DE60006129T2

DE60006129T2 - Verfahren zur reinigung von 2-keto-l-gulonsäure

Info

Publication number: DE60006129T2
Application number: DE60006129T
Authority: DE
Inventors: M. Kevin MOORE
Original assignee: Archer Daniels Midland Co
Current assignee: Archer Daniels Midland Co
Priority date: 1999-08-02
Filing date: 2000-07-31
Publication date: 2004-07-29
Anticipated expiration: 2020-08-01
Also published as: AU777126B2; CN1371384A; EP1203003A1; EP1203003B1; CA2388299A1; AU6392400A; DE60006129D1; US6153791A; EP1203003B8; ATE252592T1; KR20020022789A; WO2001009152A1; JP2003506333A

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren für die Aufreinigung von 2-Keto-L-gulonsäure durch kontinuierliche Flüssigkeitschromatographie unter Verwendung eines schwach basischen Ionenaustauscherharzes.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
2-Keto-L-gulonsäure ist ein signifikantes Zwischenprodukt bei der Herstellung von L-Ascorbinsäure (Vitamin C), einem essentiellen Nährstoff. Während 2-Keto-L-gulonsäure in der Vergangenheit im industriellen Maßstab unter Verwendung der Reichstein-Methode synthetisiert wurde (Helvetica Chimica Acta 17:311 (1934)), sind Fermentationsverfahren unter Zuhilfenahme eines oder mehrerer Mikroorganismen zur kommerziellen Produktion von 2-Keto-L-gulonsäure bevorzugt. US-Patent Nr. 2,421,611 offenbart beispielsweise ein Verfahren, welches mikrobielle Oxidation von D-Glukose zu 5-Keto-D-gluconsäure involviert, gefolgt von chemischer oder mikrobieller Reduktion zu L-Idonsäure und anschließend mikrobielle Oxidation zu 2-Keto-L-gulonsäure. Die japanischen Patentveröffentlichungsnummern 39-14493, 53-25033, 56-15877 und 59-35290, offenbaren beispielsweise ähnliche Verfahren, welche die mikrobielle Oxidation von D-Glukose zu 2,5-Diketo-D-gulonsäure gefolgt von mikrobieller oder chemischer Reduktion zu 2-Keto-L-gulonsäure einschließen. Enzymatische Herstellungsverfahren, welche die Oxidation von L-Sorbose zu 2-Keto-L-gulonsäure über ein Sorboson-Intermediat einschließen, sind ebenfalls entwickelt worden und verwenden Gluconobacter oxydans (US-Patent Nr. 4,935,359; 4,960,695; und 5,312,741), Pseudogluconobacter saccharoketogenes (US-Patent Nr. 4,877,735), Pseudomonas sorbosoxidans (US-Patent Nr. 4,933,289 und 4,892,823) und Mischungen von Mikroorganismen (US-Patent Nr. 3,912,592; 3,907,639 und 3,234,105).
Vor der Umwandlung in Ascorbinsäure muss 2-Keto-L-gulonsäure jedoch zunächst aus der Fermentationsbrühe isoliert werden. Wie in US-Patent Nr. 4,990,441 beispielsweise beschrieben wird, kann 2-Keto-L-gulonsäure aus einer Fermentationsbrühe durch ein Verfahren, umfassend die Schritte von (a) Entfernen von unlöslichem Material aus der Brühe durch Zentrifugation, Filtration in Gegenwart eines ausfällenden Agens, oder Ultrafiltration; (b) Entfernen anorganischer Kationen durch Ansäuern; und (c) Isolieren der 2-Keto-L-gulonsäure durch Kristallisation, gewonnen werden.
US-Patent Nr. 5,202,476 beschreibt als einen zusätzlichen Reinigungsschritt vor der Kristallisation die Entfernung von Säureverunreinigungen aus der Fermentationsbrühe durch deren Adsorption an ein Anionenaustauscherharz.
Hohe Ausbeuten der 2-Keto-L-gulonsäure sind mit diesen Methoden jedoch schwierig zu erhalten, da 2-Keto-L-gulonsäure eine hohe Löslichkeit in der Kristallisationsmutterlösung aufweist.
Darüber hinaus schließt die Umwandlung zu Ascorbinsäure entsprechend dem Verfahren, welches in US-Patent Nr. 5,391,771 beschrieben ist, die Herstellung des Methylesters von 2-Keto-L-gulonsäure durch Reaktion mit Methanol mit ein. Diese Esterbildungsreaktion involviert ein Gleichgewicht zwischen der freien Säureform und dem Methylester von 2-Keto-L-gulonsäure und erfordert daher substantiell wasserfreie Bedingungen, um ausreichende Ausbeuten des gewünschten Produkts für die kommerzielle Anwendung sicherzustellen.
Dementsprechend besteht weiterhin ein Bedürfnis für ein Verfahren zur Wiedergewinnung von 2-Keto-L-gulonsäure aus wässrigen Lösungen, wie z.B. Fermentationsbrühen, in hohen Ausbeuten.
Verfahren für die Entfernung von Säuren aus wässrigen Medien sind unter Verwendung von anionischem Austauscherharz entwickelt worden. Solche Verfahren sind beispielsweise in US-Patent Nr. 5,278,339 (Cyclohexandicarbonsäuren) und 4,323,702 (Carboxylsäuren wie z.B. Adipinsäure) und in der internationalen Veröffentlichungsnummer WO 92/16490 (Zitronensäure) beschrieben. In all diesen Verfahren wird die gewünschte Säure zunächst auf einer anionischen Säule bis zu einem Maximalwert adsorbiert (welche durch Messen der Veränderung in der Konzentration von Säure in dem Effluenten während der Beladung bestimmt wird) und in der Folge mit einem Agens, welches die anionische Säure regeneriert, desorbiert. Diese Verfahren sind generell jedoch nicht geeignet für die Wiedergewinnung von 2-Keto-L-gulonsäure aus wässrigen Lösungen, da der Wassergehalt der gewonnenen 2-Keto-L-gulonsäure tendenziell zu hoch für die folgende Esterbildung ohne zusätzliche Reinigungsschritte ist.
Dementsprechend besteht nach wie vor ein Bedürfnis für ein Verfahren zur Wiedergewinnung von 2-Keto-L-gulonsäure aus wässrigen Lösungen, wie z.B. Fermentationsbrühen, in substanziell wasserfreier Form.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Es ist daher eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, Verfahren zum Aufreinigen von 2-Keto-L-gulonsäure in hohen Ausbeuten zur Verfügung zu stellen. Andere Aufgaben, Merkmale und Vorteile der vorliegenden Erfindung werden in der detaillierten Beschreibung von bevorzugten Ausführungsformen im Folgenden dargestellt und werden im Einzelnen durch die Beschreibung offenbart oder können durch Ausführen der Erfindung gelernt werden.
Diese Aufgaben und Vorteile der Erfindung mit Hilfe der Methoden, welche besonders in der niedergeschriebenen Beschreibung und den Ansprüchen dazu aufgezeigt werden, werden realisiert und umgesetzt.
Diese und andere Aufgaben werden durch die Verfahren der vorliegenden Erfindung erfüllt, welche in einer ersten Ausführungsform allgemein auf ein Verfahren zur Aufreinigung von 2-Keto-L-gulonsäure mit Hilfe eines kontinuierlichen Chromatographieprozesses unter Verwendung eines schwach basischen Ionenaustauscherharzes gerichtet sind. Andere bevorzugte Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung werden in genauerem Detail unten beschrieben.
KURZE BESCHREIBUNG DER FIGUREN
1 ist ein Diagramm, welches die Aufreinigung von 2-Keto-L-gulonsäure wie in Beispiel 1 beschrieben, zeigt.
2 ist ein Diagramm, welches die Reinigung von 2-Keto-L-gulonsäure wie in Beispiel 2 beschrieben, zeigt.
3 ist ein Diagramm, welches die Reinigung von 2-Keto-L-gulonsäure wie in Beispiel 3 beschrieben, zeigt.
4 ist ein Diagramm des kontinuierlichen Chromatographiesystems, welches in Beispiel 6 eingesetzt wird.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG VON BEVORZUGTEN AUSFÜHRUNGSFORMEN DER ERFINDUNG
In einer ersten bevorzugten Ausführungsform ist die vorliegende Erfindung gerichtet auf ein Verfahren für die Aufreinigung von 2-Keto-L-gulonsäure unter Verwendung eines kontinuierlichen Chromatographiesystems, welches eine Vielzahl von Kammern aufweist. Jede Kammer der Vielzahl von Kammern beinhaltet teilweise feste Materie und hat einen Einlass für den Flüssigkeitseintritt in die Kammer und einen Auslass für den Flüssigkeitsaustritt aus der Kammer.
Das erfinderische Verfahren umfasst bevorzugt die folgenden Schritte:

(a) Einführen einer wässrigen Lösung enthaltend 2-Keto-L-gulonsäure in eine Vielzahl von Kammern durch den Einlass der Kammer, so dass die wässrige Lösung den Feststoff, enthaltend in der Kammer kontaktiert und dann die Kammer durch den Auslass verlässt;
(b) Einführen eines Lösungsmittels in die Kammer durch deren Einlass in derselben Art und Weise wie die wässrige Lösung in Schritt (a) (d.h. so dass die wässrige Lösung das Feststoffmaterial enthaltend in der Kammer kontaktiert und dann diese durch ihren Auslass verlässt);
(c) Leiten der wässrigen Lösung, welche die Kammer durch ihren Auslass verlässt, zu einer zweiten Kammer;
(d) Sammeln des Lösungsmittels, welche die Kammer durch ihren Auslass verlässt;
(e) Einführen der wässrigen Lösung in die zweite Kammer durch deren Einlass in derselben Art und Weise wie für die erste Kammer (d.h. so dass die wässrige Lösung das Feststoffmaterial enthaltend in der Kammer kontaktiert und diese dann durch ihren Auslass verlässt); und
(f) Wiederholung der Schritte (b)–(e) für jede Kammer der Vielzahl von Kammern.

In einer alternativen Ausführungsform wird das Lösungsmittel in Schritt (d) nicht gesammelt, sondern wird alternativ direkt in die zweite Kammer der Vielzahl von Kammern durch ihren Einlass folgend Schritt (f) eingeführt. Gemäß dieser alternativen Ausführungsform des erfinderischen Verfahrens, wird das Lösungsmittel gesammelt, nachdem es die letzte der Vielzahl von Kammern verlassen hat, d.h. nach Abschluss der Schritte (b)–(e) für alle Kammern der Vielzahl von Kammern oder nach Abschluss von jedem intermediären Zyklus, d.h. nachdem die Schritte (b)–(e) für eine bestimmte Anzahl der Vielzahl von Kammern abgeschlossen worden sind, und nicht nachdem die Schritte (b)–(e) für jede Kammer abgeschlossen sind.
Nachdem das Lösungsmittel enthaltend 2-Keto-L-gulonsäure eingesammelt worden ist, kann 2-Keto-L-gulonsäure gemäß konventionellem Verfahren isoliert und gewonnen werden.
Das Lösungsmittel, welche in diesem erfinderischem Verfahren verwendet wird, kann jedes Lösungsmittel, welches die selektive Aufreinigung von 2-Keto-L-gulonsäure aus einer wässrigen Lösung erlaubt, sein. Geeignete Lösungsmittel können empirisch von den Fachleuten bestimmt werden. Bevorzugt ist das Lösungsmittel Wasser oder ein niedriger Alkohol, wie z.B. Methanol oder Ethanol.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform des erfinderischen Verfahrens wird das verwendete Lösungsmittel zum Teil aufgrund seiner Eignung für die Verwendung in der nachfolgenden Umwandlung der 2-Keto-L-gulonsäure zu Ascorbinsäure ausgewählt. Zum Beispiel schließt die Umwandlung von 2-Keto-L-gulonsäure zu Ascorbinsäure gemäß des Verfahrens, welches in US-Patent Nr. 5,391,771 beschrieben wird, die Herstel lung des Methylesters von 2-Keto-L-gulonsäure durch Reaktion der freien Säure mit Methanol ein. In einer solchen Ausführungsform des erfinderischen Verfahrens ist das verwendete Lösungsmittel bevorzugt Methanol, noch mehr bevorzugt wasserfreies Methanol.
Die wässrige Lösung von Schritt (a) (d.h. die Lösung, von welcher 2-Keto-L-gulonsäure isoliert wird) ist typischerweise, jedoch nicht immer, eine Fermentationsbrühe, welche durch Kultivierung von einem oder mehreren Mikroorganismen, welche 2-Keto-L-gulonsäure und/oder eine Vorläuferform davon produzieren, produziert wird. Zusätzlich zu Wasser enthalten solche Fermentationsbrühen generell die Nährstoffe, welche für den (die) Mikroorganismus (Mikroorganismen), welcher) für die Herstellung von 2-Keto-L-gulonsäure eingesetzt (wird) werden, nötig sind einschließend, aber nicht begrenzt auf, Aminosäuren, anorganische und/oder organische Salze, Kohlenhydrate, und verschiedene Vitamine und Wachstumsfaktoren.
Bevorzugt wird die Fermentationsbrühe zunächst filtriert, um Biomasse und andere unlösliche Verunreinigungen zu entfernen und/oder mit aktivierter Aktivkohle zur Farbentfernung vor Schritt (a) des erfinderischen Verfahrens behandelt. Es wurde festgestellt, dass die Wiedergewinnung von 2-Keto-L-gulonsäure verbessert wird, wenn die Fermentationsbrühe filtriert und/oder mit Aktivkohle vor Schritt (a) des erfinderischen Verfahrens oben behandelt wird.
Neben Fermentationsbrühen kann 2-Keto-L-gulonsäure auch aus jeder anderen wässrigen Lösung, welche 2-Keto-L-gulonsäure enthält, unter Verwendung des Verfahrens der vorliegenden Erfindung aufgereinigt werden.
Die Aufreinigung von 2-Keto-L-gulonsäure gemäß des erfinderischen Verfahrens wird verbessert, wenn die 2-Keto-L-gulonsäure in der Form der freien Säure und nicht als ein Salz vorliegt. Dementsprechend wird eine erhebliche Menge jeglicher Art von Kationen, welche in der wässrigen Lösung enthaltend 2-Keto-L-gulonsäure enthalten sein können (wie z.B. diejenigen, welche für die Kontrolle des pH's während der Fermentation eingesetzt werden), bevorzugt aus der wässrigen Lösung vor der chromatografischen Auftrennung der vorliegenden Erfindung entfernt.
Die Entfernung von Kationen aus der wässrigen Lösung kann unter Verwendung der Verfahren und Techniken, welche für die Fachleute bekannt und verfügbar sind, ergänzt werden. Illustrative Beispiele von geeigneten Verfahren schließen Fällung von Kalziumionen unter Verwendung von Schwefelsäure und die Verwendung von stark sauren Kationenaustauscherharzen (in ihrer protonierten Form) ein.
Das erfinderische Verfahren wird bevorzugt unter Verwendung eines kontinuierlichen chromatographischen Systems durchgeführt, wie beispielsweise derjenigen, welche z.B. in US-Patent Nr. 4,522,726, US-Patent Nr. 4,764,276, US-Patent Nr. 4,808,317 und US-Patent Nr. 5,069,883 beschrieben werden. Illustrative Beispiele solcher Systeme sind kommerziell von Advanced Separation Technologies Inc. (Lakeland, Florida, USA) erhältlich.
Die kontinuierlichen chromatographischen Systeme, welche zur Durchführung des erfinderischen Verfahrens nützlich sind, umfassen eine Vielzahl von Kammern, wobei jede einen Einlass für Flüssigkeit und einen Auslass für Flüssigkeit aufweist. Diese Systeme sind generell so angeordnet und geleitet, dass die Flüssigkeit, welche einen Auslass von einer der Vielzahl von Kammern verlässt, isoliert (und gesammelt) werden kann oder direkt in den Einlass der nächstfolgenden Kammer der Vielzahl eingeleitet werden kann.
Jede Kammer des Systems enthält eine geeignete Menge eines geeigneten Feststoffmaterials. Das Feststoffmaterial ist bevorzugt ein schwach basisches Ionenaustauscherharz.
Das besonders schwach basische Ionenaustauscherharz, welches als das Feststoffmaterial verwendet wird, kann empirisch unter den Anionenaustauscherharzen ausgewählt werden, welche dem Fachmann bekannt sind, basierend auf seiner Affinität für 2-Keto-L-gulonsäure, d.h., das Harz sollte eine genügend hohe selektive Affinität für 2-Keto-L-gulonsäure aufweisen, um die Wiedergewinnung der gewünschten Menge und/oder der gewünschten Reinheit von 2-Keto-L-gulonsäure aus der wässrigen Lösung, in der sie enthalten ist, zu ermöglichen.
Bevorzugt umfasst das schwach basische Ionenaustauscherharz ein Ionenaustauscherharz, welches Pyridinfunktionalität aufweist. Noch mehr bevorzugt ist das schwach basi sche Ionenaustauscherharz ein Polymer, umfassend Vinylpyridinreste, wie z.B. Poly-2-vinylpyridin oder Poly-4-vinylpyridin.
Geeignete schwach basische Ionenaustauscherharze sind bevorzugt zumindest zu ungefähr 2 % quervernetzt, mehr bevorzugt zu ungefähr 8 %, mit einem geeigneten Quervernetzungsagens wie z.B. Divinylbenzen. Illustrative Beispiele von geeigneten Ionenaustauscherharzen dieses Typus umfassen solche aus der REILLEX^TM Serie (verfügbar von Reilley Industries, Indianapolis, Indiana, USA), welche zu 2 % oder zu 25 % quervernetzt sind und sich durch gute thermale Stabilität auszeichnen.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist das Ionenaustauscherharz ein Poly-4-vinylpyridinharz, wie z.B. REILLEX^TM HP.
Eine kleine Menge der enthaltenen Pyridinreste kann optional, z.B. zu Pyridin-N-oxid oder quaternären Salzresten, derivatisiert werden, falls dies gewünscht wird, um die Basizität des Harzes geeignet zu modifizieren.
Das Ionenaustauscherharz kann in jeglicher Form, welche dem Fachmann bekannt ist, wie z.B. in Form von Beads oder Gelen, und einer besonderen Form, empirisch ausgewählt werden. Bevorzugt liegt das Ionenaustauscherharz in Form von Beads einer geeigneten Größe, wie z.B. 20 oder 60 mesh vor.
Die speziellen Chromatographiebedingungen, welche in dem erfinderischen Verfahren eingesetzt werden, wie z.B. Temperatur und Flussrate der mobilen Phase(n) (d.h. die wässrige Lösung, das Solvens, und, wenn optional vorhanden, die ionische Lösung) kann empirisch auf der Basis der gewünschten Ausbeute und/oder Reinheit der 2-Keto-L-gulonsäure bestimmt werden. Die entsprechende Temperatur und Flussrate einer jeden mobilen Phase kann unabhängig bestimmt werden und kann gleich oder verschieden von der Temperatur und/oder Flussrate von jeder anderen mobilen Phase (allen anderen mobilen Phasen) sein.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird die Ionenaustauscherfähigkeit des Feststoffmaterials regeneriert, nachdem das Lösemittel die Kammer verlassen hat. In solch einer Ausführungsform umfasst das erfinderische Verfahren des weiteren die Schritte von:

(d') Einführen einer ionischen Lösung in die Kammer durch ihren Einlass, so dass die ionische Lösung das Feststoffmaterial, welches in der Kammer enthalten ist, kontaktiert und dann die Kammer durch ihren Auslass verlässt.

Dieser optionale Schritt ist besonders bevorzugt, wenn die alternative Ausführungsform des erfinderischen Verfahrens wie oben beschrieben eingesetzt wird, d.h. das erfinderische Verfahren, in welchem das Lösungsmittel nicht nach dem Verlassen einer jeden Kammer gesammelt wird, sondern direkt in die nächstfolgende Kammer der Vielzahl von Kammern eingeführt wird.
Jede ionische Lösung, welche die Ionenaustauscherfähigkeit des Feststoffmaterials regeneriert, kann verwendet werden. Bevorzugt ist die ionische Lösung eine basische Lösung, mehr bevorzugt eine schwach basische Lösung, wie z.B. 1 %iges Natriumhydroxid.
Die folgenden Beispiele sind nur für Zwecke der Illustration und nicht dazu gedacht, den Umfang der Erfindung, wie er durch die beigefügten Ansprüche definiert ist, zu begrenzen.
BEISPIEL 1: ERZEUGUNG VON AUSGANGSMATERIAL FÜR DAS VERFAHREN
Eine Fermentationsbrühe, welche 70 g/l 2-Keto-L-gulonsäure, 15 g/l Sorbose (unkonvertiertes Startmaterial) und 132 g/l vollständig trockenes Feststoffmaterial umfasste, wurde verwendet. 26,6 l von der Brühe wurden ultrafiltriert, um Biomasse und andere unlösliche Verunreinigungen zu entfernen, und nach der Diafiltration wurden 32,3 l an Permeat erhalten (enthaltend 55 g/l 2-Keto-L-gulonsäure und 92 g/l vollständig trockene Feststoffmaterialien).
Das Permeat wurde über ein stark kationisches Harz in der protonierten Form geleitet, um 2-Keto-L-gulonsäuresalze vollständig in die freie Säureform überzuführen, wodurch 58 l von 30 g/l 2-Keto-L-gulonsäure unter Entfernung von 96 % an Kationen erhalten wurden. Die resultierende Lösung wurde mit Aktivkohle zur Entfernung von Farbe behandelt und filtriert. Die Lösung wurde dann auf eine 2-Keto-L-gulonsäurekonzentration von 130 g/l eingedampft, mit 190 g/l an vollständig trockenen Feststoffen und 30 g/l Sorbose.
BEISPIEL 2: 2-KETO-L-GULONSÄURE-AUFREINIGUNG MIT METHANOL BEI RAUM-TEMPERATUR
70 ml von REILLEX^TM HP Harz (verfügbar von Reilley Industries, Indianapolis, Indiana) wurden in eine Glassäule mit 1,27 cm (1/2") Durchmesser eingefüllt. Das Harz wurde mit 500 ml deionisiertem Wasser und anschließend mit 500 ml wasserfreiem Methanol gewaschen. 10 ml der Lösung, welche in Beispiel 1 hergestellt wurde, wurden auf die Säule aufgetragen. Eine Pumpe, welche am Säulenboden Unterdruck erzeugte, wurde bei 3,0 ml/min betrieben. Wenn der Flüssigkeitsstand der Probe am oberen Ende der Säule das obere Ende des Harzes erreichte, wurde Methanolzufuhr zur Säule ermöglicht. 9,0 ml Proben wurden unter Verwendung eines automatischen Probensammlers eingesammelt, welcher alle 3 Minuten weiterswitchte. Insgesamt wurden 50 Proben gesammelt und hinsichtlich 2-Keto-L-gulonsäure, Wasser, trockenen Festsubstanzen und Sorbose analysiert.
Die Ergebnisse sind in 1 dargestellt. Wie man aus diesem Diagramm sehen kann, wurden Wasser und Sorbose in den Proben 5–10 gesammelt, mit ungefähr 4 % 2-Keto-L-gulonsäure, während 2-Keto-L-gulonsäure in den Proben 15–50 gesammelt wurde, welche frei an Sorbose und in ihrem Wassergehalt niedriger als 0,5 % waren. Die Wiedergewinnung in den Proben 15–50 betrug 96 % bei einer Reinheit auf trockener Basis von 88 %.
BEISPIEL 3: AUSWIRKUNG DER TEMPERATUR AUF DIE AUFREINIGUNG VON 2-KETO-L-GULONSÄURE UNTER VERWENDUNG VON METHANOL
Beispiel 2 wurde wiederholt, außer der Tatsache, dass die Temperatur in der Ummantelung der Säule und des Methanolvorratsbehälters auf 50°C kontrolliert wurde. Die Ergebnisse sind in 2 dargestellt. Die Wiedergewinnung von 2-Keto-L-gulonsäure betrug 96 %.
Die Daten, welche aus Beispiel 2 und 3 erhalten wurden, legen nahe, dass für die Wiedergewinnung von 2-Keto-L-gulonsäure mit Methanol die Abtrennung (und damit einhergehend die Reinheit) am besten bei Raumtemperatur stattfindet, während das Eluieren von höheren 2-Keto-L-gulonsäure-Konzentrationen am besten bei höheren Temperaturen erscheint.
BEISPIEL 4: 2-KETO-L-GULONSÄURE-AUFREINIGUNG MIT HEIßEM WASSER
Beispiel 2 wurde wiederholt außer der Tatsache, dass Wasser als das Eluant verwendet wurde und die Temperatur in der Ummantelung der Säule und des Wasservorratsbehälters auf 95°C kontrolliert wurde. Die Ergebnisse sind in 3 dargestellt.
BEISPIEL 5: VERGLEICHSBEISPIEL
Ein Verfahren ähnlich zu demjenigen, welches in US-Patent Nr. 4,323,702 beschrieben ist, wurde durchgeführt, d.h., dass die Säure (2-Keto-L-gulonsäure) wird auf ein Polymer absorbiert und dann desorbiert.
100 ml von REILLEX^TM HP Harz wurden in eine Säule mit 2,54 cm (1") Durchmesser eingefüllt. 500 ml von einer 98 g/l 2-Keto-L-gulonsäure-Lösung wurden über das Harz geleitet bei einer Durchsatzmenge von 8 ml/min und bei Raumtemperatur. 100 ml von deionisiertem Wasser wurden dann verwendet, um das Harz zu waschen, und die Säule wurde anschließend geleert, wobei 26 ml Leervolumen an Wasser auftraten. Die gesamten 626 ml an Lösung, Spül- und Abflussflüssigkeit wurden analysiert und wiesen 60 g/l von 2-Keto-L-gulonsäure auf, resultierend in 11,5 g 2-Keto-L-gulonsäure, welche auf dem Harz beladen blieb.
500 ml von wasserfreiem Methanol wurden zur Eluierung verwendet, resultierend in einem Produkt von 22 g/l 2-Keto-L-gulonsäure (oder 11 g), worin jedoch auch 9,7 Gew.-% an Wasser enthalten waren.
BEISPIEL 6: 2-KETO-L-GULONSÄURE-AUFREINIGUNG UNTER VERWENDUNG VON KONTINUIERLICHER CHROMATOGRAPHIE
Ein kontinuierliches Chromatographiesystem (AST Modell C-90 CSEP; von Advanced Separation Technologies Inc., Lakeland, Florida, USA) wurden zur Wiedergewinnung von 2-Keto-L-gulonsäure aus einer Fermentationsbrühe, gewonnen in Methanol, verwendet.
Das System wurde, wie in 4 gezeigt, geleitet. Zwölf Säulen wurden mit 160 ml jeweils mit Reilley HP Polyvinylpyridinharz beladen und in dem System befestigt. Diese Säulen wurden reihum rotiert, so dass die nächste Position alle 16 Minuten eingenommen wurde, und ein kompletter Umlauf 192 Minuten dauerte.
Wasserfreies Methanol wurde in Position 12 mit einer Rate von 31,2 ml/min eingepumpt, Ausgangslösung (hergestellt wie in Beispiel 1 oben) wurde in Position 4 mit einer Rate von 6,5 ml/min eingepumpt und das gewünschte Produkt wurde an Position 8 mit einer Rate von 19,8 ml/min abgepumpt, woraus ein Abwasserfluss an Position von 17,2 ml/min resultierte.
Eine 1 %ige Natriumhydroxidlösung wurde zur kontinuierlichen Regenerierung des Harzes bei Position 1 (Fließrate 9 ml/min) verwendet. Ein 70°C heißes Sprühwasser auf die Säulen wurde an den Positionen 8–12 verwendet, um die Temperatur dort zu erhöhen.
Die Ausgangslösung beinhaltete 229 g/l von 2-Keto-L-gulonsäure. Nach einem vollständigen Umlauf des kontinuierlichen Chromatographiesystems wurden Produkt und Abwasserproben durch Sammeln von jeweils 5 vollständigen Umläufen entnommen. Der Produkttiter war 72 g/l an 2-Keto-L-gulonsäure, 1,2 % Wasser und 88 % Gesamtreinheit. Der Abflusstiter aus Position 2 war 1,1 g/l an 2-Keto-L-gulonsäure und aus Position 1 7,2 g/l an 2-Keto-L-gulonsäure. Gesamtausbeute an 2-Keto-L-gulonsäure aus der Abtrennung war ungefähr 94 %.

Claims

Verfahren zur Reinigung von 2-Keto-L-gulonsäure unter Verwendung einer Vielzahl von Kammern, wobei jede Kammer der genannten Vielzahl von Kammern einen festen partikulären Stoff enthält und einen Einlass und einen Auslass aufweist, und wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfasst: (a) Einführen einer wässrigen Lösung, welche 2-Keto-L-gulonsäure enthält, in eine der Kammer der genannten Vielzahl von Kammern durch deren genannten Einlass, so dass die genannte wässrige Lösung das genannte feste partikuläre Material darin kontaktiert und dann durch den genannten Auslass der Kammer austritt; (b) Einführen eines Lösemittels bzw. Fließmittels in die genannte Kammer durch deren genannten Einlass, so dass die genannte wässrige Lösung das genannte feste partikuläre Material darin kontaktiert und dann durch den genannten Auslass der Kammer austritt; (c) Führen der genannten wässrigen Lösung, welche aus der genannten Kammer durch deren Auslass austritt, in eine weitere Kammer der genannten Vielzahl von Kammern; (d) Auffangen des genannten Lösemittels bzw. Fließmittels, welches aus der genannten Kammer durch deren genannten Auslass austritt; (e) Einführen der genannten wässrigen Lösung in die genannte weitere Kammer von der genannten Vielzahl von Kammern durch deren Einlass, so dass die genannte wässrige Lösung das genannte feste partikuläre Material darin kontaktiert und dann durch den genannten Auslass der Kammer austritt; und (f) Wiederholen der Schritte (b)–(e) für jede Kammer der genannten Vielzahl von Kammern.
Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei der genannte feste partikuläre Stoff ein schwach basisches Ionenaustauschharz ist.
Verfahren gemäß Anspruch 2, wobei das genannte schwach basische Ionenaustauschharz ein anionisches Harz ist, welches Pyridinfunktionalität aufweist.
Verfahren gemäß Anspruch 3, wobei das genannte anionische Harz, welches Pyridinfunktionalität aufweist, ein Polymer ist, welches Reste von Vinylpyridin umfasst.
Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei das genannte Lösemittel bzw. Fließmittel Methanol ist.
Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei das genannte Lösemittel bzw. Fließmittel Wasser ist.
Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei die genannte wässrige Lösung eine Fermentationsflüssigkeit ist.
Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei die Temperatur des genannten Lösemittels bzw. Fließmittels während mindestens einer Wiederholung der Schritte (b)–(e) erhöht ist.
Verfahren gemäß Anspruch 1, welches weiterhin den folgenden Schritt umfasst: (d') Einführen einer ionischen Lösung in die genannte Kammer durch deren genannten Einlass, so dass die genannte ionische Lösung das genannte feste partikuläre Material darin kontaktiert und dann aus der genannten Kammer durch deren genannten Auslass austritt.
Verfahren zur Reinigung von 2-Keto-L-gulonsäure unter Verwendung einer Vielzahl von Kammern, wobei jede Kammer der genannten Vielzahl von Kammern ei nen festen partikulären Stoff enthält und einen Einlass und einen Auslass aufweist, und wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfasst: (a) Einführen einer wässrigen Lösung, welche 2-Keto-L-gulonsäure enthält, in eine der Kammer der genannten Vielzahl von Kammern durch deren genannten Einlass, so dass die genannte wässrige Lösung das genannte feste partikuläre Material darin kontaktiert und dann durch den genannten Auslass der Kammer austritt; (b) Einführen eines Lösemittels bzw. Fließmittels in die genannte Kammer durch deren genannten Einlass, so dass die genannte wässrige Lösung das genannte feste partikuläre Material darin kontaktiert und dann durch den genannten Auslass der Kammer austritt; (c) Führen der genannten wässrigen Lösung, welche aus der genannten Kammer durch deren Auslass austritt, in eine weitere Kammer der genannten Vielzahl von Kammern; (d) Führen des genannten Lösemittels bzw. Fließmittels, welches aus der genannten Kammer durch deren genannten Auslass austritt, in eine weitere Kammer der genannten Vielzahl von Kammern; (e) Einführen der genannten wässrigen Lösung in die genannte weitere Kammer von der genannten Vielzahl von Kammern durch deren Einlass, so dass die genannte wässrige Lösung das genannte feste partikuläre Material darin kontaktiert und dann durch den genannten Auslass der Kammer austritt; (f) Einführen der genannten Lösemittellösung in die genannte weitere Kammer der genannten Vielzahl von Kammern durch deren genannten Einlass, so dass das genannte Lösungsmittel bzw. Fließmittel das genannte feste partikuläre Material darin kontaktiert und dann durch den genannten Auslass der Kammer austritt; und (g) Wiederholen der Schritte (b)–(f) für jede Kammer der genannten Vielzahl von Kammern.
Verfahren gemäß Anspruch 10, wobei der genannte feste partikuläre Stoff ein schwach basisches Ionenaustauschharz ist.
Verfahren gemäß Anspruch 11, wobei das genannte schwach basische Ionenaustauschharz ein anionisches Harz ist, welches Pyridinfunktionalität aufweist.
Verfahren gemäß Anspruch 12, wobei das genannte anionische Harz, welches Pyridinfunktionalität aufweist, ein Polymer ist, welches Reste von Vinylpyridin umfasst.
Verfahren gemäß Anspruch 10, wobei das genannte Lösemittel bzw. Fließmittel Methanol ist.
Verfahren gemäß Anspruch 10, wobei das genannte Lösemittel bzw. Fließmittel Wasser ist.
Verfahren gemäß Anspruch 10, wobei die genannte wässrige Lösung eine Fermentationsflüssigkeit ist.
Verfahren gemäß Anspruch 10, wobei die Temperatur des genannten Lösemittels während mindestens einer Wiederholung der Schritte (b)–(f) erhöht ist.
Verfahren gemäß Anspruch 10, welches weiterhin den folgenden Schritt umfasst: (d') Einführen einer ionischen Lösung in die genannte Kammer durch deren genannten Einlass, so dass die genannte ionische Lösung das genannte feste partikuläre Material darin kontaktiert und dann aus der genannten Kammer durch deren genannten Auslass austritt.