DE3536745C2

DE3536745C2 -

Info

Publication number: DE3536745C2
Application number: DE3536745A
Authority: DE
Inventors: Geza Dr. Takacsi Nagy; Gabor Dr. Szepesi; Maria Dr. Gazdag; Geb. Sziklay Zsofia Pap; Kalman Dr. Budapest Hu Burger
Original assignee: Richter Gedeon Vegyeszeti Gyar RT
Current assignee: Richter Gedeon Vegyeszeti Gyar Nyrt
Priority date: 1984-10-16
Filing date: 1985-10-15
Publication date: 1992-01-23
Also published as: ES547862A0; AU580342B2; LU86115A1; DE3536745A1; US4684638A; CA1272192A; FI84134B; CH667459A5; FR2571724B1; IN162910B; DK472085D0; NL192779C; BE903447A; LV5175A3; ATA297985A; GB8525360D0; ZA857905B; SU1706372A3; CN85107053A; GB2165540A

Description

Die Erfindung betrifft neue Arzneimittelpräparate, die mit Zink, Calcium, Magnesium, Kobalt, Eisen oder Nickel gebildete Metallkomplexe von bis-Indolverbindungen oder deren therapeutisch akzeptierbare Salze in wäßrigem Milieu in stabiler Form enthalten. Diese Arzneimittelpräparate haben eine wesentlich bessere Stabilität als die bis-Indolverbindungen in wäßriger Lösung enthaltenden Präparate. Gegenstand der Erfindung sind weiterhin die mit Zink, Calcium, Magnesium, Kobalt, Eisen oder Nickel gebildeten Metallkomplexe oder deren therapeutisch akzeptierbaren Salze und deren Herstellung.

Die ersten bekannten Verbindungen mit bis-Indolgerüst waren in der Natur vorkommende Alkaloide. Von ihnen wurde zuerst das Vinblastin (VLB) aus der Pflanze Vinca rosea L. isoliert (US-Patentschrift Nr. 30 97 137). Darauf folgten einige weitere natürliche Verbindungen, so die Isolierung des Leurosin (Leu) und des Vinkristin (VCR) (US-Patentschriften Nr. 33 70 057 bzw. 32 05 220), dann die Herstellung von weiteren synthetischen Derivaten. Die Forschung wurde dadurch angeregt, daß innerhalb dieser Verbindungsfamilie Verbindungen mit hervorragender Anti-Geschwulst- Wirkung gefunden wurden. Die Rolle der bekannten bis-Indolalkaloide in der Geschwulsttherapie berücksichtigend können zwei vorteilhafte Gruppen der Verbindungen unter der allgemeinen Formel (I)

zusammengefaßt werden. In der Formel bedeutet:
R¹ eine Methylgruppe,
R² ein Wasserstoffatom,
R³ eine Hydroxylgruppe oder
R² und R³ zusammen eine Valenzbindung,
R⁴ eine Hydroxyl- oder Acetoxygruppe und
R⁵ eine Methoxy- oder Aminogruppe;
oder:
R¹ eine Formylgruppe,
R² ein Wasserstoffatom,
R³ eine Hydroxylgruppe oder
R² und R³ zusammen eine Epoxygruppe,
R⁴ ein Wasserstoffatom oder eine Acetoxygruppe und
R⁵ eine Methoxygruppe.

Von den unter der allgemeinen Formel (I) zusammengefaßten, als R¹ eine Methylgruppe enthaltenden Verbindungen besitzt in bezug auf die therapeutische Wirkung das Vinblastin (VLB) herausragende Bedeutung; in seiner Formel steht
R² für ein Wasserstoffatom,
R³ für eine Hydroxylgruppe,
R⁴ für eine Acetoxygruppe,
R⁵ für eine Methoxygruppe, und an der Stelle 20′ befindet sich die Hydroxylgruppe in β-, die Äthylgruppe in α-Raumstellung;
weiterhin das Leurozidin, in dessen Formel die Substituenten die obige Bedeutung besitzen, an der Stelle 20′ ist jedoch die Hydroxylgruppe in α- und die Äthylgruppe in β-Raumstellung;
das 15′,20′-Anhydrovinblastin, in dessen Formel
R¹, R⁴, R⁵ die im Zusammenhang mit dem Vinblastin angegebene Bedeutung besitzen, und
R² und R³ in Verbindung miteinander eine Valenzbildung bilden;
und das Vindezin, in dessen Formel
R² ein Wasserstoffatom,
R³ eine Hydroxylgruppe,
R⁴ eine Hydroxylgruppe,
R⁵ eine Aminogruppe bedeutet, und an der Stelle 20′ befindet sich die Hydroxylgruppe in β-, die Äthylgruppe in α-Raumstellung.

Von den unter der allgemeinen Formel (I) zusammengefaßten, als R¹ eine Formylgruppe enthaltenden bis-Indolalkaloiden sind vom Standpunkt der Anti-Geschwulst- Wirkung aus die folgenden Verbindungen von Bedeutung:
Vinkristin (VCR), in dessen Formel
R² für ein Wasserstoffatom,
R³ für eine Hydroxylgruppe,
R⁴ für eine Acetoxygruppe,
R⁵ für eine Methoxygruppe steht, und an der Stelle 20′ befindet sich die Hydroxylgruppe in β-, die Äthylgruppe in α-Raumstellung;
N-Desacetyl-N-formyl-leurozin, in dessen Formel
R² und R³ in Verbindung miteinander eine α-α-Epoxygruppe bilden,
R⁴ für eine Acetoxygruppe,
R⁵ für eine Methoxygruppe steht, und an der Stelle 20′ befindet sich die Äthylgruppe in β-Raumstellung;
17-Desacetoxy-vinkristin, in dessen Formel
R¹, R², R³ und R⁵ die im Zusammenhang mit dem Vinkristin erwähnte Bedeutung besitzen,
R⁴ für ein Wasserstoffatom steht, und an der Stelle 20′ befindet sich die Hydroxylgruppe in β-, die Äthylgruppe in α-Raumstellung; und
15′, 20′-Anhydrovinkristin, in dessen Formel
R² und R³ zusammen eine Valenzbindung bedeuten,
R⁴ für eine Acetoxygruppe und
R⁵ für eine Methoxygruppe steht.

Die bis-Indolalkaloide mit Anti-Geschwulst-Wirkung werden Geschwulstkranken intravenös verabreicht, deshalb wäre es zweckmäßig, die Verbindungen in Form von Lösungen (Injektionen oder Infusionen) zu formulieren und auf den Markt zu bringen. Dazu bestand - bisher - wegen der nicht ausreichenden Stabilität der Lösungen von bis-Indolalkaloiden keine Möglichkeit. Die bisher in die klinische Praxis eingeführten drei bis-Indolalkaloide mit Anti-Geschwulst- Wirkung, das Vinkristin, Vinblastin und Vindezin, kamen in Form von Pulverampullen, die ein aus ihren Salzen - in erster Linie aus ihren Sulfaten - hergestelltes Lyophilisat enthalten bzw. in Form von Zweiampullen-Präparaten, welche getrennt die Lyophilisat- und Lösungsmittelkomponente enthalten, auf den Markt. Diese Lösung ist einerseits wegen der Kostspieligkeit des Lyophilisierens, andererseits infolge der während der klinischen Verwendung bei der Auflösung auftretenden Probleme nicht zufriedenstellend.

Ein zur Formulierung von Vincaalkaloiden ausgearbeitetes, verbessertes Verfahren beschreibt die ungarische Patentanmeldung Nr. 2 522/83 (belgische Patentschrift Nr. 8 97 280). Nach der Beschreibung werden Vincaalkaloide enthaltende wäßrige Arzneimittelpräparate hergestellt, indem ein therapeutisch verträgliches Vinca-Dimer-Salz, ein Polyol, ein den pH-Wert der Lösung zwischen 3,5 und 5,0 haltender Acetatpuffer und ein die Vermehrung von Mikroorganismen hemmender Zuschlagstoff miteinander vermischt werden. Über die Stabilität wird - ohne konkrete Meßergebnisse - ausgesagt, daß das durch das erfindungsgemäße Verfahren hergestellten Vinkristinsulfat bei einer Lagerungstemperatur von 5°C 9 Monate lang 94-99% seiner ursprünglichen Wirkstoffkonzentration bewahrt. Für die inzwischen auf den Markt gebrachten, durch ein solches Verfahren hergestellten Vinkristin-Injektionen wird auch weiterhin eine Lagerung bei niedriger Temperatur (5°C) vorgeschrieben und nur eine Haltbarkeit von einem Jahr garantiert.

Ziel der Erfindung ist die Herstellung von Lösungen der bis-Indolalkaloide, deren Stabilität die Stabilität der bisher bekannten Lösungen bei weitem übertrifft und auch bei Zimmertemperatur eine Lagerung über längere Zeit ermöglicht.

Die folgenden Metallkomplexe, nämlich mit Zink, Calcium, Magnesium, Kobalt, Eisen oder Nickel gebildete Metallkomplexe von bis-Indolverbindungen der allgemeinen Formel (I)

oder deren therapeutisch akzeptierbare Salze, worin bedeuten:
R¹ eine Methylgruppe,
R² ein Wasserstoffatom,
R³ eine Hydroxylgruppe oder
R² und R³ zusammen eine Valenzbindung,
R⁴ eine Hydroxyl- oder Acetoxygruppe und
R⁵ eine Methoxy- oder Aminogruppe;
oder:
R¹ eine Formylgruppe,
R² ein Wasserstoffatom,
R³ eine Hydroxylgruppe oder
R² und R³ zusammen eine Epoxygruppe,
R⁴ ein Wasserstoffatom oder eine Acetoxygruppe und
R⁵ eine Methoxygruppe,
sind neu. Diese Metallkomplexe haben in wäßrigem Milieu bei einem pH-Wert von 3,0-6,0 eine sehr gute Stabilität.

In der Literatur wurden bisher nur der N-2′-Bor-Komplex des 20′S-Desoxyvinblastin (Chemical Abstracts, 99:140214s [1983]) bzw. ein mit Tubulin gebildeter Komplex bestimmter bis-Indolalkaloide vom Vinblastin-Typ (belgische Patentschrift Nr. 8 54 053) erwähnt. Das Tubulin ist ein Protein mit großem Molekulargewicht, welches - dem erwähnten Patent zufolge - bei einem pH-Wert zwischen 6,6 und 7,6 mit den untersuchten bis-Indolalkaloiden Komplexe bildet. Die Stabilität der Komplexe in wäßriger Lösung wurde in keiner Veröffentlichung erwähnt.

Ein weiteres Ziel der Erfindung ist die Herstellung von therapeutisch akzeptierbaren Metallkomplexen der bis-Indolalkaloide. Dieses wird erreicht durch ein Verfahren zur Herstellung von mit Zink, Calcium, Magnesium, Kobalt, Eisen oder Nickel gebildeten Metallkomplexen von bis-Indolverbindungen der allgemeinen Formel (I), indem man eine bis-Indolverbindung der allgemeinen Formel (I) oder deren therapeutisch akzeptierbares Salz in wäßrigem Milieu bei einem pH-Wert von 3,0-6,0 mit einem nicht toxischen, in Wasser löslichen Salz von Zink, Calcium, Magnesium, Kobalt, Eisen oder Nickel umsetzt, und gewünschtenfalls den erhaltenen Metallkomplex in an sich bekannter Weise isoliert.

Die Umsetzung kann gegebenenfalls in Gegenwart von üblichen pharmazeutischen Trägerstoffen und/oder anderen Zusätzen oder vor deren Zugabe ausgeführt werden.

Im erfindungsgemäßen Verfahren können die z. B. mit gesättigten einbasischen Carbonsäuren (z. B. Ameisensäure, Essigsäure), mit Oxysäuren mit 6 Kohlenstoffatomen (z. B. Gluconsäure, Levulinsäure, Lactobionsäure), mit Disacchariden (z. B. Saccharose) oder mit anorganischen Säuren (z. B. Schwefelsäure) gebildeten Salze von Zink, Magnesium, Calcium, Kobalt, Eisen oder Nickel zur Komplexbildung verwendet werden. Besonders vorteilhaft sind die mit Zink, Magnesium oder Calcium gebildeten Komplexe, wobei die Metalle vorzugsweise in Form von Gluconat oder Acetat zum Reaktionsgemisch gegeben werden.

Die Komplexbildung erfolgt bei einem pH-Wert zwischen 3,0 und 6,0, und der pH wird durch ein geeignetes Puffersystem, vorzugsweise durch einen den pH-Wert in den entsprechenden Grenzen haltenden Acetatpuffer (z. B. durch ein Natriumacetat/Essigsäure-System), stabilisiert.

Werden durch das erfindungsgemäße Verfahren direkt für Injektionen verwendbare Lösungen hergestellt, ist in diesen die Konzentration der bis-Indolalkaloide von der wirksamen Dosis und vom therapeutischen Spektrum der Wirkstoffe abhängig. Die Konzentration der bis- Indolalkaloide beträgt im allgemeinen 0,01-10 mg/ml, vorzugsweise 0,1-10 mg/ml, günstigstenfalls 0,5-1,0 mg/ml. Da die bis-Indolalkaloide, die in der oben angegebenen allgemeinen Formel (I) als R¹ eine Formylgruppe enthalten, im allgemeinen in niedrigerer Dosis wirken, ist es zweckmäßig, von diesen Lösungen mit kleinerer Wirkstoffkonzentration herzustellen, während im Falle der in größerer Dosis wirkenden, als R¹ eine Methylgruppe enthaltenden Verbindungen, z. B. dem Vinblastin, die Wirkstoffkonzentration etwas größer ist.

Bei Durchführen der Komplexbildung unter den obigen Bedingungen bilden sich - polarographischen Messungen zufolge - dominant bis-Indolalkaloid-Metallkomplexe mit einem Molverhältnis von 1 : 1. Deshalb wird das Metallsalz, auf das bis-Indolalkaloid gerechnet, mindestens in moläquivalenter Menge verwendet. Damit die volle bis-Indolalkaloid- Menge in Komplexe überführt wird, ist es zweckmäßig, mit einem kleinen Überschuß an Metallsalz zu arbeiten. Auf 1 mg Vinkristinsulfat gerechnet ist die Ca²⁺-Menge von z. B. 41-100 µg vorteilhaft, bevorzugter 50 µg, die Mg²⁺-Ionenmenge beträgt vorzugsweise 24-55 µg, bevorzugter 26-28 µg, die Zn²⁺-Ionenmenge dagegen vorzugsweise 66-140 µg, bevorzugter 70 µg.

In den Injektionslösungen werden als Isotonierungsmittel im allgemeinen Zucker oder Zuckeralkohole, wie Glucose, Mannit oder Maltose, verwendet. Die Menge des Isotonierungsmittels wird in jedem Fall osmometrisch festgelegt.

Als organische Hilfslösungsmittel werden z. B. Äthanol oder Glycoläther mit einem Molekulargewicht von 200-600 (Polyalkylenglycole) verwendet, ersteres vorzugsweise in einer Konzentration von 4-8%, letztere vorzugsweise in einer Konzentration von 5-15%.

Die stabilen, gebrauchsfertigen Injektionslösungen können noch bekannte Konservierungsmittel, wie z. B. Benzylalkohol, Nipagin A, Nipagin M, Propyl-paraben oder deren Gemisch, in in der Pharmazie bekannten und verwendeten Konzentrationen enthalten.

Als Antioxydans kann z. B. Natrium- oder Kaliumpyrosulfit in einer Konzentration von 0,02-0,15, vorzugsweise 0,05%, verwendet werden.

Der pH der durch das erfindungsgemäße Verfahren hergestellten stabilen Lösungen wird zwischen 3,0 und 6,0, vorzugsweise auf 3,5-5,0, eingestellt, im Falle von Vinkristinsulfat vorzugsweise auf einen Wert von 4,5, was in Einklang mit den im USP XX vorgeschriebenen Grenzen ist. In Gegenwart der verwendeten Metallsalze kann der pH gut stabilisiert werden.

Nach einer vorteilhaften Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens werden in destilliertem Wasser von Injektionsqualität die zur Komplexbildung notwendige Menge an Metallsalzen und gegebenenfalls weitere übliche Zusatzstoffe, z. B. Isotonierungsmittel, Hilfslösungsmittel, Puffer, Konservierungsmittel und Antioxydantien aufgelöst. Dann wird zur erhaltenen Lösung die wäßrige Lösung des entsprechenden bis-Indolalkaloids gegeben. Die Lösung wird danach mit destilliertem Wasser von Injektionsqualität auf das Endvolumen gebracht, homogenisiert, steril gefiltert und in inerter Gasatmosphäre in sterile Gläser gefüllt.

Polarographische Untersuchungen

Zum Nachweis der Wechselwirkung zwischen Vinkristin und den Metallionen Zink, Calcium und Magnesium diente eine polarographische Untersuchungsreihe. Es wurde eine Probenreihe hergestellt, in der jede Probe neben einer variablen Menge Vinkristinsulfat (Vinkristin-Konzentration zwischen 10^-3 und 10^-5 Mol/l) Zinkionen in einer konstanten Konzentration von 10^-4 Mol/l enthielt. Aus den Proben, deren pH-Wert durch ein Essigsäure-Natriumacetat- Puffersystem auf 5,5 eingestellt wurde, wurden wäßrige Lösungen mit einer Acetation-Konzentration von 0,15 MOl/l hergestellt.

Die Meßergebnisse werden in Fig. 1 dargestellt. Die in der Figur verwendeten Zeichen sind die folgenden:

"A"-Kurve:
Polarogramm einer wäßrigen Zinkacetat-Lösung mit einer Zinkionen-Konzentration von 10^-4 Mol/l,
"B"-Kurve:
Polarogramm einer 10^-4 Mol/l Zinkionen und 5×10^-4 Mol/l Vinkristin enthaltenden wäßrigen Lösung,
"C"-Kurve:
Polarogramm einer 10^-4 Mol/l Zinkionen und 10^-4 MOl/l Vinkristin enthaltenden wäßrigen Lösung.

Aus der Figur ist erkennbar, daß bei Vinkristin-Überschuß auf dem Polarogramm überhaupt keine Zink-Stufe erscheint. Eine auf die Erscheinung einer Zink-Stufe hinweisende Oszillation größeren Ausmaßes wurde unmittelbar vor dem Abscheiden der Grundlösung bei einem Vinkristin-Zink-Verhältnis von etwa 1 : 1 wahrgenommen. Bei der weiteren stufenweisen Verringerung der Konzentration des Liganden wurde auch die Zink-Stufe sichtbar, und bei einer Vinkristin-Konzentration von 2,5×10^-5 Mol/l und darunter war ihre Form und das Potential der Halbstufe gleich dem des freien Zinks.

Die obengenannten Fakten beweisen eindeutig, daß das Zinkion mit dem Vinkristin auch schon bei einem Konzentrationsverhältnis von 1 : 1 einen Komplex großer Stabilität bildet.

Die Wechselwirkung des Vinkristin mit den Calcium- und Magnesiumionen wurde auf indirekte Weise durch die Untersuchung der Wirkung dieser letzteren Ionen auf das polarographische Verhalten des Vinkristin-Zink-Systems nachgewiesen.

Bei einem Vinkristin-Zink-Verhältnis von 1 : 1 (10^-4 Mol/l), bei dem die Zink-Stufe gerade auf dem Polarogramm erscheint, wurden in stufenweise ansteigender Menge Calcium (Fig. 2) bzw. Magnesium (Fig. 3) zum System gegeben. Die in den Figuren verwendeten Zeichen sind die folgenden:

Fig. 2:
"A"-Kurve:
Polarogramm einer 10^-4 Mol/l Zinkionen und 10^-4 Mol/l Vinkristin enthaltenden wäßrigen Lösung,
"B"-Kurve:
Polarogramm einer 10^-4 Mol/l Zinkionen und 5 Mol/l Calciumchlorid enthaltenden wäßrigen Lösung,
"C"-Kurve:
Polarogramm einer in Gegenwart von 5 Mol/l Calciumchlorid 10^-4 Mol/l Zinkionen und 10^-4 Mol/l Vinkristin enthaltenden wäßrigen Lösung;

Fig. 3:
"A"-Kurve:
Polarogramm einer 10^-4 Mol/l Zinkionen und 10^-4 Mol/l Vinkristin enthaltenden wäßrigen Lösung,
"B"-Kurve:
Polarogramm einer 10^-4 Mol/l Zinkionen und 5 Mol/l Magnesiumchlorid enthaltenden wäßrigen Lösung,
"C"-Kurve:
Polarogramm einer in Gegenwart von 5 Mol/l Magnesiumchlorid 10^-4 Mol/l Zinkionen und 10^-4 Mol/l Vinkristin enthaltenden wäßrigen Lösung.

Sowohl im Fall von Calcium als auch im Fall von Magnesium wurde gefunden, daß sich mit Erhöhen der Konzentration der erwähnten Metalle die charakteristische Stufe des freien Zinks stufenweise herausbildet, und in den in Gegenwart von 5 Mol/l Calcium bzw. Magnesium auch Vinkristin enthaltenden und nur Zink enthaltenden, aber unter sonst gleichen Bedingungen aufgenommenen Polarogrammen die Zink-Stufe in Hinsicht auf Höhe und Halbstufenpotential übereinstimmt. Es sei bemerkt, daß das Zink vom Calcium und Magnesium völlig aus dem Vinkristin-Komplex verdrängt wurde. Auf Grund des für die vollständige Verdrängung des Zinks notwendigen Calcium- bzw. Magnesiumüberschusses (50 000fach) kann gesagt werden, daß die Stabilität des Zink-Vinkristin- Komplexes um etwa 4,5-5 Größenordnungen größer ist als bei den mit Vinkristin gebildeten Komplexen des Calcium- bzw. Magnesium.

Potentiometrische Untersuchungen

Zum Zwecke der direkten Bestimmung der Stabilitätskonstanten des Calcium-Vinkristin-Komplexes wurden potentiometrische Untersuchungen durchgeführt.

Für die Messungen wurde eine spezielle (DD-Patent Nr. 1 46 101) Calcium selektive Membranelektrode verwendet. Die Referenzelektrode war eine Ag/AgCl-Elektrode des Typs Radelkis OP 0820P. Die Messungen wurden mit einer computergesteuerten automatischen Titriereinrichtung durchgeführt. Die Vinkristin-Konzentration wurde zwischen 5×10^-4 und 2×10^-3 Mol/l, aber innerhalb der einzelnen Meßreihen auf einem konstanten Wert gehalten. Als Titriermittel wurde Calciumchloridlösung einer Konzentration von 0,1 Mol/l verwendet, deren Faktor durch komplexometrische Titration kontrolliert wurde. Die Messungen wurden bei einer Temperatur von 25°C in einer Lösung mit einem pH von 5,5 durchgeführt, die Ionenstärke wurde, um den Aktivitätskoeffizienten zu halten, auf einem konstanten Wert von 1,00 eingestellt.

Ein charakteristisches Titrationskurvenpaar wird in Fig. 4 gezeigt. Die in der Figur verwendeten Zeichen sind die folgenden:

Kurve 1: Kalibrationskurve der Elektrode,
Kurve 2: Titrationskurve der 10^-3 Mol/l Vinkristin enthaltenden Lösung

p[Ca] = -log[Ca²⁺] .

Hieraus ist ersichtlich, daß die Konzentration der freien Calciumionen in Gegenwart von Vinkristin signifikant sinkt, die Komplexbildung zwischen den Calciumionen und dem Vinkristin anzeigend. Auf den Messungen basierend wurde (d. h. die Zahl der auf ein Vinkristinmolekül kommenden gebundenen Calciumionen) ausgerechnet, dieser Wert ergab maximal 1,0. Mit dieser Bekannten wurde die Stabilitätskonstante des Komplexes ausgerechnet, wofür in einer Lösung mit einer Ionenstärke von 1 Mol der Wert log β = 3,27±0,1 erhalten wurde. In Fig. 5 sind die gemessenen und die auf der obigen Stabilitätskonstanten basierend errechneten -Werte aufgezeigt. Die errechneten Werte wurden durch eine fortlaufende Linie verbunden. Die gute Übereinstimmung der errechneten und gemessenen Werte bestätigt die Richtigkeit des für die Stabilitätskonstante erhaltenen Wertes.

Die pH-Abhängigkeit der erwähnten Komplexbildungsreaktionen wurde mit Deprotonierungs-Gleichgewichtsmessungen des Calvin-Typs untersucht, es wurde das polarographische Verhalten des Zn-VCR-Systems untersucht, und die potentiometrischen Ca²⁺-Ionen-Koordinationsuntersuchungen wurden in Lösungen mit verschiedenem pH durchgeführt. Bei den Untersuchungen zeigte sich im pH-Bereich von 3,5-5,5 keine Abhängigkeit vom pH. Das bestätigt, daß die genannten Ionen (Zn²⁺, Ca²⁺, Mg²⁺) von den Sauerstoffatomen des VCR-Donors umgeben werden, welche im untersuchten pH-Bereich nicht protonisiert werden.

Die Metallkomplexe können in fester Form getrennt und isoliert werden.

Stabilitätsuntersuchungen

Die Stabilität der durch das erfindungsgemäße Verfahren hergestellten vinkristinsulfathaltigen Lösungen wurde mit "High pressun liquid chromatography" (HPLC) Methoden kontrolliert.
HPLC-Methode zur Bestimmung des Vinkristin-Gehalts:
Säule: Nucleosil 5 µ C₈, 250×4,6 mm (Chrompack),
Eluierungsmittel: Gemisch aus Methanol, Wasser und Diäthylamin,
Wellenlänge: 297 nm,
Strömungsgeschwindigkeit: 2 ml/min.

Die Bestimmung des Wirkstoffgehaltes fand mit einem äußeren Standard statt, d. h. als Vergleich wurde die reine wäßrige Lösung von Vinkristinsulfat gleichen Ursprungs und gleicher Konzentration verwendet wie die der zu untersuchenden Lösung (Injektion) von Vinkristinsulfat.

Beschleunigte Stabilitätsuntersuchungen

In der folgenden Tabelle 1 werden die Ergebnisse der beschleunigten Stabilitätsuntersuchungen zusammengefaßt. Dabei wurde die Stabilität des nach Beispiel 1 hergestellten erfindungsgemäßen Präparates (Lösung 1) mit der Stabilität des nach Beispiel 1 der belgischen Patentschrift Nr. 8 97 280 hergestellten (Lösung 3) und mit einem im Handel erhältlichen einampulligen Injektions-Vinkristinpräparat (Lösung 2) verglichen. Die Lösungen wurden unter völlig gleichen Bedingungen 5 bis 10 Tage lang bei 75°C mit Wärme behandelt.

Tabelle 1

Aus den Angaben der Tabelle 1 ist ersichtlich, daß das erfindungsgemäß hergestellte, den Ca-Komplex des Vinkristin enthaltende stabilisierte Injektionspräparat während der beschleunigten Stabilitätsuntersuchungen eine wesentlich bessere Stabilität zeigte als die Lösungen nach der genannten belgischen Patentschrift oder die im Handel befindlichen, das Vinkristin nicht in Form von Metallkomplexen enthaltenden Lösungen.

Langanhaltende Stabilitätsuntersuchungen

a) Von der nach dem Beispiel 1 der vorliegenden Anmeldung hergestellten Vinkristinsulfat-Lösung mit einer Wirkstoffkonzentration von 1 mg/ml wurden je 5 ml in 3 Ampullen gefüllt. Bei ständiger Lagerung der Lösungen bei 5°C erhielt man die in Tabelle 2/A aufgeführten Ergebnisse. Aus den Angaben der Tabelle ist ersichtlich, daß während einer zwölfmonatigen Lagerung praktisch keine Zersetzung stattgefunden hat.

Tabelle 2/A

Wirkstoffmenge (%)

Es wurde im wesentlichen die gleiche Methode wie oben angewandt, außer daß anstelle von Ampullen Phiolen verwendet wurden (Lagerung im Kühlschrank bei 2-8°C). Dabei wurden folgende Ergebnisse erhalten:

Tabelle 2/B

(%)

b) Von der nach Beispiel 1 hergestellten Vinkristinsulfat- Lösung mit einer Wirkstoffkonzentration von 1 mg/ml wurde je 1 ml in Gläser gefüllt. 100 Gläser wurden bei 5°C und 100 Gläser bei Zimmertemperatur gelagert. Die erhaltenen Durchschnittsergebnisse sind in Tabelle 3 zusammengefaßt.

Tabelle 3

Wirkstoffmenge (%)

Aus den Angaben ist ersichtlich, daß die Lösungen nach der Lagerung bei 5°C nicht zerfielen und der VCR-Gehalt bei Lagerung auf Zimmertemperatur ein wenig sinkt.

Aus den Stabilitätsangaben geht eindeutig hervor, daß die erfindungsgemäßen, die bis-Indolalkaloide in komplexer Form enthaltenden Lösungen eine ausgezeichnete Stabilität aufweisen. Demzufolge bleibt bei 5°C auch über einen Zeitraum von 2 Jahren eine verwendungsfähige Qualität erhalten. Außerdem ist es bei der Injektionenherstellung von Vorteil, daß die Sterilisation auch mit einer Wärmebehandlung von 100°C mit Sicherheit, ohne die Gefahr des Zerfalls, durchführbar ist.

Die Erfindung wird anhand der folgenden Beispiele veranschaulicht, ohne daß der Schutzumfang auf diese eingeschränkt wird.

Beispiel 1

Vinkristinsulfat\|0,1 g
Propyl-paraoxybenzoat	0,02 g
Essigsäure (98%)	0,025 g
Calciumgluconat · H₂O	0,05 g
Natriumacetat · 3 H₂O	0,06 g
Methyl-paraoxybenzoat	0,13 g
Äthanol (96%)	5 g
Mannit	10 g
Destilliertes Wasser von Injektionsqualität auf	100 ml

In einer aliquoten Menge von frisch ausgekochtem und mit Stickstoffgas gesättigtem destilliertem Wasser von Injektionsqualität werden das Mannit, Calciumgluconat und Natriumacetat aufgelöst, und man gibt die vorgeschriebene Menge Essigsäure dazu. Propyl-paraoxybenzoat und Methyl-paraoxybenzoat werden in 96%igem Äthanol aufgelöst, dann wird die erhaltene Lösung mit der auf die obige Weise hergestellten Grundlösung vermischt. Dann wird das in einem kleinen Teil destilliertem Wasser gesondert aufgelöste Vinkristinsulfat dazugegeben. Das Volumen der Lösung wird sodann mit destilliertem Wasser von Injektionsqualität auf das Endvolumen ergänzt, dann wird die Lösung homogenisiert, steril gefiltert und in unter inerter Gasatmosphäre sterilisierte Gläser gefüllt.

Beispiel 2

Vinkristinsulfat\|0,1 g
Propyl-paraoxybenzoat	0,005 g
Magnesiumgluconat	0,045 g
Essigsäure (98%)	0,025 g
Natriumacetat · 3 H₂O	0,0256 g
Methyl-paraoxybenzoat	0,05 g
Äthanol (96%)	5 g
Mannit	5 g
Destilliertes Wasser von Injektionsqualität auf	100 ml

Bei der Herstellung der Lösungen wird nach der Beschreibung des Beispiels 1 vorgegangen.

Beispiel 3

Vinkristinsulfat\|0,1 g
Essigsäure (98%)	0,025 g
Zinkgluconat	0,049 g
Natriumacetat · 3 H₂O	0,06 g
Benzylalkohol	0,9 g
Äthanol (96%)	5 g
Mannit	5 g
Destilliertes Wasser von Injektionsqualität auf	100 ml

In einem aliquoten Teil von frisch ausgekochtem mit Stickstoffgas gesättigtem destilliertem Wasser von Injektionsqualität werden Mannit und Zinkgluconat aufgelöst, dann werden zur Lösung Essigsäure und das Gemisch aus Äthanol und Benzylalkohol gegeben. Anschließend wird das in einem kleinen Teil des destillierten Wassers gesondert aufgelöste Vinkristinsulfat hinzugegeben. Das Volumen der Lösung wird mit destilliertem Wasser von Injektionsqualität auf das Endvolumen eingestellt, dann wird die Lösung homogenisiert und nach sterilem Filtern in unter inerter Gasatmosphäre sterilisierte Gläser gefüllt.

Beispiel 4

Vinkristinsulfat\|0,1 g
Propyl-paraoxybenzoat	0,005 g
Calciumacetat · H₂O	0,0222 g
Essigsäure (98%)	0,025 g
Natriumacetat · 3 H₂O	0,0256 g
Methyl-paraoxybenzoat	0,05 g
Äthanol (96%)	5 g
Mannit	5 g
Destilliertes Wasser von Injektionsqualität auf	100 ml

Bei der Herstellung der Lösung wird nach der Beschreibung von Beispiel 1 verfahren.

Beispiel 5

Vinkristinsulfat\|0,1 g
Essigsäure (98%)	0,025 g
Natriumacetat · 3 H₂O	0,0256 g
Calciumgluconat	0,056 g
Benzylalkohol	0,9 g
Sorbit	5 g
Poly(äthylenglycol) 400	10 g
Destilliertes Wasser von Injektionsqualität auf	100 ml

In einem aliquoten Teil von frisch ausgekochtem und mit Stickstoffgas gesättigtem destilliertem Wasser von Injektionsqualität werden nacheinander das Sorbit und Calciumgluconat aufgelöst. Dann werden die Essigsäure und das Gemisch von Benzylalkohol und Poly(äthylenglycol) hinzugegeben. Danach wird das in einem kleinen Teil des destillierten Wassers gesondert gelöste Vinkristinsulfat hinzugegeben und das Volumen der Lösung mit destilliertem Wasser von Injektionsqualität auf das Endvolumen eingestellt. Nach Homogenisieren und sterilem Filtern wird die Lösung in unter inerter Gasatmosphäre sterilisierte Gläser gefüllt.

Beispiel 6

Vinblastinsulfat\|0,1 g
Propyl-paraoxybenzoat	0,005 g
Calciumacetat · H₂O	0,023 g
Essigsäure (98%)	0,049 g
Natriumacetat · 3 H₂O	0,049 g
Methyl-paraoxybenzoat	0,05 g
Äthanol (96%)	5 g
Mannit	5 g
Destilliertes Wasser von Injektionsqualität auf	100 ml

Bei der Herstellung der Lösung wird nach der Beschreibung von Beispiel 1 vorgegangen.

Beispiel 7

Vinkristinsulfat\|0,1 g
Propyl-paraoxybenzoat	0,02 g
Essigsäure (98%)	0,025 g
Zinksulfat	0,033 g
Natriumacetat · 3 H₂O	0,06 g
Methyl-paraoxybenzoat	0,13 g
Äthanol (96%)	5 g
Mannit	10 g
Destilliertes Wasser von Injektionsqualität auf	100 ml

Claims

1. Mit Zink, Calcium, Magnesium, Kobalt, Eisen oder Nickel gebildete Metallkomplexe von bis-Indolverbindungen der allgemeinen Formel (I) oder deren therapeutisch akzeptierbare Salze, wobei bedeuten:
R¹ eine Methylgruppe,
R² ein Wasserstoffatom,
R³ eine Hydroxylgruppe; oder
R² und R³ zusammen eine Valenzbindung,
R⁴ eine Hydroxyl- oder Acetoxygruppe, und
R⁵ eine Methoxy- oder Aminogruppe;
oder:
R¹ eine Formylgruppe,
R² ein Wasserstoffatom,
R³ eine Hydroxylgruppe; oder
R² und R³ zusammen eine Epoxygruppe,
R⁴ ein Wasserstoffatom oder eine Acetoxygruppe und
R⁵ eine Methoxygruppe.

2. Zink-, Calcium- oder Magnesiumkomplex des Vinkristin.

3. Zink-, Calcium- oder Magnesiumkomplex des Vinblastin.

4. Verfahren zur Herstellung der Metallkomplexe von bis-Indolverbindungen gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man eine bis-Indolverbindung der allgemeinen Formel (I) oder deren therapeutisch akzeptierbares Salz in wäßrigem Milieu bei einem pH-Wert von 3,0-6,0 mit einem nicht toxischen, in Wasser löslichen Salz von Zink, Calcium, Magnesium, Kobalt, Eisen oder Nickel umsetzt, und gewünschtenfalls den erhaltenen Metallkomplex in an sich bekannter Weise isoliert.

5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß das genannte Metallsalz in einer Menge verwendet wird, daß das Molverhältnis Metall : bis- Indolverbindung 1 : 1 ist.

6. Verfahren nach einem der Ansprüche 4 und 5, dadurch gekennzeichnet, daß als bis-Indolverbindung der allgemeinen Formel (I) Vinkristin oder Vinblastin oder eines ihrer therapeutisch akzeptierbaren Salze verwendet wird.

7. Verfahren nach einem der Ansprüche 4 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß ein nichttoxisches Salz von Zink, Calcium oder Magnesium verwendet wird.

8. Verfahren nach einem der Ansprüche 4 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß das Zink, Calcium oder Magnesium in Form eines Acetat- oder Gluconatsalzes verwendet wird.

9. Stabile wäßrige Arzneimittelpräparate, die als Wirkstoff einen therapeutisch akzeptierbaren Komplex einer bis-Indolverbindung gemäß Ansprüchen 1 bis 3, gegebenenfalls zusammen mit gebräuchlichen Trägerstoffen und/oder anderen Hilfsstoffen enthalten.