NL8402466A - Een nieuwe clavine-producerende stam, een werkwijze voor de bereiding ervan, alsmede een microbiologische werkwijze voor de productie van clavinealkaloiden. - Google Patents

Description

k it- -"ί NL 32234-Kp/cs

Een nieuwe clavine-producerende starar een werkwijze voor de bereiding ervan, alsmede een microbiologische werkwijze voor de productie van clavinealkaloïden.

De uitvinding heeft betrekking op een nieuwe microbiologische werkwijze voor de productie van clavinealkaloïden met de algemene formule van het formuleblad/ waarin R een hydroxymethyl of methylgroep voorstelt, 5 alsmede op een biologisch zuivere culture van de Calviceps fusiformis variant stam No. 00211, die de genoemde alkaloïden produceert, alsmede op een werkwijze voor het verkrijgen en in stand houden van deze biologisch zuivere culture.

Van de alkaloïden bereide elymoclavine (R = hydroxy-10 methyl) is van primair belang, aangezien dit een geneesmiddel is met analeptische en antiparkinson-werking, naast de remming van de prolactinesecretie [B. Berde en Q. Schild: Ergot Alkaloids and related compounds; Hand. Exp. Pharm., 49, Springer Verlag, Berlin (1978* Voorts is de elymoclavine een * 15 mogelijk uitgangsmateriaal voor de lysergolsynthese en een tussenproduct van Nicergoline. De agroclavine (R = methyl) is een voorloper voor de elymoclavine.

Bekend is, dat Claviceps fungus-stammen in staat zijn ergotalkaloïden te biosynthetiseren op rogge in een gastheer-20 parasiete inter-relatie. Van de clavine-producerende Clavi-ceps-stammen was bovendien bekend, dat zij de alkaloïden in kwestie ook kunnen produceren onder saprofytische condities JM. Abe et al.: J. Agric. Chem. Soc. (Japan) 25, 458 (1952)}. Ofschoon de laatstgenoemde weg niet werd toegepast voor be-25 reiding op fabrieksschaal, bleek dit een adequate basis te vormen voor het onderzoek van de biosynthese van het skelet [L.C. Vining: Can. J. Microbiol. 12, 915 (1966) en H.G. Floss: Tetrahedron 32, 873 (1976)].

De eerste in de industrie toegepaste werkwijze werd 30 uitgewerkt door G.T. Banks et al. [j. Gen. Microbiol. 82, 345 (1974)]. In deze werkwijze werd een Claviceps fusiformis-stam geïsoleerd uit Pennisetum typhoideum sclerotium en vervolgens verbeterd door herhaalde selectie teneinde een stam met hogere productie te verkrijgen. De nieuwe stam produceer-35 de agroclavine.

3402466 ' ? * - 2 -

Dan hebben Z. Rehacek et al. nieuwe mutanten van de stam Claviceps purpurea bereid. Een mutant produceerde in hoofdzaak agroclavine, terwijl twee andere stammen in hoofdzaak elymoclavine produceerden. In geval van beide elymocla-5 vine-producerende mutanten bleek echter de alkaloïdeconcen-tratie in de fermentatiebouillon slechts 300-600 yg/ml te zijn [J. Nat. Prod. 44, 225 (1981)”].

Het Sovjet octrooischrift No. 735.010 alsmede'Prikl. Biok. Microbiol. 1_6, 569 (1980) beschrijven een natuurlijke 10 stam van Claviceps fusiformis, die zes verschillende alkaloïden produceert met een totale alkaloïdeconcentratie van 1220 yg/ml, waarin het elymoclavineaandeel 70-75% uitmaakt.

S.H. Ambiket et al. [Phytochem. 9_, 1953-58 (1970)J hebben gevonden, datclavine-producerende stammen van het 15 Claviceps purpurea-type cytochroom P-450 bevatten, waarvan de concentratie kan worden verhoogd met behulp van fenobarbi-ton, dat resulteert in een gelijktijdige toename van de door de stam geproduceerde alkaloïdeconcentratie.

Het doel van de uitvinding is een stam te verkrij-20 gen, die in staat is clavinealkaloïden, in hoofdzaak elymoclavine, te produceren in een hoge opbrengst eventueel samen met alkaloïden, waaruit elymoclavine gemakkelijk kan worden bereid.

De modelproeven werden uitgevoerd onder gebruik-25 making van een stam van het Claviceps fusiformis-type, dat op een glycerine-pepton cultuurmedium, als voornaamste alkaloïde agroclavine produceerde naast een veel geringere hoeveelheid elymoclavine [A. Tonolo en Ê. Udvardy-Nagy: Acta. Microbiol. Acad. Sci. Hung. 15_, 29 (1968)] . Deze stam werd 30 gedeponeerd op 2 mei 1977 bij de National Collection of Microorganisms, National Institute for Public Health (Orszdgos Kozegëszségügyi Intëzet, Boedapest) onder No. 00164.

Onderzoekingen hebben aangetoond, dat deze model-stam een alternerende oxidase-enzym, namelijk cytochroom P-35 450, bevatte, terwijl barbituraattoevoegseis zowel het cytochroom P-450-gehalte, als de totale alkaloïdeproductie stimuleerden .

Gevonden is, dat wanneer de cultuur van de 00164-stam werd gekweekt in aanwezigheid van barbituraten, de mor- 8402456 * i - 3 - fologie en de pigmentatie van de kolonies aanzienlijk verschillend zijn geworden van die van de originele. Na herhaalde selectie bleken deze nieuwe aspecten stabiel te zijn en waren karakteristiek voor de nieuw geselecteerde stam, zelfs 5 in aanwezigheid van barbituraten.

De biochemische eigenschappen van de nieuwe variëteit onderscheidt zich van die van de hoofdstam, dat wil zeggen de stam No. 00164. De groeisnelheid en het polysaccharide-vor-mingsvermogen zijn zwakker, terwijl het alkaloïde- en pigment-10 vormingsvermogen sterker zijn in het geval van de nieuwe variëteit. Wat werkelijk verrassend was, was het feit, dat het elymoclavine-aandeel in de totale alkaloïdeconcentratie verreweg domineerde, terwijl de hoofdstam in hoofdzaak agroclavine produceerde.

15 Deze nieuwe stam werd gedeponeerd op 15 oktober 1981 bij de National Collection of Microorganisms, National Institute for Public Health (OrszSgos Kozegêszségügyi Intézet, Boedapest) onder No. 00211.

In het licht van het bovenstaande heeft de uitvinding 20 betrekking op een nieuwe microbiologische werkwijze voor de bereiding van clavinealkaloïden met de algemene formule van het formuleblad, waarin R een methyl of een hydroxymethyl-groep voorstelt door kweken van een Claviceps fusiformis-stam in een vloeibaar ondergedompeld kweekmedium met daarin bronnen 25 van koolstof, stikstof, minerale zouten en eventueel andere toevoegsels onder aerobe condities, waarin een Claviceps fusi-vormis-variantstam, gedeponeerd onder No. 00211, wordt gebruikt als alkaloïde-producerende stam en de verkregen alkaloïden worden gewonnen.

30 Een ander doel van de uitvinding is een biologisch zuivere culture van Claviceps fusiformis-variantstam No. 00211, die kan worden gefermenteerd, voor de productie van clavinealkaloïden met de algemene formule van het formuleblad.

De uitvinding heeft verder betrekking op een werk-35 wijze voor de productie van een biologisch zuivere culture van Claviceps fusiformis-variantstam No. 00211, waarin een Claviceps fusiformis-stam No. 00164 wordt gekweekt in een vast kweekmedium met daarin bronnen van. koolstof, stikstof, 8402466 4 * - 4 - minerale zouten en agar alsmede een toevoegsel, dat de vorming van cytochroom P-450 bevordert, gevolgd door selectieve isolatie van de nieuwe stam No. 00211.

De nieuwe stam wordt verkregen in aanwezigheid van 5 een toevoegsel, dat de vorming van cytochroom P-450 bevordert. Dit toevoegsel is van het barbituraattype en wordt gebruikt in een hoeveelheid van 1-10 mmol/1 fermentatiebouillon. De culture wordt geïncubeerd bij 20-28°C gedurende 7-21 dagen en de violet gekleurde, vlak uitgespreide kolonies van de 10 nieuwe stam, die gemakkelijk te onderscheiden zijn van de hoofdstamkolonies, worden geselecteerd, welke selectie eventueel wordt herhaald al dan niet in aanwezigheid van barbituraten, terwijl de nieuwe variantstam, die tenminste 85% elymoclavine produceert, wordt geïsoleerd.

15 Volgens de uitvinding wordt de hoofdstam No. 00164 gekweekt in een cultuurmedium, dat in een vaste vorm wordt omgezet met agar.

Cultuurmedia, geschikt voor het kweken van de hoofdstam, hebben de volgende samenstellingen: 20 .. Kweekmedium "A" saccharose 100,0 g 1-asparagine 10,0 g calciumnitraat 1,0 g kaliumdiwaterstoffosfaat 0,25 g 25 magnesiumsulfaat 0,25 g kaliumchloride 0,125 g ferrosulfaat 0,033 g zinksulfaat 0,027 g 1-cysteïnehydrochloride 0,010 g 30 gistextract (Difcoj 0,100 g agar (Difco) 30,0 g

De pH van de oplossing van de bovengenoemde componenten wordt ingesteld op een waarde van 5,2 met behulp van natriumhydroxide, de vloeistof wordt met water tot 1000 ml 35 verdund en vervolgens gedurende 30 min bij 110°C gesteriliseerd. Bij koeling wordt het kweekmedium vast.

8402466 -3 > - 5 -

Kweekmediuia "B"

Uit 39 g aardappelglucoseagar (Difco) wordt 1000 ml kweekmedium bereid onder gebruikmaking van de techniek, die is beschreven voor medium "A".

5 Kweekmedium "C” saccharose 100,0 g succinezuur 10,0 g calciumnitraat 1,0 g ammoniumnitraat 1,0 g 10 kaliumdiwaterstoffosfaat 0,25 g magnesiumsulfaat 0,25 g kaliumchloride 0,125 g ferrosulfaat 0,009 g zinksulfaat 0,003 g 15 .agar (Difco) 30,0 g

De pH van het bovengenoemde mengsel wordt ingesteld op een waarde van 5,5-5,6 met behulp van ammoniumhydroxide, waarna 1 1 van het kweekmedium wordt bereid op de wijze zoals beschreven voor medium "Au.

20 Kweekmedium "D” glycerine 100 g pepton (Difco) 20 g agar (Difco) 30 g

De bovengenoemde componenten worden verdund met 25 water tot 1000 ml, de pH van de oplossing wordt ingesteld op 6,5-6,8, waarna de oplossing wordt gesteriliseerd gedurende 30 min bij 11Q°C.

Het kweken wordt uitgevoerd in een van de bovengenoemde kweekmedia onder steriele aerobe omstandigheden bij 30 20-28°C in aanwezigheid van een toevoegsel, dat de vorming van cytochroom P-450 bevordert, bij voorkeur in aanwezigheid van barbituraten. Als een toevoegsel van het barbituraattype komen in aanmerking N-fenylbarbituraten, bijvoorbeeld feno-barbital of methylfenobarbital. Het kweken wordt uitgevoerd 35 gedurende 7-21 dagen, waarna de kolonies, van de nieuwe stam worden geïsoleerd. De nieuwe stam kan in stand worden gehouden op schuingehouden agar of in gevriesdroogde vorm.

84 0 2 4 6 6 i' Cr - 6 -

De voornaamste morfologische en biochémische aspecten, waardoor de nieuwe stam zich onderscheidt van de hoofdstam, zijn in de volgende tabel opgenomen.

Morfologische en biochemische Stam No. 00164 Stam No. 00211 aspecten_______ 5 Koloniemorfologie Beigekleurig, Violetkleurig, in kweekmedium "C" scherpe randen scherpe randen, vlakke, op de 21ste dag kolonies met grillig kolonies met aeriaal-myce- oppervlak (zoals in lium (zoals weergegeven in fig. II.aangegeven), fig. III), 15-20 mm in dia- 10 10-15 mm diameter_meter_ -_

Koloniemorfologie Beigekleurig, dicht, Bruin-violet gekleurd, in kweekmedium "C" visceuze culture dun flocculante kweek op de 12de dag (ondergedompelde 15 kweek) a) macroscopische eigenschappen b) ' microscopische lange hyphae , 3-6 y in diameter, eigenschappen vaak draadvorming_ 20 Fenobarbital tolerantie a) in.vast (agar) 1 mmol/1 10 mmol/1 kweekmedium b) in vloeibaar 0,6 mmol/1 5 mmol/1 25 kweekmedium _-_

Cytochroom P-450-concentratie (nmol/ g droog mycelial- cel) in kweekmedium 1,0-1,5 2,5-3,0 30 "C" gedurende de 4-7de dag_

Polysaccharidecon-centratie (mg/ml) op de 7de dag in 20,8 3,8 35 kweekmedium "C"_____________________________________________ 84 0 24 6 6 ί - 7 -

Morfologische en biochemische Stam No. 00164 Stam No. 00211 aspecten

Totale alkalolde-prcductiesnelheid (yg/ml/dag) op de 5 4-7de dag in kweek- medium "C" (bereid 50-80 200-250 zonder agar)

Alkaloïdegehalte a) in kweekmedium "C" 10 (bereid zonder agar) agroclavine % 75-80 5-15 elymoclavine % 20-25 85-95 b) in kweekmedium ”D” 15 (bereid zonder agar) agroclavine % 90-95 5-10 elymoclavine %_5-10_ 90-95

De bovenbeschreven nieuwe stam No. 00211 is geschikt 20 voor de bereiding van clavinealkaloïden en wel op de volgende manier:

Bij het fermentatieproces wordt een geschikt vloeibaar kweekmedium met daarin bronnen van koolstof, stikstof, minerale zouten en eventueel andere toevoegsel(s) gebruikt.

25 In de alkaloïde-producerende fermentatie zijn onder andere de volgende kweekmediumsamenstellingen geschikt:

Kweekmedium "E" mannitol ' 40,0 g/1 succinezuur 10,0 g/1 30 maisweekvloeistof 2,0 g/1 kaliumdiwaterstoffosfaat 1,0 g/1 magnesiumsulfaat 0,3 g/1

De pH van de oplossing van bovengenoemde componenten wordt ingesteld op een waarde van 5,2-5,3 met behulp van.

35 ammoniumhydroxide.

8402466 - 8 -

Kweekmedium "F" saccharose 50,0 g/1 geraspte aardappelen 10,-0 g/1 ammoniumnitraat 1,0 g/1 5 kaliumdiwaterstoffosfaat 0,25 g/1 magnesiumsulfaat 0,25 g/1.

De pH van de oplossing van bovengenoemde componenten wordt ingesteld op 5,4-5,5 met behulp van ammoniumhydroxide.

Kweekmedium "G" 10 sorbitol 60,0 g/1 succinezuur 36,0 g/1 kaliumdiwaterstoffosfaat 0,25 g/1 magnesiumsulfaat 0,30 g/1 ferrosulfaat 0,009 g/1 15 zinksulfaat 0,003 g/1

De pH van de oplossing van de bovengenoemde componenten wordt ingesteld op een waarde van 5,4-5,5 met behulp van ammoniumhydroxide.

Elk van de bovengenoemde mengsels wordt opgelost in 20 water bij 50-60'°C en vervolgens gedurende 30 min bij 110°C gesteriliseerd.

Kweekmedia "E", “F" en "G" zoals, bovenbeschreven, of kweekmedia "C" of "D" bereid zonder agar, zijn geschikt voor alkaloïdeproductie. De fermentatie wordt uitgevoerd onder 25 steriele, aerobe omstandigheden in een ondergedompelde kweek bij 20-28°C gedurende 10-15 dagen bij een pH-traject van 4,2 tot 6,0.

De uitvinding wordt nader toegelicht aan de hand van de volgende niet-beperkende voorbeelden.

30 VOORBEELD I

14 dagen oude kolonies van Claviceps fusiformis-variantstam No. 00211 werden gekweekt op een kweekmedium "A" en vervolgens van het agaroppervlak verwijderd met 5 ml fysiologische zoutoplossing. De verkregen suspensie werd ge-35 homogeniseerd', waarna 1 ml inoculum werd overgebracht in een 500 ml erlenmeyerkolf met 100 ml medium "C" erin, bereid zonder agar. De culture werd gedurende 7 dagen geïncubeerd bij 24°C op een roterende schudder (240 omwentelingen/min, 2 cm verplaatsing).

8402466 - 9 -

Van de verkregen culture werd 4 ml overgebracht in een 500 ml erlenmeyerkolf, waarin 100 ml voorafgesteriliseerd medium "C" aanwezig was. De culture werd gedurende 12 dagen gekweekt onder de bovengenoemde omstandigheden. Op de derde 5 en vijfde dag werd 1-1 ml van 10% steriele waterige oplossing van een gistextract (Difco) toegevoegd aan de fermentatie-bouillon.

Op de twaalfde dag bleek het droge mycelialcelgehalte van de bouillon 18 g/1 te zijn. De beige-violet gekleurde 10 myceliummat werd van het medium afgezonderd en het totale al-kaloïdegehalte van het filtraat bepaald met behulp van Urk's reagens onder gebruikmaking van elymoclavinestandaard, welk gehalte 1300 yg/ml bleek te zijn.

Het elymoclavine- en agroclavinegehalte van de bouil-15 Ion werd als volgt bepaald: 20 ml van de gehomogeniseerde culture werd geëxtraheerd met 40 ml van een 4:1 mengsel van chloroform en isopropanol bij pH 9. Van de organische laag werd 10 ml tot droog ingedampt en wel onder verminderde druk. Het residu werd opgelost in 0,5 ml van een 1:1 mengsel van 20 chloroform en methanol. Van de oplossing werd 20 μΐ blootgesteld aan dunne laagchromatografie onder gebruikmaking van DC Alufolien Kieselgel 6QF254 (Merck, Art. 5554) absorbens en een 4:1 mengsel van chloroform-ethanol als ontwikkelingsmiddel, Vlekken werden gemeten bij 254 nm door UV-licht. De ely-25 moclavine (Rf 0,20) en de agroclavine (Rf 0,30) werden bepaald via spectrofotometrie bij 283 nm in een 1:1 mengsel van methanol en wijnsteenzuur. Het elymoclavinegehalte was 1150 yg/ml bij een agroclavineconcentratie van 55 yg/ml.

VOORBEELD II

30 Gevriesdroogde kolonies van Claviceps fusiformis- variantstam No. 00211 werden gesuspendeerd in 2 ml fysiologische zoutoplossing. De gehomogeniseerde suspensie werd overgebracht in een 500 ml erlenmeyerkolf, waarin 100 ml vooraf gesteriliseerd medium "E" aanwezig was. De culture werd ge-35 kweekt gedurende 7 dagen onder de in voorbeeld I beschreven omstandigheden.

Van de verkregen culture werden 2 x 2 ml overgebracht in een 500 ml erlenmeyerkolf, waarvan elk 100 ml medium "G” bevatte. De cultures werden gekweekt bij 24°C onder schudden 8402466 - 10 - gedurende 3 dagen. De verkregen inocula werden overgebracht in een 10 1 glasfermenteerinrichting met 5 1 van het steriele kweekmedium "G" erin. De cultures werden gekweekt bij 24°C onder beluchting (0,5 1/1/min) en roeren (430 omw./min) ge-5 durende 12 dagen. Desgewenst werd 0,5 ml/1 steriel Struktol SB 2020 antischuimmiddel toegevoegd.

Aan het eind van de fermentatie bevatte de bouillon 16 g droog mycelialcel/1 en het totale alkaloïdegehalte, bepaald volgens voorbeeld I, bedroeg 1550 μg/ml, waarvan de 10 elymoclavine 1435 ug/ml bedroeg en de agroclavine 90 ug/ml.

VOORBEELD III

Gevriesdroogde kolonies van Claviceps fusiformis-variantstam No. 00211 werd gesuspendeerd in 2 ml fysiologische zoutoplossing, waarna de gehomogeniseerde suspensie 15 werd gexnoculeerd op een medium "B". De culture werd geïncu-beerd bij 24°C in het donker gedurende 14 dagen. De aldus verkregen zaadculture werd uit het oppervlak verwijderd en vervolgens met 5 ml fysiologische zoutoplossing gehomogeniseerd. 2 x 2 ml van de gehomogeniseerde culture werden over-20 gebracht in 500 ml erlenmeyerkolven, waarvan elk 100 ml medium "F" bevatte. De cultures werden gedurende 5 dagen bij-.24°C geschud en vervolgens overgebracht in een 10 1 glasfermenteerinrichting, die 5 1 van het steriele kweekmedium "C" bevatte.

De culture werd gekweekt bij 24°C onder beluchting 25 (0,5 1/1/min) en roeren (430 omw./min) gedurende 2 dagen. Het aldus verkregen inoculum werd overgebracht in een 160 1 roestvrijstalen fermenteerinrichting, die 110 1 steriel medium "C" bevatte, aangevuld met 20 g/1 natriumchloride.

De culture werd gekweekt bij 24°C onder beluchting 30 (0,4 1/1/min) en roeren (200 omw./min) gedurende 12 dagen. Tijdens de fermentatieprocedure werd steriel Struktol SB 2020 antischuimmiddel toegevoegd in een totale hoeveelheid van ca. 220 ml.

De gerede fermentatiebouillon bevatte 15 g droog 35 mycelialcel/1, en 1815 μ totaal alkaloïde/ml, waarvan de elymoclavine 1630 μg/ml bedroeg en de agroclavine 240 Ug/ml. De bouillon werd afgefiltreerd en in het filtraat werden de elymoclavine en agroclavine bepaald via HPLC (adsorbens: Nucleo- 8402466 - 11 - sil 10 C 18; eluens: 3:2 mengsel van acetonitril en 0,01 M waterig ammoniumcarbonaat; UV-detectie bij 280 nm). De elymo-clavine bleek een retentietijd te hebben van 8,7 min en de agroclavine een retentietijd van 32,0 min.

8402466

Claims (5)

1. Microbiologische werkwijze voor de bereiding van clavinealkaloïden met de algemene formule van het formuleblad, waarin R een methyl of een hydroxymethylgroep voorstelt, door kweken van Claviceps fusiformis-stam in vloei- 5 stof ondergedompeld kweekmedium met daarin bronnen van koolstof, stikstof, minerale zouten en eventueel andere toevoegsels, onder aerobe omstandigheden onder gebruikmaking van een Claviceps fusiformis-variantstam, gedeponeerd onder No. 00211, als alkaloide-producerende stam, en winning van de verkregen 10 alkaloïden.

2. Werkwijze volgens conclusie 1, waarbij de fermentatie wordt uitgevoerd bij een temperatuur van 20-28°C in een pH-gebied van 4,2 tot 6,0.

3. Biologisch zuivere culture van Claviceps fusiformis-15 variantstam No. 00211, die gefermenteerd kan worden teneinde clavinealkaloïden met de algemene formule van het formuleblad te produceren.

4. Werkwijze voor de bereiding van een biologisch zuivere culture van Claviceps fusiformis-variantstam No. 00211, 20 waartoe de Claviceps fusiformis-stam No. 00164 wordt gekweekt in een vast kweekmedium met daarin bronnen van koolstof, stikstof, minerale zouten en agar alsmede een toevoegsel voor het bevorderen van de vorming van cytochroom P-450, en door isoleren van de kolonies van de nieuwe stam No. 00211 door se-25 lectie.

5. Werkwijze volgens conclusie 4, waarbij het toevoegsel, dat de vorming van cytochroom P-450 bevordert, een barbituraat is, dat gebruikt wordt in een hoeveelheid van 1-10 mmol/1 fermentatiebouillon. 30 84 0 2 4 6 6