JPS63313593A - クラビンアルカロイドの製造方法 - Google Patents

クラビンアルカロイドの製造方法

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JPS63313593A
JPS63313593A JP63045978A JP4597888A JPS63313593A JP S63313593 A JPS63313593 A JP S63313593A JP 63045978 A JP63045978 A JP 63045978A JP 4597888 A JP4597888 A JP 4597888A JP S63313593 A JPS63313593 A JP S63313593A
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    • C12P17/183—Heterocyclic compounds containing nitrogen atoms as the only ring heteroatoms in the condensed system containing an indolo[4,3-F,G]quinoleine nucleus, e.g. compound containing the lysergic acid nucleus as well as the dimeric ergot nucleus
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 この発明は、次の一般式（Ｉ）、 （式中、凡はメチル基又はヒドロキシメチル基である） で表わされるクラビンアルカロイドの微生物学的製造方
法に関する。
〔従来の技術〕
製造される上記アルカロイドの内、エリモクラビン（＊
ｌｙｍｏｅｌａｖ１ｎｓ　）　（Ｒ＝ヒドロキシメチル
）が、興奮効果及び抗・９−キンノン効果を有する薬剤
として、並びにプロラクチン分泌を阻害するものとして
、まず興味深い（Ｂ、　Ｂａｒｄ・及び００Ｓｃｈ１１
ｄ　：　Ｅｒｇｏｔｓ　ａｌｋａｌｏｉｄｓ　ａｎｄ　
ｒｅｌａｔｅｄｃｏｍｐｏｕｎｄ＠　：　　Ｈａｎｄｂ
、　　Ｅｘｐ、　　Ｐｈａｒｍ　＠ｌ　４９　、　　ス
フリンガ−７エルラーク、ベルリン（Ｉ９７８））。
さらに、エリモクラビン社すゼルゴール（ｌｙｓ＠ｒ−
ｇｏｌ　）合成の可能性ある出発材料であり、そしてニ
セルゴリン（ｎｉｃｅｒｇｏｌｌｎｅ　）の中間体であ
る。
アルボフラビン（Ｒ＝メチル）はエリモクラビンの前駆
体である。
クラピセブス菌株は、宿主−寄生生物相互関係において
、ライ麦上で麦角アルカロイドを生合成することができ
ることが知られている。クラピン生産性クラビセデス株
について、これらが死物寄生条件下においても問題のア
ルカロイドを生産することも知られｆｉ　［Ｍ、　Ａｂ
＊等、Ｊ＊　Ａｇｒｌｅ、　Ｃｈｅｍ＊Ｓｏｃ、　（日
本）２５，４５８（Ｉ９５２）］、後者の方法はプラン
トスケールの製造には使用されなかったが、骨格の生合
成の研究のために適切な基礎を与えた［　Ｌ−Ｃｏ　Ｖ
ｉｎｌｎｇ＊　Ｃａｎ−Ｊ−Ｍｌｅｒｏｂｉｏｌ、　１
２．９１５（Ｉ９６０）　：及びＨ，Ｇ＠Ｆｌｏｓｓ、
Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ　　３２．８７３（Ｉ９７６）
）。
工業的に使用される第一の方法はＧ、　Ｔ、　Ｂａｎｋ
ｓ等によシ解決された（　Ｊ＠　Ｇ＠ｎ、　Ｍｉｃｒｏ
ｂｉｏｌ。
８２．３４５（Ｉ９７４））。この方法において、クラ
ビセデスの７ジフオルミスが、ペンニセツム・ティＩイ
ディ、ウムΦスクレロチウム（Ｐｅｎｎｌｓｅｔｕｍｔ
ｙｐｈｏｉｄｅｕｍ　ｓｃｌｅｒｏｔｉｕｍ　）から分
離され、そして、反復選択によって改良され、高収量株
が得られた。
この新株はアルボフラビンを生産した。
そして、Ｒ＠ｈａｅｅｋ等はクラビセブス・プルデレア
（Ｃ１ａｖｉｃ＊ｐｓ　ｐｕｒｐｕｒｅａ　　）の新変
異株を調製した。１つの変異株は主としてアルボフラビ
ンを生産したが、他の２つの株は主としてエリモクラビ
ンを生産した。しかしながら、エリモクラビン生産変異
株の両者においてアルカロイドレベルは発酵プロス中３
００〜６００μ９７ｍ１に過ぎなかった［　Ｊ、　Ｎｅ
ｔ、　Ｐｒｏｄ、　４４　、２２５　（Ｉ９８１）　］
。
ソ連特許明細書４７３５，０１０、及びＰｒ１ｋｌ　。
Ｂｉｏｋ、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、１６，５９６　（Ｉ９
８０）は、６攬類の異るアルカロイドを生産するクラビ
セグス・７ノフオルミスの天然様を開示しているが、こ
の合計アルカロイドレベルは１２２０μｍ７ｋｌであり
、エリモクラピン部分が７０〜７５９６を占める。
Ｓ、　Ｈ，Ａｍｂｉｋｅｔ等（Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍ、　
９．１９５３−５８（Ｉ９７０））は、クラピセブス・
デルゾレア型のクラビン生産株がチトクロームＰ−４５
０を含有し、そのレベルがフェノパルピトンによって増
加し、同時にこの菌株によって生産されるアルカロイド
レベルが上昇することを見出し良。
〔発明が解決しようとする問題点〕
発明者等は、クラビンアルカロイド類、主としてエリモ
クラビンを、高収量で、場合によってはエリゴクラビン
から容易に分離することができるアルカロイド類と一緒
に、生産することができる方法を提供することを目的と
する。
〔問題点を解決するための手段〕
グリセリン−（プトン培地上で主たるアルカロイドとし
てアグロクラビンを生産しそして少いアルカロイドとし
てエリモクラピンを生産するタイプのタラビセグス・フ
ジフォルミスの菌株を用いてモデル実験が行われた［　
Ａ、　Ｔｏｎｏｉｏ　及ヒＥ。
Ｕｄｖａｒｄｙ−Ｎａｇｙ　、　Ａｃｔａ＠Ｍ１ｃｒｏ
ｂｉｏ１．　Ａｃａｄ。
Ｓｃｉ、　Ｈｕｎｇ、　１５．２９　（Ｉ９６８）　］
。この菌株は、１９７７年５月２日に、ナショナルコレ
クシ、ン　オプ　ミクロオーガニスムス、ナショナル　
インスティテエート　７オアパブリツク　ヘルス（Ｎａ
ｔｌｏｎａｌ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｍｉｃｒ
ｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ。
Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｉｎ５ｔｉｔｕｔ＠ｆｏｒ　Ｐｕｂ
ｌｉｃ　Ｈ＠ａｌｔｈ　）　（オルスツァゴス　ケツェ
ｒスツェギエギー　インテツェツ、ツタベスト（Ｏｒｓ
ｚａｇｏｓ　Ｋｏｚｅｇ＠ｓｚｓｅｇｕｇｙｉＩｎｔ＠
ｔ＋ｓｅｔ、　Ｂｕｄｍｐ＊ｓｔ　）に、４００１６４
として寄託され、その後同一番号のもとにブダペスト条
約に基く国際寄託に移管された。この研究によシ、この
モデル菌株が交互酸化酵素すなわちチトクロームＰ−４
５０？含有し、そしてパルピッレート添加物がチトクロ
ームＰ−４５０含量及び全アルカロイド生産の両者を刺
激することが示された。
ＡＯＯ１６４株をパルピッレートの存在下で増殖せしめ
る場合に、コロニーの形態及び色素生成が元株のそれと
は実質止具ってくることが見出された。反復選択の後、
これらの新しい特徴は安定化し、そしてパルピッレート
の非存在下においても新しく選択された菌株の特徴とな
りた。
新変異株の生化学的性質は親株、すなわち浅００１６４
株のそれと異る。新変異株の場合、増殖速度及びポリサ
ッカライド生成能は弱いが、アルカロイド及び色素生成
能はより強い。驚くべきことに、全アルカロイドレベル
中エリモクラビンが支配的であり、これに対して親株は
主としてアグロクラビンを生産した。
この新規な菌株は、１９８１年１０月１５日に、ナシ、
ナル　コレクショ″ン　オプ　ミクロオーガニスムス、
ナシ賃ナル　インスティテエー゛ドアオア　／ＩＰブリ
ック　ヘＡ／　ｘ　（Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｃｏ１１＠ｃ
ｔｉｏｎｏｆ　Ｍｉｅｒｏｏｒｇａｎｉｍｍｓ、　Ｎａ
ｔｉｏｎａｌ　Ｉｎ５ｔｌｔｕｔ＠ｆｏｒＰｕｂｌｉｃ
　Ｈｅａｌｔｈ　（オルスツァゴス　ケツェダスツェギ
ュギイーインテツェト、ブタペスト（Ｏｒｓｚａｇｏｓ
　ＫｏｚｅｇｅｓｚｓｅｇｕｇｙＩ　Ｉｎｔｏｓｅｔ、
　Ｂｕｄａｐｅｓｔ　）に、ム００２１１として寄託さ
れ、その後同一番号のものにブダイスト条約に基く国際
寄託に移された。
従って、この発明は、Ｒがメチル又はヒドロキシメチル
である一般式（Ｉ）のクラビンアルカロイドの新規な、
微生物学的製造方法に関し、この方法は、炭素源、窒素
源及び鉱物塩類、並びに場合によりては他の添加物を含
んで成る液体培地に、アルカロイド生産菌株としてカル
ビセデス・フジフォルミス変異株（寄託番号４００２１
１）？好気的条件下で培養し、そして生成したアルカロ
イドを採取することを特徴とする。
この発明のよ紀ｌ）方法は、一般式（Ｉ）のクラビンア
ルカロイドを発酵生産することができるクラビセグス・
７ジ７オルミス変異株４００２１１の生物学的に純粋な
培養物を用いて行われろ。
この発牟肯−ζ←ｂクラビセゾス・フジ７オルミス変異
株４００２１１の生物学的に純粋な培養物舎妻☆彷−は
、クラビセブス・ フジフォルミスＡ００１６４株を、炭素源、窒素源、鉱
物塩類及び寒天、並びにチトクロームＰ−４５０の生成
を促進する添加物を含有する固体培地中に培養し、そし
て次に新菌株４００２１１１選択的に分離することによ
りｖ造ざレロ。
新菌株はチトクロームＰ−４５０の生成を促進する添加
物の存在下で得られる。この添加物はパルピッレート型
のものであり、そして１〜１０ｍモル／１発酵プロスの
濃度で適用される。培養物を２０℃〜２８℃にで７〜２
１日間インキエペートシ、そして親株コロニーから容易
に区別することができる新株の紫色の平らな外部に拡が
ったコロニーを選択し、場合によってはパルピッレート
の存在下又は非存在下で選択を繰り返し、モして８５チ
以上のエリモクラビンを生産する新変異株を分離する。
この発明に従えば、親株７ｆ１００１６４は寒天で固化
した培地に増殖する。
親株の増殖に適する培地は次の組成を有する。
培地Ａ シェークロース　　　　　　　　　　１００．ＯｇＬ−
アスノぐラギン　　　　　　　　　　１０．０　　　、
ｉｉｌ硝酸カルシウム　　　　　　　　　　１．０　　
３燐酸−カリウム　　　　　　　　　　　０．２５　　
ｇ硫酸マグネシウム　　　　　　　　　　０．２５　．
９塩化カリウム　　　　　　　　　　　　０．１２！Ｍ
硫酸第一鉄　　　　　　　　　　　　　０．０３３．９
硫酸亜鉛　　　　　　　　　　　　　　０．０２７．９
Ｌ−システィン塩酸塩　　　　　　　　０．０１０ＩＩ
酵母エキストラクト（ディフコ）　　　　０．１００．
９寒天（ディフコ）　　　　　　　　　　３０．ＯＩＩ
上記の成分の溶液のＰＨヲ水酸化ナトリウムにより５．
２に調整し、この液を水で１０００１１１に稀釈し、そ
して次に１１０℃にて３０分間殺菌する。
冷却後、培地は固化する。
培地Ｂ 培地Ａについて記載した方法により、ポテト−グルコー
ス寒天（ディフコ）３９９から１０００プの培地を調製
する。
培地Ｃ シェークロース　　　　　　　　　１００．０　　　、
！ｉ’コハク酸　　　　　　　　　　　　　　１０．０
　　　ｇ硝酸カルシウム　　　　　　　　　　１．ＯＩ
硝酸アンモニウム　　　　　　　　　　１．０９燐酸−
カリウム　　　　　　　　　　　０．２５＃硫酸マグネ
シウム　　　　　　　　　　０．２５．！ｉ’塩化カリ
ウム　　　　　　　　　　　　０．１２５．９硫酸第一
鉄　　　　　　　　　　　　　０．００９．９硫酸亜鉛
　　　　　　　　　　　　　　０．００３Ｆ寒天（ディ
７コ）　　　　　　　　　　３０．０　　　Ｎ上記の混
合物のＰＨｔ−水酸化アンモニウムによシ５．５〜５．
６に調整し、そして次に培地Ａについて記載したのと同
様にして１ノの培地を調製する。
培地Ｄ グリセリン　　　　　　　　　　　　１００　１１ベグ
トン（ディフコ）　　　　　　　　　２０　ｇ寒天（デ
ィフコ）　　　　　　　　　　　３０　ｇ上記の成分を
水で１０００ｄに稀釈し、溶液の−を６．５〜６．８に
調整し、次にこの溶液を１１０℃にて３０分間殺菌する
。
培養は、上記の培地のいずれかにおいて、無菌的好気的
条件下において２０℃〜２８℃にて、チトクロームＰ−
４５０の生成を促進する添加物、好ましくはパルピッレ
ート類の存在下で、実施する。パルピッレート型の添加
物として、Ｎ−７エニルパルビツレート、例エハフェノ
パルピタール又はメチルフェノパルピタールを挙げるこ
とができる。培養ｔ−７〜２４日間行い、そして新菌株
のコロニーを分離する。新菌株は寒天スラント上に、又
は凍結乾燥物の形で維持することができる。
新菌株を親株から区別する主な形態学的及び生化学的特
徴を次表に示す。
上記の新菌株４００２１１は、次のようにしてクラビン
アルカロイドの製造のために使用することができる。
発酵法において、炭素源、窒素源、鉱物塩類。
及び場合によってはその他の添加物を含有する適当な液
体培地を使用する。
アルカロイド生産発酵においては特に次の培地組成を用
いる。
培地Ｅ マンニトール　　　　　　　　　　　４０．０ｇ／ｌコ
ハク酸　　　　　　　　　　　　　　１０．１／Ａ’コ
ーンスチーデリカ−２，Ｏ９／１ 燐酸−カリウム　　　　　　　　　　　　１．０１１７
１硫酸マグネシウム　　　　　　　　　　０．３１７１
上記成分の溶液のｐＨ’を水酸化アンモニウムによシ５
．２〜５．３に調整する。
培地Ｆ シェークロース　　　　　　　　　　　５０．０．９／
ｊつぶしたポテト　　　　　　　　　１０．ＯＥｌ／１
１硝酸アンモニウム　　　　　　　　　１．ＯＦｉ／１
燐酸−カリウム　　　　　　　　　　０．２５！／／１
硫酸マグネシウム　　　　　　　　　０．２５１７１上
記成分の溶液のｐＨｔ−水酸化アンモニウムにより５．
４〜５．５に調整する。
培地Ｇ ンルビトール　　　　　　　　　　６０．０　１１／１
コハク酸　　　　　　　　　　　　　３６．０　１１／
１燐酸−カリウム　　　　　　　　　　０．２５１／／
１硫酸マグネシウム　　　　　　　　　０．３０１／１
硫酸第一鉄　　　　　　　　　　　　０．００９１／１
硫酸亜鉛　　　　　　　　　　　　　０．００：ｌ／Ａ
’上記成分の溶液のｐＨを水酸化アンモニウムによシ５
．４〜５．５に調整する。
上記の組成物はいずれも５０〜６０℃において水に溶解
し、そして１１０℃にて３０分間殺菌する。
上記の培地Ｅ、Ｆ、及びＧ、並びに寒天を加えないで調
製した培地Ｃ９及びＤはアルカロイドの製造のために適
当である。発酵は、無菌的、好気的条件下で、深部培養
により、２０℃〜２８℃にで１０〜２５日間、４．５〜
６．０の…範囲において行う。
次に、例によシこの発明をさらに詳細に説明する。但し
、これによりこの発明の範囲を限定するものではない。
例１ 培地Ａ上に増殖したクラピセブス・フジフォルミス変異
株ＡＯＯ２１１の１４４日目コロニーを５ＷＬｌの生理
的塩水溶液？用いて寒天表面から取り出した。得られた
懸濁液をホモジナイズし、そしてｌ　ｍｌの種菌を、寒
天を含まない１００１１ＩＪの培地Ｃｋ収容１．．た５
００ｄのエルレンマイヤーフラスコに移した。この培養
物を、ロータリーシェーカ（２４０ｒｐｍ、２ｚ振幅）
上で２４℃にて７時間インキエペートした。
４ｍｌの得られた培養物を、１００ゴの前殺菌した培地
Ｃを収容した５００ｍ１のエルレンマイヤーフラスコに
移した。この培養物を上記の条件で１２日間増殖せしめ
た。３日目及び５日目に、殺菌した１０１酵母エキスト
ラクト水溶液１　ｍｌずつを培地に加えた。
１２２日目培地中乾燥菌体量は１８１／ｌであった。ペ
ージ瓢色〜紫色の菌糸を培地から分離した。Ｐ液中の全
アルカロイド含量は、エリモクラビン標準を用いるマａ
ｎ　Ｕｒｋ試薬によれば、１３００μｍ１／Ｔｉ１ｌで
あった。培地中のエリモクラビン及びアルボフラビンを
次のようにして測定した。
ホモジナイズした２０１１Ｌｌの培養物ｔ、ｐＨ９にお
いテ、クロロホルム／イソグロノ母ノール（４：１）混
合物４９ｄによシ抽出した。ｌＱｄの有機相を減圧下で
蒸発乾燥した。残渣をクロロホルム／メタノール（Ｉ：
１）混合物９．５　ｔｘｌ中に溶解した。
２０　ｍｌの溶液ｆ、　ＤＯＡｌｕｆｏｌｉｎ　Ｋｉｅ
ａ＊１ｇｏ１６０Ｆ２５４（メルクＡｒｔ、５５５４）
吸着材、及びクロロホルム／エタノール（４：１）混合
展開剤を用いる薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）に付
した。スポットｔ−Ｕｖ光により２５４　ｎｒｎにて検
出した。エリモクラビン（Ｒｆ＝０．２０）及びアルボ
フラビン（Ｒｆ＝０．３０　）を、メタノール／酒石酸
（Ｉ：１）混合物中２８３ｎｍにおける分光光度法によ
シ測定した。エリモクラビン含量が１１５０μｙ〜であ
り、そしてアグロクラビンレベルは５５μυ蟹であった
。
例２ クラビセブス・フジフォルミス変異株４００２１１の凍
結乾燥コロニーを２ゴの生理的塩溶液に懸濁した。ホモ
ジナイズした懸濁液を、１００ｄの前殺菌した電池Ｅを
収容した５００ゴのエルレンマイヤーフラスコに移した
。この培養物を例１に記載したのと同様の条件下で７日
間増殖せしめた。
２Ｘ２ｍｇの得られた培養物を、１００′１１１の培地
Ｇ　？収容ｆる５００１１４のエルレンマイヤーフラス
コ２本に移した。培養物ｔ−２４℃にて３日間振とうし
ながら増殖せしめた。得られた種菌’ｔ、５４！の殺菌
培地Ｇを収容した１０７のガラス製ファーメンタ−に移
した。この培養物を、通気＜０．５１／ｌ／分）及び攪
拌（４３０ｒ、ｐ、ｍ、　）のもとて２４℃にて１２時
間増殖せしめた。必要に応じて、０．５ｄ／ｊｌの殺菌
した５ｔｒｕｋｔｏｌ　ＳＢ　２０２０消泡剤を加えた
。
発酵の終点において、培養液は１６１１／ｌの乾燥菌体
を含有していた。例１に記載した方法によシ測定した全
アルカロイド含量は１５５０μｍ１／ｒｎｌであり、こ
の内エリモクラビンが１４３５μｇ／ｍｅ。
アグロクラビンが９０μｊｉｌＩＬＩであった。
例３ クラビセブス・７ジ７オルミス変異株ム００２１１の凍
結乾燥コロニーを２ｍｌの生理的塩溶液に懸濁し、そし
てホモジナイズした懸濁液を培地Ｂ上に接種した。培養
物を２４℃、暗所にて１４日間インキエヘートシた。こ
うして得られた種母培養物を表面から取シ出し、そして
５−の生理的塩溶液と共にホモジナイズした。２×２ｒ
ｔｔｌのホモジナイズした培養物を１０９ｄの培地Ｆを
収容した５００ｄのエルレンマイヤーフラスコ２本に移
した。この培養物ｔ−２４℃にて５日間振とうし、そし
て次に、５ノの殺菌した培地ｃ２収容した１０／のガラ
ス製ファーメンタ−に移した。
培養物を、２４℃にて、通気（０，５／ｌ／ｌ／分）及
び攪拌（４３０ｒ、ｐ、ｍ、　）のもとて２日間増殖せ
しめた。こうして得られた種母ｆ、２０１／ｌの塩化ナ
トリウムを補充した殺菌した培地Ｃｌｌ０Ｉｔ収容した
１６０１のステンレス鋼発酵槽に移した。
この培養物ｔ−２４℃にて、通気＜０．４１７１／分）
及び攪拌（２００ｒ、ｐａｌｌｓ　）のもとて１２日間
培養した。発酵中に、殺菌した８ｔｒｕｋｔｏｌ　５Ｂ
２０２０消泡剤を合計量２００１１ＥＪ加えた。
発酵終了液は、１５１１／ｌの乾燥菌体を含有していた
。また１８１５μｂ官の全アルカロイドを含有し、この
内エリモクラビンが１６３０μ９／！／であシ、そして
アルボフラビンが２４０μｌｉ／ｙｔｌであった。培養
液を一過し、そしてｐ液中のエリモクラビン及びアルボ
フラビン１ＨＰＬｃ（吸着剤：Ｎｕｃｌｅｏｓｉｌ　１
０　　Ｃ１８：溶離剤ニアセトニトリル１０．ＯＩＭ炭
酸アンモニウム水溶液＝３　：　２　：ＵＶ検出２８０
　ｎｍ　）で測定した。エリモクラピンは８．７分間の
保持時間で現われ、アグロクラピンのそれは３２．０分
間であ−）た。
【図面の簡単な説明】 第１図はＡ００１６４株のコロニーの形態を示し、そし
て第２図は４００２１１株のコロニーの形態を示し、い
ずれも微生物の形態を表わす図面に代る写真である。

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 １、次の一般式（ I ） ▲数式、化学式、表等があります▼（ I ） （式中、Ｒはメチル基又はヒドロキシメチル基である） で表わされるクラビンアルカロイドの微生物学的製造方
    法であって、炭素源、窒素源、鉱物塩類及び場合によっ
    ては他の添加物を含んで成る液体培地中で、アルカロイ
    ド生産菌としてクラビセプスフジフォルミス（Ｃｌａｖ
    ｉｃａｐｓｆｕｓｉｆｏｌｍｉｓ）の変異株（寄託番号
    Ｎｏ００２１１）を培養し、そしてアルカロイドを採取
    することを特徴とする方法。 ２、発酵を２０℃〜２８℃の温度、４．２〜６．０のｐ
    Ｈ範囲において行う特許請求の範囲第１項記載の方法。
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