe mit einer 2'-O-Acylgruppe, wenn sie in Gegenwart eines Fluoridions durchgeführt wird. Zwischen 100 ng und 1000 ng silylierter mRNA in 10 μl Dimethylformamid wurden mit einer Lösung vermischt, die 30 nmol Tetra-(n-butyl)-Ammoniumfluorid (TBAF), 10 μmol Essigsäureanhydrid und Tetrahydrofuran (THF) enthält, das als das Lösungsmittel dient, um das Endvolumen auf 50 μl zu bringen. Die Reaktion wird 30 Minuten bis 5 Stunden lang bei Raumtemperatur ablaufen gelassen. Alternativ können Essigsäure-Ameisensäure-, Pivalinsäure-, Propansäure-, Buttersäure-, Pentansäure-, Hexansäure-Anhydride oder Benzoesäure-Anhydrid das Essigsäureanhydrid als Acetyl-Donor oder als das Acetylierungsagens ersetzen (Beaucage and Ogilvie, (1977) Tetrahedron Letters, 1691). Die nicht abreagierten Komponenten wurden entweder durch Ethanolausfällung (Sambrook et al., (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, CSH) oder mittels Microcon-50 Spin-Column-Reinigung (Amicon, USA) wie beschrieben entfernt. Die Reaktion ist schematisch gezeigt in 9.
Beispiel 16
Phasentransfer Katalyse-2'-O-Alkylierungsansätze
Zu dem Zweiphasensystem, das aus 1 μg (1,6 pmol) mRNA besteht, wurden 6 ng Tetrabutylammonium-Iodid in 5 μl Dichlormethan zugefügt, und 2,5 μl von 7,8 nmol NaOH wurden lebhaft für 30 Minuten vermischt, und dann wurden 4 nmol entweder von Dimethyl- oder Diethyl-Sulfat zugefügt, während die Reaktionstemperatur bei 45 °C beibehalten wurde. Die Reaktion wurde 3 Stunden lang bei 45 °C ablaufen gelassen, und dann wurde 1 μl NH₃ zugefügt, gerührt und 30 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubiert (Merz, (1973) Angew. Chem. Intl. Edit. 12:846). Die nicht abreagierten Komponenten wurden aus der Methylether-modifizierten RNA entweder durch Ethanolausfällung (Sambrook et al., (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, CSH) oder durch Microcon-50 Spin-Column-Reinigung (Amicon, USA) wie beschrieben entfernt. Alternativ könnten 6 ng eines anderen Phasentransferkatalysators, wie zum Beispiel Tetrabutylammonium-Bromid, Tetrabutylammonium-Hydrogensulfat oder Tetraethylammonium-Tetrafluorborat verwendet werden.
Beispiel 17
Dialkylsulfat Reaktionen
Zu 1 μg (1,6 pmol) mRNA wurden 20 μl Dimethylformamid zugegeben, und 4 nmol entweder von Dimethyl- oder Diethylsulfat wurden zugegeben, während die Reaktionstemperatur auf Raumtemperatur gehalten wurde. Die Reaktion wurde 3 Stunden lang bei Raumtemperatur ablaufen gelassen (Tazawa, et al., (1972) Biochemistry 11:4931). Die nicht abreagierten Komponenten wurden aus der Methylether-modifizierten RNA entweder durch Ethanolausfällung (Sambrook et al., (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, CSH) oder durch Microcon-50 Spin-Column-Reinigung (Amicon, USA) wie beschrieben entfernt.
Beispiel 18
Diazomethan und SnCl₂ zur 2'-Methyletherbildung
Zu 1 μg (1,7 pmol) mRNA in 10 μl Dimethylformamid wurden 7 nmol eines Diazomethans, 1 ng SnCl₂ in einem Gesamtvolumen von 50 μl 1,2-Dimethoxyethan zugefügt. Alle Reaktionskomponenten wurden über Eis gemischt und die Reaktion wurde 24 Stunden lang bei Raumtemperatur ablaufen gelassen (Robins, (1974) J. Org. Chem. 39:1891-1899; Ekborg, (1980) J. Carbohydrates Nucleosides Nucleotides 7:57-61; Robins, (1981) Can. J. Chem. 59:3360-3364). Die nicht abreagierten Komponenten wurden entweder durch Ethanolausfällung (Sambrook et al., (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, CSH) oder mittels Microcon-50 Spin-Column-Reinigung (Amicon, USA) wie beschrieben entfernt.
Beispiel 19
Verwendung von Methyliodid zur 2'-Methyletherbildung
Zu 1 μg (1,7 pmol) mRNA in 10 μl Dimethylformamid wurden 7 nmol eines Alkyliodids zum Beispiel Methyliodid, 1 ng Ag₂O in einem Gesamtvolumen von 50 μl Dimethylformamid zugegeben. Alle Reaktionskomponenten (Purdies Verfahren) wurden über Eis vermischt und die Reaktion wurde 24 Stunden lang bei Raumtemperatur im Dunkeln ablaufen gelassen. (Furukawa, Y. et al. (1965) Chem. Pharm. Bull. 13:1273; Furukawa, (1965) Chem. Pharm. Bull. 13:1273-1278; Inoue, (1987) Nucleic. Acid. Res. 15:6131-6148). Die nicht abreagierten Komponenten wurden entweder durch Ethanolausfällung (Sambrook et al., (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, CSH) oder mittels Microcon-50 Spin-Column-Reinigung (Amicon, USA) wie beschrieben entfernt.
Beispiel 20
Northern Blotting
Eine Probe von modifizierter mRNA wurde wie in Beispiel 6 hergestellt, 1 μg wurde auf ein 0,8 %-iges Agarosegel aufgegeben, gefolgt von Elektrophorese und Transfer zu einer Membran (Hybond, Amersham, UK) wie beschrieben (Sambrook et al., (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, CSH). Die Membran wurde dann bei einer Hybridisierung mit einer radioaktiv markierten Sonde unter Verwendung von Standardverfahren verwendet. Alternativ wurde nach Transfer und immobilisierung der modifizierten mRNA auf der Membran die Acetyl- oder jede andere Ammoniak empfindliche Gruppe an der 2' Position mit 28 %-igem Ammonium-Hydroxid wie folgt gespalten. Die Membran wurde mit 50 ml konzentriertem Ammoniak bedeckt und bei Raumtemperatur 5 Minuten lang inkubiert. In diesem Fall wird die Acetylgruppe an der 2'-Position (d. h. 2'-O-COR) durch die ursprüngliche 2'-OH-Gruppe ersetzt und besitzt daher normale Hybridisierungseigenschaften. Der Vorteil dieses Ansatzes ist, dass keine Denaturierungsmittel erforderlich sind weder in dem Gel-Beladungspuffer noch in dem Gel, weil die modifizierte RNA eine reduzierte Sekundärstruktur aufweist. Außerdem kann die modifizierte RNA gelagert, bearbeitet, auf dem Gel getrennt werden und kann zu einer Membran in einer Form, in der die Ribonuklease protektiert ist, geblottet werden. Die Bindungseigenschaften der modifizierten RNA zu der Membran sind wahrscheinlich wegen ihrer erhöhten Hydrophobie verbessert.
Beispiel 21
Acetylierung und Verwendung von Imidazol-Reaktionspartnern
Zu 0,1-1 μg RNA in 1 μl Wasser wurden 20 μl Triethylamin, das eine katalytische Menge (60 μg; 490 nmol) 4-Dimethylaminopyridin (DMAP) enthält, zugefügt und dann wurde 1 μl (10 μmol) von N-Acetylimidazol (Zum Nachschlagen: Newer Methods of Prep. Org. Chem. 5:61) zugegeben. Die Lösung wurde lebhaft unter Verwendung eines Rührers 5 Sekunden lang vermischt und die Reaktion wurde 60 Sekunden lang bei Raumtemperatur (22 °C) ablaufen gelassen. Die Reaktion wurde dann durch Zugabe von 3 Reaktionsvolumina Ethanol oder Methanol beendet, gefolgt von 5-sekündigem Mischen mit einem Rührer. Die modifizierte RNA wurde aus den Reaktionspartnern und dem Lösungsmittel unter Verwendung eines von mehreren Verfahrens entfernt. Das bevorzugte Verfahren war die Reinigung unter Verwendung einer Centricon-50 Spin-Column (Amicon, USA). Alternative Imidazol-Reaktionspartner wie zum Beispiel N-Benzoylimidazol können nach dem gleichen Protokoll verwendet werden.
Beispiel 22
Fluoreszierende Markierung der RNA
Derivate von Isatosäure- und N-Methylisatosäure-Anhydriden sind fluoreszierend (Hiratsuka (1982) J. Biol. Chem. 257:13351). Fluoreszierende RNA Derivate sind nützlich als Sonden für Hybridisierungsstudien, wie zum Beispiel Southern Blotting und weitere Anwendungen. Zu 0,1-1 μg RNA in 1 μl Wasser wurden 20 μl eines nicht basischen Lösungsmittels, wie zum Beispiel Dimethylformamid, THF oder Dimethyl-Sulphoxid zugefügt, das eine katalytische Menge (60 μg; 490 nmol) 4-Dimethylaminopyridin (DMAP) enthält, und dann wurden 10 μl (100 μmol) entweder Isatosäure-Anhydrid oder N-Methylisatosäure-Anhydrid zugegeben. Die Lösung wurde lebhaft unter Verwendung eines Rührers 5 Sekunden lang vermischt, und die Reaktion wurde 60 Minuten lang bei Raumtemperatur (22 °C) ablaufen gelassen. Die Reaktion wurde dann durch Zugabe von 3 Reaktionsvolumina Ethanol oder Methanol beendet, gefolgt von 5-sekündigem Mischen mit einem Rührer. Die fluoreszierende RNA wurde aus den Reaktionspartnern und dem Lösungsmittel unter Verwendung eines von mehreren Verfahren entfernt. Das bevorzugte Verfahren war die Reinigung unter Verwendung einer Centricon-50 Spin-Column (Amicon, USA). Die Anregungswellenlängen lagen bei 330 nm für die Isatosäure-Anhydrid-Derivate und bei 350 nm für die N-Methylisatosäure-Anhydrid-Derivate mit Emissionsspektren im Bereich von 410-445 nm, abhängig von der Polarität des Lösungsmittels.
Beispiel 23
Acetylierung unter Verwendung eines Tributylphosphin-Katalysators
Zu 0,1-1 μg RNA in 1 μl Wasser wurden 20 μl Triethylamin zugefügt, das eine katalytische Menge (60 μg; 490 nmol) Tributylphosphin enthält (Vedejs und Diver (1993) J. am. Chem. Soc. 115:3358), und dann wurde 1 μl (10 μmol) Essigsäureanhydrid zugegeben. Die Lösung wurde lebhaft unter Verwendung eines Rührers 5 Sekunden lang vermischt, und die Reaktion wurde 60 Sekunden lang bei Raumtemperatur (22 °C) laufen gelassen. Die Reaktion wurde dann durch Zugabe von 3 Reaktionsvolumina Ethanol oder Methanol beendet, gefolgt von 5-sekündigem Mischen mit einem Rührer. Modifizierte RNA wurde aus den Reaktionspartnern und dem Lösungsmittel unter Verwendung eines von mehreren Verfahren entfernt. Das bevorzugte Verfahren war die Reinigung unter Verwendung einer Centricon-50 Spin-Column (Amicon, USA).
Beispiel 24
Unkatalysierte Acetylierung
Zu 0,1-1 μg RNA in 1 μl Wasser wurden 20 μl Triethylamin zugefügt, das 1 μl (10 μmol) Essigsäureanhydrid enthält. Die Lösung wurde lebhaft unter Verwendung eines Rührers 5 Sekunden lang vermischt, und die Reaktion wurde 60 Sekunden lang bei Raumtemperatur (22 °C) laufen gelassen. Die Reaktion wurde dann durch Zugabe von 3 Reaktionsvolumina Ethanol oder Methanol beendet, gefolgt von 5-sekündigem Mischen mit einem Rührer. Modifizierte RNA wurde aus den Reaktionspartnern und dem Lösungsmittel unter Verwendung eines von mehreren Verfahrens entfernt. Das bevorzugte Verfahren war die Reinigung unter Verwendung einer Centricon-50 Spin-Column (Amicon, USA).
Beispiel 25
Übernachtreaktion unter Verwendung reduzierter Mengen an Essigsäureanhydrid
Zu 0,1-1 μg RNA in 1 μl Wasser wurden 20 μl Triethylamin zugefügt, das eine katalytische Menge (60 μg; 490 nmol) 4-Dimethylaminopyridin (DMAP) enthält, und dann wurden 0,1 μl (1 μmol) oder 0,01 μl (0,1 μmol) Essigsäureanhydrid zugegeben. Die Lösung wurde lebhaft unter Verwendung eines Rührers 5 Sekunden lang vermischt, und die Reaktion wurde über Nacht bei Raumtemperatur (22 °C) laufen gelassen. Die Reaktion wurde dann durch Zugabe von 3 Reaktionsvolumina Ethanol oder Methanol beendet, gefolgt von 5-sekündigem Mischen mit einem Rührer.
Beispiel 26
Mischungen von acetylierenden Reaktionspartnern
Zu 0,1-1 μg RNA in 1 μl Wasser wurden 20 μl Triethylamin zugefügt, das eine katalytische Menge (60 μg; 490 nmol) 4-Dimethylaminopyridin (DMAP) enthält, und dann wurde 1 μl einer Mischung aus 9 Teilen Essigsäureanhydrid (8,82 μmol) und einem Teil Acetylchlorid (1,4 μmol) zugegeben. Die Lösung wurde lebhaft unter Verwendung eines Rührers 5 Sekunden lang vermischt, und die Reaktion wurde über Nacht bei Raumtemperatur (22 °C) laufen gelassen Die Reaktion wurde dann durch Zugabe von 3 Reaktionsvolumina Ethanol oder Methanol beendet, gefolgt von 5-sekündigem Mischen mit einem Rührer.
Beispiel 27
Mischungen von modifizierenden Reaktionspartnern
Unter gewissen Umständen, wenn es wünschenswert ist, mit zwei oder mehreren modifizierenden Gruppen modifizierte RNA zu erhalten, können Mischungen aus modifizierenden Reaktionspartnern in der gleichen Reaktion verwendet werden. Der jeweilige Anteil und die Reaktivität jedes Reaktionspartners bestimmt die endgültige Anzahl von jeder modifizierenden Gruppe, die an jede RNA-Kette angelagert wird. Zu 0,1-1 μg RNA in 1 μl Wasser wurden 20 μl Triethylamin zugefügt, das eine katalytische Menge (60 μg; 490 nmol) 4-Dimentylaminopyridin (DMAP) enthält, und dann wurde 1 μl (5 μmol) einer Mischung aus einem Teil Essigsäureanhydrid und einem Teil (5 μmol) Propionsäure-Anhydrid zugegeben. Die Lösung wurde lebhaft unter Verwendung eines Rührers 5 Sekunden lang vermischt, und die Reaktion wurde über Nacht bei Raumtemperatur (22 °C) laufen gelassen. Die Reaktion wurde dann durch Zugabe von 3 Reaktionsvolumina Ethanol oder Methanol beendet, gefolgt von 5-sekündigem Mischen mit einem Rührer. Im Prinzip könnte jede Kombination von Reaktionspartnern vermischt werden, vorausgesetzt, dass es keine chemische Reaktion zwischen ihnen gibt, um einen großen Bereich vielfach modifizierter RNA zu ergeben. Weitere nützliche Kombinationen von Reaktionspartnern wären eine Mischung aus Essigsäureanhydrid und Isatosäure-Anhydrid. In diesem Fall würde erwartet, dass die resultierende modifizierte RNA eine erhöhte Resistenz gegenüber Ribonuklease hätte und fluoreszierend wäre.
Beispiel 28
Acetylchlorid Verdünnung
Es wurde entdeckt, dass das Hinzufügen von 1 μl unverdünntem Acetylchlorid direkt zu der Reaktion zu exzessiver Produktion eines weißen Niederschlags führt, der die Handhabung der Flüssigkeit schwierig macht. Aus diesem Grund wurde Acetylchlorid zuerst in einem geeigneten Lösungsmittel wie zum Beispiel Toluol verdünnt, bevor es mit der RNA vermischt wurde. Zu 0,1-1 μg RNA in 1 μl Wasser wurden 20 μl Triethylamin zugefügt, das eine katalytische Menge (60 μg; 490 nmol) 4-Dimethylaminopyridin (DMAP) enthält, und dann wurde 1 μl von entweder 10 %-igem (1,4 μmol) oder 25 %-igem (3,5 μmol) in Toluol verdünntem Acethylchlorid zugegeben. Die Lösung wurde lebhaft unter Verwendung eines Rührers 5 Sekunden lang vermischt, und die Reaktion wurde über Nacht bei Raumtemperatur (22 °C) laufen gelassen. Die Reaktion wurde dann durch Zugabe von 3 Reaktionsvolumina Ethanol oder Methanol beendet, gefolgt von 5-sekündigem Mischen mit einem Rührer.
Beispiel 29
Protektion mit 18-Krone-6-Ether
Es wurde berichtet, dass die Zugabe von 18-Krone-6 die Reaktion von Essigsäureanhydrid mit primären Aminen unterdrückt (Barrett et al., (1978) J. Chem. Soc. Chem. Commun. 471). Um die Wirksamkeit der 18-Krone-6 Zugabe zur RNA-Acetylierung zu testen, wurde er in unterschiedlichen Mengen zu einer Standard-Acetylierungsreaktion zugegeben. Zu 0,1-1 μg RNA in 1 μl Wasser wurden 20 μl Triethylamin zugegeben, das eine katalytische Menge (60 μg; 490 nmol) 4-Dimethylaminopyridin (DMAP) enthält, und es wurden entweder 6,6 μg, 660 ng, 66 ng, 6,6 ng, 660 pg oder 66 pg 18-Krone-6 zugegeben und 5 Minuten lang bei Raumtemperatur komplexieren gelassen, und dann wurde 1 μl (10 μmol) Essigsäureanhydrid zugegeben. Die Lösung wurde lebhaft unter Verwendung eines Rührers 5 Sekunden lang vermischt, und die Reaktion wurde 20 Sekunden lang bei Raumtemperatur (22 °C) ablaufen gelassen. Die Reaktion wurde dann durch Zugabe von 3 Reaktionsvolumina Ethanol oder Methanol beendet, gefolgt von 5-sekündigem Mischen mit einem Rührer.
Beispiel 30
Erhöhte RNA-Substratmenge
Um die obere Grenze für die Menge an RNA zu bestimmen, die zu einer Standard-Acetylierungsreaktion zugegeben werden kann, wurden unterschiedliche Mengen RNA zugefügt. Die höchste verwendete RNA Konzentration (24 μg) stellt die höchste RNA Konzentration dar, die in 1 μl Wasser aufzulösen möglich war, ohne dass die RNA aus der Lösung ausfiel. Zu entweder 0,5, 1, 2, 6, 12 oder 24 μg RNA in 1 μl Wasser wurden 20 μl Triethylamin zugefügt, das eine katalytische Menge (60 μg; 490 nmol) 4-Dimethylaminopyridin (DMAP) enthält, und dann wurde 1 μl (10 μmol) Essigsäureanhydrid zugegeben. Die Lösung wurde lebhaft unter Verwendung eines Rührers 5 Sekunden lang vermischt, und die Reaktion wurde 20 Sekunden lang bei Raumtemperatur (22 °C) ablaufen gelassen. Die Reaktion wurde dann durch Zugabe von 3 Reaktionsvolumina Ethanol oder Methanol beendet, gefolgt von 5-sekündigem Mischen mit einem Rührer. Es wurde entdeckt, dass sogar mit 24 μg RNA die Acetylierungsreaktion bis zu dem gleichen Grad abläuft wie die Reaktionen, die weniger RNA enthalten. Daher können 20 μg oder mehr RNA pro Reaktion unter diesen Bedingungen modifiziert werden.
Beispiel 31
Deprotektion mit Alkali
Die reversible Natur der Acetylierungsreaktion wurde unter Verwendung von Alkali untersucht, von dem bekannt ist, dass es zu einer Spaltung der Acetylgruppe und zum Austausch mit einer -OH-Gruppe führt. Zu 0,1-1 μg acetylierter RNA in 5 μl Wasser wurde 1 μl von entweder 1 M, 500 mM oder 250 mM von frisch gelöstem NaOH zugefügt, und die Deprotektion 15 Minuten lang bei Raumtemperatur vor der Neutralisierung mit einem gleichen Volumen und einer gleichen Konzentration an HCl ablaufen gelassen. Es wurde entdeckt, dass anschließend an die Acetylgruppenspaltung die 2'-OH-Gruppe durch das Alkali angegriffen wurde, was zu einer Spaltung der RNA-Phosphat-Hauptkette führt.
Beispiel 32
Deprotektion mit Ammonium-Hydroxid
Ammonium-Hydroxid ist ebenso ein effektiver Reaktionspartner für die Acetylgruppenspaltung. Zu 0,1-1 μg acetylierter RNA in 5 μl Wasser wurden 1 μl oder 5 μl Ammonium-Hydroxidlösung (26 %-ig) zugefügt, und Deprotektion 15 Minuten lang bei Raumtemperatur ablaufen gelassen. Die RNA kann unter Verwendung einer Centricon-50 Column gereinigt werden. Andere Acylgruppen, wie zum Beispiel solche, die durch die Reaktion mit Buttersäure- oder Propansäure-Anhydriden erzeugt wurden, werden ebenfalls durch diese Ammonium-Hydroxid Behandlung gespalten.
Beispiel 33
Stabilität der modifizierten RNA
Die Instabilität der RNA ist eine Folge der Reaktivität der Ribose 2'-OH-Gruppen, die zum Bruch des Strangs führen. Viele Bedingungen und Chemikalien führen zum Brechen des RNA-Strangs, wie zum Beispiel hoher pH und zweiwertige Metall-Ionen. Die Auswirkung der Modifikation der 2'-OH-Gruppe ist es, die Stabilität und die Unversehrtheit der RNA zu erhöhen, wodurch vollständige cDNA Kopien ermöglicht werden und exakte Messungen ihrer Größe und Menge gemacht werden können.
Es wird vorgezogen, 2'-OH Modifikationen auszuwählen, die die modifizierte RNA mit einer maximalen Stabilität versehen, die jedoch leicht unter milden Bedingungen entfernt werden können, ohne zur Spaltung der RNA-Kette zu führen. Obwohl Acetyl unter Verwendung von Ammoniak oder KCN zum Beispiel entfernt werden kann, kann eine gewisse nachfolgende Spaltung der RNA-Kette auftreten, und daher wird, wenn es von Bedeutung ist, die Modifikation nachfolgend zu entfernen, es bevorzugt, eine 2'-OH Modifikation auszuwählen, die unter milderen Bedingungen als Acetyl entfernt wird. In der Acyl-Reihe werden sowohl Methoxyacetat (20), Formyl (100) und Chloracetyl (760), Bromacetyl (7,6 × 10³), Dichloroacetyl (1,6 × 10⁴), Trichloroacetyl (10⁵) als auch Carbonate leichter gespalten als Acetyl (entsprechende Spaltungsraten verglichen mit Acetyl sind in Klammern angegeben, siehe; Greene and Wuts (1991) Protective Groups in Organic Synthesis, 2^nd Ed. Wiley Interscience). Die Wahl der spezifischen 2'-OH Modifikation hängt von dem Grad der Protektion ab, der erforderlich ist, während das Verfahren durchgeführt wird, und der Leichtigkeit, mit der die Modifikation entfernt werden kann. Zum Beispiel ist Chloracetat zu labil, um die RNA während der Gelelektrophorese zu protektieren, weil es durch den Elektrophoresepuffer gespalten wird.
Experimenteller Ansatz
Eine biophysikalische Schlüsseleigenschaft der RNA ist ihre Unversehrtheit und Vollständigkeit. Natürliche RNA-Ketten können zehntausende Basen lang sein und müssen in diesem Zustand erhalten werden, wenn sie brauchbar untersucht werden sollen. Um die Robustheit der modifizierten RNA unter Bedingungen zu messen, von denen man weiß, dass sie zu RNA-Kettenspaltung führen, wurde eine Sequenziergel-Untersuchung verwendet. Es wurde einfach ein radioaktives Nukleotid in die RNA während einer in vitro Transkriptionsreaktion eingebaut, dann die RNA modifiziert und Bedingungen ausgesetzt, die normalerweise zu ihrem Abbau führen. Das Ergebnis wurde nach Elekrophorese auf einem Sequenziergel analysiert, um seine Vollständigkeit einzuschätzen. Intakte (modifizierte) RNA ergab eine einzelne Bande, wohingegen abgebaute RNA als eine Verschmierung von kleineren Fragmenten erschien. In jedem Fall wurde die mit verschiedenen Reaktionspartnern modifizierte RNA nebeneinander mit natürlicher RNA verglichen. Ein zusätzlicher Vorteil dieser Gel-Untersuchung war die eindeutige Identifikation der modifizierten RNA-Proben-Laufspuren auf Grund ihrer reduzierten elektrophoretischen Mobilität (siehe nachstehende Figur).
10 zeigt die verbesserte Resistenz der modifizierten RNA. Ein Sequenziergel wurde mit abwechselnden Laufspuren normaler RNA (Laufspuren 1, 3, 5, 7) und acetylierter RNA (Laufspuren 2, 4, 6, 8) gestartet. Zwei RNA-Größen von 250 und 1525 Basen können pro Laufspur gesehen werden. Die Proben wurden in einem PCR-Puffer bei 94 °C (2,5 mM MgCl₂) 0 Minuten (Laufspur 1, 2), 2 Minuten (Laufspur 3, 4), 6 Minuten (Laufspur 5, 6) und 13 Minuten lang (Laufspur 7, 8) erhitzt. Obwohl weniger modifizierte RNA als normale RNA aufgegeben wurden (vergleiche Laufspuren 1 und 2), war acetylierte RNA immer noch nach 13 Minuten bei 94 °C detektierbar, während normale RNA nach nur 6 Minuten nicht mehr detektierbar war. Man beachte die Verschmierung in Laufspur 3 als ein Ergebnis des RNA Abbaus.
Enzymatischer Abbau der RNA-Proben
Eine Auswahl von allgemein verwendeten Nukleasen wurde mit markierten RNA-Proben inkubiert, und der Abbaueffekt durch Sequenziergel-Abbau sichtbar gemacht. Die verwendeten Enzyme und Bedingungen waren; S1 Nuklease (Part. No. E576A, Promega, USA), baut einzelsträngige DNA und RNA ab. 100 ng von jedem Typ RNA wurden mit 10 μl von 1 × S1 Nuklease-Puffer vermischt, der 15, 1,5 oder 0,15 Einheiten S1 enthält, und 15 Minuten lang bei 37 °C inkubiert. Mungbohnen Nuklease (Part. No. M194A, Promega, USA), eine Endonuklease, baut einzelsträngige DNA und RNA ab. 100 ng jeden Typs RNA wurden mit 10 μl von 1 × Mungbohnen Nuklease-Puffer vermischt, der 50, 5 oder 0,5 Einheiten Nuklease enthält, und 15 Minuten lang bei 37 °C inkubiert. 10-100 pg RNase A (Cat. No. 109 142, Boehringer Mannheim), eine Mehrzweck-RNase, wurde mit 100 ng von jeder RNA in 1 × Puffer (40 mM Tris-HCL (pH 7,5), 6 mM MgCl₂, 2 mM Spermidin und 10 mM NaCl) vermischt und 15 Minuten lang bei 37 °C inkubiert. 1/1000 Einheit RNase One^TM (Part. No. M4261, Promega, USA) wurde mit 100 ng von jeder RNA in 1 × RNase One-Puffer vermischt und 15 Minuten lang bei 37 °C inkubiert.
Chemischer Abbau der RNA-Proben
Bedingungen, von denen bekannt ist, dass sie RNA-Abbau begünstigen, schließen hohen pH-Wert und Metall-Ionen ein. In jedem Fall wurden 100 ng von jeder markierten RNA-Probe (modifiziert und normal) unter den folgenden Bedingungen vermischt. Ein gleiches Volumen Formamid und RNA-Probe wurde vermischt und 1 Minute bis 30 Minuten lang bei 99 °C inkubiert. Eine 9 mM MnCl₂-Lösung wurde mit jeder RNA vermischt, um die endgültige Mn²⁺ Konzentration auf 1,5 mM einzustellen. Die Mischung wurde dann 5 Minuten lang bei 100 °C erhitzt. Eine 25 mM MgCl₂-Lösung wurde mit jeder RNA vermischt, um die endgültige Mg²⁺ Konzentration auf 1,5 mM einzustellen. Die Mischung wurde dann 5 Minuten lang bei 100 °C erhitzt. 100 ng von jeder RNA wurde mit 100 mM, 250 mM, 500 mM und 1 M NaOH-Lösung vermischt und 5 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubiert. 100 ng RNA wurden mit 10 μl PCR-Puffer (15 mM Tris-HCL pH 8,8, 60 mM KCl, 2,5 mM MgCl₂) vermischt und 5 Minuten lang bei 94 °C erhitzt, gefolgt von 15 Minuten bei Raumtemperatur. Serum-Untersuchungen wurden durchgeführt, indem die roten Blutkörperchen-Komponenten aus 200 μl menschlichem Blut entfernt wurden und 100 ng RNA mit 10 μl Serum 15 Minuten lang bei 37 °C inkubiert wurden.
Schlussfolgerung
Die Modifikation der Ribose 2'-OH-Gruppe bietet eine hervorragende Resistenz gegenüber Bedingungen, die ansonsten zu schnellem Abbau der RNA führen würden. Kohlenstoffkettenlängen, die an die 2'-OH-Gruppe der Test-RNA angelagert wurden, betrugen von 2 Kohlenstoffen (Acetyl) bis 8 Kohlenstoffen (Oktanoat) und Trimethyl-Acetyl und die Benzoylgruppe. Die Kettenlänge mit 8 Kohlenstoffen war nicht bevorzugt, weil das Ausmaß der RNA-Modifikation unter 100 % lag. Kohlenstoffkettenlängen von 3-5 waren bevorzugt, weil sie die RNA effizient modifizierten und gute Protektion vor sowohl enzymatischem als auch chemischem Angriff boten. Die Protektion vor Abbau in 1 × PCR-Puffer ist wichtig, weil DNA- oder RNA-Polymerisation fast immer das Erhitzen von Proben in Mg oder Mn enthaltenden Puffer einbezieht; Bedingungen, die rasch zum Abbau der RNA-Matrize führen und als ein Ergebnis zu schwacher Empfindlichkeit.
Beispiel 34
PCR und reverse Transkription
EXPERIMENTELL
Herstellung der Matrize
Synthetische RNA-(in vitro)-Transkripte und gereinigte virale RNA (BMV) wurden als Matrizen verwendet. RNA-Matrizen, die aus einer in vitro Transkriptionsreaktion unter Verwendung von T7 RNA Polymerase und pGEM Express Positive Control Template (Part. No. P256A, Promega, USA) abstammen, wurden gemäß der Herstelleranweisungen hergestellt. Zwei RNA Transkripte wurden mit einer Länge von 1065 und 2346 Basen erzeugt (siehe 11). Matrizen DNA wurde durch die Zugabe von einer Einheit von RNase freier DNase RQ1 und durch 15-minütige Inkubation bei 37 °C entfernt, gefolgt von Extraktion mit Phenol : Chloroform, dann Chloroform : Isoamyl-Alkohol (24:1) und einer endgültigen Reinigung unter Verwendung von Centricon-50 Column-Filtration (Amicon, USA). Endvolumina lagen typischerweise bei 10 μl und die RNA-Konzentrationen waren auf 1 μg/μl eingestellt. Dieses Verfahren stellt sehr reine RNA-Präparate zur Verfügung, die für chemische Modifikation und die nachfolgende Verwendung als DNA-Polymerase-Matrizen geeignet sind.
Die Verwendung von DNA-Primern speziell für die RNA-Modifikation, die hergestellt wurde, resultiert in neu synthetisierten DNA-Strängen vorbestimmter Größen, wodurch die Analyse unterstützt wird. Die 1065 und 2346 Basen-RNA-Transkripte, die wie oben beschrieben hergestellt wurden, enthalten Annealing-Sites für die Primer SP6 und T3. SP6 und T3 könnten zusammen für PCR oder SP6 alleine für reverse Transkriptionsstudien verwendet werden.
Reverse Transkription
100 ng (modifizierte oder normale) RNA wurden 10 Minuten lang bei 75 °C in 10 μl Wasser erhitzt, das 50 ng SP6 Primer oder Oligo (dT) enthält, und dann über Eis stehen gelassen. Alternativ war kein Pre-Annealing-Schritt für die BMV RNA reverse Transkription erforderlich. Die Modifikation der RNA könnte mit einer Auswahl von modifizierenden Reaktionspartnern wie zum Beispiel Essigsäure-Ameisensäure-, Essigsäure- oder Benzoesäure-Anhydriden gemacht werden. Die reverse Transkriptionsreaktion enthielt entweder 2 μl von 25 mM MgCl₂ oder 13 mM MnCl₂, 2 μl 100 mM DTT, 1 μl 10 mM dNTPs, 1 μl 32P dCTP und 1 μl (10 Einheiten) Superscript II (Gibco-BRL, USA), (10 Einheiten) HIV reverse Transkriptase (Seikagaku, Japan), 10 Einheiten von MULV Point Mutant (Promega, USA) oder (10 Einheiten) AMV reverse Transkriptase (Invitrogen, Niederlande). Die Reaktion wurde bei einer Temperatur von 37 °C bis 55 °C 30 Minuten lang inkubiert und durch die Zugabe von 1 μl von 0,5 M EDTA gestoppt. TCA-Ausfällung wurde durchgeführt, indem 5 μl der Reaktion auf Glasfilter getupft wurden und dreimal mit 100 ml 10 %igem TCA gewaschen und gezählt wurden. Für die Gelanalyse der 32P markierten cDNA wurde die Reaktion mit einem Volumen von 95 %igem Formamid beladenem Farbstoff, der Bromphenolblau enthielt, vermischt und auf ein 7M Harnstoff, 4%-iges Acrylamidgel gegeben, das 1 × TBE enthält, und bei 80 W 1 Stunde lang laufen gelassen. Das Gel wurde dann 5 Minuten lang in 10 %-iger Essigsäure fixiert und getrocknet. Die Banden wurden unter Verwendung eines Molecular Dynamics Phoshorimager quantifiziert.
Ergebnisse der reversen Transkription
Sowohl Superscript II als auch HIV reverse Transkriptase können modifizierte RNA in einen komplementären DNA-Strang kopieren. Jedoch wurde eine starke Verringerung der Produktmenge (50-100-fach weniger als normale RNA) mit Superscript II Reaktionen beobachtet, wenn acetylierte RNA unter Verwendung von Oligo (dT) revers transkribiert wurde. Diese Verringerung erfolgte wahrscheinlich auf Grund der thermischen Instabilität des Oligo (dT) : modifizierten Poly(A)-RNA-Hybrids, da die modifizierte RNA eine reduzierte Schmelztemperatur zu haben scheint. Effektives Priming wurde erreicht, indem Primer wie zum Beispiel SP6 verwendet wurden, die G und C Basen enthalten, die die Stabilität erhöhen. Hervorragende Ergebnisse wurden mit formylierten und Methoxyethoxymethyl-Chlorid modifizierten BMV RNA erzielt.
Vorteile der modifizierten RNA Matrizen
In getrennten Experimenten wurde gezeigt, dass modifizierte RNA eine stark erhöhte Resistenz gegenüber Bedingungen aufweist, die rasch RNA abbauen. Bedingungen, die für die effektive Verwendung von Tth und Taq Enzymen notwendig sind (hohe Temperatur und hohe Kationenkonzentration), sind für den Abbau der Matrizen-RNA ebenso optimal. Es wäre daher vorteilhaft, in der Lage zu sein, Bedingungen zu verwenden, die für die Enzymaktivität optimal wären, jedoch nicht zum Abbau der Matrize führten. Indem die 2'-OH-Gruppen modifiziert werden, behält die modifizierte RNA sowohl ihre Matrizenaktivität als auch ihre Vollständigkeit unter Bedingungen bei, unter denen ein erheblicher Teil der normalen RNA abgebaut wird.
Die verringerte Schmelztemperatur der modifizierten Matrizen-RNA sollte auch das Ausmaß an Sekundärstruktur reduzieren. RNA-Sekundärstruktur führt zur Blockierung der DNA-Polymerase, und als ein Ergebnis davon zu Kettenabbruch und unvollständigen DNA-Kopien. Die Sekundärstruktur der mRNA ist das Haupthindernis für die Produktion von cDNA-Klonen in ganzer Länge und deren Archiven. Unglücklicherweise führen die Verfahren des Stands der Technik, die entwickelt wurden dazu, das Ausmaß an Sekundärstruktur zu reduzieren, ebenso zu RNA-Abbau. Da die modifizierte RNA weniger Sekundärstruktur aufweist, sollte die Enzymhemmung reduziert sein und daher der Anteil an cDNA-Klonen mit ganzer Länge erhöht sein. Zusätzlich wird die Matrizen-modifizierte RNA nicht abgebaut und daher ist die Qualität der Matrize ebenso verbessert.
RT-PCR Amplifikation von modifizierten RNA-Matrizen
Das folgende Zwei-Enzyme-Verfahren wurde verwendet, um modifizierte RNA-Matrizen zu amplifizieren. Zu 0,1-1 μg RNA-Matrize, die SP6 und T3 Sites enthält, wurden in 1 μl Wasser 20 μl Triethylamin zugefügt, das eine katalytische Menge (60 μg; 490 nmol) 4-Dimethylaminopyridin (DMAP) enthält, und dann wurde 1 μl (10 μmol) Essigsäureanhydrid oder Essigsäure-Ameisensäure-Anhydrid zugegeben. Die Lösung wurde lebhaft unter Verwendung eines Rührers 5 Sekunden lang vermischt, und die Reaktion 60 Sekunden lang bei Raumtemperatur (22 °C) ablaufen gelassen. Die Reaktion wurde dann durch Zugabe von 3 Reaktionsvolumina Ethanol oder Methanol beendet, gefolgt von 5-sekündigem Mischen mit einem Rührer. Die modifizierte RNA wurde aus den Reaktionspartnern und dem Lösungsmittel unter Verwendung eines von mehreren Verfahren entfernt. Das bevorzugte Verfahren war, die Mischung auf ein Endvolumen von 400 μl Wasser zu verdünnen, was dann zu einer Centricon-50 Spin-Column (Amicon, USA) zugeführt wurde und 15 Minuten lang bei 3000g zentrifugiert wurde oder bis der Filter trocken war. Der Filter wurde dann durch Zugabe von 400 μl Wasser gewaschen und wieder 15 Minuten lang bei 3000g zentrifugiert. Die modifizierte RNA wurde wieder gewonnen, indem die Schale, die den Filter hält, in ein frisches Zentrifugengefäß ausgeleert wurde, und 60 Sekunden lang bei 3000g zentrifugiert wurde.
Teile der modifizierten RNA (100 pg bis 10 ng) wurden als Matrizen für die reverse Transkription mit Superscript II Enzym verwendet. 100 ng (modifizierter oder normaler) RNA wurden 10 Minuten lang bei 75 °C in 10 μl Wasser erhitzt, das 50 ng SP6 Primer enthält, und dann über Eis stehen gelassen. Dazu wurden 2 μl von 25 mM MgCl₂, oder 13 mM MnCl₂, 2 μl 100 mM DTT, 1 μl 10 mM dNTPs, 1 μl 32P dCTP und 1 μl (10 Einheiten) Superscript II (Gibco-BRL, USA) (10 Einheiten) zugegeben. Die Reaktion wurde innerhalb des Temperaturbereichs von 37 °C bis 55 °C 30 Minuten lang inkubiert. Die Matrize wurde entfernt, indem die Proben mit RNase A (1 μg) 15 Minuten lang bei 37 °C inkubiert wurden. 8 μl Anteile der reversen Transkriptionsreaktion wurden zu der folgenden PCR Mischung hinzugefügt. Die PCR wurde in einem Endvolumen von 100 μl mit einer endgültigen Konzentration von 15 mM Tris-HCL pH 8,8, 60 mM KCl, 2,5 mM MgCl₂, 400 μM jedes dNTPs, 10 pmol von jedem Primer SP6 und T3 und eine Einheit Taq DNA Polymerase (Amersham, UK) durchgeführt. Die Zyklusparameter waren 94 °C × 20 sek., 55 °C × 20 sek. und 72 °C × 30 sek. für 30 Zyklen. Die PCR-Produkte wurden im Anschluss an Agarosegel-Elektrophorese und Anfärben mit EtBr sichtbar gemacht.
Reverse Transkription mit Tth DNA Polymerase
Reverse Transkription mit Tth DNA Polymerase bietet den Vorteil einer erhöhten Reaktionstemperatur, die das Ausmaß an RNA-Sekundärstruktur reduzieren kann. Das folgende Zwei-Enzyme-Verfahren wurde verwendet, um die modifizierten RNA-Matrizen zu amplifizieren. Zu 0,1-1 μg RNA-Matrize, die SP6 und T3 Sites enthält, wurden in 1 μl Wasser 20 μl Triethylamin zugeführt, das eine katalytische Menge (60 μg; 490 nmol) 4-Dimetylaminopyridin (DMAP) enthält, und dann wurde 1 μl (10 μmol) Essigsäureanhydrid zugegeben. Die Lösung wurde lebhaft unter Verwendung eines Rührers 5 Sekunden lang vermischt, und die Reaktion 60 Sekunden lang bei Raumtemperatur (22 °C) ablaufen gelassen. Die Reaktion wurde dann durch Zugabe von 3 Reaktionsvolumina Ethanol oder Methanol beendet, gefolgt von 5-sekündigem Mischen mit einem Rührer. Die modifizierte RNA wurde aus den Reaktionspartnern und dem Lösungsmittel unter Verwendung eines von mehreren Verfahren entfernt. Das bevorzugte Verfahren war, die Mischung zu einem Endvolumen von 400 μl Wasser zu verdünnen, was dann einer Centricon-50 Spin-Column (Amicon, USA) zugeführt wurde, und 15 Minuten lang bei 3000g zentrifugiert wurde, oder bis der Filter trocken war. Der Filter wurde dann durch Zugabe von 400 μl Wasser gewaschen und wieder 15 Minuten lang bei 30008 geschleudert. Die modifizierte RNA wurde wieder gewonnen, indem die Schale, die den Filter enthält, in ein frisches Zentrifugengefäß ausgeleert wurde, und es 60 Sekunden lang bei 30008 zentrifugiert wurde.
Das folgende Protokoll ist im Wesentlichen identisch mit dem, das von Boehringer Mannheim GmbH zur Verfügung gestellt wurde. Zu 2 μl von 1 × Puffer (10 mM Tris-HCl pH 8,9, 90 mM KCl) wurden 2 μl von 9 mM MnCl₂, 0,4 μl von 200 μM, 750 nM SP6 Primer, 50-200 ng modifizierter Matrizen-RNA und 1 μl (4 Einheiten) von Tth DNA Polymerase und Wasser bis zu einem Endvolumen von 20 μl zugegeben. Die Reaktion wurde 30 Minuten lang bei 70 °C inkubiert. Die DNA-Produkte könnten dann in einer Standard-PCR-Reaktion verwendet werden oder durch Zugabe von Spurenmengen (1 μl) von radioaktivem ³²p dATP zu der Reaktion und durch Trennung der Produkte durch Gelelektrophorese sichtbar gemacht werden.
Beispiel 35
Hybridisierung
Experimenteller Ansatz
Die modifizierte RNA wurde entweder auf einem festen Träger, wie zum Beispiel einer Filtermembran (Zielsubstrat), immobilisiert oder mit Radioaktivität markiert (Sonde), und mit dem Zielsubstrat hybridisieren gelassen. Vergleiche wurden zwischen modifizierter und normaler RNA als Zielmolekül und Sonden angestellt.
Dot Blotting
RNA-Proben wurden wie folgt markiert. 100 ng von entweder modifizierter (acetylierter) oder normaler RNA wurden zu 13 μl Wasser, 2 μl 10 × Kinase-Puffer und 1 μl von alkalischer Shrimp-Phosphatase (Boehringer Mannheim) hinzugefügt. Die Reaktion wurde 10 Minuten bei 37 °C inkubiert, und dann wurde das Enzym durch Behandlung 10 Minuten lang bei 65 °C zerstört. Das 5' Ende der RNA wurde dann durch Zugabe von 2,5 μl ³²p γ-ATP und 1 μl T4 Polynukleotid-Kinase (Boehringer Mannheim) markiert und 90 Minuten bei 37 °C inkubiert. Nicht aufgenommener Marker wurde unter Verwendung einer Centricon-50 Column gemäß der Herstelleranleitungen entfernt.
cDNA-Zielmolekül wurde unter Verwendung von 1000 ng von 7,5 kb Poly(A)-schwänziger RNA (Cat. No. 15621-014, Gibco-BRL, USA) unter Verwendung eines Superscript II cDNA Kits (Life Technologies, USA), unter Verwendung von Oligo (dT) als ein reverser Transkriptase-Primer gemäß den Herstellungsanleitungen hergestellt. Die Reaktion wurde beendet, indem bei 70 °C 10 Minuten lang inkubiert wurde. RNA wurde durch Behandlung mit RNase H entfernt (200 ng RNase H wurden der Reaktion zugefügt und 15 Minuten lang bei 37 °C inkubiert) und 50 ng der verbleibenden cDNA wurde auf ein 5 mm Quadrat von Hybond N+ platziert und, bevor u/v Quervernetzung stattfindet, 3 Minuten lang trocknen gelassen und bei 65 °C 10 Minuten lang ausgeheizt. Zwei solche Quadrate wurden mit entweder einer modifizierten oder einer normalen 7,5 kb RNA ³²p markierten Sonde bei 65 °C über Nacht in einem Church-Puffer (0,5 M NaPi pH 7,2, 7 %iges SDS und 1 mM EDTA) hybridisiert. Die Quadrate wurden dann bei Raumtemperatur in 1 × Church-Puffer gewaschen und die Ergebnisse durch Szintillationszählung quantifiziert.
12 zeigt einen Vergleich der Hybridisierungseigenschaften von modifizierter RNA und RNA, wobei Panel A eine modifizierte 7,5 kb RNA-Sonde ist und Panel B eine normale 7,5 kb RNA-Sonde ist. Jede Sonde wurde zu einem immobilisierten cDNA Zielmolekül hybridisiert.
Vergleich unterschiedlicher Hybridisierungsmembranen
Um eine optimale Hybridisierungsmembran zur Verwendung auszuwählen, wurde eine Portion einer radiomarkierten modifizierten (acetylierten) RNA auf 5-mm-Quadrate von sechs unterschiedlichen Membranen (Protran NC, Hybond N+ (Amersham, UK), Immobilon for DNA sequencing, Porablot NCL, Porablot PVDF, Immobilon P) getupft und bei Raumtemperatur getrocknet. Jedes Quadrat wurde dann zweimal 5 Minuten lang bei 65 °C in Church-Puffer gewaschen und die Menge der verbleibenden Radioaktivität auf den Quadraten unter Verwendung eines Szintillationszählers gemessen. Tabelle 1 Bindungseigenschaften unterschiedlicher Hybridisierungsmembranen
Aus diesen Ergebnissen wurde es offensichtlich, dass Hybond N+ die beste Membran war, um acetylierte RNA zu binden. Hybond N+ war jedoch weniger geeignet als Nitrozellulose für die Hybridisierung. Hybridisierungssignale waren näherungsweise zweimal stärker, wenn die modifizierte RNA an Nitrozellulose gebunden war statt an Hybond N+. Nylonmembranen sind jedoch im Wesentlichen resistenter gegenüber Ammoniumhydroxidbehandlung anstatt Nitrozellulose.
Ein weiterer Vergleich wurde zwischen modifizierter (acetylierter) RNA gemacht, in einem denaturierten oder nativen (gefalteten) Zustand die auf Membranen getupft wurde. Die Denaturierung wurde durchgeführt durch Erhitzen auf 68 °C 5 Minuten lang in einer 50%-igen Formamid/2,2-M-Formaldehydlösung, ehe sie auf Hybond-N+-Membranen getüpfelt und bevor sie mit markierter cDNA-Sonde hybridisiert wurde. Bezüglich der Hybridisierungssignale wurden keine bedeutenden Unterschiede detektiert zwischen denaturierter und nativer gefalteter modifizierter RNA.
Northern-Blotting-Verfahren
Northern Blotting wurde gemäß Goda und Minton (1995) Nucleic Acid Res. 16:3357-3358 durchgeführt. Kurz, die Gele wurden präpariert, indem 0,5 ml von 1 M Guanidinthiozyanat und 2 μl von EtBr (10 mg/ml) in 100 ml geschmolzener 1,2 %-iger Agarose, die 1 × TBE-Puffer enthält, hinzugegeben wurden. Modifizierte (acetylierte) oder normale RNA (0,24-9,5 kB RNA-Ladder (Cat. No. 15620-016, Life Technologies, USA); CAT mRNA, Luziferase (Promega, USA) oder menschliche Leber mRNA (Clontech, USA) wurden denaturiert, indem 10 μl Probe (25 ng-1 μg) mit 10 μl Formaldehyd und 5 μl Formamid gemischt wurden, erhitzt wurden auf 90 °C 5 Minuten lang, und dann 10 × Beladungsfarbe (50 %-iges Glycerol, 1 mM EDTA, pH 8,0, 0,4 % Bromophenol blau) hinzugefügt wurden. Auf die zweistündige Elektrophorese bei 100 V wurde das Gel fotografiert, (siehe Panel A) und danach wurde die RNA auf eine Hybond-N+-(Amersham, UK) Membran gemäß den Herstelleranleitungen übertragen. Die Membran wurde über Nacht bei 65 °C in 'Church-Puffer' mit einer radioaktiven Sonde hybridisiert.
Deprotektion mit Ammoniak
Unter den eingesetzten Bedingungen hybridisierte die modifizierte RNA nur sehr schwach mit der Sonde. Die Ergebnisse sind in 13 gezeigt. Im Gegensatz hierzu ergab die normale RNA ein sehr starkes Signal (Panel B). Durch Entfernen (Deprotektion) der Acetylgruppen aus der modifizierten RNA unter Verwendung einer Ammoniakbehandlung, wurde die Hybridisierung wiederhergestellt (Panel C). Die Erfolglosigkeit bezüglich der Hybridisierung könnte auf Grund der Reduktion der modifizierten RNA oder Zwischenreaktionen zwischen der geladenen Carbonylgruppe (C=O), welche ein Teil jeder Acetylgruppe ist (-CO-CH₃), erfolgt sein. Die negative Ladung des Sauerstoffs könnte ausreichend sein, um eine Interaktion mit den positiven Ladungen zu gestatten, welche die Hybond-N+-Membran bedecken, und im Ergebnis bewirken, dass die modifizierte RNA eine Konformation annimmt, die mit der Hybridisierung nicht kompatibel ist. 50 ml von Ammoniumhydroxid (26 %-ig) wurden zu der Northern-Membran gefügt und 5 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubiert. Die Membran wurde mit Wasser gespült und dann 10 Minuten lang in Church-Puffer getaucht. Die Hybridisierung wurde durchgeführt, wie beschrieben.
Es wird offensichtlich sein, dass andere 2'-Substituenten als Acetyl längere oder kürzere Inkubationszeiträume mit Ammoniumhydroxid erfordern können, Phenoxyacetyl ist beispielsweise 50 mal labiler als Acetyl. Es gibt darüber hinaus andere Verfahren, um die modifizierende Gruppe zu entfernen, wie beispielsweise KCN-Spaltung.
13 zeigt einen Vergleich des Verhaltens von modifizierter und unmodifizierter RNA auf Agarosegel und Northern Blotting. Panel A zeigt ein mit EtBr gefärbtes Agarosegel (Reihe 1) 0,24-9,5 kb RNA-Ladder (Cat. No. 15620-016, Life Technologies, USA), (Reihe 2) 0,24-9,5 kb RNA-Ladder, modifiziert durch Acetylierung vor der Elektrophorese. Es sind die Unterschiede bezüglich der Mobilität und der gesteigerte Abbau normaler RNA zu bemerken. Panel B zeigt, dass acetylierte RNA nicht bemerkenswert mit einer radioaktiven cDNA-Probe hybridisiert, wenn sie an eine Nylonmembran unter Standardbedingungen gebunden ist. Panel C zeigt, dass die Hybridisierung auf die Entfernung der Acetylgruppen aus der modifizierten RNA mittels Ammoniakbehandlung folgend stark ist.
Änderungen bezüglich der elektrophoretischen Mobilität modifizierter RNA
14 zeigt die Beziehung zwischen elektrophoretischer Mobilität (mm) und dem Molekulargewicht (Basen) modifizierter (acetylierter) und normaler RNA in einem Agarosegel (siehe Panel A in 13). Die obere Linie gibt nicht-modifizierte RNA wieder und die untere Linie gibt modifizierte RNA wieder. Modifizierte RNA wandert mit näherungsweise 75 % der Geschwindigkeit einer normalen RNA, wodurch ihr erhöhtes Molekulargewicht auf Grund der Acetylgruppe und möglicherweiser eine Änderung der Sekundärstruktur widergespiegelt wird. Es wurde gefunden, dass die individuellen Markierungen an einem RNA-Marker (0,24-9,4 kb RNA-Ladder, Life Technologies, USA), modifiziert mit Essigsäure, Propionsäure, Buttersäure oder Valeriansäureanhydrid, alle sehr ähnliche Mobilitäten gegenüber einander hatten, trotz der Unterschiede bezüglich der Molekulargewichte der modifizierenden Gruppe. Die RNA, die unter Verwendung von Benzoesäureanhydrid modifiziert wurde, hatte eine Mobilität gleich der von nicht-modifizierter RNA. Dies kann die Änderungen bezüglich der Struktur der modifizierten RNA wiedergeben und, wie leicht sie den Siebvorgang durch das Agarosegel passieren kann. Eine verringerte Mobilität modifizierter RNA in dem Agarosegel kann durch Änderungen der Konformation des Polynukleotids verursacht werden. Um Änderungen bezüglich des Molekulargewichts der RNA auf Grund der Modifikation exakt zu messen, ist es notwendig, denaturierende Sequenziergele, wie beispielsweise 6 M Harnstoff-6%-iges Acrylamid mit radiomarkierter RNA im Bereich von 250-500 Nukleotiden, zu verwenden.
Abschließende Feststellung
RNA, die durch Acetylierung modifiziert wurde, hat geänderte Hybridisierungseigenschaften, welche möglicherweise ein niedrigeres Tm des Hybrids widerspiegeln. Standardbedingungen der Hybridisierung für Northern Blotting sind möglicherweise zu streng, und es sollte eine niedrigere Temperatur gewählt werden. Entfernung der modifizierenden Gruppen rekonstituiert die Hybridisierungseigenschaften der RNA.
Folgende sind die bedeutenden Vorteile der Verwendung von modifizierter RNA für Northern Blotting. 1) Modifizierte RNA bindet mit größerer Wirksamkeit an die Hybridisierungsmembran als normale RNA; 6 Mal mehr modifizierte RNA als normale RNA wird nach Waschen in einer starken Waschlösung bei 65 °C auf der Membran zurückgehalten. 2) Modifizierte RNA wird während der Elektrophorese nicht abgebaut, und als ein Ergebnis hiervon repräsentiert sie das Startmaterial zuverlässig. 3) Es können einfachere Northern-Blotting-Materialien verwendet werden, weil die modifizierte RNA eine verringerte Schmelztemperatur aufweist. Ohne Sekundärstrukturbildung kann die RNA der Elektrophorese unter milden Bedingungen unterzogen werden, ohne die Verwendung toxischer Denaturierungsmittel, wie beispielsweise Formaldehyd. Trotz ihrer Toxizität sind Formaldehyd-Northern-Blots gegenwärtig das Standardverfahren. Von Formaldehyd ist bekannt, dass es die Adeninbase kovalent modifiziert und hierdurch Wasserstoffbindungen unterdrückt und als Folge davon die RNA-Sekundärstruktur. Es würde also erwartet werden, dass die Formaldehyd-Modifikation die Wirksamkeit der Hybridisierung zwischen Sonde und Zielmolekül verringert. Im Gegensatz hierzu stellt acetylierte RNA ein Mittel dar, um die Sekundärstruktur zu verringern und, auf die Deprotektion folgend, hocheffiziente Hybridisierungseigenschaften zu gestatten. Mit Formyl modifizierter RNA ist es nicht notwendig, vor der Hybridisierung zu deprotektieren, obwohl einiger Formylverlust spontan in der Hybridisierungsmischung erfolgen kann. Die modifizierte RNA ermöglicht eine wesentlich deutlichere Trennung der Banden und, anders als bei normaler RNA, keinen Abbau.
Beispiel 36
Acylierung in wässriger Tetrahydrofuran-Lösung
Zu 0,1-1 μg an RNA in 1 μl Wasser werden 20 μl Tetrahydrofuran zugegeben, die eine katalytische Menge (60 μg; 490 nmol) an DMAP enthalten, und dann werden 10 μmol Essigsäureanhydrid oder ein anderes Acylierungsmittel zugegeben. Die Lösung wurde 5 Sekunden lang unter Verwendung einer Verwendung eines Rührers lebhaft gemischt, und die Reaktion wurde 20-60 Minuten lang bei Raumtemperatur ablaufen gelassen, bevor sie durch das Hinzufügen von drei Volumina an Ethanol und durch Mischen beendet wurde. Die modifizierte RNA könnte aus den Essigsäure-Ameisensäure- Propanonsäure-, Buttersäure-, Pentansäure-, Hexansäure-, Heptansäure-, Oktansäure- oder Benzoesäureanhydriden ausgereinigt werden.
Beispiel 37
Acetylierung in wässriger Dimethylformamid-Lösung unter Verwendung von 4-Pyrrolidinopyridin
Zu 0,1-1 μg an RNA in 1 μl Wasser wurden 20 μl von Dimethylformamid hinzugegeben, welches eine katalytische Menge an 4-Pyrrolidinopyridin enthielt, sodann wurden 0,1-10 μmol Essigsäureanhydrid oder ein Acylierungsagens zugefügt. Die bevorzugte Reaktion umfasste 1 μg RNA, 20 μl Dimethylformamid, 60 μg an 4-Pyrrolidinopyridin und 0,1 μmol an Essigsäureanhydrid. Die Lösung wurde 5 Sekunden lang unter Verwendung eines Rührers lebhaft gemischt und die Reaktion wurde 20-60 Minuten lang bei Raumtemperatur ablaufen gelassen, bevor sie durch die Zugabe von drei Volumina an Ethanol und durch Mischen beendet wurde. Die modifizierte RNA könnte aus den Reaktionspartnern gereinigt werden unter Verwendung von Centricon-50-Spin-Column oder Ethanolausfällung. Andere Acylierungsmittel umfassen Benzoesäure-, Propansäure-, Buttersäure-, Pentansäure-, Hexansäure-, Heptansäure- und Caprylsäureanhydride.
Beispiel 38
Acylierung in wässriger Dimethylformamid-Lösung unter Verwendung von DMAP
Zu 0,1-1 μg RNA in 1 μl Wasser wurden 20 μl Dimethylformamid, die eine katalytische Menge (60 μg; 490 nmol) an DMAP, oder (3 mg) 1-Methylimidazol enthielten, hinzugefügt, und dann wurden 0,1-10 μmol an Essigsäureanhydrid oder einem acylierenden Mittel zugefügt. Die bevorzugte Reaktion enthielt 1 μg RNA, 20 μl von Dimethylformamid, 60 μg DMAP und 1 μmol an Essigsäureanhydrid. Die Lösung wurde 5 Sekunden lang unter Verwendung eines Rührers lebhaft gemischt und die Reaktion wurde 20-60 Minuten lang bei Raumtemperatur ablaufen gelassen, bevor sie durch die Zugabe von drei Volumina an Ethanol und durch Mischen beendet wurde. Die modifizierte RNA könnte aus den Reaktionspartnern unter Verwendung von Centricon-50-Spin-Column oder Ethanolausfällung ausgereinigt werden. Andere Acylierungsmittel umfassen Propansäure-, Buttersäure-, Pentansäure-, Hexansäure-, Heptansäure-, Oktansäure- oder Benzoesäureanhydride.
Beispiel 39
Acylierung unter Verwendung von 2-Hydroxypyridinkatalysator
Zu 0,1-1 μg an RNA in 1 μl Wasser wurden 20 μl Triethylamin gegeben, welches eine katalytische Menge (60 μg; 490 nmol) an 2-Hydroxypyridin enthielt, sodann wurden 0,1-10 μmol Essigsäureanhydrid oder ein anderes Acylierungsmittel zugegeben. Die bevorzugte Reaktion enthielt 1 μg RNA, 20 μl an TEA, 60 μg DMAP und 1 μmol Essigsäureanhydrid. Die Lösung wurde 5 Sekunden lang unter Verwendung einers Rührers lebhaft durchmischt und die Reaktion wurde 5-20 Minuten lang bei Raumtemperatur ablaufen gelassen, bevor sie durch die Zugabe von drei Volumina an Ethanol und durch Mischen beendet wurde. Die modifizierte RNA könnte aus den Reaktionspartnern unter Verwendung von Centricon-50-Spin-Column oder Ethanolausfällung ausgereinigt werden. Andere Acylierungsmittel umfassen Propansäure-, Buttersäure-, Pentansäure-, Hexansäure-, Heptansäure-, Oktansäure- oder Benzoesäureanhydride.
Beispiel 40
Verwendung von Tetraethylammoniumacetat zur Acetylierung
Zu 1 μg (1,7 pmol) mRNA oder viraler RNA wurde 1 μmol Tetraethylammoniumacetat zugegeben und die Mischung wasserfrei vorgelegt und dann in 1 μl (10 μmol) Essigsäureanhydrid resuspendiert. Nachfolgend auf einen Inkubationszeitraum von 2 Stunden bei Raumtemperatur wurden 10 μl von 1:1 (v:v) Pyridin; Wasser zugegeben und die Reaktion 5 Stunden lang bei Raumtemperatur inkubiert. Die nicht abreagierten Komponenten wurden entweder durch Ethanolfällung (Sambrook et al., (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, CSH) oder Microcon-50 Spin-Column-Reinigung (Amicon, USA) entfernt, wie beschrieben.
Beispiel 41
Verwendung von Pyridinchlorchromat zur Oxidation
Oxidation von Alkoholen (-OH→=O) ist ein wohl bekanntes Verfahren und Pyridinchlorchromat (Corey's Reagent) ist als Oxidationsmittel besonders nützlich. Die Verwendung von Essigsäure kann die Reaktionsgeschwindigkeit erhöhen (Agarwal et al., (1990) Tetrahedron 46:4417-4420). Zu 1 μg (1,7 pmol) an mRNA oder viraler RNA in 10 μl Dimethyl formamid wurden 5 nmol an Pyridinchlorchromat, 40 μl (1,6 nmol) Essigsäure hinzugegeben, um als ein Säurekatalysator zu dienen, und die Mischung wurde 2 Stunden lang bei Raumtemperatur inkubiert. Die nicht abreagierten Komponenten wurden entweder durch Ethanolausfällung (Sambrook et al., (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, CSH) oder Mirocon-50 Spin-Column-Reinigung (Amicon, USA) entfernt, wie beschrieben.
Beispiel 42
Stabilität von mit Buttersäure- und Pentansäureanhydriden modifizierter RNA
RNA wurde mit entweder Buttersäure- oder Pentansäureanhydriden in Übereinstimmung mit dem Verfahren aus Beispiel 6 modifiziert.
15 zeigt eine verbesserte Stabilität von RNA, die mit Buttersäure- und Pentansäureanhydriden modifiziert wurde. Die Laufspuren zeigen wie folgt: Laufspur 1; radiomarkierte Ribosonde-(Promega, USA) RNA, Laufspur 2; Buttersäureanhydrid-modifizierte RNA, Laufspur 3; Pentansäureanhydrid-modifizierte RNA, Laufspuren 4-6; Proben, die mit 5 Einheiten von Mungbohnennuklease 10 Minuten lang bei 37 °C behandelt worden sind, Laufspur 4; RNA, Laufspur 5; Buttersäureanhydrid-modifizierte RNA, Laufspur 6; Pentansäureanhydrid-modifizierte RNA, Laufspuren 7-9; Proben, welche mit 15 Einheiten von S1-Nuklease 10 Minuten lang bei 37 °C behandelt worden sind, Laufspur 7; normale RNA, Laufspur 8; Buttersäureanhydrid-modifizierte RNA, Laufspur 9; Pentansäureanhydrid-modifizierte RNA, Laufspuren 10-12; Proben, die 15 Minuten lang bei 22 °C in 80 mM NaOH behandelt worden sind; Laufspur 10; normale RNA, Laufspur 11; Buttersäureanhydrid-modifizierte RNA, Laufspur 12; Pentansäureanhydrid-modifizierte RNA, Laufspur 13; Markierungslaufspur mit Essigsäureanhydrid-modifizierter RNA. Der vollständige Abbau von RNA mit Mungbohnennuklease (Laufspur 4), S1-Nuklease (Laufspur 7) und ihr teilweiser Abbau mit Base (Laufspur 10), verglichen mit modifizierten Formen, ist zu bemerken.
Beispiel 43
Acetylchloridmodifikation von RNA in Gegenwart und Abwesenheit von Katalysator
Dieses Beispiel vergleicht den Grad an RNA-Acetylierung, wie unten herausgestellt, in Übereinstimmung mit dem Verfahren aus Beispiel 8 in Gegenwart und Abwesenheit des Katalysators, DMAP.
16 zeigt einen Vergleich des Grades an Acetylierung von RNA unter Verwendung unterschiedlicher Konzentrationen an Acetylchlorid mit oder ohne den Katalysator DMAP. Die Laufspuren sind wie folgt: Laufspur 1; radiomarkierter Ribosonden-RNA-Marker (Promega, USA), Laufspur 2; acetylierter Ribosonden-RNA-Marker, Laufspuren 3-12; Acetylierung von RNA mit Acetylchlorid in einem katalysierten (3 mg/ml DMAP) (Laufspuren 3-7) oder nichtkatalysiertem (Laufspuren 8-12) Lösungsmittelsystem. Acetylchlorid-variierende Konzentrationen und in einem Endvolumen von 1 μl Toluol wurden mit 100 ng RNA in 1 μl Wasser gemischt, 20 μl TEA mit oder ohne einen Katalysator, und 20 Sekunden lang bei Raumtemperatur inkubiert. Laufspur 3; 0,25 %, Laufspur 4; 0,5 %, Laufspur 5; 0,75 %, Laufspur 6; 1 % und Laufspur 7; 1,25 % Endkonzentration an Acetylchlorid mit DMAP. Laufspur 8; 0,25 %, Laufspur 9; 0,5 %, Laufspur 10; 0,75 %, Laufspur 11; 1,0 % und Laufspur 12; 1,25 % Endkonzentration an Acetylchlorid ohne DMAP. Das Ausmaß der Acetylierung wächst mit steigender Acetylchloridkonzentration und in der Gegenwart von DMAP-Katalysator. Selbst wenn die höchsten Konzentrationen an Acetylchlorid verwendet werden mit dem Katalysator (Laufspur 7), gibt es eine geringere Modifikation als mit Essigsäureanhydrid (Laufspur 2).
Beispiel 44
Acetylierung von RNA mit verlängerter Reaktionszeit
Unter Verwendung der Methodologie von Beispiel 37, zeigt dieses Beispiel die Wirkung der Reaktionszeit auf die Acetylierung von RNA unter der Verwendung von Essigsäureanhydrid.
17 zeigt eine gesteigerte Acetylierung von RNA, wenn die Reaktionszeiten verlängert werden. Modifikationsreaktionen wurden mit 20 ng radiomarkierter Ribosonde-RNA und 100 ng Hefe-RNA ausgeführt, 1 μl an Essigsäureanhydrid, 20 μl an TEA, die 3 mg/ml von DMAP enthalten, gemischt und für die folgenden Zeiten inkubiert. Die Laufspuren zeigen wie folgt: Laufspur 1; 0 Sekunden, Laufspur 2; 20 Sekunden, Laufspur 3; 1 Minute, Laufspur 4; 6 Minuten und Laufspur 5; 20 Minuten bei Raumtemperatur, ehe die Reaktion angehalten und auf einem Sequenziergel analysiert wurde. Die Reaktionen wurden durch das Hinzufügen von drei Volumina an Ethanol unter Durchmischen angehalten.
Beispiel 45
Ausmaß an RNA-Modifikation unter Verwendung von DMAP-Katalysator
Dieses Beispiel vergleicht das Ausmaß an RNA-Modifikation in der Gegenwart und Abwesenheit des Katalysators DMAP. Eine DMAP-katalysierte Acetylierungsreaktion wurde in Übereinstimmung mit Beispiel 6 durchgeführt und verglichen mit einer analogen Reaktion, die in der Abwesenheit von DMAP in Übereinstimmung mit Beispiel 36 durchgeführt wurde.
18 zeigt, dass der Katalysator DMAP das Ausmaß an RNA-Modifikation durch Essigsäureanhydrid steigert. Laufspur 1; 20 ng an radiomarkierter Ribosonde-RNA, 10 μg an Hefe-RNA, 10 μg an Essigsäureanhydrid und 20 μl an TEA, welches 3 mg/ml an DMAP enthielt, Laufspur 2; 20 ng an radiomarkierter Ribosonde-RNA, 10 μl an Hefe-RNA, 1 μl an Essigsäureanhydrid, 20 μl an TEA ohne DMAP, Laufspur 3; unmodifizierte RNA-Größenmarker. Die Reaktionen wurden 20 Sekunden lang bei Raumtemperatur durchgeführt. Es ist die ausgeprägte Stufe zwischen Laufspuren 1 und 2 zu bemerken, die zeigt, dass die RNA in Laufspur 2 stärker modifiziert ist in der Gegenwart von DMAP als ohne (Laufspur 1).
Beispiel 46
Formylierung von RNA unter Verwendung von Benzoesäure-Ameisensäureanhydrid
Benzoesäure-Ameisensäureanhydrid wurde hergestellt, indem entweder 6 Moläquivalente (1 ml) von Essigsäure mit 1 (1 g) oder 2 Moläquivalenten (2 g) Benzoesäureanhydrid gemischt wurden und 15 Minuten lang bei 22 °C durchmischt wurden. 1 μl des Produkts wurde ohne weitere Reinigung in einer 20-μl-Reaktion, umfassend 19 μl THF, 3,2 mg (39 μmol) 1-Methylimidazol und 60 μg DMAP und 100 ng RNA verwendet, und die Reaktion wurde 1 Stunde lang bei 22 °C inkubiert. Unter einigen Reaktionsbedingungen ist dieses Reagenz instabil, was zur Entstehung von Kohlenmonoxyd und Benzoesäure innerhalb des Lagerungsgefäßes führt, wenn dies bei 4 °C gelagert wird. Die Einfachheit der Herstellung von Benzoesäure-Ameisensäureanhydrid erlaubt jedoch, dass das Reagenz jedes Mal hergestellt wird, wenn es gebraucht wird.
Beispiel 47
Formylierung von RNA und RT-PCR
Formylierungsreaktion
5 μl von Essigsäure-Ameisensäureanhydrid wurden zu einer 100-μl-Reaktion zugefügt, umfassend 95 μl THF, 16 mg (195 μmol) 1-Methylimidazol, 300 μg DMAP und 100 ng BMV-RNA, und dann wurde die Reaktion 10 Minuten lang bei 22 °C inkubiert, vor Reinigung durch Ethanolfällung, Centricon-50-Spin-Filtrierung (Amicon, USA), Dialyse oder Binden an Siliziumoxidkügelchen (Qiagen, Deutschland). Die formylierte RNA wurde in Wasser gelöst, um eine Endkonzentration von 25 ng/μl zu ergeben.
Reverse Transkription
25 ng formylierter BMV-RNA wurden zu 10 μl Reaktionsmischung, umfassend die folgenden abschließenden Komponentenkonzentrationen, zugegeben: 200 mM Tris-HCl (pH 8,4 bei 24 °C), 75 mM KCl, 1,3 mM MnCl₂, 10 mM DTT, 1 mM dNTPs, 110 ng eines Oligonukleotid-Primers und 100 Einheiten von Superscript II^TM (Life Technologies, USA) oder MULV RNase H^- (Promega, USA). Wasser wurde verwendet, um das Endvolumen auf 10 μl zu bringen. Die Reaktion wurde 1 Stunde lang im Temperaturbereich von 28-34 °C voranschreiten gelassen. Die cDNA kann dann beispielsweise durch Ethanolausfällung, Centricon-50-Filtrierung gereinigt werden oder direkt in einer PCR-Reaktion wie folgt verwendet werden.
PCR-Amplifikation
Die PCR wurde durchgeführt in einem Endvolumen von 25 μl mit einer Endkonzentration von 15 mM Tris-HCl bei einem pH-Wert von 8,8, 60 mM KCl, 2,5 mM MgCl₂, 400 μM jedes dNTPs, 10 pmol von jedem Primer BMV F und BMV R und eine Einheit Taq-DNA-Polymerase (Amersham, UK). Generell werden 2,5 ng (1 μl) cDNA-Matrize, die aus der formylierten BMV-RNA erzeugt wurden, zu der Reaktion hinzugefügt. Die Zyklusparameter betrugen 94 °C × 20 Sekunden, 55 °C × 20 Sekunden und 72 °C × 30 Sekunden über 30 Zyklen. Die PCR-Produkte wurden nach der Gelelektrophorese und Anfärben mit EtBr sichtbar gemacht.
Beispiel 48
Hybridisierung mit formylierter RNA
Northern-Blotting-Verfahren
Northern Blotting wurde gemäß Goda und Minton (1995) Nucleic Acid. Res. 16:3357-3358 ausgeführt. Kurz, die Gele wurden vorbereitet durch Hinzufügen von 0,5 ml von 1 M Guanidinthiozyanat und 2 μl EtBr (10 mg/ml) in 100 ml geschmolzener 1,2%-iger Agarose, die 1 × TBE-Puffer enthält. Modifizierte RNA (formyliert) oder RNA (0,24-9,5 kb) Ladder (Cat. No. 15620-016, Gibco-BRL, USA) wurden in ein gleiches Volumen (3 μl) Glycerol/0,01 %-igem Bromphenolblau gegeben. Auf die zweistündige Elektrophorese bei 100 V folgend wurde das Gel fotografiert (siehe Panel A), und dann wurde die RNA auf eine Hybond-N+-(Amersham, UK) Membran gemäß den Herstelleranleitungen übertragen. Die Membran wurde über Nacht bei 65 °C in 5 ml "Church-Puffer" mit 10⁶ cpm/ml einer radioaktiven cDNA-Sonde, welche die RNA-Ladder darstellte, hybridisiert. Die Membran wurde zwei Mal bei Raumtemperatur in Church-Puffer gewaschen, und es wurde ein Bild erfasst und unter Verwendung eines Phosphor-Imagers und von ImageQuant (Molecular Dynamics, USA) analysiert.
Das Hybridisierungssignal von all den Banden in der formylierten RNA-Laufspur lag um 4 % höher als in der RNA-Laufspur, möglicherweise, weil die formylierte RNA intakter war und/oder effizienter auf die Membran übertragen wurde als RNA. Ein weiterer Vorteil war die exzellente Auflösung der RNA-Ladder-Banden, welche dazu neigten, sich in Einzelbanden aufzuteilen, wohingegen die RNA-Banden eine nahezu kontinuierliche Verschmierung zwischen der 0,24- und der 9,4-kb-Bande bildeten. Dies kann daher kommen, weil die formylierte RNA ihre Sekundärstruktur verloren hat und daher im Gel auf der Basis ihres Molekulargewichts getrennt wurde. Während die 7,5- und 9,4-kb-RNA-Banden schlecht transferierten und/oder hybridisierten, hybridisierte die formylierte 7,5- und 9,4-kb-Bande stark, so dass einzelne Banden sichtbar waren. Die Fähigkeit, lange RNA zu detektieren, ist für den Erfolg des Northern Blotting kritisch, da viele zelluläre Transkripte bei über 5 kb Länge liegen und einige, so wie das Xist-Säugertranskript, im Wesentlichen bei mehr als 10 kb liegen.
Dot-Blotting-Verfahren
Um die optimale Temperatur für die Hybridisierung formylierter RNA in Church-Puffer festzustellen, wurden gleiche Mengen an formylierter 0,24-9,4 kb RNA-Ladder oder unmodifizierter RNA-Ladder auf Hybond N+ getüpfelt und behandelt wie bei Northern Blots. Die immobilisierten Proben wurden über Nacht bei 55, 60 und 65 °C mit 10⁶ cpm/ml radioaktiver cDNA-Sonde in 200 μl Church-Puffer hybridisiert und dann zwei Mal in 1 ml Church-Puffer bei 22 °C gewaschen. Die Hybridisierung wurde quantitativ bestimmt unter Verwendung eines Phosphor-Imagers. Die folgende Tabelle 2 stellt die Ergebnisse, die in beliebigen Einheiten dargestellt sind, dar. Tabelle 2
Aus diesen Ergebnissen kann ersehen werden, dass die optimale Temperatur bei der Hybridisierung formylierter RNA in Church-Puffer bei 55 °C liegt, für RNA bei 60 °C. Bei 55 °C hybridisiert Formyl-RNA 1,05 Mal besser als RNA.
Beispiel 49
Modifikation von RNA unter Verwendung 2-Methoxyethoxymethyl-(MEM)Chlorid
Zu 120 μl einer EDPA- und THF-Mischung (1:7 v/v) wurden 3 μl MEM-Chlorid und 10-100 ng RNA in 1 μl Wasser gegeben. Die Reaktion wurde kurz verrührt und bei 22 °C 5-30 Minuten lang inkubiert. Die Reaktion wurde angehalten und die modifizierte RNA aus den Reaktionskomponenten durch das Hinzufügen von drei Volumina an Ethanol, enthaltend 300 mM Natriumacetat, aufgenommen, gefolgt durch 5-minütiges Zentrifugieren bei 10.000 g. Das Pellet wurde mit 100 μl von 70%-igem Ethanol gewaschen und in Wasser rückgelöst vor der Analyse oder vor Verwendung als eine RT-PCR-Matrize. Unter diesen Bedingungen wurde durch Gelelektrophorese in Harnstoff-4-%-igem-Acrylamid- Sequenziergel mit geeigneten Molekulargrößenmarkern herausgefunden, dass die RNA scheinbar zu 100 % modifiziert wurde.
Beispiel 50
Reverse Transkription von MEM-modifizierter RNA
20 ng von MEM-modifizierter BMV-RNA wurden zu einer 10-μl-Reaktionsmischung gegeben, die die folgenden Endkomponentenkonzentrationen enthält: 200 mM Tris-HCl (pH 8,4 bei 24 °C), 75 mM KCl, 1,3 mM MnCl₂, 10 mM DTT, 1 mM dNTPs, 110 ng Oligonukleotid-Primer und 100 Einheiten von MULV Point Mutant (Promega, USA). Wasser wurde hinzugefügt, um das Endvolumen auf 10 μl aufzufüllen. Es ist zu bemerken, dass das 1,3 mM MnCl₂ in der Reaktion durch 2,5 mM MgCl₂ ersetzt werden kann. Die Reaktion wurde bei 42 °C 1 Stunde lang ablaufen gelassen. Die cDNA kann dann direkt in einer PCR-Reaktion wie folgt verwendet werden.
Die PCR wurde durchgeführt in einem Endvolumen von 50 μl mit einer Endkonzentration von 15 mM Tris-HCl, pH 8,8, 60 mM KCl, 2,5 mM MgCl₂, 400 μM jedes dNTPs, 10 pmol jedes Primers BMV F und BMV R und eine Einheit Taq-DNA-Polymerase (Amersham Pharmacia Biotech, UK). 4 μl cDNA-Matrize wurden pro Reaktion zugegeben. Die Zyklusparameter betrugen 94 °C × 8 Sekunden, 55 °C × 8 Sekunden und 72 °C × 10 Sekunden für 30 Zyklen. Die PCR-Produkte wurden auf die Agarosegelelektrophorese folgend und nach Anfärben mit EtBr sichtbar gemacht.
Beispiel 51
Hybridisierung von MEM-modifizierter RNA
Ein Vergleich der Fähigkeit von MEM-modifizierter RNA gegenüber der Hybridisierung von RNA wurde unter Verwendung einer einfachen Dot-Blot-Hybridisierung getestet. Das immobilisierte Zielmolekül war 100 ng eines Alkali-denaturierten pGEMEX-Plasmids (Promega, USA), welches auf Hybond N+ (Amersham Phamarcia Biotech, UK) quervernetzt wurde unter der Verwendung von Standard-Dot-Blot-Protokollen (Sambrook et al., CSH). Zu 100 μl von Church-Hybridisierungspuffer (0,5 M NaPi PH 7,2, 7 % SDS und 1 mM EDTA), der die Membran enthielt, wurden näherungsweise 5000 cpm von ³²p UTP-markierter Ribosonde, die mittels in-vitro-Transkription aus pGEMEX unter Verwendung von RNA-Polymerase T3 dargestellt wurde (Promega, US), zugegeben. Die Hybridisierung wurde bei 55 °C 2 Stunden lang laufen gelassen, dann wurde die Membran unter Waschbedingungen wachsender Stärke gewaschen. Diese waren: 10 Minuten bei 22 °C in 500 μl Church-Puffer, 10 Minuten bei 65 °C in 500 μl von 100 mM NaCl/10 mM Tris-HCl (pH 7,5) und 10 Minuten bei 65 °C in 0,1 %-iger SDS. Das Ausmaß an Radioaktivität, was an dem Zielmolekül hybridisiert verblieb, wurde unter Verwendung eines Instant Imagers quantifiziert (Hewlett Packard, US). Die Ergebnisse zeigten, dass 20 % mehr MEM-modifizierte RNA an das Zielmolekül hybridisieren als an eine RNA-Sonde, und beide Sonden vom Zielmolekül abgewaschen wurden unter ähnlichen Bedingungen. 20 zeigt eine Kurve der hybridisiert verbleibenden RNA unter den Waschbedingungen gesteigerter Stärke (die obere Kurve stellt die MEM-modifizierte RNA dar).
Beispiel 52
Modifikation von RNA mit Triisopropylchlorosilanchlorid (TIPSCl)
10 ng von ³²P UTP radiomarkierter RNA in 1 μl THF wurden zu einer 45 μl Silylierungsreaktion, umfassend 5 μl EDPA und 35 μl -THF, 200 μg von entweder Imidazol oder DMAP-Katalysator und 3 μl von Triisopropylchlorosilanchlorid (TIPSCl) (Tertbutyldimethylchlorosilanimidazol (TBDMS-Imidazol), Trimethylsilylimidazol (TMS-Imidazol) oder anderen geeigneten Silylierungsreagenzien, welche ebenfalls verwendet werden könnten, zugegeben und 30 Minuten bis 3 Stunden lang bei 22 °C reagieren gelassen. Die Reinigung wurde mittels Ethanolausfällung und Analyse mittels Harnstoff-Acrylamid-Sequenziergelelektrophorese durchgeführt, unter Verwendung geeigneter Molekulargewichtsmarker, um den Grad der Modifikation zu messen. Es wurde festgestellt, dass das Hinzufügen von Imidazol zu der Reaktion, umfassend EDPA/THF und TIPSCl, zu einem signifikant verringerten Ausmaß an Abbau einer 1500 Nukleotide umfassenden RNA führte.
Beispiel 53
Stabilitätsstudien acylierter RNA
Um die relative Stabilität acylierter RNA und RNA unter Bedingungen, die gemeinhin während der Lagerung oder des Transports auftreten, zu testen, wurde der Zerfall einer radiomarkierten 1500 Nukleotide umfassenden acetylierten RNA mit RNA in Wasser bei 37 °C verglichen. Zu 100 ng von ³²P UTP radiomarkierter acetylierter RNA (acetyliert und gereinigt unter Standardbedingungen) oder RNA (Ribosonde, Promega, USA) wurden 10 μl Wasser hinzugefügt und bei 37 °C entweder 1 Tag oder 4 Tage lang inkubiert. Die Proben wurden dann auf ein Harnstoff-4-%-iges-Acrylamid-Sequenziergel aufgegeben. Auf die Elektrophorese, das Trocknen und das Aussetzen eines Phosphor-Screens folgend, wurde die 1500 Nukleotid-Bandenintensität unter Verwendung eines Phosphor-Imagers und ImageQuant-Software (Molecular Dynamics, USA) quantifiziert. Die Ergebnisse sind mit dem Graph von 21 gezeigt. Während über 80 % der RNA nach 4 Tagen bei 37 °C abgebaut worden sind, konnte kein Abbau der acetylierten RNA detektiert werden.
Beispiel 54
Acylcyanid-RNA-Modifikation
Die Verwendung von Acylcyaniden zur Acylierung wurde berichtet (Angew. Chem. Int. Ed. (1982) 21:36; Tetrahedron Lett. (1971) 185; J. Chem. Soc., Perkin 1 (1976) 1351). Zu 0,1-1 μg an mRNA in 1 μl Wasser wurden 20 μl Triethylamin hinzugefügt und dann 10 μmol von entweder Acetylcyanid oder Benzoylcyanid. Die Lösung wurde unter Einsatz eines Rührers 5 Sekunden lang lebhaft durchmischt, und dann wurde die Reaktion 30 Minuten lang bei Raumtemperatur (22 °C) reagieren gelassen. Die Reaktion wurde dann durch Zugabe von drei Reaktionsvolumina an Ethanol oder Methanol, gefolgt durch 5 Sekunden langes Durchmischen mit einem Rührer beendet. Modifizierte RNA wurde aus den Reaktionspartnern und dem Lösungsmittel unter Verwendung eines von verschiedenen Verfahren entfernt. Das bevorzugte Verfahren war, die Mischung in ein Endvolumen von 400 μl Wasser zu lösen, welches dann in einen Centricon-50-Spin-Column (Amicon, USA) gegeben und 15 Minuten lang bei 3000 g oder, bis der Filter trocken war, zentrifugiert wurde. Der Filter wurde dann durch Zugabe von 400 μl Wasser gewaschen und erneut 15 Minuten lang bei 3000 g zentrifugiert. Die modifizierte RNA wurde durch Ausleeren des Gefäßes, welches den Filter enthielt, aufgenommen in ein frisches Zentrifugengefäß und durch 60 Sekunden langes Zentrifugieren bei 3000 g. Die Ausbeute-Volumina lagen typischerweise bei 5-15 μl, und die Ausbeute erzielte > 95 %.
Beispiel 55
Acetylbromid RNA Modifikation
Die Verwendung von Acetylbromid zur Acetylierung wurde überprüft (Synthesis (1975) 249; J. Med. Chem. (1973) 16:630; ibid (1974) 17:427). Zu 0,1-1 μg mRNA in 1 μl Wasser wurden 20 μl Triethylamin hinzugefügt, und dann wurden 10 μmol Acetylbromid hinzugefügt. Die Lösung wurde lebhaft unter Verwendung eines Rührers 5 Sekunden lang vermischt, und die Reaktion 30 Minuten lang bei Raumtemperatur (22 °C) ablaufen gelassen.
Vorzugsweise läuft die Reaktion in Gegenwart von Trifluoressigsäure ab, um die Acetylierung auf die 2'-OH-Gruppen zu richten. Zu 0,1-1 μg mRNA in 1 μl Wasser wurden 20 μl Tetrahydrofuran zugegeben, die 1-10 mM Trifluoressigsäure enthalten, und dann wurden 10 μmol Acetylbromid hinzugefügt. Die Lösung wurde lebhaft unter Verwendung eines Rührers 5 Sekunden lang vermischt, und die Reaktion wurde 30 Minuten lang bei Raumtemperatur (22 °C) ablaufen gelassen. Die Reaktion wurde dann durch Zugabe von 3 Reaktionsvolumina Ethanol oder Methanol beendet, gefolgt von 5-sekündigem Mischen mit einem Rührer. Die modifizierte RNA wurde aus den Reaktionspartnern und dem Lösungsmittel unter Verwendung eines von mehreren Verfahren entfernt. Das bevorzugte Verfahren war, die Mischung zu einem Endvolumen von 400 μl Wasser zu verdünnen, das dann einer Centricon-50 Spin-Column (Amicon, USA) zugeführt wurde, und 15 Minuten lang bei 30008 zentrifugiert wurde, oder bis der Filter trocken war. Der Filter wurde dann durch Zugabe von 400 μl Wasser gewaschen und wieder 15 Minuten lang bei 3000g geschleudert. Die modifizierte RNA wurde wiedergewonnen, indem die Schale, die den Filter hält, in ein frisches Zentrifugengefäß ausgeleert wurde, und 60 Sekunden lang bei 3000g zentrifugiert wurde. Die Wiedergewinnungsvolumina lagen typischerweise bei 5-15 μl und die Wiedergewinnungsausbeute >95 %.
Beispiel 56
Dialyse, um Reaktionskomponenten zu entfernen
Eine Standard 20 μl Modifikationsreaktion, die 19 μl Triethylamin, 100 μg DMAP, 2 μl Essigsäureanhydrid und 500 ng von 0,24-9,4 kb RNA-Ladder (Life Technologies) enthält, wurde 10 Minuten lang bei 22 °C inkubiert und in einen Mini-Slide-A-Lyzer (MWCO 3.500) überführt, und die Einheit mit einer Cap versehen. Die Dialyseeinheit wurde dann in 800 ml Wasser unter langsamem Rühren überführt. Nach 90 Minuten wurde ein Viertel (5 μl) der dialysierten Reaktion auf ein 1 %-ige Agarose, 0,5 × TBE Gel gegeben, und nach der Elektrophorese wurde die modifizierte RNA sichtbar gemacht, indem sie durch Ethidiumbromid eingefärbt wurde. Es war offensichtlich, dass die acetylierte RNA weitgehend frei von Verunreinigungen war, da sie leicht in das Gel eindrang: verunreinigter RNA ist es nicht möglich, in das Gel einzudringen auf Grund der vorliegenden Verunreinigungen. Die Dialyse bietet daher ein einfaches und geeignetes Mittel zur Reinigung nach der Reaktion.
Beispiel 57
Bromierung der RNA mit Phosphor-Tribromid
Zu 30 μl einer 1:1 Mischung von Triethylamin und Dimethylformamid (DMF) wurden 0,1 μl (1 μmol) PBr₃ und 1 μl RNA (100 ng), die in DMF gelöst ist, zugegeben. Die Reaktion wurde 10 Minuten lang bei 22 °C unter Mischen ablaufen gelassen. Die halogenierte RNA kann dann durch eine beliebige Anzahl von Mitteln, wie zum Beispiel Ethanolausfällung, gereinigt werden. Es ist wichtig, das PBr₃ in einem unreaktiven Lösungsmittel wie zum Beispiel DMF zu verdünnen, da sonst ein dichter Niederschlag gebildet wird. Weitere für die Reaktion verwendbare Lösungsmittel sind Pyridin, Ether und, weniger vorzuziehen, DMF. Eine Erhöhung der PBr₃ Menge führt zur Bildung eines Niederschlags, der schwierig von der RNA zu trennen ist. Jedoch löst zweimaliges Waschen des Niederschlags mit 500 μl 70 %-iges Ethanol die Ausfällung, wodurch sich die RNA-Probe wiedergewinnen lässt.
Beispiel 58
Chlorierung der RNA mit Phosphor-Trichlorid
Zu 30 μl Pyridin wurden 0,1 oder 1 μl (11,5 μmol) PCl₃ und 1 μl RNA (100 ng), die im DMF gelöst ist, hinzugefügt. Die Reaktion wurde 10 Minuten lang bei 22 °C unter Mischen ablaufen gelassen. Die halogenierte RNA kann dann durch eine beliebige Anzahl von Mitteln wie zum Beispiel Ethanolausfällung gereinigt werden. Es ist wichtig, das PCl₃ in einem nicht reaktiven Lösungsmittel wie zum Beispiel DMF zu verdünnen. Weitere für die Reaktion verwendbare Lösungsmittel sind Ether, DMF und, weniger vorzuziehen, Triethylamin. Die Reaktion wird in 6 gezeigt.
Beispiel 59
Chlorierung der RNA mit Thionylchlorid
Zu 30 μl Ether wurden 0,01, 0,1 oder 1 μl (11,5 μmol) Thionylchlorid (SOCl₂) und 1 μl RNA (100 ng), die im DMF gelöst ist, zugefügt. Die Reaktion wurde 10 Minuten lang bei 22 °C unter Mischen ablaufen gelassen. Die halogenierte RNA kann dann durch eine beliebige Anzahl von Mitteln wie zum Beispiel Ethanolausfällung gereinigt werden. Es ist wichtig, das SOCl₂ in einem unreaktiven Lösungsmittel wie zum Beispiel DMF zu verdünnen. Weitere für die Reaktion verwendbare Lösungsmittel sind Pyridin oder DMF. Andere Lösungsmittel, die verwendet werden können, sind DMF und, weniger vorzuziehen, Triethylamin.
Beispiel 60
Reverse Transkription der halogenierten RNA
30 ng von bromierter BMV RNA wurden zu 100 ng eines Oligonukleotid-Primers (GAGCCCCAGCGCACTCGGTC) zu 3 μl Gesamtvolumen hinzugefügt und bei 72 °C 10 Minuten lang erhitzt, bevor es über Eis abgekühlt wurde. Dann wurden 7 μl einer Reaktionsmischung hinzugefügt, die die folgenden Endkonzentrationen der Komponenten enthält: 50 mM Tris-HCl (pH 8,4 bei 24 °C), 75 mM KCl, 1,3 mM MgCl₂, 10 mM DTT, 1 mM dNTPs und 100 Einheiten Superskript II^TM (Life Technologies, USA). Die Reaktion wurde 1 Stunde lang bei 37 °C ablaufen gelassen. 5 μl der cDNA Reaktion wurden auf ein 1 %-iges Agarosegel geladen und nach der Elektrophorese mit Ethidium Bromid eingefärbt. Eine breite Bande der cDNA wurde beobachtet, die das reverse Transkriptionsprodukt darstellt. Die cDNA wurde dann direkt in einer PCR Reaktion wie folgt verwendet.
PCR Amplifikation
Die PCR wurde in einem Endvolumen von 25 μl mit einer Endkonzentration von 15 mM Tris-HCl pH 8,8, 60 mM KCl, 2,5 mM MgCl₂, 400 μM jedes dNTPs, 10 pmol von jedem Primer BMV F (CTATCACCAAGATGTCTTCG) und BMV R (GAGCCCCAGCGCACTCGGTC) und einer Einheit Taq DNA Polymerase (Amersham, UK). 1 μl der Matrizen-cDNA wurde pro Reaktion zugefügt. Zyklusparameter waren 94 °C × 10 sek., 55 °C × 10 sek. und 72 °C × 15 sek. für 30 Zyklen. Die PCR-Produkte wurden nach der Gelelektrophorese durch Einfärben mit Ethidiumbromid sichtbar gemacht. Aus dieser Amplifikation ergab sich eine große Menge an PCR-Produkt, gleich wie oder größer als die Menge, die durch ein identisches Verfahren unter Verwendung von BMV RNA als eine Matrize erzeugt wurde.
Beispiel 61
Nukleaseresistenz der halogenierten RNA
RNA wurde wie folgt bromiert. 500 μl Triethylamin/DMF (1:1) wurden zu 5 μl phosphorigem Tribromid und 1 μg von (0,24-9,5 kb) RNA-Ladder (Cat. No. 15620-016, Life Technologies), die in 10 μl DMF gelöst ist, hinzugefügt und kurz vermischt. Die Reaktion wurde nach 10 Minuten bei 22 °C durch die Zugabe von 3 Volumina Ethanol, 0,3 M NaOAc gestoppt, und die bromierte RNA fiel aus. Die Probe wurde in 20 μl Wasser resuspendiert.
2 μl (100 ng) bromierter RNA oder RNA wurden zu einer 10 μl Reaktion, die 1 μl RNase ONE^TM (Promega, USA) in 1 × Promega Reaktionspuffer enthält, hinzugefügt und 6 Minuten lang bei 22 °C inkubiert. Alternativ wurden 50 ng der Probe zu einer Reaktion, die 10 μg RNase A enthält, hinzugefügt und 9 Minuten lang bei 22 °C inkubiert. Das Ausmaß des RNA-Abbaus wurde durch Agarosegel-Elektrophorese analysiert. Während die gesamte RNA-Ladder abgebaut wurde, so dass kein mit Ethidiumbromid eingefärbtes Material sichtbar wurde, wurde ungefähr die Hälfte der bromierten Probe sichtbar, obwohl sie teilweise abgebaut war. Diese Nuklease-Experimente zeigen die verbesserte Resistenz, die durch den Austausch der 2'-OH-Gruppe durch ein Bromatom entsteht.
Beispiel 62
Reverse Transkription der RNA Matrizen, die mit kleinen Mengen Essigsäureanhydrid modifiziert sind
Obwohl mit Essigsäureanhydrid modifizierte RNA im Allgemeinen keine gute Matrize für reverse Transkriptase ist, stellt die Verwendung von reduzierten Mengen an Essigsäureanhydrid eine modifizierte Matrize mit guten Matrizeneigenschaften zur Verfügung. 1 μl verdünntes Essigsäureanhydrid wurde in einer 20 μl Reaktion verwendet, die 19 μl THF, 3,2 mg (39 μmol) 1-Methylimidazol und 60 μg DMAP und 10 ng BMV RNA enthielt, und die Reaktion wurde bei 22 °C 10 Minuten lang vor Reinigung durch Ethanolausfällung inkubiert. Die BMV RNA wurde als eine Matrize für die Superskript II reverse Transkriptase verwendet, und die cDNA als eine Matrize für die PCR, die BMV spezifische Primer verwendet, eingesetzt. Die PCR Produkte wurden mit 0,0001 und 0,001, jedoch nicht mit 0,01 oder 0,1 μl Essigsäureanhydrid detektiert.
Beispiel 63
Enzymatische Acylierung
Zu 1 μg RNA wird 2,5 nmol Vinylacetat und 1 μg Candida albicans oder Schweinemilz-Lipase in 100 μl Pyridin oder THF unter Stickstoff hinzugefügt. Die Reaktion wird bei 30-60 °C über Nacht ablaufen gelassen, und die acetylierte RNA wird durch Filtration oder Phenolextraktion gereinigt, gefolgt von Ethanolausfällung. Es gibt viele, potenziell nützliche Esterasen, die ausgenutzt werden könnten, eine Acylgruppe auf die RNA zu transferieren. Solche mit einer Herkunft aus Pilzen oder Säugetieren sind bevorzugt, da viele kommerziell erhältlich sind. Die Spezifität jedes Enzyms für die Acylierungsreaktion könnte empirisch untersucht werden müssen.
Beispiel 64
Enzymatische Deacylierung
Zu 1 μg acylierter RNA, wie zum Beispiel acetylierter, butanoylierter oder propanoylierte RNA, in 100 μl eines 100 mM Phosphatpuffers (pH 7) wurde eine Einheit einer Esterase oder Lipase, wie zum Beispiel Schweineleberesterase, Schweinemilzesterase, Hasenleberesterase, Candida rugosa Lipase, Chromobacterium viscosum Lipase, Mucor javanicus Lipase, Mucor meihei Lipase, Rhizopus arrhizus Lipase, Weizenkeimlipase oder aus Pseudomonas Spezien (Sigma) hinzugefügt. Alternativ können die Enzyme aus anderen Quellen wie zum Beispiel aus dem Esterase/Lipase CloneZyme Archiv (Recombinant BioCatalysis^TM, USA) ausgewählt werden. Die Reaktion wurde 1 Stunde lang bei 37-70 °C inkubiert, abhängig von der Herkunft des Enzyms, bis der pH-Wert nicht weiter absank, was anzeigte, dass die Deacylierung vollständig war. Alternativ können organische Lösungsmittel, wie zum Beispiel Tetrahydrofuran oder Dimethylsulphoxid, in Konzentrationen verwendet werden, die von 5-100 % reichen, wenn sie mit der wässrigen Lösung vermischt werden. In bestimmten Reaktionen kann es vorzuziehen sein, die RNA unter Verwendung der Benzoylgruppe zu protektieren, da das Produkt der Spaltungsreaktion Benzoesäure sublimiert werden kann. Durch eine solche Produktentfernung würde erwartet, dass die Reaktion bis zur Vollständigkeit abläuft.
VERGLEICHENDES BEISPIEL (OVODOV)
Eine Bemühung wurde unternommen, die Arbeit von OVODOV und ALAKHOV (1990). FEBS 270:111 zu reproduzieren, die die Acetylierung von 70-75 % der 2'-OH-Gruppen einer mRNA aus einem zellfreien Transkriptionssystem unter Verwendung des Acetylierungsverfahrens von KNORRE et al (1967) Molekul. Biol 1: 837 beschreiben. Die Ergebnisse des Knorre-Verfahrens wurden mit den Ergebnissen des Verfahrens gemäß der vorliegenden Erfindung verglichen.
19 zeigt einen Vergleich der Wirksamkeit der zwei Acetylierungsverfahren. Radiomarkierte RNA-Ladders, die aus einer in vitro Transkriptionsreaktion (Promega, USA) stammen, wurden mit Essigsäureanhydrid entweder in einem wässrigen-DMF-Lösungsmittelsystem gemäß Knorre et al (Laufspuren 1-11) oder in einem 19:1 TEA: wässrigen System mit einem DMAP Katalysator (Laufspur 12) gemäß Beispiel 6 der vorliegenden Anmeldung behandelt. Aus Klarheitsgründen ist nur ein markierter RNA-Marker gezeigt. Eine Abnahme der Mobilität zeigt die Modifikation an, die RNA erfährt, was eine erfolgreiche Modifikationsreaktion anzeigt. Die Laufspuren zeigen wie folgt: Laufspur 1, Ribomark RNA wurde 2 Stunden lang bei 37 °C und dann 46 Stunden lang bei Raumtemperatur behandelt, Laufspur 2, Ribomark RNA wurde 48 Stunden lang bei Raumtemperatur behandelt, nicht modifizierte Ribomark RNA (Laufspuren 3 und 13), Ribomark RNA wurde 1 Stunde lang bei 4 °C mit 0,01 μl (Laufspur 4), 0,1 μl (Laufspur 6) oder 10 μl (Laufspur 7) Essigsäureanhydrid behandelt. Ribomark RNA wurde 1 Stunde lang bei 37 °C mit 0,01 μl (Laufspur 8), 0,1 μl (Laufspur 9), 1 μl (Laufspur 11) Essigsäureanhydrid behandelt. Laufspur 12, Ribomark RNA wurde gemäß Beispiel 6 behandelt.
Es wurde entdeckt, dass es unter den Bedingungen gemäß Knorre kaum möglich war, die RNA zu modifizieren, sogar wenn die Reaktionszeiten von der vorgegebenen einen Stunde auf 48 Stunden ausgedehnt wurden (Laufspuren 1 und 2) oder die Essigsäureanhydrid Konzentrationen 1000 fach von den vorgegebenen 98 nmol (Laufspuren 4 und 8) auf 98 μmol pro 1 μmol RNA erhöht wurden, oder die Reaktionstemperaturen von 4 °C (Laufspuren 4-7) auf 37 °C (Laufspuren 8-11) erhöht wurden. Gemäß dem Knorre-Verfahren migrierte die RNA in jedem Fall auf die gleiche Position wie die nicht modifizierten Kontrollen (Laufspuren 3 und 13). Nur das TEA/DMAP/wässrige Lösungsmittelsystem, wie in dem vorliegenden Beispiel 6 beschrieben, ergab eine Modifikation (Laufspur 12). Dieser und weitere Versuche, die Arbeit von Ovodov und Alakhov zu wiederholen, versagten, was zu der Schlussfolgerung führt, dass die Veröffentlichung von Ovodov und Alakhov die Modifikation der RNA nicht in der Weise, die sie beschreiben, ermöglicht. Dieser Befund ist übereinstimmend mit den Ergebnissen, die durch Ovodov und Alakhov in ihrer Publikation dargestellt werden, in der das Molekulargewicht des modifizierten Materials, über das berichtet wird, unverändert bleibt, wenn es mit dem nicht modifizierten Material verglichen wird.
VERGLEICHENDES BEISPIEL (WANG)
Die Verfahren, die durch Wang et al., (genannt in den nachfolgenden Literaturquellen) angewendet werden, um RNA-Oligonukleotide zu modifizieren, beziehen die Verwendung von entweder Fluordinitrobenzol (FDNP) oder Dinitrophenol (DNP) in einer wässrigen gepufferten Lösung ein. Es wurde vorhergesagt, dass die Alkalinität (pH 8,8) und die ausgedehnten Reaktionszeiten (>18 Std.) zu einer Polynukleotidspaltung mit oder ohne zugefügtem FDNP oder DNP führen würde. Um festzustellen, ob es unter diesen Reaktionsbedingungen möglich wäre, längere RNA-Polymere zu modifizieren, wurden folgende vergleichende Reaktionsbeispiele durchgeführt. Laufspur 1, positive Kontroll-RNA-Ladder (keine Behandlung), die 240, 1350, 2370, 4400, 7460 und 9490 Nukleotide lange RNA-Ketten erhält, Laufspur 2 (DNP) und Laufspur 3 (DFDNP) Reaktion gemäß Ru, Taub und Wang (1998) Oncology Res. 10:389, Laufspur 4 (DFDNP) und Laufspur 5 (DNP) Reaktion gemäß Wang WO 94/19012, Laufspur 6 wie Reaktion 1 und 2 ohne Reaktionspartner (nur Puffer, RNA und Aceton zugefügt und 18 Stunden inkubiert) und Laufspur 7, wie Reaktion 3 und 4 ohne zugefügte Reaktionspartner (nur Puffer, RNA und Aceton zugefügt und 18 Stunden inkubiert).
Ergebnisse
Die Ergebnisse sind in 22 gezeigt. Anschließend an eine 18 Stunden Inkubation beim Wang-Reaktionssystem waren alle RNA-Proben (Laufspuren 2-7) bedeutend abgebaut, wobei sie nur Spuren der doppelsträngigen DNA-Matrize zurückließen, die in der RNA-Ladder als eine Verunreinigung vorlag. In dem Puffer allein inkubierte RNA wurde ebenso abgebaut, wahrscheinlich auf Grund der Alkalinität der Reaktion. Nur in Laufspuren 2 und 3 kann ein bisschen des 240 Nukleotid RNA Marker gesehen werden. RNA allein in der Puffer/Acetonmischung führte zu einem Totalabbau der Probe, wohingegen, wenn der Reaktionspartner zugegeben wurde, leicht geringerer Abbau stattfand. Das Wang-Reaktionssystem ist daher für die Modifikation der RNA-Polynukleotide nicht geeignet. Dies kann teilweise an der komplexen Tertiärstruktur liegen, die die RNA in Lösung annimmt. Es ist notwendig, dass die 2'-OH-Gruppen modifiziert und damit geschützt werden, bevor basenkatalysierte Spaltung auftreten kann. Mit einer komplexen Tertiärstruktur, wie sie durch Polynukleotide angenommen wird, würde erwartet werden, dass die innersten 2'-OH-Gruppen für das Lösungsmittel, das den Reaktionspartner enthält, unzugänglich sind und daher nicht modifiziert werden können, bevor der RNA-Abbau stattfindet. Dies könnte erklären, warum die 240 Nukleotid-RNA weniger abgebaut ist als die 9490 Nukleotid-RNA, die vollständig abgebaut ist.
Schließlich ist keine der Reaktionsbedingungen, die von Wang et al. angewendet werden, für die Modifikation von Polynukleotiden geeignet.
Hinsichtlich der Wang-Verfahren weisen natürlich vorkommende RNA-Ketten, wie zum Beispiel mRNA und virale RNA, Längen von durchschnittlich 2000-10.000 Nukleotiden auf. Natürlich vorkommende RNA existiert im Gegensatz zu DNA zu großem Teil in Sekundärstruktur, in der Tat ist die biologische Aktivität der RNA oft abhängig von dieser Struktur. Die biologische Aktivität der RNA ist von sequenzspezifischer Sekundärstruktur abhängig. RNA-Ketten einer bestimmten Länge und komplementärer Sequenz werden spontan eine kinetisch begünstigte Konformation annehmen, die einem kugelförmigen Protein gleicht. Dies umfasst die Bereiche von Stamm und Schleife, anti-paralleler Doppelstränge und einzelsträngige Bereiche. Obwohl die biologische Aktivität der RNA häufig von dieser Sekundärstruktur abhängig ist, zum Beispiel zur Steuerung der Proteintranslation oder viraler Duplikation, bringt dies vom Gesichtspunkt der Modifikation der 2'-OH-Gruppen viele Unsicherheiten und mögliche Probleme mit sich, verglichen mit Homopolymeren oder Oligonukleotiden.
Die Sekundär- und Tertiärstruktur der RNA ist in vielen Standardlehrbüchern beschrieben. In „RNA Isolation and Analysis" (1994, page 2, Bios Scientific Publishers, Oxford) wird angegeben, dass „Antiparallele Doppelhelixen natürlich zwischen zwei getrennten RNA-Ketten gebildet werden können, jedoch treten sie gewöhnlicherweise eher zwischen zwei Segmenten der gleichen Kette, die auf sich selbst zurückfaltet. Diese kurzen doppelhelikalen Bereiche sind durch einzelsträngige Strecken verbunden, wobei sie eine kugelförmige Form annehmen", und in dem Abschnitt, der Basic principles betitelt ist, wird angegeben, dass „RNA ein lineares Molekül ist... mit oftmals hochgradiger Sekundär- und Tertiärstruktur" und „... RNA Moleküle auch anfällig für Aggregation sind...", „Jedoch, die gleichen Probleme der RNA-Aggregation... auch angetroffen werden. Es ist daher notwendig, denaturierende Gele zu verwenden, um die tatsächliche Größe in der Abwesenheit jeglicher konformationsbestimmender Faktoren, Aggregation und Kerben in der RNA, zu bestimmen" und „eine Tertiärstruktur normalerweise einen verdeckten katalytischen Kern faltet, der nicht in Kontakt mit dem umgebenden Lösungsmittel ist."
In „Molecular Biology of the Cell" (3. Edition (1994) page 7, Garland Publishing, Inc, NY.) wird angegeben, dass "solche Verbindungen komplexe dreidimensionale Falt-Muster bilden, und das Molekül als Ganzes eine spezifische Form annimmt, die gänzlich von der Sequenz seiner Nukleotiden abhängt" und „Ein RNA-Molekül daher zwei spezielle Eigenschaften besitzt: Es trägt in seiner Nukleotidsequenz kodierte Information ... und besitzt eine spezifisch gefaltete Struktur, die es befähigt, selektiv mit anderen Molekülen zu interagieren, und bestimmt, wie es auf die Umgebungsbedingungen reagieren wird." In „Nucleic Acids in Chemistry and Biology" (2. Edition, (1996) Oxford University Press) wird angegeben, dass „Verschiedene natürliche RNAs entweder lange, doppelsträngige Strukturen bilden können oder eine kugelförmige Form annehmen, die aus kurzen Duplexdomänen gebildet ist, die über einzelsträngige Segmente verbunden sind". Im Gegensatz zu einzelsträngigen Oligonukleotiden, die nur mit dem Lösungsmittel Interaktionen aufweisen, müssen längere RNA-Ketten die Beiträge der Interaktionen zwischen Basen, Zuckern, Phosphaten, Ionen und Lösungsmittel innerhalb und zwischen RNA-Ketten berücksichtigen.
In „Biorganic Chemistry: Nucleic Acids" (1996, Oxford University Press) wird angegeben, dass „RNA-Moleküle mit jenen der kugelförmigen Proteine verglichen werden können und nicht einfach in Kategorien wie die DNA-Konformationen passen, die Tertiarstruktur ... merklich kugelförmig im Erscheinungsbild ist.", „während dieses umfangreiche Falten das Innere der tRNA für das Lösungsmittel unzugänglich macht" und „RNA-Strukturen allgemein ziemlich ausgeprägt sind und sich wesentlich von den überwiegend linearen, wiederholenden Polymeren, die durch die DNA gebildet werden, unterscheiden".

1. Die Tertiästruktur der RNA kann mit chemischen Reaktionspartnern wie zum Beispiel Fe (II) EDTA untersucht werden, das alle dem Lösungsmittel ausgesetzten Bereiche der RNA spaltet. Nach einer solchen Spaltung ist es klar, dass nicht die gesamte RNA Kette gespalten ist, da das meiste der RNA verdeckt, und daher vor dem Lösungsmittel versteckt ist, das den Spaltungsreaktionspartner trägt. Dies zeigt klar, dass ein großer Teil der RNA normalerweise nicht für das Lösungsmittel zugänglich ist.
2. Während die thermodynamischen Eigenschaften der Oligonukleotide (bis zu einem Maximum von 30 Nukleotiden) durch eine einfache Gleichung bemessen werden können (Tm = (2 × A/T) + (4 × C/G), kann die Tm von längeren Ketten (> 30 Nukleotiden) nicht durch diese Gleichung bemessen werden, da die biophysikalischen Gesetze sich für längere Ketten wesentlich unterscheiden. Empirische Messungen zeigen, dass die Tm des Oktamers Poly(rA)·poly(rU) 9 °C ist, während sie für längere Poly(rA)·Poly(rU) Oligomere 49 °C ist.
3. Oligonukleotide oder Homopolymere sind unfähig, sinnvolle genetische Information zu tragen oder Proteinsequenzen zu kodieren, während dies die Hauptfunktion der mRNA und der viralen RNA ist.

Aus dem vorstehenden ist daher klar, dass längere RNA-Ketten nicht das gleiche chemische Verhalten (1), physikalische Verhalten (2) oder biologische Verhalten (3) wie Oligonukleotide oder Homopolymere aufweisen.
Wang-Lösungsmittel und Salzsystem
Wang verwendet 210 mM Kaliumpuffer mit vorliegend 40 %-igem Aceton Lösungsmittel. Es würde erwartet werden, dass eine derart hohe Metallion-Konzentration (die optimale Natriumkonzentration zur Aggregation und Ausfällung von RNA liegt bei 300 mM) in Gegenwart von Aceton (das als ein Lösungsmittel verwendet wird, Proteine aus Lösung auszufällen) nicht nur zur Stabilisierung der Tertiärstruktur der individuellen RNA-Ketten, sondern auch zur Aggregation der gesamten RNA Ketten führen würden, was zusammen zu der Bildung des Niederschlags führt.
Es wurde empirisch herausgefunden, dass die Stabilität von doppelsträngigen Nukleinsäuren in Gegenwart von Kaliumionen ausgesprochen wächst; die Tm erhöht sich von 70 °C bei 10 mM Kalium auf 98 °C in 1 M Kalium. Dies bestätigt, dass der Effekt des Wang-Puffersystems darin läge, die Sekundär- und Tertiärstruktur der RNA zu stabilisieren, und daher würde erwartet, dass sich die Verfügbarkeit der 2'-OH-Gruppen verringern würde, weil sie vor dem Lösungsmittel, das den Wang-Reaktionspartner beinhaltet, verdeckt sind. Von den Oligonukleotiden, wie Wang sie verwendet, würde erwartet werden, dass sie viel weniger aggregieren, weil Aggregation durch die Sequenzlänge gefördert wird. Im Gegensatz zu mRNA, rRNA und viraler RNA ist es sehr schwierig, Oligonukleotide effizient aus der Lösung zu fällen.

Claims

Verwendung eines mRNA, rRNA oder virale RNA umfassenden Polynukleotids für eine Hybridisierungsreaktion, wobei das Polynukleotid eine Länge von mindestens 1000 Nukleotiden aufweist und wobei ein Teil der Ribose-Ringe des Polynukleotids an der 2'-OH-Position kovalent modifiziert wird.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei die Hybridisierungsreaktion eine Hybridisierung zwischen einer Sonde und einer das Polynukleotid umfassenden Matrize umfasst.
Verwendung nach Anspruch 2, wobei das Polynukleotid eine Mischung von Polynukleotiden umfasst.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei die Hybidisierungsreaktion eine Hybridisierung zwischen einer Matrize und dem Polynukleotid umfasst.
Verwendung nach einem der Ansprüche 2 bis 4, wobei die Sonde oder die Matrize an einer festen Phase fixiert sind.
Verwendung nach Anspruch 5, wobei die feste Phase eine Hybridisierungsmembran, eine Kugel, ein Partikel, eine Scheibe, ein Gel, eine Matrix, einen Filter, eine geätzte Siliziumvorrichtung, einen Reaktionsbehälter, einen Mikrotiterstreifen, ein Rohr, eine Faser oder eine Kapillare umfasst.
Verwendung nach Anspruch 6, wobei die Hybridisierungsreaktion ein Blotting-Verfahren umfasst.
Verwendung nach einem der Ansprüche 2 bis 7, wobei die Sonde oder die Matrize an ein weiteres Molekül oder eine Gruppe von Molekülen angelagert ist.
Verwendung nach einem der Ansprüche 2 bis 8, wobei die Sonde oder die Matrize mit einer Markierung markiert ist.
Verwendung nach Anspruch 9, wobei die Markierung eine fluoreszierende Markierung, eine radioaktive Markierung, ein Enzym, einen Ligand oder eine Anlagerung als Markierung umfasst.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei das Polynukleotid ein Antisense-Mittel umfasst.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei das Polynukleotid eine spezifische Bindungsaffinität zu einem Liganden aufweist und die Hybridisierungsreaktion eine Hybridisierung zwischen dem Polynukleotid und einem den Ligand umfassenden Ziel umfasst.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei die Hybridisierungsreaktion eine Ligase-Kettenreaktion umfasst.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 10, wobei die Hybridisierungsreaktion ein Nuclease-Schutzprüfung umfasst, bei der nicht hybridisiertes Polynukleotid abgebaut wird und das zurückbleibende Polynukleotid analysiert wird.
Verwendung nach Anspruch 5, wobei die feste Phase einen Biochip umfasst.
Verwendung nach Anspruch 5 oder 6, wobei die Sonde fixiert ist und Oligo(dT) umfasst, wodurch die Matrize von Verunreinigungen gereinigt wird.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 10, wobei die Hybridisierungsreaktion eine Genexpressionsanalyse umfasst.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 10 zu einer Diagnose, die auf dem Vorhandensein oder der Abwesenheit einer spezifischen Nukleotid-Sequenz basiert.
Verwendung nach Anspruch 2, wobei die Sonde eine verzweigte DNA-Probe umfasst.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei die Hybridisierung eine in-situ-Hybridisierung umfasst.
Verwendung nach einem der vorangegangenen Ansprüche, wobei die Reaktionsbedingungen so ausgewählt sind, dass mindestens 75 % der Ribose-Ringe an der 2'-OH-Position kovalent modifiziert werden.
Verwendung nach einem der vorangegangenen Ansprüche, wobei die modifizierten Ribose-Ringe an der 2'-OH-Position einen Substituenten OR tragen, wobei R ausgewählt ist aus: C1-C10 Alkyl, C1-C10 Alkenyl, C1-C10 Alkynyl, C1-C10 Haloalkyl, C1-C10 Aminoalkyl, C1-C10 Haloalkoxyalkyl, C1-C10 Aminoalkoxyalkyl, C6-C14 Aryl, C6-C14 Alkylaryl, C6-C14 Arylalkyl, C6-C14 Arylalkenyl, C1-C10 Alkanoyl, C1-C10 Alkenoyl, C1-C10Haloalkanoyl, C1-C10 Dihaloalkanoyl, C1-C10 Trihaloalkanoyl, C2-C10 Haloformylalkanoyl. C1-C10 Aminoalkanoyl, 6-C14 Arylalkanoyl, C6-C14 Arylalkenoyl, C1-C10 Alkoxylalkanoyl, C6-C14 Aryloxyalkanoyl, C6-C14 Alkylarylalkanoyl, C1-C10 Azidoalkanoyl, C1-C10 Carboxyalkanoyl, C1-C10 Carboxyalkenoyl, C1-C10 Carboxyalkynoyl, C6-C14 Haloarylalkanoyl, C6-C14 Aminoarylalkanoyl, C7-C15 Alkylaminoarylalkanoyl, C1-C10 Haloalkenoyl, C1-C10 Haloalkynoyl, C1-C10 Alkylsilanyl, C3-C10 Trialkylsilanyl, C1-C10 Alkoxycarbonyl, C3-C18 Alkylthioalkoxyalkoxycarbonyl, C1-C10 Alkenyloxycarbonyl, C3-C18 Alkoxyalkoxyalkyl, C2-C12 Alkoxyalkyl, C2-C12 Alkylthioalkyl, C1-C10 Alkylsulfonyl, C12-C28 Diarylphosphone; oder ein Substituent R', wobei R' ausgewählt ist aus C1-C10 Alkyl, C1-C10 Alkenyl, C1-C10 Alkynyl, C1-C10 Haloalkyl, C1-C10 Aminoalkyl, Halo, Amino, C1-C10 Alkylamino, C6-C14 Aryl, C6-C14 Alkylaryl, C6-C14 Arylalkyl.
Verwendung nach Anspruch 22, wobei R ausgewählt ist aus: Methyl, Ethyl, Vinyl, Allyl, Ethynyl, 2-Chloroethyl, 2-Aminoethyl, Ethyloxyethyl, Methoxymethyl, Methylthiomethyl, Methoxyethoxymethyl, (2-Chloroethyl)oxyethyl, (2-Aminoethyl)oxyethyl, Phenyl, 4-Methylphenyl, Benzyl, Cinnamyl, Formyl, Acetyl, Propanoyl, Butanoyl, Pentanoyl, Hexanoyl, Heptanoyl, Octanoyl, Nonanoyl, Pivaloyl, Isobutanoyl, Isopentanoyl, Carboxyacetyl, Chloroformylnonanoyl, 3-Carboxypropanoyl, 4-Aminobutanoyl, 4-Chlorobutanoyl, Chloroacetyl, Dichloroacetyl, Trifluoroacetyl, Trichloroacetyl, 3-Azidopropanoyl, 4-Azidobutyryl, Acryloyl, Propionoyl, Crotonoyl, Benzoyl, Diphenylacetyl, Phenoxyacetyl, Methoxyacetyl, Methoxycarbonyl, 2-(Methylthiomethoxy)ethoxycarbonyl, Vinyloxycarbonyl, 4-Methylbenzoyl, 4-Chlorobenzoyl, 2-Methylaminobenzoyl, 2-Aminobenzoyl, 4-Aminobenzoyl, 4-Nitrobenzoyl, Cinnamoyl, Silanyl, Trimethylsilanyl, Triethylsilanyl, Tripropylsilanyl, Triisopropylsilanyl, t-Butyldimethylsilanyl, 2-Chlorophenyl(4-nitrophenyl)phosphono, methylsulfonyl; und R' ausgewählt ist aus Methyl, Ethyl, Vinyl, Allyl, Ethynyl, t-Butyl, 2-Chloroethyl, 2-Aminoethyl, Ethyloxyethyl, Phenyl, Benzyl, Fluoro, Chloro, Bromo, Iodo, Amino.
Verwendung nach einem der vorangegangenen Ansprüche, wobei die mRNA, rRNA oder virale RNA natürlich vorkommt.
Verwendung nach Anspruch 23 oder 24, wobei die mRNA, rRNA oder virale RNA zelluläre RNA umfasst.
Verwendung nach einem der vorangegangenen Ansprüche, wobei das Polynukleotid vor der Hybridisierung einer Deprotektion unterzogen wird.
Verfahren zur Hybridisierung eines Oligo- oder Polynukleotids mit einem modifizierten Polynukleotid umfassend mRNA, rRNA oder virale RNA, wobei das Polynukleotid eine Länge von mindestens 1000 Basen aufweist und wobei ein Teil der Ribose-Ringe des Polynukleotids an der 2'-OH-Position modifiziert wird.
Verfahren nach Anspruch 27, darüber hinaus umfassend, die Gewinnung eines modifizierten Polynukleotids durch (i) die Umsetzung von mRNA, rRNA oder viraler RNA in einem Reaktionsmedium mit einem Reaktionspartner, der in der Lage ist, die 2'-OH-Position der Ribose-Ringe der RNA kovalent zu modifizieren; (ii) die Umsetzung der RNA mit dem Reaktionspartner, um modifiziertes Polynukleotid unter Bedingungen zu produzieren, bei denen eine kovalente Modifizierung eines Teils der 2'-OH-Positionen der Ribose-Ringe erreicht wird; und (iii) wahlweises Abtrennen des modifizierten Polynukleotids vom Reaktionsmedium, wobei das Reaktionsmedium ein organisches Lösungsmittel umfasst.
Verfahren nach Anspruch 27 oder Anspruch 28, wobei der Reaktionspartner so ausgewählt ist, dass die modifizierten Ribose-Ringe an der 2'-OH-Position einen Substituenten OR tragen, wobei R ausgewählt ist aus: C1-C10 Alkyl, C1-C10 Alkenyl, C1-C10 Alkynyl, C1-C10 Haloalkyl, C1-C10 Aminoalkyl, C1-C10 Haloalkoxyalkyl, C1-C10 Aminoalkoxyalkyl, C6-C14 Aryl, C6-C14 Alkylaryl, C6-C14 Arylalkyl, C6-C14 Arylalkenyl, C1-C10 Alkanoyl, C1-C10 Alkenoyl, C1-C10Haloalkanoyl, C1-C10 Dihaloalkanoyl, C1-C10 Trihaloalkanoyl, C2-C10 Haloformylalkanoyl. C1-C10 Aminoalkanoyl, 6-C14 Arylalkanoyl, C6-C14 Arylalkenoyl, C1-C10 Alkoxylalkanoyl, C6-C14 Aryloxyalkanoyl, C6-C14 Alkylarylalkanoyl, C1-C10 Azidoalkanoyl, C1-C10 Carboxyalkanoyl, C1-C10 Carboxyalkenoyl, C1-C10 Carboxyalkynoyl, C6-C14 Haloarylalkanoyl, C6-C14 Aminoarylalkanoyl, C7-C15 Alkylaminoarylalkanoyl, C1-C10 Haloalkenoyl, C1-C10 Haloalkynoyl, C1-C10 Alkylsilanyl, C3-C10 Trialkylsilanyl, C1-C10 Alkoxycarbonyl, C3-C18 Alkylthioalkoxyalkoxycarbonyl, C1-C10 Alkenyloxycarbonyl, C3-C18 Alkoxyalkoxyalkyl, C2-C12 Alkoxyalkyl, C2-C12 Alkylthioalkyl, C1-C10 Alkylsulfonyl, C12-C28 Diarylphosphone; oder ein Substituent R', wobei R' ausgewählt ist aus C1-C10 Alkyl, C1-C10 Alkenyl, C1-C10 Alkynyl, C1-C10 Haloalkyl, C1-C10 Aminoalkyl, Halo, Amino, C1-C10 Alkylamino, C6-C14 Aryl, C6-C14 Alkylaryl, C6-C14 Arylalkyl.
Verfahren nach Anspruch 29, wobei R ausgewählt ist aus: Methyl, Ethyl, Vinyl, Allyl, Ethynyl, 2-Chloroethyl, 2-Aminoethyl, Ethyloxyethyl, Methoxymethyl, Methylthiomethyl, Methoxyethoxymethyl, (2- Chloroethyl)oxyethyl, (2-Aminoethyl)oxyethyl, Phenyl, 4-Methylphenyl, Benzyl, Cinnamyl, Formyl, Acetyl, Propanoyl, Butanoyl, Pentanoyl, Hexanoyl, Heptanoyl, Octanoyl, Nonanoyl, Pivaloyl, Isobutanoyl, Isopentanoyl, Carboxyacetyl, Chloroformylnonanoyl, 3-Carboxypropanoyl, 4-Aminobutanoyl, 4-Chlorobutanoyl, Chloroacetyl, Dichloroacetyl, Trifluoroacetyl, Trichloroacetyl, 3-Azidopropanoyl, 4-Azidobutyryl, Acryloyl, Propionoyl, Crotonoyl, Benzoyl, Diphenylacetyl, Phenoxyacetyl, Methoxyacetyl, Methoxycarbonyl, 2-(Methylthiomethoxy)ethoxycarbonyl, Vinyloxycarbonyl, 4-Methylbenzoyl, 4-Chlorobenzoyl, 2-Methylaminobenzoyl, 2-Aminobenzoyl, 4-Aminobenzoyl, 4-Nitrobenzoyl, Cinnamoyl, Silanyl, Trimethylsilanyl, Triethylsilanyl, Tripropylsilanyl, Triisopropylsilanyl, t-Butyldimethylsilanyl, 2-Chlorophenyl(4-nitrophenyl)phosphono, methylsulfonyl; und R' ausgewählt ist aus Methyl, Ethyl, Vinyl, Allyl, Ethynyl, t-Butyl, 2-Chloroethyl, 2-Aminoethyl, Ethyloxyethyl, Phenyl, Benzyl, Fluoro, Chloro, Bromo, Iodo, Amino.
Verfahren nach Anspruch 29 oder Anspruch 30, wobei der Reaktionspartner ein Säureanhydrid, ein Säurechlorid, eine Carboxylsäure, ein N-Acylimidazol, ein Alkoxyalkyl-Halogenid, ein Alkylthioalkyl-Halogenid, ein Alkoxyalkoxyalkyl-Halogenid, ein Trialkylsilan-Halogenid oder ein Trialkylsilan-Imidazol umfasst.
Verfahren nach Anspruch 31, wobei das Reakionsmedium darüber hinaus einen Acylierungskatalysator umfasst.
Verfahren nach Anspruch 32, wobei die RNA mit dem Säureanhydrid umgesetzt wird und der Acylierungskatalysator einen Fluorid-Ionen- oder Aminopyridin-Katalysator umfasst.
Verfahren nach Anspruch 33, wobei die RNA mit dem Säurechlorid umgesetzt wird und der Acylierungskatalysator einen Aminopyridin-Katalysator umfasst.
Verfahren nach Anspruch 33, wobei die RNA mit N-Acylimidazol umgesetzt wird und der Acylierungskatalysator einen Aminopyridin-Katalysator umfasst.
Verfahren nach Anspruch 32, wobei der Reaktionspartner eine Carboxylsäure in Gegenwart eines Dehydratisierungsmittels oder eines Isocyanid-Katalysators umfasst.
Verfahren nach Anspruch 32, wobei der Acylierungskatalysator 1-Methylimidazol umfasst.
Verfahren nach Anspruch 30 oder Anspruch 31, wobei der Reaktionspartner ein O-Silylierungsmittel umfasst.
Verfahren nach Anspruch 38, wobei die RNA mit dem O-Silylierungsmittel in Gegenwart eines Aminopyridin- oder Lithiumsulfid-Katalysators umgesetzt wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 28 bis 39, wobei das organische Lösungsmittel eine organische Base umfasst.
Verfahren nach Anspruch 40, wobei die organische Base das organische Lösungsmittel ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 28 bis 41, welches zusätzlich ein Reagenz zur Deprotektion umfasst.
Verfahren nach einem der Ansprüche 27 bis 42, wobei das modifizierte Polynukleotid vor der Hybridisierung einer Deprotektion unterzogen wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 27 bis 43, wobei der Reaktionspartner mit einer Markierung markiert ist.
Verfahren nach Anspruch 44, wobei die Markierung eine fluoreszierende Markierung, eine radioaktive Markierung, ein Enzym, einen Ligand oder eine Anlagerung als Markierung umfasst.