NL192779C - Metaalcomplexen van bis-indoolverbindingen en waterige farmaceutische preparaten met dergelijke verbindingen erin. - Google Patents

Description

1 192779

Metaalcomplexen van bis-indoolverbindingen en waterige farmaceutische preparaten met dergelijke verbindingen erin

De uitvinding heeft betrekking op een werkwijze voor de bereiding van een farmaceutisch aanvaardbaar 5 metaalcomplex van een bis-indoolverbinding. Dit complex heeft een verhoogde stabiliteit in een waterig medium, vergeleken met preparaten, die de bis-indoolverbinding als zodanig bevatten. De uitvinding heeft verder betrekking op farmaceutisch aanvaardbare metaalcomplexen van bis-indoolverbindingen, alsmede op stabiele waterige farmaceutische preparaten, die als werkzaam bestanddeel voornoemd farmaceutisch aanvaardbaar complex bevatten.

10 De eerste bekende verbindingen met bis-indoolskelet waren alkaloïden, die voorkomen in de Vinca rosea L-plant, waaruit eerst vinblastine (VLB) (zie Amerikaans octrooischrift Nov. 3.097.137) en dan vincristine (VCR) en leurosine (Leu; zie de Amerikaanse octrooischriften Nos. 3.205.220 en 3.370.057) werden geïsoleerd. Aangezien sommige van deze alkaloïden uitstekende antitumorwerking hadden, werden diverse synthetisch gemodificeerde derivaten bereid.

15 De bekende indool-dihydroindoolverbindingen, die met succes werden toegepast bij tumortherapie, hebben de algemene formule 1 van het formuleblad.

Algemene formule 1 omvat twee groepen van bekende antitumormiddelen, waarbij in één groep R1 een methylgroep voorstelt, terwijl in de andere groep R1 een formylgroep voorstelt.

In het eerste geval is de betekenis van de substituenten als volgt: 20 R1 stelt een methylgroep voor, R2 stelt een waterstofatoom voor, R3 stelt een hydroxilgroep voor of stellen R2 en R3 tezamen een valentiebinding voor, R4 stelt een hydroxil- of een acetoxigroep voor, terwijl 25 R5 een methoxi- of een aminogroep voorstelt.

In het andere geval is de definitie van de substituenten als volgt: R1 stelt een formylgroep voor, R2 stelt een waterstofatoom en R3 stelt een hydroxilgroep voor, of stellen 30 R2 en R3 tezamen een expoxigroep voor, R4 stelt een waterstofatoom of een acetoxigroep en R5 stelt een methoxigroep voor.

Voorkeursverbindingen met de algemene formule 1, waarin R1 een methylgroep voorstelt, zijn als volgt: vinblastine (VLB), komt overeen met de algemene formule 1 35 van het formuleblad wanneer R2 een waterstofatoom voorstelt, R3 een hydroxilgroep voorstelt, R4 een acetoxigroep voorstelt, en R5 een methoxigroep voorstelt, terwijl op de plaats 20’ van het skelet de hydroxilgroep 6- en de ethylgroep 40 α-configuratie hebben; leurosidine, komt overeen met de algemene formule 1 van het formuleblad, wanneer R2, R3, R4 en R5 dezelfde betekenissen hebben als in het geval van VLB, maar waarbij op de 20'- plaats van het skelet de hydroxilgroep een a- en de ethylgroep een β-configuratie heeft: 45 15', 20'-anhydro-vinblastine, komt overeen met algemene formule 1, wanneer R2 en R3 tezamen een valentieverbinding vormen, R4 een acetoxigroep voorstelt, terwijl R5 een methoxigroep voorstelt; en vindesine, komt overeen met de algemene formule 1 van het formuleblad, wanneer 50 R2 een waterstofatoom voorstelt, R3 een hydroxilgroep voorstelt, R4 een hydroxilgroep voorstelt, terwijl R5 een aminogroep voorstelt en op de 20'-plaats de hydroxilgroep een β-configuratie heeft, terwijl de ethylgroep een α-configuratie bezit.

55 Voorkeursverbindingen met de algemene formule 1 van het formuleblad, waarin R1 een formylgroep voorstelt, zijn als volgt: vincristine (VCR), komt overeen met de algemene formule 1 van het formuleblad, wanneer 192779 2 R2 een waterstofatoom voorstelt, R3 een hydroxilgroep voorstelt, R4 een acetoxilgroep voorstelt, terwijl R5 een methoxigroep voorstelt, en in de positie 20' de hydroxilgroep een β-configuratie heeft en de 5 ethylgroep een a-configuratie; N-desacethyl-N-formyl-leurosine, komt overeen met de algemene formule 1 van het formuleblad, wanneer R2 en R3 tezamen een α-α expoxibrug vormen, R4 een acetoxigroep voorstelt en R5 een methoxigroep voorstelt, terwijl de ethylgroep op de plaats 20' een β-configuratie heeft; 10 17-desacetoxi-vincristine, komt overeen met de algemene formule 1 van het formuleblad, wanneer R4 een waterstofatoom voorstelt, terwijl de andere substituenten dezelfde zijn als in het geval van VCR; en 15', 20'-anhydro-vincristine, komt overeen met de algemene formule 1 van het formuleblad, wanneer R2 en R3 tezamen een valentiebinding vormen, 15 R4 een acetoxigroep voorstelt, terwijl R5 een methoxigroep voorstelt.

Bis-indoolverbindingen worden in het algemeen aan patiënten, die lijden aan neoplastische ziekten, intraveneus toegediend. Voor dit doel dienen de werkzame verbindingen gebracht te worden in de vorm van 20 een stabiele oplossing (dat wil zeggen injecteerbare oplossing of infusie), die direct in de patiënten kunnen worden ingespoten. Tengevolge van de onvoldoende stabiliteit van de bis-indoolverbindingen in waterige oplossingen was er tot nu toe weinig hoop op een direct toepasbaar preparaat. De drie bis-indoolverbindingen, dat wil zeggen het vincristine, vinblastine en vindesine, die in de klinische praktijk algemeen werden gebruikt, waren in twee afzonderlijke ampullen beschikbaar, één ervan bevatte het 25 gelyofiliseerde werkzame bestanddeel (poederampul) en de andere het steriele oplosmiddel (oplosmiddel-ampul) voor het doen oplossen van de werkzame component voorafgaande aan het gebruik. Deze twee-ampullenverpakking heeft echter diverse nadelen. Ten eerste is het lyofiliseren kostbaar, ten tweede dient het oplossen van elk gelyofiliseerd monster uitgevoerd te worden volgens de goedgekeurde steriliteits-en pyrogeenvrije standaards, teneinde bij de toediening risico’s te vermijden.

30 Een verbeterde methode voor het verwerken van de preparaten van vinca-dimeren is beschreven in het Belgische octrooischrift No. 897.280. Overeenkomstig deze methode worden waterige medische preparaten van een vinca-dimeer bereid door oplossen van het farmaceutisch aanvaardbare zout van een vinca-dimeer en door toevoeging aan de oplossing van een polyol, van een acetaatbuffer voor het handhaven van de pH van de oplossing op een waarde tussen 3 en 5, alsmede van een bacteriostatisch middel. Er zijn geen 35 opslagstabiliteitsproeven beschreven, er wordt slechts vermeld, dat 94-99% van het oorspronkelijke werkzaam bestanddeelgehalte aanwezig is na een 9 maanden durende opslag, indien de monsters bewaard zijn bij 5°C. Ondertussen werd één-ampul vincristinepreparaat op de markt gebracht, met de garantie dat dit preparaat gedurende een jaar stabiel bleef bij 5°C opslag.

Het doel van de uitvinding is het vinden van een preparaat voor dimeer-indoolverbindingen, die beter zijn 40 dan de bekende preparaten, dat wil zeggen die zelfs opslagstabiel zijn gedurende lange tijd bij kamertemperatuur.

Gevonden is, dat de bis-indoolverbindingen en respectieve de zuuradditiezouten ervan gemakkelijk metaalcomplexen vormen met bi- of multivalente metaalionen, die geschikt zijn voor de vorming van complexen, terwijl de aldus verkregen complexen uitstekende stabiliteitseigenschappen bezitten in waterig 45 medium bij een pH van 3,0-6,0.

De uitvinding verschaft derhalve een werkwijze voor de bereiding van een farmaceutisch aanvaardbaar metaalcomplex van een bis-indoolverbinding, met het kenmerk, dat men een oplossing van een bis-indoolverbinding met de algemene formule 1 van het formuleblad, waarin R1 een methylgroep voorstelt, 50 R2 een waterstofatoom voorstelt, R3 een hydroxilgroep voorstelt, of R2 en R3 tezamen een valentiebinding voorstellen, R4 een hydroxil- of acetoxigroep voorstelt, terwijl R5 een methoxi- of aminogroep voorstelt, of 55 R1 een formylgroep voorstelt, R2 een waterstofatoom voorstelt, R3 een hydroxilgroep voorstelt, of 3 192779 R2 en R3 tezamen een epoxigroep voorstellen, R4 waterstofatoom of een acetoxigroep voorstelt, en R5 een methoxigroep voorstelt of een farmaceutisch aanvaardbaar zout daarvan in een waterig medium omzet met een niet-toxisch, in 5 water oplosbaar zout van een twee- of meerwaardig metaal, dat in staat is complexen te vormen bij een pH van 3,0-6,0, en men het verkregen metaalcomplex desgewenst isoleert.

De werkwijze volgens de uitvinding kan eventueel in aanwezigheid van of gevolgd worden door toevoeging van een gebruikelijke drager en/of verder toevoegsel.

De nieuwe complexen alsmede de nieuwe preparaten vallen binnen de beschermingsomvang van de 10 uitvinding.

Twee typen complexen, gevormd door bis-indoolalkaloiden, werden reeds beschreven. In C.A.

99:140214s (1983) wordt N-2'-borancomplex van 20'-deoxi-vinblastine beschreven tezamen met de structurele analyse ervan. Tubulinecomplex van het vinblastine type alkaloïden, die actiever zijn dan de vrije alkaloïden, zijn beschreven in het Belgische octrooischrift No. 854.053. Tubuline, een proteïne met hoog 15 molecuulgewicht, vormt een complex met vinblastine en dergelijke bij een pH van 6,6-7,6 volgens de beschrijving. Er is echter geen sprake van de stabiliteit van de bekende complexen in waterige oplossingen.

Volgens de onderhavige uitvinding vindt complexvorming plaats tussen een bis-indoolverbinding of een zout daarvan en een in water oplosbaar zout van een twee- of meerwaardig metaal, dat in staat is complexen te vormen. Complexvorming vindt plaats in water bij een pH van 3-6 en desgewenst kan het 20 verkregen complex uit de oplossing worden gewonnen op op zichzelf bekende wijze.

Metaalionen, die geschikt zijn voor de vorming van farmaceutisch aanvaardbare complexen, zijn bijvoorbeeld die van zink (II), magnesium (II), calcium (II), kobalt (II), ijzer (II) of nikkel (II), Deze kunnen worden gebruikt in de vorm van hun zouten, gevormd bijvoorbeeld met verzadigde monobasische carboxi-laatanionen - voorbeelden hiervan zijn formiaat en acetaat - of met een oxicarboxilaatanion met 6 koolstof-25 atomen - voorbeelden hiervan zijn gluconaat, levulinaat, lactobionaat -; met een disaccharide, zoals sucrose, en met anorganische anionen, zoals sulfaat of chloride. De metaalionen, die de meeste voorkeur verdienen, zijn zink (II), magnesium (II) en calcium (II), in het bijzonder wanneer zij worden toegepast in de vorm van een gluconaat- of acetaatzout.

De pH, die varieert van 3,0 tot 6,0, kan worden ingesteld met behulp van een geschikte buffer, bij 30 voorkeur met een acetaatbuffer, die een mengsel is van natriumacetaat en azijnzuur, die zorgt voor het handhaven van de vereiste pH in de loop van de complexvorming.

Wanneer er oplossingen, die gereed zijn voor inspuiting, dienen te worden bereid, wordt de bis-indoolverbinding gebruikt als een farmaceutisch aanvaardbaar zout in een therapeutisch effectieve concentratie. Deze concentratie varieert van één werkzaam bestanddeel tot de volgende, afhankelijk van de 35 effectieve dosering en de therapeutische wijdte van de afzonderlijke bis-indoolverbindingen. In het algemeen dient een concentratie van 0,01-10 mg/ml, bij voorkeur 0,1-10 mg/ml, en liefst 0,5-1,0 mg/ml te worden gebruikt. Een groep van de bis-indoolverbindingen met de algemene formule 1 van het formuleblad, waarin R1 een formylgroep voorstelt, bijvoorbeeld het vincristine of dergelijke, is effectief in een lagere dosering dan de andere groep van verbindingen, die valt onder de algemene formule 1 van het formuleblad, waarin R1 40 een methylgroep voorstelt, bijvoorbeeld het vinblastine en dergelijke. Zo kunnen dergelijke vincristine type verbindingen in het algemeen gebruikt worden in een lagere concentratie dan het vinblastine type alkaloïden.

Evenwichtsanalyses van de systemen lieten zien, dat onder de bovengenoemde omstandigheden de bis-indoolcomponent en de metaalionen in het complex aanwezig zijn voornamelijk in een 1:1 molaire 45 verhouding. Op basis van de complexvormingsconstante dient de metaalcomponent te worden gebruikt in een geringe molaire overmaat vergeleken met de bis-indoolverbinding, teneinde onvolledige complexvorming te voorkomen. Zo dient bijvoorbeeld op 1 mg vincristinesulfaat 41-100 μρ Ca2+, bij voorkeur 50 μg calciumion, of 24-55 μg Mg2*, bij voorkeur 26-28 μg magnesiumion, of 66-140 μρ Zn2+, bij voorkeur 70 g zinkion te worden toegevoegd.

50 Injectieoplossingen worden geïsotoniseerd met behulp van een hexose of een hexitol, voorbeelden daarvan zijn glucose, mannitol en maltose. De werkelijke hoeveelheid van het isotoniseermiddel kan via osmometrie worden bepaald.

De oplossing kan een hulpoplosmiddel, zoals ethanol of een glycoether (polyalkyleenglycol) met een hoger molecuulgewicht bevatten. Bij voorkeur bevat het preparaat ethanol en glycolether in een hoeveelheid 55 van 4-8% respectieve 5-15%.

De stabiele, voor gebruik gerede injectieoplossingen kunnen ook een gebruikelijk conserveermiddel bevatten, zoals benzylalcohol, Nipagin A, Nipagin M, nipasol (propylparabeen) of een mengsel daarvan 192779 4 (nipacombine) in een voor gebruik geschikte combinatie.

Als antioxidatiemiddel kan bijvoorbeeld natrium- of kaliumpyrosulfiet worden gebruikt in een concentratie van 0,02-0,15%, bij voorkeur 0,-05%.

De pH van de stabiele oplossingen dient te worden ingesteld op een waarde van 3,0-6,0, bij voorkeur 5 3,5-5,0. In het geval van vincristine is de voorkeurs-pH 4,5, zoals goedgekeurd door USP XX. In aanwezigheid van de gebruikte metaatzouten is een gewenste pH gemakkelijk te handhaven.

Volgens een voorkeursuitvoeringsvorm van de uitvinding wordt een voor de complexvorming voldoende hoeveelheid metaalzout opgelost in een steriel, gedestilleerd, pyrogeen-vrij water, eventueel tezamen met de gebruikelijke toevoegsels, zoals een isotoniseermiddel, een hulpoplosmiddel, een buffer, een conserveer-10 middel en een antioxidant, terwijl aan de aldus verkregen oplossing de waterige oplossing van de gewenste bis-indoolverbinding wordt toegevoegd. De oplossing wordt aangevuld tot het eindvolume met bacteriosta-tisch water voor injectie, wordt gehomogeniseerd, wordt onderworpen aan steriele filtratie en vervolgens verdeeld in steriele ampullen onder inerte gasatmosfeer.

De interactie tussen vincristine en bepaalde metaalionen, zoals zink, calcium en magnesium, werden 15 bestudeerd aan de hand van polarografische en potentiometrische evenwichtsmetingen.

Voor het onderzoeken van de VCR-zink-interactie werd een reeks monsters, waarvan elk een constante hoeveelheid zinkionen (10"4 mol/l) en variërende hoeveelheden vincristine in de vorm van zijn sulfaatzout variërend van 10‘3 tot 10'5 mol VCR/I, bereid. De pH van deze waterige oplossingen werd ingesteld op 5,5 met een azijnzuur-natriumacetaatbuffer van 0,15 mol/l concentratie (hierna genoemd als bufferoplossing).

20 De monsters werden onderworpen aan polarografische analyse. Er zijn drie karakteristieken polarogram-men weergegeven in figuur 1.

Polarogram A werd verkregen uit de bufferoplossing, die 10'4 mol zinkchloride/l bevatte.

Polarogram B is afkomstig van de bufferoplossing, die 10'4 mol zinkchloride/l en 5 χ 10'4 mol VCR/I bevatte.

25 Polarogram C werd verkregen uit de bufferoplossing, die zowel zinkchloride als de VCR in 10-4 mol/l concentratie bevatte.

De curves werden als volgt geïnterpreteerd: wanneer een overmaat VCR aanwezig is, kan er op het polarogram geen zinkgolf worden gezien. Dit wijst op de vorming van een zinkcomplex met hoge stabiliteit. Oscillatie, die wijst op de oorspronkelijke aanwezigheid van de polarografische zinkgolf, werd waargenomen 30 bij ca. 1:1 VCR:zink molaire verhouding, vlak voor de depolarisatie die werd veroorzaakt door de katalytische waterstofgolf. Verdere daling in de VCR concentratie resulteerde in de ontwikkeling van de zinkgolf en wanneer de VCR-concentratie werd verlaagd tot 2,5 χ 10 s mol/l of beneden deze waarde, vertoonden de vorm en de halfwaardepotentiaal van de golf geen verdere veranderingen en was dezelfde als in het geval van de vrije zinkionen.

35 De bovengenoemde resultaten laten zien, dat een stabiel complex werd verkregen tussen zinkionen en VCR, zelfs bij hun 1:1 molaire verhouding.

Interactie tussen VCR en calcium- of magnesiumionen werd indirect bestudeerd, waarbij met name het effect van de metaalionen op de polarografische eigenschappen van het VCR-zinksysteem werd onderzocht. Meer in het bijzonder werden aan een oplossing van VCR en zinkionen in 1:1 molaire verhouding 40 (het signaal, dat wijst op de aanwezigheid van zink, verschijnt juist in het polarogram) geleidelijk toenemende hoeveelheden calcium- of magnesiumchloride toegevoegd.

Het effect van calciumionen is weergegeven in figuur 2 waarin polarogram A werd verkregen uit de bufferoplossing, die 10'4 mol/l zinkchloride en 10"4 mol/l VCR bevatte.

Polarogram B werd verkregen uit de bufferoplossing, waarbij 10'4 mol/l zinkchloride en 5 mol/l calcium-45 chloride werd opgelost, terwijl polarogram C werd verkregen uit de bufferoplossing, die 5 mol/l calcium-chloride, 10"4 mol/l zinkchloride en 10'4 mol/l VCR bevatte.

Het effect van magnesiumionen is weergegeven in figuur 3, waarin polarogram A dezelfde is als in figuur 2, terwijl polarogrammen B en C werden verkregen uit de bufferoplossingen, die 5 mol/l magnesiumchloride in plaats van calciumchloride bevatten, terwijl de andere bestanddelen dezelfde waren als in geval van 50 figuur 2.

Beide figuren laten zien, dat toename in de concentratie van hetzij de calciumionen, hetzij de magnesiumionen, resulteert in de ontwikkeling van een polarografische golf, die karakteristiek is voor de vrije zinkionen. Wanneer het 5 mol/l calcium- of magnesiumionconcentratieniveau is bereikt, werd in alle polarogrammen dezelfde volledig ontwikkelde zinkgolf waargenomen (hetgeen identiek is aan de vrije 55 zinkionen zowel in de termen van halfgolfpotentiaal als beperkende (diffusie) stroom), hetgeen daarop wijst, dat de zinkionen vrijgemaakt werden door de calcium- of magnesiumionen uit het complex. Aangezien een ca. 50.000-voudige hoeveelheid aan calcium- of magnesiumionen is vereist voor de totale substitutie van 5 192779 het zink, is de geschatte stabiliteit van het zink-VCR-complex in de orde 4,5-5 hoger dan die van de complexen, die gevormd zijn hetzij met calcium, hetzij met magnesium.

De stabiliteitsconstante van het complex, dat is gevormd bij de reactie van calciumionen met het vincristineligande werd bepaald via potentiometrische evenwichtsmetingen.

5 Het sulfaat van vincristinesulfaat hoofdsubstantie is vervangen door chlorideionen. Het op deze wijze gevormde vincristinechloride werd gebruikt voor de verdere evenwichtsstudies.

Waterige oplossingen met een pH van 5,5 werden bereid uit het vincristinechloride met VCR-concentraties van 5 x 10-4 mol/l tot 2 χ 10'3 mol/l. De VCR-concentratie bij elke afzonderlijke serie metingen werd op constant niveau gehouden. De ionensterkte van deze oplossingen werd ingesteld op 1,0 door 10 toevoeging van natriumnitraat aan de oplossingen, teneinde de activiteitscoefficiënten op een constant niveau te houden.

Deze VCR-oplossingen werden getitreerd in een computergeregelde potentiometrische titratie-inrichting bij 25°C met 0,1 mol/l calciumchloride standaard-oplossingen onder gebruikmaking van een speciaal calciumion-selectieve membraanelektrode (zie DD146.101) en een Ag/AgC1-referentie elektrode (Radelkis 15 0P0820P-model). De concentratie van de calciumchloride standaardoplossing werd via complexometrische titratie gecontroleerd.

Een typische grafiek van elektrodepotentiaalwaarden versus calciumionconcentraties is afgebeeld in figuur 4 (pCA = -log[Ca]2+, waarbij curve 1 de calibratiecurve van de elektrode is, terwijl curve 2 de titratiecurve weergeeft, die is verkregen voor 10'3 mol/l vincristine-oplossing. De laatste toont de complex-20 vorming tussen calciumionen en VCR door de afname in de vrije calciumionconcentratie tengevolge van de aanwezigheid van vincristine.

Gebaseerd op de potentiometrische resultaten werd het aantal calciumionen, dat is gebonden door één vincristinemolecuul (n) berekend. De maximale verkregen waarde voor n was 1, hetgeen wijst op de vorming van een complex met een 1:1 Ca:VCR-concentratieverhouding. De stabiliteitsconstante (5), 25 berekend voor dit complex uit de evenwichtsgegevens, bleek log β = 3,27±0,1 te zijn.

Figuur 5 toont de n-waarden, berekend uit de potentiometrische gegevens (punten) en berekend op basis van de evenwichtsconstante (continue lijn). De goede overeenkomst tussen de experimenteel bepaalde en computer-gesimuleerde n-waarden levert het bewijs voor de correctheid van de resultaten.

De pH-afhankelijkheid van de genoemde complexvormingsreacties werd onderzocht door Calvin-type 30 deprotonatie-evenwichtsmetingen, door bestudering van de pH-afhankelijkheid van het polarografische gedrag van het Zn-VCR-systeem en aan de hand van de potentiometrische calciumioncoördinatiestudies in oplossingen met verschillende pH. Geen van deze onderzoekingen heeft de pH-afhankelijkheid van het complexvormingsproces opgeleverd in het pH-gebied van 3,5-5,5. Dit betekent, dat de genoemde ionen (Zn2+, Ca2+, Mg2+) worden gecoördineerd via de zuurstofdonoratomen van vincristine, die niet zijn geproto-35 neerd in het genoemde pH-gebied.

De metaalcomplexen kunnen in vaste toestand worden geïsoleerd en geanalyseerd.

Stabiliteitsproeven, waarbij het werkelijke gehalte aan werkzaam bestanddeel werd gecontroleerd, werden uitgevoerd volgens HPLC-methode (USP XXI.p. 1118). In geval van VCR werden bijvoorbeeld de monsters uitgevoerd door een kolom ( 250 χ 4,6 mm) verpakt met Nucleosil 5 C8 (Chrompack) bij een 40 stromingssnelheid van 2 ml/min. De elutie werd verricht met een mengsel van methanol, water en diethyla-mine (pH 7,5), terwijl het VCR-gehalte werd bepaald bij 297 nm, met behulp van externe standaardmonsters, die vincristinesulfaat USP referentiestandaard in waterige oplossing bevatten.

Versnelde stabiliteitsproeven werden uitgevoerd uit drie groepen monsters van verschillende oorsprong, waarbij namelijk monster 1 werd bereid volgens voorbeeld I van het onderhavige octrooischrift, voorbeeld lil 45 volgens voorbeeld 1 van Belgisch octrooischrift No. 897.280 en voorbeeld II Oncovin (Eli Lilly) was, dat beschikbaar is op de markt. De monsters werden gedurende 5 respectieve 10 dagen bewaard bij 75°C.

De proefresultaten zijn in tabel A vermeld.

192779 6

TABEL A

No. van monster VCR- VCR-gehalte % bij 75°C Kleur* na gehalte —- 5 (%) bij de na 5 na 10 5 dagen 10 dagen start dagen dagen 1 100 82,6 69,6 2y 3y 2 100 67,9 43,3 4y 5y 10 3 100 80,6 59,6 2y 4y •Zie: Colorimetric Matching Fluids, Vlth Hungarian Pharmacopeia, English Edition, Vol. I, biz. 328.

Uit de tabel volgt duidelijk, dat monster 1, bereid volgens de onderhavige aanvrage (VCR-Ca2+ complex), 15 een veel betere stabiliteit had dan de andere twee monsters, die het VCR in vrije vorm bevatten.

Voor lange termijn-stabiliteitsproeven werd een oplossing van een VCR-Ca2+ complex, bereid volgens voorbeeld 1, toegepast. In drie ampullen werden telkens 5 ml van bovengenoemde oplossing overgebracht.

De ampullen werden onder steriele omstandigheden afgesloten en gedurende 12 maanden bij 5°C bewaard.

Het VCR-gehalte, bepaald door HPLC, is opgenomen in tabel B/a. Uit de resultaten blijkt duidelijk, dat 20 praktisch geen ontleding optrad.

TABEL B/a VCR-gehalte (%), na 25 bij begin 3 maanden 6 maanden 9 maanden 12 maanden 100,8 100,9 100,2 100,5 98,7 30 Door in hoofdzaak de bovengenoemde methode te volgen, echter onder gebruikmaking van ampullen (normale chargegrootte) werden de volgende resultaten verkregen (opslag: in een koelkast bij 2-8°C): TABEL B/b 35 bij begin na 3 6 9 12 maanden maanden maanden maanden VCR-gehalte (%) 97,5 96,9 95,4 96,3 95,1 40 Aanverwante alkaloïden (%) 1,9 2,5 3,0 2,8 3,1 -------—-------- 1,1 ml porties van een charge van oplossing, bereid volgens voorbeeld I, werden verdeeld in 200 ampullen. De ampullen werden afgesloten onder steriele omstandigheden, waarvan 100 vervolgens 45 bewaard werden bij 5°C, terwijl de overige 100 ampullen gedurende 15 maanden bij kamertemperatuur bewaard werden. De stabiliteitsgegevens zijn in tabel C vermeld.

TABEL C

50 VCR-gehalte (%)

Opslagduur opgeslagen bij 5°C bij kamertemperatuur zero tijd 100,0 100,0 55 1 maand 98,0 98,4 2 maanden 100,4 96,4 7 192779 TABEL C (vervolg) VCR-gehalte (%)

Opslagduur opgeslagen 5 bij 5°C bij kamertemperatuur 3 maanden 100,4 98,4 4 maanden 100,4 97,6 5 maanden 98,7 102,8 10 6 maanden 99,4 100,3 7 maanden 100,3 98,3 8 maanden 100,2 96,7 10 maanden 99,2 94,3 12 maanden 98,3 91,7 15 15 maanden 98,1 85,5

De in tabel C opgenomen gegevens laten zien, dat bij 5°C geen ontleding optrad, terwijl bij kamertemperatuur een geringe afname van het VCR-gehalte kon worden waargenomen.

20 De experimentele gegevens hebben onbetwist bevestigd, dat de complexen, gevormd tussen een bis-indoolverbinding en een metaalion, uitstekende stabiliteitseigenschappen hebben. Bij opslag bij 5°C treedt er zelfs na 2 jaren opslag geen verandering in het gehalte van het werkzame bestanddeel op.

Bovendien kunnen oplossingen, die het complex bevatten, worden gesteriliseerd bij 100°C zonder ontleding van het werkzame bestanddeel.

25 De uitvinding wordt nader toegelicht aan de hand van de volgende voorbeelden.

Voorbeeld 1

Vincristinesulfaat 0,1 g propyl-p-hydroxibenzoaat 0,02 g 30 azijnzuur (98%) 0,025 g calciumgluconaat H20 0,05 g natriumacetaat 3H20 0,06 g methyl-p-hydroxibenzoaat 0,13 g ethanol (96%) 5,0 g 35 mannitol 10,0 g gedestilleerd water voor injectie tot 100,0 ml

De bovengenoemde hoeveelheden mannitol, calciumgluconaat en natriumacetaat werden opgelost in een gelijk deel gedestilleerd water voor injectie, dat tevoren werd ontgast en met stikstof werd doorspoeld. Aan 40 deze oplossing werd azijnzuur toegevoegd. Propyl-p-hydroxibenzoaat en methyl-p-hydroxibenzoaat werden opgelost in 96% ethanol, waarna zij vermengd werden met de waterige oplossing. Tenslotte werd in een portie van het gedestilleerde water het vincristinesulfaat opgelost en vervolgens aan de andere bestanddelen toegevoegd. Het volume van de oplossing werd aangevuld tot 100 ml. De oplossing werd gehomogeniseerd, onder steriele omstandigheden gefiltreerd en vervolgens verdeeld in steriele ampullen onder inerte 45 beschermende gasatmosfeer, waarna de ampullen werden afgesloten.

Voorbeeld II

Vincristinesulfaat 0,1 g propyl-p-hydroxibenzoaat 0,005 g 50 magnesiumgluconaat 0,045 g azijnzuur (98%) 0,025 g natriumacetaat. 3H20 0,0256 g methyl-p-hydroxibenzoaat 0,05 g mannitol 5,0 g 55 ethanol (96%) 5,0 g gedestilleerd water voor injectie tot 100,0 ml 192779 8

Onder gebruikmaking van de bovengenoemde bestanddelen werd een soortgelijke procedure uitgevoerd als in voorbeeld I onder oplevering van het waterige preparaat.

Voorbeeld III

5 Vincristinesulfaat 0,1 g azijnzuur (98%) 0,025 g natriumacetaat.3H2Q 0,06 g zinkgluconaat 0,049 g benzylalcohol 0,9 g 10 ethanol 5,0 g mannitol 15,0 g gedestilleerd water voor injectie tot 100,0 ml

In een gelijk deel gedestilleerd water, dat vers werd ontgast en met stikstof doorspoeld, werd het mannitol 15 en zinkgluconaat opgelost. Aan deze oplossing werd azijnzuur en het mengsel van ethanol en benzylalcohol toegevoegd. Tenslotte werd het vincristinesulfaat, opgelost in een minimale hoeveelheid van het gedestilleerde water, toegevoegd aan de oplossing, waarna het volume ervan werd aangevuld tot 100 ml. De gehomogeniseerde oplossing werd onderworpen aan steriele filtratie, vervolgens verdeeld in steriele ampullen onder inerte beschermende gasatmosfeer, waarna de ampullen werden afgesloten.

20

Voorbeeld IV

Vincristinesulfaat 0,1 g propyl-p-hydroxibenzoaat 0,005 g caiciumacetaat.H20 0,0222 g 25 azijnzuur (98%) 0,025 g natriumacetaat.3H20 0,0256 g methyl-p-hydroxibenzoaat 0,05 g ethanol (96%) 5,0 g mannitol 5,0 g 30 gedestilleerd water voor injectie tot 100,0 ml

Met de bovengenoemde componenten werd een soortgelijke procedure als in voorbeeld I uitgevoerd i onder oplevering van een waterig preparaat.

35 Voorbeeld V

Vincristinesulfaat 0,1 g azijnzuur (98%) 0,025 g natriumacetaat.3H20 0,026 g calciumgluconaat 0,056 g 40 benzylalcohol 0,9 g sorbitol 5,0 g polyethyleenglycol 400 10,0 g gedestilleerd water voor injectie tot 100,0 ml 45 In een gelijk deel vers ontgast en met stikstof doorstroomd gedestilleerd water voor injectie werden achtereenvolgens sorbitol en calciumgluconaat opgelost. Aan deze oplossing werden azijnzuur en het mengsel van benzylalcohol en polyethyleenglycol 400 toegevoegd. Dan werd vincristinesulfaat, opgelost in een minimale hoeveelheid gedestilleerd water, bijgemengd aan de oplossing, die tenslotte werd aangevuld tot het eindvolume. Dan werd de oplossing gehomogeniseerd en onder steriele omstandigheden gefiltreerd.

50 De steriele oplossing werd verdeeld over steriele ampullen onder inerte beschermende gasatmosfeer, waarna de ampullen werden afgesloten.

Voorbeeld VI

Vinblastinesulfaat 0,1 g 55 propyl-p-hydroxibenzoaat 0,005 g calciumacetaat.H20 0,023 g azijnzuur (98%) 0,049 g

Claims (7)

9 192779 Voorbeeld VI (vervolg) natriumacetaat.3H20 0,049 g methyl-p-hydroxibenzoaat 0,05 g ethanol (96%) 5,0 g 5 mannitol 5,0 g gedestilleerd water voor injectie tot 100,0 ml Met de bovengenoemde componenten werd een soortgelijke procedure uitgevoerd als in voorbeeld I onder oplevering van een waterig preparaat. 10 Voorbeeld VII Vincristinesulfaat 0,1 g propyl-p-hydroxibenzoaat 0,02 g azijnzuur (98%) 0,025 g 15 zinksulfaat 0,033 g natriumacetaat.3H20 0,06 g methyl-p-hydroxibenzoaat 0,13 g ethanol (96%) 5,0 g mannitol 10,0 g 20 gedestilleerd water voor injectie tot 100,0 ml Met de bovengenoemde componenten werd een soortgelijke procedure uitgevoerd als in voorbeeld I onder oplevering van een waterig preparaat. 25

1. Werkwijze voor de bereiding van een farmaceutisch aanvaardbaar metaalcomplex van een bis-indoolverbinding, met het kenmerk, dat men een oplossing van een bis-indoolverbinding met de algemene 30 formule 1 van het formuleblad, waarin R1 een methyigroep voorstelt, R2 een waterstofatoom voorstelt, R3 een hydroxilgroep voorstelt, of R2 en R3 tezamen een valentiebinding voorstellen,

35 R4 een hydroxil- of acetoxigroep voorstelt, terwijl R5 een methoxi- of aminogroep voorstelt, of R1 een formylgroep voorstelt, R2 een waterstofatoom voorstelt, R3 een hydroxilgroep voorstelt, of 40 R2 en R3 tezamen een expoxigroep voorstellen, R4 een waterstofatoom of een acetoxigroep voorstelt, en R5 een methoxigroep voorstelt of een farmaceutisch aanvaardbaar zout daarvan in een waterig medium omzet met een niet-toxisch, in water oplosbaar zout van een twee- of meerwaardig metaal, dat in staat is complexen te vormen bij een pH 45 van 3,0-6,0, en men het verkregen metaalcomplex desgewenst isoleert.

2. Werkwijze volgens conclusie 1, met het kenmerk, dat de hoeveelheid van het niet-toxische twee- of meerwaardige metaalion voldoende is voor het verschaffen van een molaire verhouding van metaal tot bis-indoolverbinding van 0,95 tot 1,05:1.

3. Werkwijze volgens conclusie 1 of 2, met het kenmerk, dat de bis-indoolverbinding met de algemene 50 formule 1 van het formuleblad vincristine of vinblastine of een farmaceutisch zout daarvan is.

4. Werkwijze volgens een der conclusies 1-3, met het kenmerk, dat het niet-toxische twee- of meerwaardige metaalion, dat in staat is complexen te vormen, een zink (II)-, calcium (II)- of magnesium (ll)-ion is.

5. Complex van vincristine met een zink (II)-, calcium (II)- of magnesium (ll)-ion.

6. Complex van vinblastine met een zink (II)-, calcium (II)- of magnesium (ll)-ion. 192779 10

7. Stabiele waterige farmaceutische preparaten, die als werkzaam bestanddeel een farmaceutisch aanvaardbaar complex van een bis-indoolverbinding met de algemene formule 1 van het formuleblad met een twee- of meenwaardig metaal in een therapeutisch effectieve hoeveelheid bevatten. Hierbij 6 bladen tekening