DE3306622C2

DE3306622C2 -

Info

Publication number: DE3306622C2
Application number: DE3306622A
Authority: DE
Inventors: Giancarlo Sportoletti; Pier Giuseppe Pagella; Pietro Mailand/Milano It Cremonesi
Original assignee: ITALFARMACO SpA MAILAND/MILANO IT
Current assignee: ITALFARMACO SpA MAILAND/MILANO IT
Priority date: 1982-03-02
Filing date: 1983-02-25
Publication date: 1990-02-22
Also published as: GR78470B; BE896051A; NO830707L; AT390067B; CH653893A5; BR8301005A; AU1185883A; DK159824B; JPS58159421A; NL190399C; IT1150213B; DE3306622A1; FI830678L; FI77574C; ATA70983A; DK84883A; SE8301129L; ZA831350B; AR229805A1; US4493829A

Description

Die Erfindung betrifft die im Anspruch 1 angegebenen succinylierten Proteine, die Eisen in biologisch verfügbarer Form enthalten, ein Verfahren zu ihrer Herstellung gemäß den Ansprüchen 8 und 9, sowie eine pharmazeutische Zubereitung zur Behandlung der Sideropenie beim Menschen, die als Wirkstoff die biologisch verfügbares Eisen enthaltenden succinylierten Proteine enthält gemäß Anspruch 10. Die Ansprüche 2 bis 7 betreffen Ausgestaltungen des Anspruchs 1.

Eisen, das in allen Körpergeweben vorkommt, spielt im physiologischen Stoffwechsel eine sehr wichtige Rolle. Eisen stellt einen Teil und eine essentielle Komponente des Hämoglobins, Myoglobins und der Enzym Katalase, Fumarsäuredehydrogenase, Peroxidase, Cytochrome, DPN-Cytochromreduktase und der Metallflavoproteine, wie z. B. Ferroflavin, dar. Die Gewebe eines Erwachsenen enthalten 1,5 bis 5 g Eisen, wovon 60 bis 65% in den roten Blutkörperchen konzentriert sind, während 18 bis 30% in gebundener Form in Ferritinproteinen und Hämosiderin, das in der Leber, in der Milz, im Knochenmark und in den Zellen des endothelialen Retikularsystems lokalisiert ist, vorliegen. Der Rest des Eisens ist über die obengenannten verschiedenen Enzyme verteilt. So enthält Myoglobin beispielsweise 4% und Transferrin beispielsweise 0,1%, das β₁-Globulin für den hämatischen Transport des Eisen von intestinalem Ursprung. Es kann bei physiologischen pH-Werten 2 Eisenatome in undissoziierbarer Form binden.

Der Eisenbedarf des Körpers wird gedeckt zum Teil durch Verwendung von endogenem Eisen, das aus dem Abbau alter roter Blutkörperchen stammt, und zum Teil durch Absorption von exogenem Eisen. Die Absorption des exogenen Eisens erfolgt entlang des Duodenums und im oberen Abschnitt des Jejunums, und es reichert sich vorwiegend in der Leber an.

Das erste pathologische Symptom für einen Eisenmangel ist die hyperchrome Sideropenie, die verschiedene Ursachen haben kann: chronische Hämorrhagien, wie sie bei Gastroduodenalgeschwüren auftreten, oder Neoplasie; Mangeldiäten oder eine schlechte Adsorption wie im Falle von Durchfall; ein erhöhter Eisenbedarf, z. B. bei der Schwangerschaft, Lactation, Infektionserkrankungen und dergl.; eine schlechte physiologische Verwertung; und bei verschiedenen Behandlungen, beispielsweise bei der Verabreichung von ACTH und Cortisonen.

Die beste Therapie zur Beseitigung dieser Eisenmangelerkrankungen ist die Verabreichung von Eisenpräparaten. Dadurch wird der anämische Zustand wirksam verhindert, wenn er tatsächlich durch einen Eisenmangel verursacht ist. Dabei treten im allgemeinen jedoch unerwünschte Nebenwirkungen auf, die in erster Linie auf den Träger, mit dem das Eisen eingeführt wird, zurückzuführen sind.

Die verbreitetsten pharmazeutischen Zubereitungen zur oralen Verabreichung von Eisen basieren auf sehr verschiedenartigen organischen und anorganischen Säuresalzen. Beispiele für oral zu verabreichende Arzneimittel, die derzeit auf dem Markt befindlich sind, sind solche auf Basis von anorganischen Salzen des Typs Ferrichlorid, Ferrosulfat oder Ferriphosphat, oder auch solche auf Basis von organischen Salzen, wie z. B. Citrate, Cholinate, Asparagate, Fumarate, Gluconate, Glycinate, Lactate, Oxalate und Succinate. Für eine intramuskuläre Injektion wird im allgemeinen der Ferrodextran-Komplex verabreicht, während für intravenöse Behandlungen (beispielsweise zur Behandlung der Sideropenie, bei der eine Verabreichung per os versagt) der Ferrodextrin-Komplex verwendet wird.

Im Falle der zuletztgenannten Eisenkomplexe sind die hauptsächlich auftretenden unerwünschten Nebenwirkungen allergische Reaktionen, Temperaturanstiege, Tachycardie, Leucozytose, Lymphadenopathie im Falle der intramuskulären Behandlung und sogar ein anaphylaktischer Schock, Thrombophlebitis und Kreislaufkollaps infolge einer intravenösen Behandlung. Im Falle einer oralen Behandlung unter Verwendung von Eisenpräparaten auf Basis der obengenannten Eisensalze mit anorganischen oder organischen Säuren, treten als Nebenwirkungen im allgemeinen gastrointestinale Schäden mit einer Nekrose und Perforation der mukösen Membranen in ernsteren Fällen sowie Durchfall und Erbrechen auf. Die geringe Verträglichkeit macht ferner die Verabreichung von ausreichenden Mengen Eisen schwierig.

Um die Nebenwirkungen herabzusetzen, wurde bereits vorgeschlagen, die Eisenpräparate zusammen mit der Nahrung aufzunehmen, was aber ebenfalls ungünstig ist, weil in diesem Falle die Absorption des Eisens schlecht ist. Es hat sich nämlich in der Praxis gezeigt, daß die Absorption von Eisenpräparaten am besten ist, wenn der Patient vorher gefastet hat. Die gleichzeitige Verwendung von Mitteln zur Neutralisation der Salzsäure im Magen bringt zusätzliche Magen- und Darmreizungen mit sich, die ihrerseits die Absorption der Eisenpräparate vermindern und den anämischen Zustand verschlimmern.

Einen wesentlichen Fortschritt in der Eisentherapie hat die orale Verabreichung von Präparaten auf Ferritinbasis mit sich gebracht. Ferritin ist ein Eisen(III)globulin und stellt das wichtigste eisenhaltige Protein in den Körpern von Säugetieren dar. Das Handelsprodukt wird aus der Milz von Pferden als Ausgangsmaterial extrahiert. Sein Eisengehalt beträgt 20%, bezogen auf das Trockengewicht. Sein Proteinanteil, das Apoferritin, hat ein Molekulargewicht von etwa 445 und umgibt einen "Kern" aus kristallinem Oxidphosphateisen. Es ist für die orale Verabreichung geeignet, da es wasserlöslich ist.

Mit der Behandlung mit Präparaten auf Ferritinbasis ist es zwar gelungen, die unerwünschten gastrointestinalen Nebenwirkungen zu verringern, Ferritinpräparate sind jedoch außerordentlich teuer wegen des teuren Ausgangsmaterials, und die zur Verfügung stehenden Mengen sind beschränkt, weil sie ausschließlich aus der Milz von Pferden gewonnen werden müssen.

Da bekannt ist, daß Eisen eine bestimmte Affinität gegenüber Proteinen hat, wurden die verschiedensten Proteine tierischen Ursprungs (Serumproteine, Organproteine, Ovalbumine, Lactoproteine) oder pflanzlichen Ursprungs (Sojaprotein) auf ihre Eignung als Träger für die Verabreichung von Eisen untersucht. Zu diesem Zweck wurden anorganische Ferrisalze mit den genannten Proteinen umgesetzt unter Bildung der entsprechenden Ferroprotein-Derivate, die jedoch bei ihrer therapeutischen Verwendung verschiedene Nachteile aufweisen:

- die erhaltenen Eisenderivate werden unlöslich, wenn der Prozentsatz des mit dem Protein verbundenen Eisens über 0,5% liegt,
- es ist schwierig oder sogar unmöglich, festzustellen, welcher Anteil des Gesamteisengehalts in den unlöslichen Präparaten tatsächlich an das Protein gebunden ist und welcher Anteil in Form von hydrierten Oxiden, die schwere Magenschädigungen hervorrufen können, mitausgefällt wird,
- das Eisen ist in diesen Derivaten ungleichmäßig verteilt, und die Eisenverbindungen sind instabil;
- im Falle einiger Proteine, beispielsweise jener von Milch, ist die Gegenwart eines beträchtlichen Anteils von unlöslichen Derivaten zusammen mit löslichen Derivaten bei verschiedenen pH-Werten beobachtet worden, wobei die Zusammensetzung der löslichen Anteile extrem variabel war schon bei sehr geringen Abänderungen der experimentellen Parameter.

Aus der GB-PS 15 75 577 und aus der DE-OS 25 39 778 ist es bereits bekannt, daß Metallproteinate, insbesondere Eisenproteinate, bzw. Succinyl-Orgotein-Komplexe von Metallen, insbesondere von Zink und Kupfer, zur Erhöhung der betreffenden Metallspiegel an Säugetiere verabreicht werden können. Die komplexgebundenen Metalle liegen darin jedoch in einer weitgehend unlöslichen Form vor. So ist in Beispiel 4 der DE-OS 25 39 778 beispielsweise angegeben, daß nur etwa 5% des im Succinylorgoteinkomplex gebundenen Zinks und noch weniger des entsprechenden komplexgebundenen Kupfers bei der Dialyse aus dem Protein freigesetzt werden können. Das heißt, in den darin beschriebenen Metall-Protein-Komplexen liegt das Metall nicht in biologisch verfügbarer Form vor.

Das gilt auch für den in "The Journal of Biological Chemistry", Band 248, Nr. 14 (25. Juli 1973), Seiten 4905-4908, beschriebenen Eisen-Protein-Komplex (Eisensuperoxiddismutase), in dem die Eisenionen in dem Eisen-Protein-Komplex so fest gebunden sind, daß sie biologisch nicht verfügbar sind.

Aufgabe der Erfindung war es daher, einen Eisen-Protein-Komplex zu finden, der die vorstehend geschilderten Nachteile nicht aufweist und das Eisen in locker gebundener Form enthält und dennoch stabil und bei pH-Werten von mehr als 5 löslich ist, so daß es bei der Verabreichung an Menschen und Tiere biologisch leicht verfügbar ist.

Es wurde nun überraschend gefunden, daß diese Aufgabe erfindungsgemäß dadurch gelöst werden kann, daß Eisen an succinylierte Proteine komplex gebunden wird.

Gegenstand der Erfindung sind succinylierte Proteine, die dadurch gekennzeichnet sind, daß sie Eisen in biologisch verfügbarer Form enthalten.

Mit dem erfindungsgemäßen succinylierten Eisen-Protein-Komplex ist es erstmals gelungen, der Fachwelt ein Protein zur Verfügung zu stellen, das Eisen in locker gebundener Form enthält und dennoch stabil und bei pH-Werten von mehr als 5 löslich ist, so daß es bei der Verabreichung an Menschen und Tiere biologisch leicht verfügbar ist. Darüber hinaus haben die erfindungsgemäßen Eisen-Proteinpräparate den Vorteil, daß ihre Eisengehalte in beliebiger und reproduzierbarer Weise variiert werden können, so daß es damit erstmals möglich ist, Säugetiere durch orale Verabreichung mit biologisch verfügbarem Eisen zu versorgen, ohne daß die bisher stets beobachteten unerwünschten Nebenwirkungen, wie z. B. gastrische Schäden, auftreten.

Gemäß einer bevorzugten Ausgestaltung der Erfindung enthalten die succinylierten Proteine das in biologisch verfügbarer Form vorliegende Eisen in einer Menge von 0,1 bis 20 Gew.-%.

Der Grad ihrer Succinylierung liegt vorzugsweise zwischen 20 und 100%.

Das Basisprotein der erfindungsgemäßen succinylierten Proteine ist vorzugsweise pflanzlichen oder tierischen Ursprungs.

Gemäß einer besonders bevorzugten Ausgestaltung der Erfindung handelt es sich bei dem Protein um ein Milchprotein mit einem Grad der Succinylierung von mehr als 70%, das mehr als 4 Gew.-% Eisen in biologisch verfügbarer Form enthält.

Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausgestaltung der Erfindung handelt es sich bei dem Protein um Ovalbumin mit einem Grad der Succinylierung von mehr als 70%, das mehr als 4 Gew.-% biologisch verfügbares Eisen enthält.

Gemäß einer noch weiteren bevorzugten Ausgestaltung der Erfindung handelt es sich bei dem Protein um Sojaprotein mit einem Grad der Succinylierung von mehr als 70%, das mehr als 4 Gew.-% biologisch verfügbares Eisen enthält.

Gegenstand der Erfindung ist ferner ein Verfahren zur Herstellung der vorstehend beschriebenen eisenhaltigen succinylierten Proteine, das dadurch gekennzeichnet ist, daß ein succinyliertes Protein in einem wäßrigen Medium bei einem pH-Wert zwischen 2 und 10, vorzugsweise in der Nähe des Neutralpunktes, mit Eisensalzen umgesetzt und das dabei erhaltene Produkt durch Ausfällen bei pH 2 bis 4 oder durch Entfernen des Lösungsmittels nach Einstellung des pH-Wertes auf Werte, die sich der Neutralität nähern, isoliert wird.

Gegenstand der Erfindung ist ferner eine pharmazeutische Zubereitung, die sich besonders gut eignet zur Behandlung der Sideropenie beim Menschen, die als aktiven Wirkstoff die vorstehend beschriebenen succinylierten Proteine, die biologisch verfügbares Eisen enthalten, enthält.

Die erfindungsgemäße pharmazeutische Zubereitung eignet sich besonders gut zur Behandlung der Anämie, die durch Eisenmangel bei Säugetieren verursacht ist, wobei bei ihrem humanmedizinischen oder veterinärmedizinischen Gebrauch keinerlei unerwünschte Nebenwirkungen auftreten. Dies hat sich beispielsweise gezeigt bei Ratten, denen an 20 aufeinanderfolgenden Tagen die erfindungsgemäße pharmazeutische Zubereitung täglich oral verabreicht worden war. Bei ihnen ergab sich kein Hinweis auf gastrische Schäden, und die erfindungsgemäße pharmazeutische Zubereitung wies einen hohen Grad an Verträglichkeit auf.

Unter den Bedingungen der Siderämie ergab sich bei der oralen Verabreichung äquivalenter Mengen von Eisen in Form von Ferrosulfat, Pferdemilzferritin und Ferroprotein-Derivaten von succinylierten Milchproteinen, hergestellt wie in dem weiter unten folgenden Beispiel 1, im Rahmen eines Vergleichsversuchs, daß:

(a) die hämatischen Eisenspiegel, erzeugt durch den erfindungsgemäßen succinylierten Eisen-Protein-Komplex, durchweg höher lagen, auch nach längerer Zeit nach der Behandlung, als die durch Verabreichung von Ferrosulfat gemäß Stand der Technik erzeugten Eisenspiegel (vergleiche die weiter unten folgende Tabelle IX); und
(b) die hämatischen Eisenspiegel, erzeugt durch Verabreichung des erfindungsgemäßen succinylierten Eisen-Protein-Komplexes innerhalb einer 6-stündigen Versuchsperiode durchweg höher lagen als die unter Verwendung von Standard-Ferritin gemäß Stand der Technik erzeugten Eisenspiegel (durchschnittliche Erhöhung 1,5 : 1) (vergleiche die weiter unten folgende Tabelle X).

In Anbetracht der außerordentlich guten Verträglichkeit des erfindungsgemäßen Eisen-Protein-Komplexes, seiner geringen Toxizität (<4000 mg/kg bei Mäusen des Typs Swiss), der damit erzielbaren hohen Eisenspiegel, die auch über längere Zeiträume hinweg aufrechterhalten werden können, und der Leichtigkeit der Beschaffung des Ausgangsmaterials ist durch die vorliegende Erfindung eine deutliche Verbesserung des Standes der Technik erzielbar, die auch für den Fachmann nicht vorhersehbar war.

Die physikalisch-chemischen Eigenschaften der erfindungsgemäßeen Succinylferroproteine sind, wie weiter oben erwähnt, reproduzierbar und stabil, wie die weiter unten folgenden Beispiele zeigen. Daß sie kein nicht-gebundenes Eisen enthalten, zeigt sich darin, daß sie in einem alkalischen Medium (das heißt unter Bedingungen, unter denen evtl. vorhandene Eisenionen in Form von hydriertem Eisenoxid ausfallen) vollständig löslich sind.

Die erfindungsgemäßen Succinyl-Ferroprotein-Derivate können auf den verschiedensten Gebieten eingesetzt werden. Sie eignen sich insbesondere als Wirkstoffe zur Behandlung der Sideropenie.

Ein wichtiger Aspekt der vorliegenden Erfindung sind pharmazeutische Präparate für die Human- und Veterinärmedizin, die festgelegte Mengen dieser Derivate enthalten. Diese Präparate können oral verabreicht werden, beispielsweise in Form von Tabletten, Kapseln, Ampullen; in Form von Cachets, die Granulate enthalten; in Form von Sirupen; in Form von Pulver, das als Beifuttermittel verwendet werden kann.

Beispiele für erfindungsgemäß verwendbare Formulierungen sind folgende:

- Ampullen, die 5 bzw. 10 bzw. 40 mg Eisen in Form von Ferrosuccinylproteinen neben wäßrigen Lösungsmitteln, Stabilisierungsmitteln, Geschmacksstoffen und dgl., wie sie üblicherweise in der Pharmazie eingesetzt werden, enthalten;
- Tabletten, die 5 bzw. 10 bzw. 40 mg Eisen in Form von Ferrosuccinylproteinen neben in der Arzneimittelindustrie üblichen Verdünnungsmitteln und Dispergiermitteln enthalten;
- Kapseln, die 5 bzw. 10 bzw. 40 mg Eisen in Form von Ferrosuccinylproteinen enthalten;
- Einheitsdosen-Cachets, die ein aufbrausendes Granulat entsprechend einer Menge von 5 bzw. 10 bzw. 40 mg Eisen in Form von Ferroproteinen neben in der Pharmazie üblichen Zusätzen, wie Zucker, Geschmacksstoffen und Stabilisierungsmitteln, enthalten; und
- Milchpulver, das einem Entwöhnungs-Tierfutter zugesetzt werden kann mit einem Wirkstoffgehalt von 5 bis 20 Gew.-%.

Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele näher erläutert.

Beispiel 1 Herstellung von Eisenderivaten aus succinylierten Proteinen aus Vollmilchpulver mit einem Eisengehalt von 5%

1 kg Milchpulver wurde in 6 l 0,3 M Natriumbicarbonat suspendiert. Unter mechanischem Rühren und pH-Wertkontrolle wurden 500 g Bernsteinsäureanhydrid portionsweise zugegeben, wobei der pH-Wert innerhalb eines Bereiches von 7,5 und 8 gehalten wurde durch Zugabe von 4n NaOH. Das erhaltene Gemisch wurde 2 bis 3 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Während dieser Zeit hatte sich die Suspension vollständig gelöst. Die opaleszierende Lösung wurde zentrifugiert oder filtriert, bis sie fast klar war, und langsam mit HCl auf einen pH-Wert von 3 angesäuert.

Der gebildete Niederschlag wurde durch Zentrifugieren oder Filtrieren abgetrennt und in Wasser resuspendiert (8 Liter). Es wurde NaOH-Lösung zugefügt, bis er vollständig gelöst war (pH-Wert 7,5). Es wurde zentrifugiert und die klare Lösung wurde durch Zugabe von HCl bis auf einen pH-Wert von 2,5 bis 3 wieder angesäuert.

Der gebildete Niederschlag wurde durch Filtrieren oder Zentrifugieren gesammelt und mit einer HCl-Lösung mit einem pH-Wert von 3 gewaschen. Der Rückstand, bestehend aus succinylierten Proteinen (dessen Succinylierungsgrad variieren kann als Funktion der Menge des eingesetzten Bernsteinsäureanhydrids; in dem hier beschriebenen Fall betrug er 90% der Gruppen, die succinyliert werden können in dem Ausgangsprotein, wie unten angegeben), wurde nach dem Trocknen im Vakuum in destilliertem Wasser dispergiert. Er wurde gelöst durch durch die Zugabe von NaOH bis zu einem pH-Wert von 7,5, unter Verdünnung der Lösung in der Weise, daß die Endproteinkonzentration 0,04 g/ml betrug.

Eine Lösung eines Eisensalzes (z. B. FeCl₃) mit einem Verhältnis von Fe³⁺/succinyliertes Protein von 1 : 10, bezogen auf Gewichtsteile, wurde zu dieser Lösung zugegeben. Dies ergab eine Suspension, die durch mechanisches Rühren fein dispergiert wurde, während der pH-Wert auf 2,5 sank. Das Rühren wurde während 3 Stunden bei Raumtemperatur fortgesetzt, und die Suspension wurde dann filtriert. Der Feststoff wurde in Wasser suspendiert (3 Volumenteile) und durch Zugabe von NaOH gelöst (pH-Wert 7,5).

Die Lösung, die nicht vollständig klar war, wurde filtriert und das Produkt in festem Zustand wiedergewonnen unter Anwendung einer der folgenden Methoden:

(a) Die Lösung wurde angesäuert, und der erhaltene Niederschlag wurde bei einem pH-Wert von 2,5 abfiltriert und unter Vakuum getrocknet.
(b) die klare Lösung wurde gegen Wasser dialysiert, um das Natriumchlorid zu entfernen, und dann gefriergetrocknet oder in einem Sprühtrockner getrocknet.

Die Endprodukt-Ausbeuten waren die gleichen und betrugen bis zu 20 Gew.-% des eingesetzten Milchpulvers. Die Charakteristiken des Produkts sind in Tabelle I angegeben (Beispiel 1b).

Beispiel 2 Herstellung eines Eisen-Derivats aus succinylierten Milchproteinen mit einem Eisengehalt von 5%

Es wurde das Beispiel 1 wiederholt, wobei diesmal jedoch das Ausgangsprodukt aus 350 g Milchproteinen bestand, die vorher aus Milchpulver ausgefällt worden waren durch Dispergieren des Pulvers in Wasser (5 l), Ansäuern auf einen pH-Wert von 2,5 mit einer Mineralsäure und anschließendes Filtrieren oder Zentrifugieren des Proteinfeststoffs und Trocknen.

Der Eisengehalt für die in den Beispielen 1 und 2 erhaltenen Derivate betrug, wie unten angegeben (Tabelle I), 4 bis 5 Gew.-%.

Beispiel 3 Herstellung von Eisenderivaten aus succinylierten Milchproteinen mit unterschiedlichen Eisengehalten

Die in den Beispielen 1 und 2 beschriebenen Verfahrensstufen wurden angewandt mit denselben Mengen Milchpulver oder vorher ausgefällten Milchproteinen, während das Gewichtsverhältnis von Fe³⁺/succinyliertes Protein geändert wurde in 0,1 : 10; 0,2 : 10; 0,5 : 10 und 1,5 : 10. Dabei wurden Eisenderivate erhalten, deren Charakteristiken in Tabelle I gezeigt sind.

Beispiel 4 Herstellung von Eisenderivaten aus succinylierten Eierproteinen (Ovalbumin)

5 g Ovalbumin wurden in 100 ml Wasser, das 3 g KHCO₃ enthielt, gelöst, und es wurden 2,5 g Bernsteinsäureanhydrid portionsweise zu der klaren Lösung zugegeben, während der pH-Wert durch Zugabe von NaOH zwischen 5 und 8 gehalten wurde. Das Gemisch wurde 2 Stunden bei Raumtemperatur reagieren gelassen. Nach dem Ansäuern der Lösung auf einen pH-Wert von 3,4 wurde ein Niederschlag erhalten, der durch Zentrifugieren isoliert, durch Auflösen bei einem pH-Wert von 7,5 durch NaOH gereinigt und dann bei einem pH-Wert von 3,4 wieder ausgefällt wurde. Der Feststoff wurde durch Zentrifugieren gewonnen und im Vakuum getrocknet.

Der trockene Feststoff wurde in destilliertem Wasser suspendiert und durch Zugabe von NaOH (pH 8) gelöst, so daß eine Endlösung mit 0,04 g Protein/ml erhalten wurde.

Eine Lösung eines Fe³⁺-Salzes (z. B. Ferrichlorid) wurde zu der sehr viskosen Lösung zugegeben, bis ein Gewichtsverhältnis von succinylierten Proteinen zu Fe³⁺ von 10 : 1 erhalten wurde. Unter diesen Bedingungen sank der pH-Wert auf 2,6 unter Bildung eines Niederschlags, der durch Filtrieren gewonnen wurde. Dieser Niederschlag wurde in Wasser wieder aufgelöst, und es wurde NaOH zugegeben, bis er vollständig gelöst war (pH-Wert= 7,5). Nach der Dialyse gegen Wasser zur Entfernung von Natriumchlorid wurde das feste Produkt durch Gefriertrocknen oder durch einen Sprühtrockner wiedergewonnen. Die Ausbeute des Derivats betrug 33 Gew.-% des Ausgangsproteins. Sein Eisengehalt und seine Charakteristiken sind in der Tabelle I wiedergegeben.

Beispiel 5 Herstellung von Eisenderivaten aus succinylierten Rinderserumproteinen

1,5 g NaHCO₃ wurden zu 50 ml einer Lösung von Rinderserumproteinen zugegeben, und das Gemisch wurde portionsweise mit 6 g Bernsteinsäureanhydrid versetzt, während der pH-Wert durch Zugabe von NaOH zwischen 7,5 und 8 gehalten wurde. Nach vollständiger Zugabe wurde das Reaktionsgemisch 2 h lang bei Raumtemperatur stehengelassen, und dann wurde ein Niederschlag erzeugt durch Ansäuern auf einen pH-Wert von 2,4 mittels einer Mineralsäure. Der Niederschlag wurde durch Zentrifugieren gewonnen und wie in Beispiel 4 beschrieben gereinigt.

Das feste Produkt wurde in Wasser suspendiert und durch NaOH auf einen pH-Wert von 7,5 gebracht. Zu der auf diese Weise erhaltenen Lösung wurde eine Lösung eines Eisen(III)-salzes (z. B. Ferrichlorid) zugegeben, bis ein Gewichtsverhältnis von succinylierten Proteinen zu Fe³⁺ von 10 : 1 erreicht war. Der pH-Wert sank spontan auf 2,4, und es wurde ein Niederschlag erhalten, der sich - wenn auf einen pH-Wert von 7,5 gebracht - nur teilweise löste. Die Lösung wurde durch Zentrifugieren von dem Rückstand getrennt, gegen Wasser dialysiert, um Natriumchlorid zu entfernen, und dann wurde eine Gefriertrocknung durchgeführt. Die Gewichtsausbeute an Eisenderivat, bezogen auf das Ausgangsprotein, betrug 30%. Der Eisengehalt und die Charakteristiken sind in der Tabelle I angegeben.

Beispiel 6 Herstellung von Eisenderivaten aus succinylierten Proteinen aus Schweineleber

400 g frische Schweineleber wurden in einem handelsüblichen Homogenisator in Gegenwart von 800 ml einer 0,2molaren KHCO₃-Lösung mit einem pH-Wert von 8,3 homogenisiert. Nach dem Zentrifugieren bei 9000 U/min bei 5°C wurde die überstehende Flüssigkeit gesammelt und durch eine 0,45 µm Celluloseacetatmembran filtriert. Zu 50 ml der klaren Lösung wurden 1,2 g Bernsteinsäureanhydrid portionsweise zugegeben, wobei durch Zugabe von NaOH sichergestellt wurde, daß der pH-Wert zwischen 7,5 und 8 blieb.

Die Lösung wurde 1 Stunde bei Raumtemperatur stehengelassen und dann mit Mineralsäure auf einen pH-Wert von 3 angesäuert, wodurch eine Ausfällung erhalten wurde, die auf dieselbe Weise wie in Beispiel 4 verarbeitet wurde, jedoch mit der Änderung, daß die endgültige Gewinnung durch Gefriertrocknen der Lösung, die gegen Wasser dialysiert worden war, erfolgte.

Der gefriergetrocknete Rückstand wurde in Wasser suspendiert und unter Verwendung von Soda auf pH 8 gebracht. Man erhielt eine Lösung, die nicht vollständig klar war und die zentrifugiert wurde.

Eine Lösung von Eisen (z. B. Ferrichlorid) wurde zu der klaren überstehenden Flüssigkeit hinzugefügt in der Weise, daß das succinylierte Protein/Fe³⁺-Verhältnis 10 : 1 betrug.

Der pH-Wert der Lösung fiel auf 2,6 unter Bildung eines Niederschlags, der auf die gleiche Weise wie in den vorhergehenden Beispielen gereinigt wurde. Der Feststoff, der durch Gefriertrocknung der Endlösung erhalten wurde und gegen Wasser dialysiert wurde, hatten die Charakteristiken und den Eisengehalt wie in Tabelle I angegeben.

Beispiel 7 Herstellung von Eisenderivaten aus succinylierten Sojaproteinen

5 g Sojaproteine wurden in 100 ml Wasser mit einem Gehalt von 3 g NaHCO₃ suspendiert. Das Gemisch wurde gerührt bis zur vollständigen Auflösung, wobei der pH-Wert durch Zugabe von NaOH zwischen 7,5 und 8 gehalten wurde. Es wurden 2,5 g Bernsteinsäureanhydrid portionsweise hinzugefügt. Das Gemisch wurde 2 Stunden bei Raumtemperatur gerührt und durch Zugabe von Mineralsäure auf einen pH-Wert von 3,4 gebracht, wodurch ein Niederschlag gebildet wurde, der auf dieselbe Weise wie in den früheren Beispielen gereinigt wurde.

Der feste Rückstand der finalen Gefriertrocknung wurde in 100 ml Wasser suspendiert, der pH-Wert wurde durch Zugabe von Soda auf 8 korrigiert, und dann wurde die Lösung, die nicht vollständig klar war, zentrifugiert.

Die klare überstehende Lösung wurde mit einer Eisenlösung (z. B. Ferrichlorid) in der Weise behandelt, daß das succinylierte Protein/Fe³⁺-Gewichtsverhältnis 10 : 1 betrug. Der pH-Wert der Lösung fiel spontan auf 2,6, und es wurde ein Niederschlag gebildet und auf die gleiche Weise wie in den vorhergehenden Beispielen behandelt. Der bei der finalen Gefriertrocknung erhaltene Feststoff hatten die Charakteristiken und den Eisengehalt, wie in Tabelle I angegeben.

Die Gewichtsausbeute in bezug auf das Ausgangsprotein betrug 22%.

Chemisch-physikalische Eigenschaften der Eisenderivate von succinylierten Proteinen, wie sie in den Beispielen 1 bis 7 erhalten wurden

Die gemäß den vorstehenden Beispielen erhaltenen Derivate wurden nach den folgenden Methoden analysiert:

a) Bestimmung des Grades der Succinylierung

Der Grad der Succinylierung ist ausgedrückt als Prozentsatz der succinylierten Gruppen, bezogen auf die Anzahl der Gruppen des Ausgangsproteins, die succinyliert werden können. Die Messung erfolgte nach der Methode von S. Moore und W. H. Stein, in "J. Biol. Chem." 211 (1954) 907, durch Bestimmung der Anzahl der freien Aminogruppen der Proteins mit Ninhydrin. Die Ergebnisse sind in Tabelle I wiedergegeben.

b) Bestimmung des Eisengehaltes

Der Eisengehalt wurde bestimmt entweder nach der Heißextraktion mit 2 n HCl oder nach vollständiger Digerierung des Proteins durch Schwefelsäure, wie beschrieben in "Standard Methods", 14. Aufl. (1975), Seite 208, APHA-AWWA-WPCF (Reaktions mit o-Phenanthrolin). Die Werte sind in Tabelle I angegeben.

c) Spektrokopische Daten 1) EPR-Spektroskopie

Alle Derivate, die in den vorstehenden Beispielen beschrieben sind, zeigten dasselbe spektroskopische Verhalten. Das EPR-Spektrum des Succinyl-Ferroprotein-Derivats, das in Beispiel 1 hergestellt worden ist, wurde als Beispiel 1 aufgetragen. Das Spektrum wurde von einem gefriergetrockneten Pulver aufgenommen und hatte ein sehr breites Signal, zentriert um g=2,0, mit einer Signalamplitude von 2000 G. Es war noch ein weiteres gut aufgelöstes Signal vorhanden, und es war auch zentriert um g=2,0. Die Form beider Signale war charakteristisch für ineinanderwirkende Fe³⁺ paramagnetische Zentren (F. Reid et al. ,"Inorg. Chem." 7 (1968), 119). Alle diese Daten zeigten das Vorliegen von Proteinstrukturen, die um das verbindende Zentrum geschlossen waren.

2) Zirkulardichroismus

Das Verhalten der verschiedenen beschriebenen Derivate war auch in diesem Fall ähnlich. Das Zirkulardichroismus- Spektrum des Succinyl-Ferroprotein-Derivats, erhalten in Beispiel 1, wurde als Beispiel aufgetragen. Das Spektrum war charakterisiert durch eine negative Aktivität in der UV-Zone. Diese zeigt ein intensives negatives Band mit einer Spitze bei 200 nm und einer Schulter, auch negativ, zentriert bei 225 nm. Diese spektralen Charakteristiken zeigten das Vorherrschen einer "statistischen" Proteinstruktur (inter alia: F. Ciardelli & P. Salvadori- "Optical Rotatory Dispersion and Circular Dichroism"- Heyden & Son Ltd., London (1973) - Kap. 4.5).

3) UV-sichtbares Absorptionsspektrum

Das Verhalten im Hinblick auf das elektro-magnetische Spektrum der verschiedenen beschriebenen Derivate war ähnlich. Die Fig. 1 zeigt das UV-sichtbare Spektrum für das Succinyl-Ferroprotein-Derivat, hergestellt in Beispiel 1.

Das Spektrum (kontinuierliche Linie) zeigt keine Absorptionsspeaks, sondern nur eine sehr schwache Schulter bei 450 nm. Unter UV gab es eine ziemlich definierte Schulter, die bei 270 nm zentriert war, und eine sehr intensive Absorption mit einem Peak unter 220 nm.

Die Fig. 1 zeigt auch (gestrichelte Linie) das Spektrum von Ferritin aus Pferdemilz zum Vergleich.

Die Absorptionsspektren im sichtbaren Bereich sind in der Fig. 1 wiedergegeben, und sie wurden in Wasser mit pH 7 ausgeführt. Das Spektrum von Pferdemilz-Ferritin unter denselben Bedingungen ist auch als Vergleich wiedergegeben.

4) Fluoreszenzemissionsspektrum

Die Fluoreszenzemissionsspektren sind in Fig. 2 wiedergegeben, in denen die kontinuierliche Linie den Succinyl- Ferroprotein-Derivaten der Erfindung, die strichpunktierte Linie der Lactoproteinen als solchen und die gestrichelte Linie den succinylierten Lactoproteinen entspricht.

Das Unterdrücken der Fluoreszenz des Proteins aufgrund der Anwesenheit des Metalls kann man erkennen.

d) Elektrophorese

Die elektrophoretischen Spuren der verschiedenen Derivate auf Celluloseacetat im Vergleich zu succinylierten Proteinen, den Original-Proteinen und Ferritin sind in den Fig. 3 bis 6 wiedergegeben.

Die Fig. 3 zeigt die Ergebnisse der Elektrophorese, ausgeführt auf Sojabohnen (Spur 1), succinylierten Sojaproteinen (Spur 2), Eisenderivat von succinylierten Sojaproteinen (Spur 3), Eisenderivat von nichtsuccinylierten Sojaproteinen, lösliche Fraktion (Spur 4).

Die Fig. 4 zeigt die Ergebnisse von Elektrophoresen, ausgeführt auf Ovalbumin (Spur 1), succinyliertem Ovalbumin (Spur 2), Eisenderivat von succinyliertem Ovalbumin (Spur 3), Eisenderivat von Ovalbumin (Spur 4).

Die Fig. 5 zeigt die Ergebnisse von Elektrophoresen, ausgeführt auf Lactoproteinen (Spur 1), succinylierten Lactoproteinen (Spur 2), Eisenderivat von succinylierten Lactoproteinen (Spur 3), Pferdeleber-Ferritin (Spur 4).

Die Fig. 6 zeigt die Ergebnisse von Elektrophoresen (densitometrische Ablesung bei 550 nm), ausgeführt auf dem Eisenderivat von succinylierten Lactoproteinen (durchgezogene Linie), dem Eisenderivat von succinylierten Sojaproteinen (strichpunktierte Linie) und dem Eisenderivat von succinyliertem Ovalbumin (gestrichelte Linie).

e) Gelfiltration

Das Gelfiltrationsprofil auf Sephadex G 75 auf dem Eisenderivat von succinylierten Milchproteinen (erhalten wie in Beispiel 1 beschrieben), im Vergleich zu den succinylierten Proteinen selbst ist in der Fig. 7 angegeben, in der die ausgezogene Linie die succinylierten Lactoproteine, die gestrichelte Linie die korrespondierenden Eisenderivate betrifft.

Die Ordinate zeigt eine Adsorption bei 280 nm und die Abszisse die fortschreitende Zahl der gesammelten Fraktionen. Aus dem Profil kann man erkennen, daß die Anwesenheit von Eisen einen einzigen Peak mit einer Retentionszeit ähnlich der der leeren Säule hervorruft.

In Anbetracht der Tatsache, daß der molekulare Ausschluß von Sephadex G 75 etwa 75 000 Daltons beträgt, ist der scheinbare minimale Molekulargewichtswert dieses Aggregats größer als dieser Wert.

Darüber hinaus wurde in einer anderen Weise ein doppelter Peak mit größerer Randomisation bei den succinylierten Proteinen festgestellt. Dieser Faktor wurde auch bei der Elektrophorese (Fig. 5) beobachtet.

Dieser Verhaltenstyp zeigt, daß das vorhandene Eisen den Brennpunkt einer intermolekularen Aggregation des Proteinmediums darstellt.

Weitere Daten wurden extrahiert aus dem Filtergel auf Sephadex G 200 im Vergleich zu Ferritin (Fig. 8, in welcher die Abszisse und Ordinate ähnlich sind zur Fig. 7, wobei die durchgezogene Linie dem Eisenderivat von succinylierten Lactoproteinen entspricht und die gestrichelte Linie sich auf Ferritin, erhalten aus Pferdemilz, bezieht). Auch in diesem Fall war der Peak unzweideutig, während die Retentionszeit größer war als die von Ferritin. Dies zeigt, daß das scheinbare Molekulargewicht kleiner ist als das von Ferritin aus Pferdemilz.

f) Stabilität in Magensaft

Dieser Test wurde mit dem Eisenderivat, erhalten aus Beispiel 1, ausgeführt durch Auflösen von 25 mg des Derivats in 0,5 ml destilliertem Wasser und Hinzufügen dieser Lösung zu 5 ml Magensaft einer Ratte. Es wurde ein Niederschlag erhalten, und die Suspension wurde bei 37°C 60 Minuten lang unter Rühren inkubiert. Danach wurde der Niederschlag durch Zentrifugieren abgetrennt, und die überstehende Flüssigkeit wurde auf ihren Eisengehalt analysiert. Die Menge des Eisens, die auf den Magensaft aufgegeben wurde, betrug 1% des anfänglichen Gesamtwertes.

g) Ausfällung des Eisenderivats mit Ammoniumsulfat

30 Gew.-%/Vol-% des Ammoniumsulfats wurden zu einer 10 gew.-%/- vol-%igen Lösung des Eisenderivats, hergestellt wie in Beispiel 1, zugegeben. Es wurde ein Niederschlag des Proteinderivats des Eisens erhalten. Dieser hatte Eigenschaften, die mit seinen anfänglichen Eigenschaften identisch waren, und er war noch löslich in Wasser. Eisen war in der Lösung nicht vorhanden.

Die oben wiedergegebenen Daten zeigen, daß die Komplexbildungskapazität der succinylierten Proteine im Hinblick auf Eisen nicht nur typisch ist für succinylierte Milchproteine, sondern auch charakteristisch ist für succinylierte Proteinderivate verschiedenen Ursprungs und physiologischer Funktion, gleichgültig ob tierisch oder pflanzlich.

Wie oben erwähnt sind viele Tier- und Pflanzenproteine eines nichtmodifizierten Typs nicht für eine Bindung von Eisen geeignet. Wenn nichtmodifizierte Milchproteine, Ovalbumin, Sojaproteine, Serumproteine, Organextraktproteine (Leber) mit Eisen unter den Bedingungen umgesetzt werden, wie sie für die Herstellung der entsprechenden Succinylprotein- Derivate beschrieben worden sind, wird ein Produkt erhalten mit einem ähnlichen Eisengehalt, aber mit völlig verschiedenen Eigenschaften in bezug auf Löslichkeit und Stabilität. Z. B. liefert Sojaprotein, wie in Tabelle I gezeigt, ein Endprodukt, das, wenn gefriergetrocknet, unlöslich ist jenseits 75% und sein Eisen abgibt, wenn es mit Magensaft behandelt wird. Zusätzlich zum Komplexbildungs-Verhalten im Hinblick auf das Eisen wird das Verhalten der succinylierten Ferroprotein-Derivate der Erfindung (z. B. Löslichkeit in einem alkalischen Medium, Stabilität in einem sauren Medium und in Gegenwart von Magensäften sogar bei hohen Eisengehalten) nicht dem Basisprotein zugeschrieben und konnte daher nicht vorhergesehen werden.

Toxizität

a) Die akute Toxizität wurde auf oralem Wege an Mäusen des Stammes Swiss getestet durch eine gastrische Probe im Hinblick auf das Ferrosuccinylprotein des Milchproteins, erhalten gemäß Beispiel 1, mit destilliertem Wasser als Träger. Die LD₅₀ war größer als 4000 mg/kg.
b) Die Toxizität bei wiederholter Verabreichung des Derivats von Beispiel 1 (nachstehend als Ferrolat bezeichnet) bei Ratten, per os, wurde 20 Tage lang bei einer fortlaufenden Behandlung von männlichen Wistar-Ratten aufgezeichnet, die ein anfängliches Gewicht von 200 g hatten, 14 Tage vor der Behandlung in Käfigen gehalten wurden und dann in beliebige Gruppen zu 10 Tieren aufgeteilt wurden (Gruppe I: Kontrolle; II, II und IV Ferrolat bei 30 bzw. 100 bzw. 300 mg/kg/Tag).

Das Präparat, das zur Zeit seiner Verwendung in destilliertem Wasser gelöst war, wurde täglich zur gleichen Tageszeit jeden Tag mittels einer Sonde verabreicht. Die Kontrollgruppe erhielt ein gleiches Volumen Leitungswasser (10 ml/kg). Während der Behandlung wurden die Ratten täglich vor der Verabreichung gewogen und über mehrere Stunden nach Verabreichung des Produkts beobachtet. Der Nahrungsmittelverbrauch wurde am Ende der Behandlung gemessen, und 24 Stunden nach der letzten Verabreichung und nach einem Fasten von 20 Stunden wurden die Ratten mit Ether betäubt und durch Durchschneiden der Halsschlagader getötet. Ein Teil des Blutes wurde in einem Reagenzglas, das EDTA (2 Tropfen einer 4%igen Lösung) enthielt, gesammelt, und der Rest wurde als Serum gelassen. Hämochromocytometrische Untersuchungen wurden mit dem Gesamt-Blut ausgeführt und hämatochemische Untersuchungen wurden mit dem Serum ausgeführt.

Ergebnisse Gewichtsänderungen und Nahrungsmittelverbrauch

Die Fig. 9 zeigt die Gewichtszuwachskurven, erhalten während der Behandlung bis zum Tag vor dem Töten.

Die Tabellen II und III zeigen die Werte, die sich auf die Gewichtszunahme und den Nahrungsmittelverbrauch der Tiere während der Behandlung beziehen.

Die Gewichtszunahmekurve der Gruppe von Ratten, die mit Ferrolat in einer Menge von 300 mg/kg behandelt wurde, zeigt eine signifikante Verzögerung mit Bezug auf die Gewichtszunahmekurve der Kontrollgruppe der Ratten vom 15. Tag nach Beginn der Behandlung; dieselbe Gruppe Ratten konsumierte im Durchschnitt weniger Nahrung (-11,7%).

Geringe Unterschiede, die von einem statistischen Standpunkt aus nicht signifikant sind, wurden beobachtet bei den übrigen Gruppen von Ratten, die mit Ferrolat behandelt worden waren.

Hämatologische Untersuchungen

Die Ergebnisse sind in Tabelle IV gezeigt.

Hämotochemische Untersuchungen

Die Ergebnisse sind in Tabelle V gezeigt. Eine leichte Abnahme der alkalischen Phosphate wurde beobachtet, bei den Ratten, die mit 300 mg/kg/Tag Ferrolat behandelt worden waren.

Harnuntersuchungen

Die Ergebnisse sind in der Tabelle VI gezeigt.

Organuntersuchungen

Die Tabelle VII zeigt die absoluten Durchschnittsgewichte der Hauptrattenorgane, und die Tabelle VIII zeigt die entsprechenden Durchschnittsgewichte in Relation zum Körpergewicht.

Ein signifikantes Anwachsen des relativen Gewichts der Milz und der Lungen wurde bei der Gruppe von Ratten festgestellt, die mit Ferrolat 100 mg/kg/Tag behandelt worden war. Zusätzlich zu einer signifikanten Abnahme des Körpergewichts wurde eine signifikante Zunahme des durchschnittlichen Gewichtes der Hoden bei der Gruppe von Ratten festgestellt, die mit 30 mg/kg/Tag Ferrolat behandelt worden war.

Hämatische Niveaus nach der oralen Verabreichung a) Ferrolat/Ferrosulfat-Vergleich

Männliche Wistar-Ratten mit einem Gewicht von etwa 200 g wurden nach 18-stündigem Fasten willkürlich in Gruppen zu 5 Tieren aufgeteilt. Jede Gruppe wurde zu einer bestimmten Stunde getötet, und das Blut wurde bei jedem Tier durch Resektion der Schlagader entnommen.

Die Menge an Eisen in dem Blut eines jedem Tieres der Gruppe wurde spektrophotometrisch bestimmt mittels Bathophenanthrolin- sulfonsäure (Fe-Test).

Die Verabreichung wurde ausgeführt durch die Probe in einer wäßrigen Lösung (5 ml/kg). Das Succinyl-Ferroprotein-Derivat, das verwendet wurde, war wie in Beispiel 1 hergestellt (Ferrolat). Die Dosierungen und die Ergebnisse sind in Tabelle IX gezeigt. Man kann erkennen, daß die Menge an Eisen/kg für beide Derivate dieselbe war (Eisen: 1 mg/kg).

b) Ferrolat/Ferritin-Vergleich

Männliche Wistar-Ratten mit einem Gewicht von etwa 200 g wurden nach 18-stündigem Fasten willkürlich in Gruppen zu 9 Tieren aufgeteilt. Jede Gruppe wurde zu einer vorbestimmten Stunde getötet, und das Blut wurde bei jedem Tier durch Resektion der Schlagader entnommen.

Die Menge an Eisen in dem Blut eines jedem Tieres der Gruppe wurde spektrokopisch bestimmt mittels der Eisencolorimetrischen Methode.

Die Verabreichung erfolgte durch eine Probe in einer wäßrigen Lösung (5 ml/kg). Die Dosierungen und Ergebnisse sind in Tabelle X gezeigt.

Man kann erkennen, daß die Menge an Eisen/kg/ für das Succinyl-Ferroprotein-Derivat (bezeichnet als Ferrolat) gleich derjenigen des Ferritins war und 1 mg/kg betrug.

c) Vergleich zwischen Succinyl-Ferroprotein-Derivaten erhalten aus verschiedenen Proteintypen

Männliche Wistar-Ratten mit einem Gewicht von etwa 200 g wurden nach 18stündigem Fasten willkürlich aufgeteilt in Gruppen zu 5 Tieren (eine pro Dosis des Derivates und eine Kontrollgruppe). Jede Gruppe wurde 2 Stunden nach der Verabreichung getötet, und durch Resektion der Halsschlagader wurde das Blut von jedem Tier entnommen. Es wurde der Eisengehalt in dem Blut bestimmt mittels des Bathophenanthrolin- sulfonsäure-Fe-Tests. Die orale Verabreichung wurde durch eine Probe in einer wäßrigen Lösung (5 ml/kg) ausgeführt. Die Dosen der einzelnen Derivate, die verwendet wurden, wurden so gewählt, daß immer 1 mg/kg Eisen verabreicht wurde.

Getestete Produkte:

1) Succinylierte Sojaproteine+Fe (4,42%)
2) Succinyliertes Ovalbumin+Fe (3,57%)
3) Succinylierte Rinderserumproteine+Fe (5,78%)
4) Succinylierte Milchproteine+Fe (4,5%) (Ferrolat)

Die Ergebnisse sind in der Tabelle XI angegeben.

Tabelle I

Tabelle II

Gewichtszunahme

Tabelle III

Nahrungsmittelverbrauch

Tabelle IV

Hämatologische Daten

Tabelle V

Hämatochemische Daten

Tabelle VI

Harnuntersuchung

Tabelle VII

Absolutes Frischgewicht der Organe der Ratten

Tabelle VIII

Relatives Frischgewicht der Organe der Ratten

Claims

1. Succinylierte Proteine, dadurch gekennzeichnet, daß sie Eisen in biologisch verfügbarer Form enthalten.

2. Proteine nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß sie 0,1 bis 20 Gew.-% Eisen in biologisch verfügbarer Form enthalten.

3. Proteine nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß der Grad ihrer Succinylierung zwischen 20 und 100% liegt.

4. Proteine nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß das Basisprotein pflanzlichen oder tierischen Ursprungs ist.

5. Protein nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß es sich um ein Milchprotein mit einem Grad der Succinylierung von mehr als 70% handelt, das mehr als 4 Gew.-% Eisen in biologisch verfügbarer Form enthält.

6. Protein nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß es sich dabei um Ovalbumin mit einem Grad der Succinylierung von mehr als 70% handelt, das mehr als 4 Gew.-% biologisch verfügbares Eisen enthält.

7. Protein nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß es sich dabei um Sojaprotein mit einem Grad der Succinylierung von mehr als 70% handelt, das mehr als 4 Gew.-% biologisch verfügbares Eisen enthält.

8. Verfahren zur Herstellung der eisenhaltigen succinylierten Proteine nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß ein succinyliertes Protein in einem wäßrigen Medium bei einem pH-Wert zwischen 2 und 10 mit Eisensalzen umgesetzt und das erhaltene Produkt durch Ausfällen bei pH 2 bis 4 oder durch Entfernen des Lösungsmittels nach Einstellung des pH-Wertes auf Werte, die sich der Neutralität nähern, isoliert wird.

9. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß die Umsetzung zwischen dem succinylierten Protein und den Eisensalzen bei einem pH-Wert in der Nähe der Neutralität durchgeführt wird.

10. Pharmazeutische Zubereitung zur Behandlung der Sideropenie beim Menschen, dadurch gekennzeichnet, daß sie als aktiven Wirkstoff die biologisch verfügbares Eisen enthaltenden succinylierten Proteine nach einem der Ansprüche 1 bis 7 enthält.