DE3429573A1 - Bei gaerung zur clavinmutterkornalkaloiderzeugung, insbesondere elymoclavinerzeugung, faehiger claviceps fusiformis-variantenstamm sowie verfahren zu seiner herstellung und seine verwendung zur herstellung von clavinmutterkornalkaloiden - Google Patents
Bei gaerung zur clavinmutterkornalkaloiderzeugung, insbesondere elymoclavinerzeugung, faehiger claviceps fusiformis-variantenstamm sowie verfahren zu seiner herstellung und seine verwendung zur herstellung von clavinmutterkornalkaloidenInfo
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Description
DR. STEPHAN G. BESZfDES PATENTANWALT VNR: 101265
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PROFESSIONAL REPRESENTATIVE ALSO BEFORE THE EUROPEAN PATENT OFFICE
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(VIA Bayerische Landesbank
P 2 006
zur Patentanmeldung
RICHTER GEDEON VEGY^SZETI R.T.
Budapest, Ungarn
betreffend
Bei Gärung zur CTavinmutterkornalkaloiderzeagung,
insbesondere Elymoclavinerzeugung, fähiger Claviceps
fusiformis—Variantenstamm sowie Verfahren zu seiner
Herstellung und seine Verwendung zur Herstellung von Clavinmutterkornalkaloiden
Die Erfindung betrifft einen neuen bei Gärung zur CIavinmutterkornalkaloiderzeugung,
insbesondere Elymoclavinerzeugung, fähigen Claviceps fusiformis-Variantenstamm sowie
ein Verfahren zu seiner Herstellung und seine Verwendung zur Herstellung von Clavinmutterkornalkaloiden auf dem Wege
einer Gärung.
Es ist bekannt, daß die Pflanzenparasiten Claviceps-—Pilze
in Symbiose mit ihren Wirtspflanzen zur Biosynthese von Mutterkornalkaloiden fähig siod. !fan den die Clavinmutterkornalkaloide
erzeugenden Claviceps-Stämmen war lange bekannt, daß sie die charakteristischen Alkaloide auch auf
dem Wege der Gärung erzeugen (M. Abe und Mitarbeiter: J. Agric. Chem. Soc. [Japan] 2£ [1952], 458). Obwohl es
für die Technik beziehungsweise Industrie nicht von Bedeutung war, bedeutet es für die Forschung der Biosynthese
des Grundgerüstes lange eine entsprechende Basis (L. C. Vining und Mitarbeiter: Can. J. Microbiol. 12. [1966], 915;
H. G. Floss: Tetrahedron £2 [1976], 873).
Das erste technische beziehungsweise industrielle Verfahren wurde von G. T. Banks und Mitarbeiter ausgearbeitet
(J. Gen. Microbiol. 82 [1974], 345). In ihrem Verfahren
wurde von ihnen Agroclavin mit einem aus dem Sklerocium von
Pennisetum typhoideum isolierten und dann durch Selektion verbesserten Stamm von Claviceps fusiformis hergestellt.
Dann wurden von Rehacek neue Claviceps purpurea-Mutanten
hergestellt. Die eine Mutante war ein vor allem Agroclavin erzeugender Stamm. 2 weitere Mutanten erzeugten
300 bis 600 ug/ml Elymoclavin (J. Nat. Prod. 44 [1981],
225).
-8 -
In der sowjetischen Patentschrift 735 010 beziehungsweise Prikl. Biok. Mikrobiol. 16 [1980], 569 wurde die
Verwendung eines in der Natur vorkommenden Stammes von Claviceps fusiformis beschrieben· Bei der Gärung erzeugt
der Stamm kennzeichnend 6 verschiedene Clavinalkaloide. Das Gesamtalkaloidniveau beträgt 1 220 jug/ml und davon beträgt
die Menge von Elymoclavin bei Verwendung eines entsprechend ausgewählten Nährbodens 70 bis 75%·
Von S. H. Ambike und Mitarbeitern (Phytochem. _°/ [1970],
1 953 bis 1 95Ö) wurde festgestellt, daß die die Glavinalkaloide
erzeugenden Stämme Claviceps purpurea Cytochrom P-450
enthalten. Ferner wurde von ihnen beobachtet, daß mit dem Zusatzstoff Phenylbarbiturat die Menge von Cytochrom P-4-5Q
erhöht und dadurch gleichzeitig auch die Menge des erzeugten Gesamtalkaloides gesteigert werden kann.
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, einen bei Gärung zur Clavinmutterkornalkaloiderzeugung fähigen Mikroorganismenstamm,
welcher ein hohes Gesamtalkaloidniveau sichert und innerhalb der Gesamtalkaloidmenge möglichst
vorwiegend Elymoclavin eventuell neben leicht davon trennbaren anderen Alkaloiden, erzeugt, sowie ein Verfahren zu
seiner Herstellung und seine Verwendung zur Herstellung von Clavinmutterkornalkaloiden zu schaffen.
Das Obige wurde überraschenderweise durch die Erfindung
erreicht.
Als Ausgangsstamm wurde ein Stamm Claviceps fusiformis, der auf einem Glycerin/Pepton-Nährboden hauptsächlich Agröclavin
und als Nebenalkaloid Elymoclavin erzeugt (A. Tonolo
und E. Udvardy-Nagy: Acta Microbiol. Acad. Sei. Hung. Λ%
[196b], 29), verwendet. Dieser Stamm wurde am 2. Mai 1977
unter der Nummer MG 00164 bei der Nationalen Stammsammlung des Ungarischen Landesinstitutes für Gesundheitswesen
(Orszagos Közegeszsegügyi Intezet) hinterlegt.
Dieser als Ausgangsstamm verwendete Stamm Claviceps fusiformis enthält ähnlich wie der von Ambike eingesetzte
Stamm Claviceps purpurea ein alternierendes Oxydaseenzym, nämlich das Cytochrom P-450, und die erzeugte Gesamtalkaloidmenge
kann durch die Erzeugung von Cytochrom Ρ-Λ50
fordernde Stoffe, wie Barbiturate, erhöht werden.
Weiterhin wurde festgestellt, daß die Koloniemorphologie und Pigmentierung der in Gegenwart eines die Erzeugung
von Cytochrom P-450 fördernden Stoffes, wie Barbiturates,
gezüchteten Kultur wesentlich von der des Ausgangsstammes abweicht. Durch Wiederholung der Selektion
wurden die neuen morphologischen Eigenschaften so stabil, daß sie auch für den selektierten Stamm ohne Gegenwart des
Zusatzstoffes kennzeichnend waren. Der neue Stamm ergab auf einem zusatzfreien Nährboden im Vergleich zur Ausgangskultur
einen höheren Gehalt an Cytochrom P-A50.
Das Wachstum des neuen Stammes ist zurückhaltender und seine Polysaccharidbildung geringer, seine Alkaloid- und
Pigmenterzeugung dagegen stärker als die des Ausgangsstammes. Es ist völlig überraschend, daß der neue Stamm
hauptsächlich Elymoclavin erzeugt, während der Mutterstamm, das heißt der Stamm Claviceps fusiformis Nr. MG 00164
hauptsächlich Agroclavin erzeugt. Das Elymoclavin kann vom Agroclavin leicht abgetrennt werden, zum Beispiel nach der
ungarischen Patentschrift 171 659·
Dieser neue Stamm wurde am 2. Mai 1977 unter der Nummer MNG 00164 bei der Nationalen Stammsammlung des
Ungarischen Landesinstitutes für Gesundheitswesen
- 10 -
- 10 (Orszagos Közeg&szsegügyi Intezet) hinterlegt.
Gegenstand der Erfindung ist daher der bei Gärung zur Clavinmutterkornalkaloiderzeugung, insbesondere Elymodavinerzeugung,
fähige neue Claviceps füsiformis-Variantenstämm Claviceps purpurea, hinterlegt am 15. Oktober 1981 unter der
Nummer MNG 00211 bei der Nationalen Stammsammlung des Ungarischen Landesinstitutes für Gesundheitswesen (Orszägos
Közegeszsegügyi Intezet), mit den folgenden charakteristischen
Eigenschaften:
| Morphalogiaeher Charakter | MN'G 002LL |
| Koloniemorphologie | L5-2O mm fLache, scharf kantige, vioLefcte Luftmyzelkolonie (Fig. 2) |
| Auf mib Agar verfestigtem NTülu"- boden. "C" am 2 L. Tag (Figur 2) |
beige-lila Lockere, fVaumige KuLtür |
| En subiaeraer KuLtur· auf Nährboden "C" am 12. Tag α) makroskopische Erscheinung b) mikroskopisches Bild |
3-6 u dicke, lange, oft Ge flechte bildende Hyphen |
| - 11 - | |
« S.
| Biochemischer Charakter | 10 mMol/Liter 5 mMoL/Liter |
| Phenobarbitaltoleranz: a) auf Agarnährboden b) auf flüssigem Nährboden |
2,5-3,0 |
| Cyfcochrom P-450-Gehalt auf Nährboden "C" am 4.-7. Tag nMol/g trockene Zellmasse |
3,8 mg/ml |
| Polysaccharidbildung auf Nährboden "C" am 7- Tag auf Grund der Bildung von äthanolhaltigem Niederschlag |
200-250 |
| Geschwindigkeit der G-esamtalka- loidprodxüction auf ohne Zusatz von Agar hergestelltem Jialirbo— den "C" am 4.-7. Tag /ug/ml/Tag |
5-I5 _35-9£ 5-10 90-95 |
| Alkaloidzusammensetzung auf ohne Zusatz von Agar hergestell tem Nährboden "C" Agroclavin % Eiymoclavin $ auf ohne Zusatz von Agar herge stelltem Nährboden "D" Agroclavin % Eiymoclavin % |
- 12 -
bei Zusammensetzung der Nährböden "C" und 11D"
| Nährboden 11C" | 100,0 | S |
| Rohrzucker | 10,0 | g |
| Bernsteinsäure | 1,0 | S |
| Calciumnitrat | 1,0 | g |
| Ammoniumnitrat | 0,25 | g |
| Kaiiumhydrogenphosphat | 0,25 | g |
| Magne siumsulfat | 0,125 | g |
| Kaliumchlorid | 0,009 | g |
| Eisen(II)-sulfat | 0,003 | g |
| Zinksulfat | 30,0 | g |
| Agar-Agar | ||
pH 5,5-5*6 (mit NH^OH eingestellt) ,
zu dessen Herstellung die obigen Bestandteile in 1 1 Leitungswasser
bei einer Temperatur von 50 bis 600C gelost
werden, worauf die Lösung 30 Minuten lang bei 1100C sterilisiert
wird und dann der erhaltene Nährboden nach dem Abkühlen fest wird,
Nährboden 11D"
Glycerin 100,0 g
Pepton 20,0 g
Agar-Agar 30,0 g
zu dessen Herstellung die obigen Bestandteile bei einer
Temperatur von 50 bis 600C in 1 1 Leitungswasser gelöst
werden, der pH-Wert der Lösung auf 6,5 bis 6,8 eingestellt wird ι
wird.
wird.
Temperatur von 50 bis 600C in 1 1 Leitungswasser gelöst
6, wird und die Lösung 30 Minuten lang bei 1100C sterilisiert
Gegenstand der Erfindung ist auch ein Verfahren zur Herstellung und Aufrechterhaltung des erfindungsgeinäßen
- 13 -
Variantenstammes Claviceps purpurea, welches dadurch gekennzeichnet ist, daß der auf einem mindestens 1 Kohlenstoff-
und Stickstoffquelle(n) sowie Mineralsalz(e) enthaltenden
agarhaltigen festen Nährboden in Gegenwart eines die alternierende Oxydaseenzymerzeugung, hauptsächlich die Erzeugung
von Cytochrom P-450, fördernden Stoffes, in einer Menge von 1 bis 10 mMol, bezogen auf 1 1 Nährboden, 7 bis 21 Tage lang
bei einer Temperatur von 20 bis 28°C bebrütet wird und die erhaltenen vom Ausgangsstamm durch ihren lila (violetten)
Stich der beige Farbe und flach ausgedehnte Form gut unterscheidbaren Kolonien selektiert werden, gegebenenfalls die
Selektion, gegebenenfalls in Gegenwart eines die Erzeugung von Cytochrom F-45Q, fördernden Stoffes, wiederholt wird und
der erhaltene Variantenstamm Claviceps purpurea; der mindestens
au 85% Elymoclavin erzeugt, abgetrennt wird.
Vorzugsweise wird als die Erzeugung von Cytochrom P-450 fördernder Stoff ein barbituratartiger Zusatzstoff
verwendet, weil solche die erzeugte Gesamtalkaloidmenge besonders stark erhöhen.
Ferner ist Gegenstand der Erfindung die Verwendung des erfindungsgemäßen Tariantenstammes Claviceps purpurea zur
Herstellung von Clavinmutterkornalkaloiden der allgemeinen Formel
6N- CH-
E für einen Methyl- oder Hydroxymethylrest
steht,
durch Gärung in einem mindestens 1 Kohlenstoff- und Stickstof f quelle (n) und Mineralsalz(e) sowie gegebenenfalls anderefn]
Zusatzstoff(e) enthaltenden flüssigen Nährboden i,n submerser Kultur unter aeroben Bedingungen.
Im Falle, daß in der allgemeinen Formel E für einen Hydroxymethylre st steht, handelt es sich um Elymoclavin
und im Falle, daß E einen Methylrest bedeutet, um Agroclavin.
Von den hergestellten Alkaloiden ist das Elymoclav^Ji
das wertvollere, es wirkt analeptisch und hat eine Anti·-
parkinsonwirkung und hemmt die Prolactinsekretion (B. Berde und 0. Schild: Ergot Alkaloids and Eelated Compounds; Handb.
Exp. Pharm., 4£ [197Ö], Springer-Verlag, Berlin). Das
Elymoclavin ist ferner auch die Ausgangssubstanz beziehungsweise das Zwischenprodukt zur Herstellung von Lysergol
sowie des daraus herstellbaren Nicergolines.
Beispiele für zur Verwendung im erfindungsgemäßen Verfahren zur Herstellung des erfindungsgemäßen Variantenstammes
Claviceps purpurea MNG 00211 verwendbare Nährboden sind die folgenden:
- 15 «*
Nährboden "A." :
Rohrzucker LOO,0 g
1-Asparagin 10,0 g
Calciumn.itrat 1,0 g
Kaliuradihydrogenphosphat 0,25
Magnesiumsulfat 0,25 g
KaLiumchLorid Q,L25 S
Eisen(ll)-3ulfat 0,033 S
ZinJcsuLfafc 0,027 S
l-Cyateinhydrochlorid 0,010 g
Hefeextrakt - O1LOO s
Agar-Agar 30,Og pH 5,2 (mit VTaOH eingestellt).
Die obigen Beatandteile werden in 1 1 Leitungswasser
bei einer Temperatur von 50 bis-60 C gelöst, dann wird die Lösung 30 Minuten lang bei 110 C
sterilisiert. Dex· erhaltene Nährboden wird nach Abkühlen,
fest.
Nährboden "B"
Aus 39 S Kartoffelglukoseagar wird
ähnlich wie beim Nährboden "A" I 1 Nährboden gekocht.
Rohrzucker LOO1O s
Bernsteinsäure LO,0 g
Calciumnitrat 1,0 g
Ammoniumnitrat 1,0 g
- 16 -
Kaliiimhydrosenphosphat 0,25 g
Magnesiumsulfat 0,25 S
Kaliumchlorid 0,125 S
Eisen(ll)-sulfat 0,009 S
Zinksulfat 0,003 S
Agar-Agac 30,0 g
pH 5,5-5,6 (mit NH1+OH eingestellt).
Aus den obigen Bestandteilen wird ähnlich
wie beim Nährboden "AM 1 1 Nährboden gekocht.
Nährboden "D"
Glycerin 100,0 g
Pepton 20,0 g
Agar-Agar 30,0 g
Die obigen Bestandteile werden bei einer Temperatur von 50 bis 600C in 1 1 Leitungswasser gelöst, der pH-Wert
der Lösung wird auf 6,5 bis 6,8 eingestellt und die Lösung
wird 30 Minuten lang bei 1100C sterilisiert.
Auf einem der obigen Nährböden kann das Züchten unter sterilen aeroben Bedingungen bei einer Temperatur von
20 bis 280C in Gegenwart eines die Bildung von Cytochrom
P-450 fördernden Zusatzes, vorteilhaft eines barbituratartigen Zusatzstoffes, in einer Menge von 1 bis 10 mMol,
bezogen auf 1 1 Nährboden, durchgeführt werden. Als barbituratartige
Zusatzstoffe kommen in erster Linie N-Phenyl barbiturate, wie 5-(Äthyl)-5-(phenyl)-barbitursäure
[Phenobarbital] oder 5-(Äthyl)-1-(methyl)-5-(phenyl)-barbitursäure
[Methylphenobarbital], in Frage. Das Züchten wird
im allgemeinen 7 bis 21 Tage lang durchgeführt, worauf die Edonisn des neuen Stammes abgetrennt werden.
- 17 -
In der folgenden Tabelle sind die die Ausgangskultur
(MEfG 00164) und den neuen Stamm (MNG 00211) unterscheidenden wichtigsten morphologischen und biochemischen Merkmale
zusammengestellt:
Tpbelle
| MorphoLogischer Charakter | MNG 00 ιό*+ | MNG 002LL | LO mMoL/Liter |
| Ko Loni emorphologie | L0-L5 mm | L5-2O mm | 5 mMoL/Liter |
| Auf mit Agar verfestigtem Nähr | reich ge | fLache, scharf | |
| boden "C" am 2L. Tag | fältelte, | kantige, violet | |
| (Figuren. 1 und 2) | scharf | te Luftmyzel | |
| kantige , | kolonie | ||
| fceigefarbqne | (Fig. 2) | ||
| Ko Lo nie | |||
| • | (Fig, I) | ||
| In submerser KuLtür | |||
| auf Nährboden "C" tun 12. Tag | beigefarbene | beige-lila | |
| a) makroskopische Erscheinung | KuLtur mit | L ο cke re, flaumi | |
| watteartiger | ge Kultur | ||
| Viskosität | |||
| 3-6 αχ dicke | , Lange, oft | ||
| b) mikroskopisches Bild | GefLochte biLdende Hyphen | ||
| Biochemischer Charakter | |||
| PhenobarbitaLtoLeranz: | L raMoL/Liter | ||
| a) auf Agarnährboden | 0,6 raMo L/Liter | ||
| b) auf fLüsaigera Nährboden | |||
- 18 -
| MNG 0Ql6h | MNG 00211 | |
| Cytochrora P-^5O-GehaLt | ||
| auf Nährboden "C" am h.-7. Tag | ||
| nMol/g trockene Zellmasse | 1,0-1,5 | 2,5-3,0 |
| Polys accharidbi Ldung | ||
| auf Nährboden "C" am 7. Tag | ||
| auf Grund der Bildung von | ||
| äthanolhaItigern Niederschlag | 20,8 mg/mL | 3,8 mg/ml |
| Geschwindigkeit der Gesamtalkä— | ||
| Loidproduktion auf ohne Zusatz | ||
| von Agar hergestelltem HährbO— | ||
| den "C" am 4.-7. Tag | ||
| yug/ml/Tag | 50-80 | 200-250 |
| ALkaloidzusammensetzung auf | ||
| ohne Zusatz von Agar hergestell | ||
| tem Nährboden "C" | ||
| Agroclavin % | 75-80 | 5-15 |
| Elymoclavin $ | 20-25 | 85-90 |
| auf ohne Zusatz von Agar herge | ||
| stelltem Nährboden "D" | ||
| Agroclavin fo | 90-95 | 5-10 |
| Elymoclavin % | 5-10 | . 9O-:95 |
Der nach dem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellte neue Stamm Claviceps purpurea Nr. MNG 00211 kann zur Herstellung
von Clavinalkaloiden wie folgt eingesetzt werden:
Beispiele für das Gärungsverfahren zur Verwendung des
erfindungsgemäßen Stammes Claviceps purpurea Nr. KHG 002"ίί
geeignete flüssige Nährböden sind wie folgt:
- 19 -
Mannit 40,0 g/l
Bernsteinsäure 10,0 g/l
Maisbrei 2,0 g/l
Kaliumdihydrogenphosphat 1,0 g/l
Magnesiumsulfat 0,3 g/l
pH 5,2-5,3 (mit NHj+OH eingestellt)
Nährboden "F":
Eohrzucker 50,0 g/l
geriebene Kartoffeln 10,0 g/l
Ammoniuranitrat 1,0 g/l
Kaliumdihydrogenphosphat 0,25 g/l
Magnesiumsuirat 0,25 g/l
PH 5Λ-5.5 (mit NH^OH eingestellt)
Nährboden "G":
Sorbit 60,0 "g/l
Bernsteinsäure 36,0 g/l
Kaliumdihydrogenphosphat 0,25 g/l
Magnesiumsulfat 0,30 g/l
Eisen(ll)-sulfat 0,009 g/l
Zinksulfat · 0,003 g/l
pH 5,^-5,5 (mit NH^OH eingestellt).
Alle obigen Nährbodenzusammensetzungen werden zweckmäßig bei einer Temperatur von 50 bis 60 C in Leitungswasser gelöst und dann 30 Minuten lang bei 110° C sterilisiert.
Auf einem der obigen Nährböden oder auf dem Nährboden
nCn kann die Gärung ohne Zusetzen von Agar-Agar unter
sterilen aeroben Bedingungen in einer submersen Kultur 10 bis
- 20 -
15 Tage lang bei einer Temperatur von 20 bis 280C in einem
pH-Bereich von M,2 bis 6,0 durchgeführt werden·
Die Erfindung wird an Hand der folgenden Beispiel·© näher erläutert, wobei die Lösungsmittel-, Extraktionsmittel- und
Eluiermittelzusammensetzungen in Volumverhältnissen angjegeben
sind.
Die iJ+tägige, auf dem Nährboden "A" gewachsene
schiefe Agarkultur des unter der Nummer 00211 deponierter;
Claviceps fus iforrais-Variantenstammos wird mit 5 ml
physiologischer Salzlösung gewaschen. 1 ml der erhaltenen
Suspension wird auf,100 ml in einem 500 ml Erlenmeyer-
-Kolben vorbereiteten flüssigen Nährboden "C" geimpft,
und die Kultur wird bei einer Temperatur von Zk C auf
einem Schütteltisch (Frequenz: 2i*0/Min., Hublänge: 2 gm)
7 Tage lang "bebrütet.
Mit k ral der so hergestellton Impfkultux wird
die produzierende Fermentation begonnen. Für· die ALknipidptpduktion
werden in einem 500 ml-Erlenmeyer-Kolben 100 inJ.
N'ihr boden "C" sterilisiert. Während unter gleichen Bedingungen
wie bei der Herstellung der Impfkultur erfolgen*» der 12tägiger Kultivationszeit wird der Kultur jeweils
1,0 ml der 10 gew.-%-igen, sterilen, wäßrigen Lösung
des Hefeextraktes DiCco am 3. und 5· Tag zugesetzt.
Am Ende der Fermentation beträgt der trockene Myzelgehalt der beige-lila Kultur 18 g/l, in seinem
Filtrat auf Grund der Reaktion nach van ürk der Gesamtälkaloidgehalt
auf den Elymoclavinstandard berechnet 1300 )ug/ml.
- 21 -
- 2Λ -
Die Alkaloidkomponeafcen der KuLtur werden mit
folgender Methode bestimmt.: 20 ml Kultur werden mit ko ml
eines ^:1 Gemisches von Chloroform und IsopropanoL bei
einem pH-Wert von 9 extrahiert und aus der organischen Phase werden 10 ml im Vakuum zur Trockne eingedampft.
Der Eindampf rücks tarid wird in 0,5 ml eines 1:1 (römisches
von Chloroform und Methanol gelöst und 20 /ul der Lösung
durch Dünnschichtchromatographie anaLysiert. (Adsorbens:
DC Alufolien Kieselgel 60F„ . (Art 555^); Eluierraittoi:
5 Il
^:1 Gemisch von Chloroform und Äthanol; Entwicklung: mit
25^ nm UV-Lichtf Elyraoclavin: R„ = 0,20; Agroclavin:
Rp = 0,30). Das Alkaloid wird vom Adsorbens durch ein
Gemisch von jeweils 10 ml Bernsteinsäure und Methanol
abgelöst und die Absorption der Lösung bei 283 run gegenüber
einer Blindlösung gemessen. Der so bestimmte Elymoclavin-Gehalt
der 12tägigen Kultur beträgt II50 ,ug/ml,
der Agroclavin-Gehalt 55 ,ug/ml.
Die lyophilisierte Kultur des unter der Nummer 00211 deponierten Claviceps fusiformis-Variaatens tarames
wird in 2 ml physiologischer Salzlösung suspendiert und die Suspension auf 100 ml in einem 500 ml Erlenmeyer-
-Kolben sterilisierten Nährboden "E" geimpft. Das Inoculum wird unter den in Beispiel I beschriebenen Bedingungen
7 Tage lang -kultiviert, dann werden je 2 ml davon auf
2x100 ml in einem 500 ml Erlenmeyer-Kolben vorbereiteten
Nährboden "G" geimpft. Nach 3tägigem Schütteln bei 2^ °C
werden mit den Pfropfkulturen je 5 I sterilisierter Nährboden
"G", der sich in einem 10 I Glasfermentor befindet,
geimpft. Das Kultivieren wird bei 2k C. mit dem Durchströmen
von 0,5 Liter Luft pro Liter je Minute und unter Rühren mit einer Geschwindigkeit von U30 Umdrehungen/Minute
- 22 -
L2 Tage Lang fortgesetzt. Zum Hemmen des Schäumens wird
notwendigerweise SchaiunverhütungsmitteL StruktoL SB 2020
in einer Menge von etwa 0,5 ml/l zugesetzt.
Der trockene Myzelgehalt der KuLtur betragt
l6 g/l und ihr Alkaloidgehalt - durch die in Beispiel I
beschriebenen Methoden bestimmt - 1550 «g/ml GesamC-aLkaloid,
wovon l435 Aig/ml Elymoclavin und 90 /Ug/ral
Lavin sind.
Die LyophiLisierte Kultur des unter der Nummer
00211 deponierten Clavicepa fuaif ormia-Variantenstarames
wird in 2 ml physiologischer Salzlösung suspendiert, dann die Suspension auf Nährboden "B" geimpft. Die Kultur wird
in einem dunklen Raum bei 24 C l4 Tage lang bebrütet·
Die auf der Oberfläche gewachsene Kultur wird in 5 ml
physiologischer Salzlösung homogenisiert und je 2 ml da·*·
von werden auf je 100 ml in zwei 500 ml Erlenmeyer-Kolben
vorbereiteten Nährboden "F" geimpft. Die Kultur wird bei
2 4 °C 5 Tage Lang geschüttelt und dann auf 5 Liter sich
in einem LO Liter-Glasfermentor befindenden sterilisierten
Nährboden "C" geimpft.
Die Impfkultivierung orfolgt bei 24 C mit dem
Durchströmen von 0,5 Liter Luft pro Liter und Minute und
unter Rühren mit einer Geschwindigkeit von 430 Umdrehungen/
Minute 2 Tage Lang. Die so gewonnene KuLcur wird auf LLO
Liter sterilisierten N'ilirboden "C" geimpft, der sich in
einem säurebeständigen Stahlfermentor mit einem Fassungsvermögen
von l60 Litern befindet und 20 g/l Natriumchlorid enthält. Dzis Kultivieren wird mit dem Durchströmen
von 0,4 Liter Luft pro Liter und Minute und unter Rühren mit einer Geschwindigkeit van 220 Umdrehungen
pro Minute bei 2 4 C 12 Tage lang fortgesetzt. Zum Hemmen des Schäumens wird der Kultur das sterilisierte
- 23 -
Schaum verhütung s mit tel Struktol SB 2020 zugesetzt. Die
Menge der Kultur beträgt während der ganzen Fennentat ion etwa 220 ml. Der zum Ende des Kultivierens erreichte
trockene Myzelgehalt beträgt 15 g/l und der Gesamtalkaloidgehalt
1815 /Ug/niLj davon beträgt das Elymoclavinniveau
1630 /Ug/ml und das AgrocLavinniveau 2^0
/Ug/ml. Diese Verte wurden durch Hochdruck-Flüssigkeitschroraatographie
wie folgt bestimmt:
Aus der gefilterten Fermentbrühe wird ein Teil
mit destilliertem Wasser auf das Zehnfache verdünnt und 20 /Ul davon werden auf die mit dem Absorbens Nucleosil
10 C 18 gefüllte Säule (Abmessungen: ^,6x2 50 mm) des
Hochdruck-Flüssigkeitschromatographs Labor MIM injiziert.
Die Elution erfolgt mit einer Strömungsgeschwindigkeit von 1,0 ml/fainute und einein 3:2 Geraisch von Acetonitril
und 0,01 M Ammoniumcarbonatlöaung· Der Nachweis geschieht
mit einem UV-Detektox* bei 280 nm. Auf dem Chroniatogranim
erscheint das Elymoclavin mit einer Retentionszeit von 8,7 und das Agroclavin mit einer Retentionszeit von
32,0 Minuten.
~ Leerseite -
Claims (3)
1.) Bei Gaining zur Clavinmutterkornalkaloiderzeugung,
insbesondere Elymoclavinerzeugung, fähiger Claviceps
fusiformis-Variantenstamm Claviceps purpurea, hinterlegt
am 15. Oktober 1981 unter der Nummer MNG 00211 bei der Nationalen Stammsammlung des Ungarischen
Landesinstitutes für Gesundheitswesen (Orszagos Közegeszsegügyi Intezet), mit den folgenden charakteristischen
Eigenschaften:
flache, scharf
kantige, violette
Lu.f tmyz β lkol onie
(Fig. 2)
boden 11C" am 21. Tag
(Figur 2)
:lockere, flaumige
Kultur
auf Nährboden "C" am 12. Tag
a) makroskopische Erscheinung
b) mikroskopisches Bild
lange, oft Ge
flechte bildende
Hyphen
5 mMoL/Liter
a) auf Agarnährboden
b) auf flüssigem Nährboden
auf Nährboden "C" am ^.-7. Tag
nMoL/g trockene Zellmasse
auf Mährboden "C" am 7. Tag
auf Grund der Bildung von
äthanolhaltigern Niederschlag
Loidproduktion auf ohne Zusatz
von Agar hergestelltem MährbO—
den "C" am 4.-7. Tag
/ug/mL/Tag
35-90
5-10
90-95
ohne Zusatz von Agar hergestell
tem Nährboden "C"
Agroclavin %
ELymoclavin $
auf ohne Zusatz von Agar herge
stelltem Nährboden "D"
Agroclavin 'fo
Elymoclavin $
bei Zusammensetzung der Nährböden "C" und "Dn
Nährboden "Gn
pH 5,5-5,6 (mit NH^OH eingestellt). ,
zu dessen Herstellung die obigen Bestandteile in 1 1 Leitungswasser bei einer Temperatur von 50 bis
60 C gelöst werden, worauf die Lösung 50 Minuten lang bei 1100C sterilisiert wird und dann der erhaltene
Nährboden nach dem Abkühlen fest wird,
Nährboden WD"
Glycerin 100,0 g
Pepton 20,0 g
Agar-Agar 50,0 g ,
zu dessen Herstellung die obigen Bestandteile bei einer Temperatur von 50 bis 600C in 1 1 Leitungswasser
gelöst werden, der pH-Wert der Lösung auf 6,5 bis 6,8 eingestellt wird und die Lösung 50 Minuten
lang bei 1100C sterilisiert wird.
— 5 —
2.) Verfahren zur Herstellung und Aufrechterhaltung des
Variantenstammes Claviceps purpurea nach Anspruch 1,
dadurch gekennzeichnet, daß man den Stamm Claviceps fusiformis, hinterlegt am 2. Mai 1977 unter der Hummer
MNG 00164 bei der Nationalen Stammsammlung des Ungarischen Landesinstitutes für Gesundheitswesen
(Orszagos Közegeszsegugyi Intezet), als Ausgangsatoff
auf einem mindestens 1 Kohlenstoff- und Stickstoffquelle(n) sowie Mineralsalz(e) enthaltenden
agarhaltigen festen Nährboden in Gegenwart eines die alternierende Oxydaseenzymerzeugung, hauptsächlich
die Erzeugung von Cytochrom P-4-50, fördernden
Stoffes, in einer Menge von 1 bis 10 mMol, bezogen auf 1 1 Nährboden, 7 bis 21 Tage lang bei einer
Temperatur von 20 bis 280C bebrütet und die erhaltenen
vom Ausgangsstamm durch ihren lila Stich der beige Farbe und flach ausgedehnte Form gut unterscheidbaren Kolonien selektiert, gegebenenfalls
die Selektion, gegebenenfalls in Gegenwart eines die Erzeugung von Cytochrom P-450 fordernden
Stoffes, wiederholt und den erhaltenen Variantenstamm Claviceps purpurea,, der mindestens zu
85% Elymoclavin erzeugt, abtrennt.
3.) Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man als die Erzeugung von Cytochrom Ρ-Λ50 fördernden
Stoff einen barbituratartigen Zusatzstoff verwendet.
4·.) Verwendung des Variantenstammes Claviceps purpurea
nach Anspruch 1 zur Herstellung von Clavinmutterkornalkaloiden der allgemeinen Formel
6H- CH-
H für einen Methyl- oder Hydroxymethylrest
stehtt
durch Garung in einem mindestens 1 Kohlenstoff- und
Stickstoffquelle(n) und Mineralsalz(e) sowie gegebenenfalls
andere[n] Zusatzstoff(e) enthaltenden flüssigen Nährboden in submerser Kultur unter aeroben
Bedingungen.
Beschreibung
Applications Claiming Priority (1)
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|---|---|---|---|
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| DE3429573A1 true DE3429573A1 (de) | 1985-02-28 |
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