CS248719B2

CS248719B2 - Production method of the clavine alcaloids

Info

Publication number: CS248719B2
Application number: CS846104A
Authority: CS
Inventors: Maria Trinn; Gabriella Kordik; Nagy E Udvrdy; Zsuzsanna Vida; Erzsebet Zaoka
Original assignee: Richter Gedeon Vegyeszet
Priority date: 1983-08-10
Filing date: 1984-08-10
Publication date: 1987-02-12
Also published as: GB2148278A; NL8402466A; ES535102A0; CH664758A5; PT79051B; ES8604306A1; HU190141B; PT79051A; GB8420369D0; ATA258284A; AT383828B; BE900294A; DE3429573A1; FR2550549A1; JPS60120997A; JPS63313593A; JPS6357035B2; FR2550549B1; JPH0159877B2; HUT35011A

Description

(54) Způsob výroby klavínových alkaloidů

Je popsána výroba klavinových alkaloidů. Obecného vzorce I

R

(·) (R = methyl nebo hydroxymethyl) submersní ' kultivací kmene Clavlceps fusiformis 00211 při 20· až 20 °C a pH 4,2 až 6.

Vynález se týká nového mikrobiologického způsobu výroby klavinových alkaloidů obecného vzorce I

M

I v němž

R znamená methylovou nebo hydroxylmethylovou skupinu.

Ze zmíněných alkaloidů je velice zajímavý elymoklavin (R = hydroxymethylová skupina) představující léčivo s analeptickým a antiparkinsonickým účinkem a ínhlbující sekreci prolaktinu [B. Berde a O. Schild: Ergot alkaloide and related compounds; Handbook Exp. Pharm., 49, Springer Verlag, Berlín (1978)]. Elymoklavin je dále potenciální výchozí látkou syntézy lysergolu a meziproduktem pro Nicergolin.

Agroklavin (R = methylová skupina) je prokursorem elymoklavinu.

Je známo, že kmeny houby Claviceps jsou schopné biosyntézy námelových alkaloidů na žitu ve vztahu hostitel-parazit. O kmenech Claviceps produkujících klaviny je rovněž známo, že produkují uvedené alkaloidy i za saprofytlckých podmínek [M. Abe se spol.: J. Agric. Chem. Soc. (Japonsko) 25, 458 1(1952)]. Zatímco poslední způsob není využíván v provozním měřítku, poskytuje dobrý podklad při biosyntéze skeletu [L. C. Vining: Can. J. Mlcrobiol. 12, 915 (1966) a H. G. Floss: Tetrahedron 32, 873 (1976)].

Prvý způsob, využitý průmyslově, byl vypracován G. T. Banksem se spol. [J. Gen. Microbiol. 82, 345 (1974)]. Při tomto způsobu byl kmen Claviceps fusilormis izolován ze sklerocia Pennisetum typhoideum a potom byl opakovaně selektován za účelem získání ikmene poskytujícího vyšší výtěžky. Tento nový kmen produkoval agroklavin.

Potom Z. Řeháček se spol. připravili nové mutanty kmene Claviceps purpurea. Jedna mutanta produkovala především agroklavin, zatímco druhá produkovala převážně elymoklavin. V případech obou mutant produkujících elymoklavin hladina alkaloidů v živném prostředí činila jenom 300 až 600 ,ug/ml [J. Nat. Prod. 44, 225 (1981)]. SSSR patent, spis 735 010, případně Prikl. Bloch. Mikróbiol., 18, 569 (1980) popisuje přirozený kmen Claviceps fuslformis produkující šest různých alkaloidů s celkovou hladinou alkaloidů 1 220 ^g/ml, kde podíl elymoklavinu dosahuje 70 až 75 %.

S. H. Ambiket se spol. [Phytochem. 9,

1953 — 1958 (1970)] shledali, že kmeny produkující klavinové alkaloidy typu Claviceps purpúreá obsahují cytochrom P-450 a jeho hladinu lze zvýšit přidáním fenobarbltalu, což vede současně ke vzrůstu hladiny alkaloidů produkovaných kmenem.

Naším cílem bylo získat kmen produkující klavinové alkaloidy, především elymoklavln, ve vysokém výtěžku spolu s alkaloidy, od nichž lze snadno elymoklavin separovat.

Modelové pokusy byly prováděny s kmenem typu Claviceps fusiformis na glycerinopeptonovém živném prostředí produkujícím agroklavin jako hlavní alkaloid a elymoklavin jako vedlejší alkaloid. [A. Tonolo a E. Udvardy-Nagy: Acta Microbiol. Acad. Sci. Hung., 15, 29 (1968)]. Tento kmen byl uložen 2. května 1977 v Národní sbírce mikroorganismů v maďarském Státním zdravotním stavu (Országos Kózegészségúgyi Intézet, Budapešť) pod číslem 00164.

Výzkumy ukázaly, že tento modelový kmen obsahoval alternující oxidázový enzym, zejména cytochrom P-450, a přidání barbiturátů stimulovalo obsah cytochromu P-450 i celkovou produkci alkaloidů.

Bylo shledáno, že byla-li kultura kmene 00164 kultivována v přítomnosti barbiturátů, byla morfologie i pigmentace kolonií podstatně odlišná ve srovnání s původními kmeny. Po opakované selekci se tyto nové znaky ustálily a staly se charakteristickými pro nově vyselektované kmeny, a to i v nepřítomnosti barbiturátů.

Biochemické vlastnosti nové varianty se liší od vlastností rodičovského kmene, tj. kmene č. 00164. Rychlost růstu a schopnost tvorby polysacharidů jsou menší, zatímco schopnost vytvářet alkaloidy a pigmenty je v případě nové varianty mohutnější. Co bylo opravdu překvapivé, byla skutečnost, že podíl elymoklavinu v hladině celkových alkaloidů převažoval, zatímco rodičovský kmen produkoval primárně agroklavin.

Tento nový kmen byl uložen 15. října 1981 v Maďarské Národní sbírce mikroorganismů ve Státním zdravotním ústavu (Országos Kózegészségúgyi Intézet, Budapešť) pod Číslem 00211.

Z výše uvedených poznatků vychází vynález nového mikrobiologického způsobu výroby klavinových alkaloidů obecného vzorce I

(0 .248719 kde

R znamená methylovou nebo hydroxylmethylovou skupinu, kultivací kmene Claviceps fusiformis v tekutém submerzním kultivačním prostředí obsahujícím zdroje uhlíku, dusíku, minerální soli a případně další přísady za aerobních podmínek. Podstata způsobu podle vynálezu spočívá v tom, že se používá varianty kmene Claviceps fusiformis uložené pod číslem 00211 jako kmene produkujícího alkaloidy, přičemž fermentace se provádí při teplotě 20 až 20 ^CC v rozsahu hodnoty pH 4,2 až 6,0 a získané alkaloidy se izolují.

Biologicky čistá kultura varianty organismu Claviceps fusiformis, kmen č. 00211, se může získat tak, že se kmen Claviceps Vusiformis č. 00211 kultivuje v pevném živném prostředí obsahujícím zdroje uhlíku, dusíku, minerální soli a agar, jakož i přísady zvyšující tvorbu cytochromu P-450, a následnou selektivní izolací uvedeného nového kmene č. 00211.

Přísady zvyšující tvorbu cytochromu P-450 jsou barbiturátového typu a používají se v množství 10 mmol/litr fermentačního prostředí. Kultura se inkubuje při teplotě 20 až 28 °C po dobu 7 až 21 dní, a fialově zbarvené ploché kolonie nového kmene, které lze snadno odlišit od rodičovského kmene, se selektují, selekce se případně opakuje v přítomnosti nebo v nepřítomnosti barbiturátů, a izoluje se nová varianta kmene produkující nejméně 85 % elymoklavinu.

Rodičovský kmen 00164 roste v prostředí ztuženém agarem.

Živné prostředí vhodné pro kultivaci rodičovského kmene má následující složení.

Živné prostředí „A“

sacharóza	100' g
1-asparagin	10,0 g
dusičnan vápenatý	1,0 g
dihydrogenfosforečnan draselný	0,25 g
síran horečnatý	0,25 g
chlorid draselný	0,125 g
síran železnatý	0,033 g
síran zinečnatý	0,027 g
L-cystein-hydrochlorid	0,010 g
kvasničný extrakt (Difco)	0,100 g
agar (Difco)	30,0 g

Hodnota pH roztoku výše uvedených složek se nastaví na 2,5 hydroxidem sodným, kapalina se zředí vodou na 1 000 ml a potom se sterilizuje při teplotě 110 °C po dobu 30 minut. Po ochlazení živné prostředí ztuhne.

Živné prostředí „B“

Ze 39 g bramboro-glukózového agaru (Difco) se za použití techniky popsané pro prostředí „A“ připraví 1000 ml živného prostředí.

Živné prostředí „C“ sacharóza kyselina jantarová dusičnan vápenatý dusičnan amonný dihydrogenfosforečnan draselný síran hořečnatý chlorid draselný síran železnatý síran zinečnatý agar (Difco)

100,0 g

10,0 g

1,0 g

0,25 g

0,125 g

0,009 g

0,003 g

30,0 g

Hodnota pH uvedené směsi se nastaví na

3,5 až 5,6 hydroxidem amonným a potom stejně, jako je uvedeno pro živné prostředí „A“, se připraví 1 litr živného prostředí.

Živné prostředí „D“ glycerol 100g pepton (Difco) 20g agar (Difco) 30g

Výše uvedené složky se ředí vodou na 1 000 ml, hodnota pH se nastavuje ná 6,5 až 6,8 a potom se roztok sterilizuje při teplotě 110 'C po dobu 30 minut.

Kultivace se provádí v kterémkoliv výše uvedeném živném prostředí za sterilních aerobních podmínek při teplotě 20 až 28 °C v přítomnosti přísad zvyšujících tvorbu cytochromu P-450, s výhodou v přítomnosti barbiturátů. Jako přísady barbiturátového typu přicházejí v úvahu N-fenylbarbituráty, například fenobarbital nebo methyřfenobarbital. Kultivace se provádí po dobu 7 až 21 dnů a potom se izolují kolonie nového kmene. Nový kmen lze udržovat na šikmém agaru nebo v lyofilizované formě.

Hlavní morfologické a biochemické znaky odlišující nový kmen od rodičovského jsou uvedeny v následující tabulce.

.2487 19

Kmen č. 00211

Morfologické a biochemické Kmen č. 00164 znaky béžově zbarvené, ostře ohraničené kolonie se svraštělým povrchem o průměru 10 až 15 mm béžově zbarvená, hustá viskózní kultura fialově zbarvené, ostře ohraničené, ploché kolonie se vzdušným myceliem o průměru 15 až 20 mm hnědo-fialová, tence vločkovitá kultura

Morfologie kolonií v živném prostředí „C“ 21. dne

Morfologie kolonií v živném prostředí „C

12. dne (v submerzní

a) makroskopické znaky

b) mikroskopické znaky Fenobarbitalová tolerance

a) na pevném (agarovém) prostředí

b) v kapalném prostředí

Hladina cytochromu P-450 (mmol/g suchého mycelia) v živném prostředí „C“, během 4. až 7. dne

Hladina polysacharidů (mg/ml) 7. dne v živném prostředí „C“

Celková produkce alkaloidů (iUg/ml/den) 4. až 7. dne v živném prostředí „C“ (připraveném bez agaru)

Obsah alkaloidů

a) v živném prostředí „C“ (připraveném bez agaru) agroklavin % elymoklavin %

b) v živném prostředí „D“ (připraveném bez agaru) agroklavin °/o elymoklavin % kultuře) dlouhé hyfy, průměru 3 až 5 nm často tvoří vlákna mmol/litr

Ď,6 mmol/litr

1,0 až 1,5

20,8 až 80 ,75 až 80 až 25 až 95 až 10 mmol/litr mmol/litr

2,5 až 3,0

3,8

200 až 250 až 15 až 95 až 10 až 95

Nový kmen č. 00211 uvedený výše je použitelný pro přípravu klavinových alkaloidů podle následujícího způsobu:

Při fermentačním způsobu se používá vhodného kapalného živného prostředí obsahujícího zdroje uhlíku a dusíku, minerální soli a případně další přísady. Pro fermentaci produkující alkaloidy lze kromě jiných použít následujících složení živných prostředí:

Živné prostředí „E“ manltol 40,0 g/litr kyselina jantarová 10,0 g/litr kukuřičný výluh :(corn steep liquor) 2,0 g/litr dihydrogenfos'forečnan draselný 1,0 g/litr síran hořečnatý 0,3 g/litr

Živné prostředí „F“ sacharóza 50,0 g/litr strouhané brambory 10,0 g/litr dusičnan amonný 1,0 g/litr dihydrogenfosforečnan draselný 0,25 g/litr síran hořečnatý 0,25 g/litr

Hodnota pH roztoku výše uvedených složek se nastaví na 5,2 až 5,3 hydroxidem amonným.

Hodnota pH roztoku výše uvedených složek se nastaví na 5,4 až 5,5 hydroxidem amonným.

Živné prostředí „G“ sorbitol 60,0 g/litr kyselina jantarová 36,0 g/litr dihydrogenfosforečnan draselný 0,25 g/litr síran hořečnatý 0,30 g/litr síran železnatý 0,009 g/litr síran zinečnatý 0,003 g/litr

Kterákoliv směs složení uvedeného vpředu se rozpustí ve vodě při teplotě 50 až °C a sterilizuje se při teplotě 110 °C po dobu 30 minut.

Výše popsaná živná prostředí „E“, „F“ a „G“ nebo živná prostředí „C“ nebo ,,D“ připravená bez agaru jsou vhodná pro produkci alkaloidů. Fermentace se provádí za sterilních aerobních podmínek v submerzní kultuře při teplotě 20 až 28 °C po dobu 10 až 15 dní v rozsahu hodnot pH 4,2 až 6,0.

Vynález je podrobně vysvětlen na následujících příkladech, které jej však neomezují.

Příklady provedení

Příklad 1 dní staré kolonie varianty Claviceps fusiformis, kmen č. 0021, na živném prostředí „A“ byly odstraněny z povrchu agaru pomocí 5 ml fysiologického roztoku. Získaná suspenze byla homogenizováría a 1 ml inokula byl přenesen do 500 ml Erlenmeyerovy baňky obsahující 100 ml prostředí „G“ připraveného bez agaru. Kultura byla inkubována při teplotě 24 °C po dobu 7 dní na rotační třepačce (240 ot./min, výkyv 2 cm).

ml získané kultury byly přeneseny do 500 ml Erlenmeyerovy baňky obsahující 100 ml vysterilizovaného prostředí „C“. Kultura byla pěstována po dobu 12 dní za výše uvedených podmínek. Třetího a pátého dne byl k fermentačnímu prostředí přidán 1 ml 10% sterilního vodného· roztoku kvasničného extraktu (Difco).

Dvanáctého dne činil obsah suchých buněk mycelia v prostředí 18 g/litr. Béžovo-fialově zbarvená masa mycelia byla oddělena od prostředí, a celkový obsah alkaloidů ve filtrátu, stanovený pomocí van Urkova činidla za použití elymoklavinového standartu, byl 1 300 ^g/ml.

Obsah elymoklavinu a agroklavinu v prostředí byl stanoven následujícím způsobem:

ml homogenizované kultury bylo extrahováno 40 ml směsi chloroform-isopropylalkohol (4:1) při hodnotě pH 9. 10 ml organické vrstvy bylo odpařeno do sucha za sníženého tlaku. Odparek byl rozpuštěn ve směsi chloroform — methanol (1:1). 20 μΐ tohoto roztoku bylo podrobeno tenkovrstevné chromatografii za použití DC Alufolií Kieselgel 6OF254 (Merek, výrobek 5554) jako adsorbentu a směsi chloroform-ethanol (4:1) jako· vyvíjecího činidla. Skvrny byly detegovány pomocí ultrafialového záření při 254 nm. Elymoklavin (R_f0,20) a agroklavin (Rf 0,30) byly stanoveny spektrofotometricky při 283 nm ve směsi methanol-kyselina vinná (1:1). Obsah elymoklavinu byl 1150 ^g/ml, obsah agroklavinu činil 55 ^g/ml.

Příklad 2

Lyofilizované kolonie varianty Claviceps fusiformis, kmen č. 0021, byly suspendovány do· 2 ml fysiologického roztoku, Homogenizovaná suspenze byla přenesena do 500 ml Erlenmeyerovy baňky obsahující 100 ml vysterilizovaného média „E“. Kultura byla pěstována po dobu 7 dní za podmínek popsaných v příkladu 1.

x 2 ml získoiné kultury byty přeneseny do 500 ml Erlenmeyerových baněk obsahujících 100 ml prostředí ,,G“. Kultury byly pěstovány při teplotě 24 °C za třepání po dobu 3 dní. Získaná inokula byla přenesena do desetilitrového skleněného fermentoru, obsahujícího 5 litrů sterilního živného prostředí ,,G“. Kultury byly pěstovány při teplotě 24 ^ClC za vzdušnění (0.5 1/1/inirn) a za míchání (430 ot/min) po> dobu 12 dní. V případě potřeby bylo přidáno· 0,5 ml/1 sterilního protipěnivého prostředku Struktolu SB 2020.

Na konci fermentace obsahovalo prostředí 16 g suchých buněk mycelia v litru a osah všech alkaloidů stanovený podle příkladu 1 byl 1 550 jíg/ml, přičemž množství elymoklavinu dosáhlo až 1 435 ^g/ml a agrokyavinu až 90 <g/ml.

Příklad· 3

Lyofilizované kolonie varianty Claviceps fusiformis, kmen č. 00211, byly suspendovány ve 2 ml fysiologického roztoku a homogenizovaná suspenze byla naočkována na prostředí ,,B“. Kultura byla inkubována při teplotě 24 °C ve tmě po dobu 14 dní. Takto získaná očkovací kultura byla sebrána z povrchu a homogenizována s 5 ml fysiologického roztoku. 2 x 2 ml homogenizované kultury byly přeneseny do 500 ml Erlenmeyerových baněk obsahujících po 100 ml prostředí „F“. Kultura byla potřepávána při teplotě 24 °C po· dobu 5 dní a potom přenesena do desetilitrového skleněného fermentoru obsahujícího 5 litrů sterilního· živného prostředí ,,C“.

Kultura se nechala růst při teplotě 24 °C za podmínek vzdušnění (0.,51/1/min) a míchání (430 ot/min) po dobu dvou dní. Takto získané inokulum bylo přeneseno do 1601itrového· nerezového fermentoru obsahujícího 110 litrů sterilního média C, ke kterému bylo doplněno^ 20 g/1 chloridu sodného.

Kultura se nechala růst při teplotě 24 °C za vzdušnění (0,4 1/11min) a míchání 200 ot/min) po dobu 12 dní. Během fermentačního procesu bylo přidáno protipěnivé činidlo, sterilní Struktol SB 2020, v celkovém množství asi 220 ml.

Po- ukončení fermentace obsahovalo prostředí 15 g suchého buněčného mycelia v litru a 1815 pg veškerých alkaloidů/ml, z (3:2) acetonitrilu a 0,01M vodného roztoku uhličitanu amonného; detekce ultrafialovým zářením při 280 nm]. Elymoklavin měl dobu retence 8,7 minuty, agroklavin 32,0 minut. i toho až 1 630 ^g/ml elymoklavinu a až 240 jug/ml agroklavinu. Prostředí bylo zfiltrováno a pomocí vysokotlaké kapalinové chromatografie (HLPC) byl stanoven ve filtrátu elymoklavin a agroklavin [adsoribent: Nucleosil 10 C 18; eluční činidlo: směs

Claims

PŘEDMĚT VYNÁLEZU

Způsob výroby klavinových alkaloidů obecného vzorce I kde !

R znamená methylovou nebo hydroxymethylovou skupinu, kultivací kmene Claviceps fusiformis v tekutém submerzním kultivačním prostředí obsahujícím zdroje uhlíku, dusíku, minerální soli a případně další přísady za aerobních podmínek, vyznačující se tím, že se používá varianty kmene Claviceps fusiformis uložené pod číslem 00 211 jako kmene produkujícího alkaloidy, přičemž fermentace se provádí při teplotě 20 až 28 °C v rozsahu hodnoty pH 4,2 až 6,0 a získané alkaloidy se izolují.