DE3133123A1

DE3133123A1 - Verfahren zur herstellung von palatinose durch unbeweglich gemachte (alpha)-glukosyltransferase

Info

Publication number: DE3133123A1
Application number: DE19813133123
Authority: DE
Inventors: Yoshikazu Yamato Kanagawa Nakajima; Junichi Yokohama Kanagawa Shimizu; Kazumasa Ayase Kanagawa Suzuki
Original assignee: Mitsui Sugar Co Ltd
Current assignee: Mitsui DM Sugar Co Ltd
Priority date: 1980-08-21
Filing date: 1981-08-21
Publication date: 1982-04-29
Also published as: DK148776B; IT1146531B; IT8103506A0; NL186019C; JPS5836959B2; NL186019B; JPS5739794A; US4386158A; GB2082591B; DE3133123C2; GB2082591A; NL8103911A; DK370081A; DK148776C

Description

• ft O *

PATENTANWÄLTE RUFF und BEIER STUTTGART

Dipl.-Chem. Dr. Ruft Dipl.-I.no. «J. Seier Dipl.-Phys. Schöndorf

Neckarstraße 5O D-7OOO Stuttgart 1 Tel.: CO71O 227Ο51· Telex Ο7-23412 erubd

Anmelderin: MITSUI SUGAR CO., Ltd.

No. 6, Nihonbashi-Honcho 3-chome, Chuo-ku, Tokyo (Japan)

18. August 1981
R/S

A 19 205

Verfahren zur Herstellung von Palatinose durch unbeweglich gemachte oC-Glukosyltransferase

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Palati nose aus Saccharose unter Verwendung von unbeweglich gemachter -Glukosyltransferase.

Palatinose ist ein reduzierendes Disaccharid, und es wurde bestätigt, daß Palatinose als natürlicher Bestandteil in Honig und Zuckerrohrsaft vorkommt. Die Süßkraft von Palatinose ist ungefähr halb so groß wie die von Saccharose.

Die Molekularstruktur von Palatinose ist 6-0-od-D-Glukopyranosyl-D-fructose, in welcher die Glukose in 1,6-Stellung an Fruc tose gebunden ist. Palatinose wird auch als Isomaltulose bezeichnet.

Bei einem Verfahren zur Herstellung von Palatinose wird das Enzym in Form.von lebenden oder toten Zellen von Protamino-

A 19 205 - 4 -

bacter rubrum einer wässrigen Lösung von Saccharose zugegeben, um Saccharose in Palatinose zu überführen, wonach das Enzym aus der Lösung in der in dem deutschen Patent 1 049 800 beschriebenen Weise entfernt wird. Hierbei wird das Enzym durch Zentrifugation abgetrennt.

Beim gegenwärtigen Entwicklungsstand wird oi-Glukosyltransferase, die Palatinose aus Saccharose bildet, durch Kultivieren einer bestimmten Bakterienart, insbesondere Protaminobacter rubrum, Serratis plymuthica usw., in Gegenwart von Saccharose hergestellt. Da das Enzym mit den Bakterienzellen verbunden ist, kann eine Zellmasse dieser Bakterien als Enzympräparat verwendet werden.

Bei der Herstellung von Palatinose aus Saccharose wird üblicherweise eine Zellmasse, die o6-Glukosyltransferase enthält, einer wässrigen Lösung von Saccharose mit einer Konzentration von 20 bis 30 % zugegeben, und die Reaktion wird unter Rühren der Mischung durchgeführt, welche währenddessen auf einer Temperatur von 20 bis 30° C und auf einem pH von etwa 7 gehalten wird. Die Reaktionsdauer hängt von der Menge des Enzyms, der Reaktionstemperatur usw. ab. Da aber die Restmenge an Saccharose in der Reaktionsmischung üblicherweise innerhalb von etwa 20 Stunden nach Zugabe der Zellen sehr gering wird, wird dieser Zeitpunkt als Reaktionsende angesehen. Danach werden die Zellen aus der Reaktionsmischung entfernt, und man erhält eine wässrige transparente Lösung von Palatinose, welche mit Hilfe von Ionenaustauscherharzen u. dgl. gereinigt und dann unter vermindertem Druck konzentriert wird, um Palatinose zu kristallisieren.

Ü ♦ 6

A 19 205 - 5 -

Bei der obigen Verfahrensweise werden die Zellen aus der Reaktionsmischung üblicherweise durch Zentrifugieren abgetrennt, da aber die Differenz in der spezifischen Dichte zwischen den Zellen und der Reaktionsmischung klein ist und auch die Zeilgröße sehr klein ist, ist der Wirkungsgrad der Abtrennung sehr schlecht und daher sind für die Durchführung des Verfahrens sehr große Einrichtungen erforderlich, was bei der industriellen Durchführung des Verfahrens mit erheblichen Problemen verbunden ist.

Erfindungsgemäß wird dieses Problem dadurch gelöst,, daß unbeweglich gemachte o6-Glukosyltransferase für die Herstellung von Palatinose verwendet wird. Zu diesem Zwecke wurde ein geeignetes Verfahren zum Unbeweglichmachen des Enzyms entwickelt und das Verfahren zur Herstellung von Palatinose durch die Verwendung von unbeweglich gemachter o(,<-G1 ukosyltransferase verbessert.

Erfindungsgemäß wird ein Verfahren zur Herstellung von Palatinose geschaffen, das dadurch gekennzeichnet ist, daß Bakterienzellen, die 06-Glukosyltransferase enthalten, welche Palatinose aus Saccharose bildet, granuliert werden, indem sie in ein Calciumalginat-Gel eingeschlossen werden, das Granulat bzw. die Granulatkörner in eine auf einen pH von 5,0 bis 5,9 neutralisierte Polyäthylenimin-Lösung eingetaucht werden, um Polyäthylenimin in das Granulat bis zu einer Polyäthylenimin-Konzentration im Gel von 0,5 bis Ί,5 % eindringen zu lassen, das Granulat mit einer Glutaraldehyd-Lösung behandelt wird, die Glutaraldehyd in einer 1,5 bis 5-fachen Menge der Menge an Polyäthylenimin im Gel enthält, um unbewegliche oC-Glukosyltranserase zu bilden, und unter Verwendung dieser unbeweglich gemachten oC-Glukosyltransferase Palatinose aus Saccharose hergestellt wird.

ΐ » t

A 19 205 - 6 -

Gemäß der Erfindung ist eine'Einschlußmethode mit Calciumalginat-Gel als erste Stufe vorgesehen. Diese Methode kann in an sich bekannter Weise sehr einfach durchgeführt werden, indem eine wässrige Lösung einer Mischung eines Enzyms und Natriumalginat hergestellt und die Lösung tropfenweise in eine wässrige Calciumchlorid-Lösung zugegeben wird, beispiels weise unter Verwendung eines Injektors, um die Mischung zu einem körnigen Material zu gelatinieren. Obwohl Calciumalginat den Nachteil hat, daß es sich bei pH-Werten über 5,8 allmählich auflöst, besitzt sein Gel eine hohe physikalische Festigkeit und kann daher in einfacher Weise sowohl in Festbettreaktoren als auch in Wirbelbett-Reaktoren eingesetzt werden.

Zellen mit oL -Glukosyltransferase-Aktivität werden durch Inokulieren von Serratia plymuthica NCIB No. 8285 in ein wässriges Medium, das 5 % Saccharose, 3 % Maiswasser, 0,3 % Dinatriumhydrogenphosphat und 0,2 % Natriumchlorid enthält und auf einen Anfangs-pH von 7 eingestellt wurde, und durch aerobes Kultivieren und Sammeln durch Zentrifugal abscheidung gewonnen. Die Zellen werden vorzugsweise in einer wässrigen 2-prozentigen Natriumalginat-Lösung von ungefähr 40 Volumenprozent der kultivierten Brühe suspendiert, wonach die Suspension tropfenweise einer wässrigen 0,1 N Calciumchlorid-Lösung unter Verwendung eines Injektors zugegeben wird, gefolgt von einem zweistündigen Rühren. Die gebildeten Körnchen werden durch Filtration abgetrennt und mit Wasser ausreichend gewaschen. Die obigen Verfahrensschritte werden alle bei Temperaturen unterhalb 25° C durchgeführt, damit die o(_r Glukosyltransferase nicht inaktiviert wird.

A 19 205 - 7 -

Werden die so erhaltenen Körnchen einer 30%igen Saccharose-Lösung (Gewicht pro Gewicht) zugegeben und läßt man die Mischung bei 25° C stehen und mißt ihre Reduktionskraft in Abhängigkeit vom Zeitablauf, dann kann bestätigt werden, daß die Reduktionskraft allmählich zunimmt. Auch bei der weiteren Analyse unter Anwendung einer Hochgeschwindigkeits-Flüssigchromatographie wurde nachgewiesen, daß der Anstieg der Reduktionskraft durch die Bildung von Palatinose verursacht wird. Dies bedeutet, daß oC-Glukosyltransferase durch die Calciumalginat-Gel-Einschlußmethode in beliebigem Maße granuliert werden kann.

Wenn jedoch die Reaktionsmischung, nachdem im wesentlichen alle Saccharose in Palatinose umgewandelt ist, filtriert wird, um die Granulatkörner zurückzugewinnen, und die Granulatkörner ausreichend mit Wasser gewaschen und dann erneut einer 30%igen Saccharose-Lösung (Gewicht pro Gewicht) zugegeben und bei 25° C stehengelassen werden, dann vermindert sich die Steigerungsrate der Reduktionskraft im Unterschied zur ersten Reaktion auf weniger als 1/10 der anfänglichen Rate. Es wird angenommen, daß dies auf eine Auflösung des Enzyms in die Reaktionsmischung zurückzuführen ist. Dies bedeutet, daß das Enzym aufgrund irgendwelcher Ursachen in die Lage versetzt wird, sich aus den Zellen zu befreien,und auf der anderen Seite die Maschen des Calciumalginat-Gel-Gitters nicht ausreichend fein sind, das Enzym-Protein zurückzuhalten.

Es wurde somit gefunden, daß, obwohl eine Granulierung von oC-Glukosyltransferase mit der Calciumalginat-Gel-Einschlußmethode möglich ist, die o£,-Glukosyl transferase doch nicht unbeweglich gemacht werden kann.

A 19 205 - 8 -

Es wurde daraufhin in Betracht gezogen, daß bei Einwirkung von als Vernetzungsmittel zum Unbeweglichmachen von Enzymen weit verwendetem Glutaraldehyd auf das durch das oben beschriebene Verfahren erhaltene Granulat komplizierte Vernetzungsverbindungen mit den vom Gel eingefangenen Zellen gebildet werden und auf diese Weise oC-Glukosyltransferase widerstandsfähig gegen eine Fresetzung wird. Deshalb wurde eine Glutaraldehyd-Behandlung näher untersucht.

Zu je 100 ml von wässrigen Glutaraldehyd-Lösungen mit Konzentrationen von 0%, 0,0-2.5%, 0,05%, 0,1% und 0,5% wurden 30 g des auf oben beschriebene Weise hergestellten Granulats aus in Calciumalginat-Gel eingeschlossenem Enzym gegeben,und nach einer Behandlung der Mischung bei 25° C während 30 Minuten wurde das Granulat jeweils durch Filtration abgetrennt und mit Wasser gewaschen. Dem so erhaltenen Granulate wurden jeweils 100 g einer 33,3%igen Saccharose-Lösung (Gewicht pro Gewicht) zugegeben, und die Reaktionsmischung wurde bei 25° C während 20 bis 23 Stunden inkubiert. Nach Abschluß der Reaktion wurden die.Granulate durch Filtration abgetrennt, ausreichend mit Wasser gewaschen und erneut zu 100 g einer 33,3%igen Saccharose-Lösung (Gewicht pro Gewicht) zugegeben, um eine zweite Reaktion durchzuführen. Auf diese Weise wurde eine Reihe von Reaktionen ausgeführt. Zu Beginn einer jeden Reaktion wurde der pH-Wert auf 6.5 bis 7.0 eingestellt, Er verminderte sich jedoch auf 5.0 bis 5.5 innerhalb von zwei Stunden und auf 4,3 bis 4.8 innerhalb von 20 Stunden. Bei jeder Reaktion wurde eine geringe Menge (2 bis 5 g) des Oberstandes der Reaktionsmischung zum Zeitpunkt von zwei Stunden nach Reaktionsbeginn als Probe entnommen, wobei der Feststoffgehalt durch ein Refraktometer und reduzieren-

* O *-■ ti

A 19 205 - 9 -

der Zucker durch eine Shaffer-Somogyi-Mikromethode gemessen wurden und dann der Umwandlungsgrad von Saccharose aus diesen Werten bestimmt wurde.

Die Ergebnisse dieser Versuche sind in Tabelle 1 wiedergegeben. Aus diesen Ergebnissen kann entnommen werden, daß die geeigneteste Konzentration der Glutaraldehyd-Lösung im Versuch bei 0.1% liegt. Wenn die Konzentration der Lösung 0.025 oder 0.05% beträgt, dann wird das Enzym unzureichend unbeweglich gemacht und die Aktivität schnell vermindert. Wenn dagegen die Konzentration 0.5? beträgt, dann wird das Enzym in hohem Maße durch die Behandlung zum Unbeweglichmachen inaktiviert. Da jedoch der Aktivitätsverlust auch bei Verwendung einer 0.1%igen Glutaraldehyd-Lösung, welche die besten Ergebnisse in dem oben beschriebenen Versuch ergab, noch groß genug ist, wurde festgestellt, daß ein unbeweglich gemachtes Enzym mit Hilfe der Glutaraldehyd-Methode nicht in der gewünschten Weise erhalten werden kann.

Tabelle 1:

Versuchsergebnisse der Auswirkung einer Glutaraldehyd-Behandlung
von in Calciumalginat-Gel eingeschlossenem Enzym

Proben Nr.	Glutar- aldehyd- konzentration U)	Saccharose-Umwandlungsrate (%) in 2 Stunden	zwei - mal	drei - mal	vier mal	fünf mal	sechs mal	sieben mal	acht mal
1 2 3 4 5	0 0,025 0,05 0,1 0,5	ein mal	8,4 52,-6 49,9 43,1 15,0	0 30,1 38,7 38,4 14,5	16,7 22,0 32,7 16,1	6,3 18,2 29,4 10,5	3,4 12,6 25,8 10,3	9,2 22,5 9,4	6,6 20,0 7,5
62,9 49,4 43,0 31,0 7,6

A 19 205 - 11 -

Polyäthylenimin hat die Eigenschaft, aufgrund einer Reaktion mit Glutaraldehyd geliert zu werden, da das Gel jedoch eine geringe physikalische Festigkeit besitzt, ist Polyäthylenimin für sich allein ungeeignet für die Herstellung von unbeweglich gemachtem Enzym. Es wurde jedoch gefunden, daß ein Gel mit hoher Rückhaltefähigkeit für das Enzym und hoher physikalischer Festigkeit geschaffen wird, wenn Polyäthylenimin mit Glutaraldehyd behandelt wird, nachdem es in das Calciumalginat-Gel eingedrungen ist. Auf diese Weise werden die Nachteile der zwei Gelarten gegeneinander aufgehoben und das der Erfindung zugrundeliegende Problem gelöst,

Ausführungen und Einzelheiten der Erfindung werden nachfolgend auch unter Bezugnahme auf Vergleichsbeispiele beschrieben.

Granulate von in Calciumalginat-Gel eingeschlossenem Enzym wurden auf dieselbe Weise wie oben beschrieben hergestellt, Und es wurden jeweils 30 g des Granulats zur Herstellung von unbeweglich gemachtem Enzym verwendet. Zusätzlich ist es bevorzugt, wenn die Teilchengröße im Durchmesser im Bereich von 0,5 bis 5 mm, vorzugsweise im Bereich von 1 bis 3 mm liegt.

Da eine Polyäthylenimin-Lösung stark alkalisch ist und Calciumalginat aufzulösen vermag, wird die Lösung vor ihrer Verwendung zweckmäßigerweise mit Salzsäure auf einen pH von 5,0 bis 5,8 neutralisiert. Die Menge an Polyäthylenimin-Lösung lag bei 30 g und die Konzentration war doppelt so hoch wie die vorbestimmte Konzentration der Lösung, die eindringen soll. Es wurden, mit anderen Worten, Polyäthylenimin-Lösungen mit Konzentrationen von 15», 2% und 3% verwen-

A 19 205 - 12 -

det, um sie in das Gel mit Konzentrationen von 0,5%, 1% bzw. 1,5% eindringen zu lassen. Nach dem Eintauchen des Granulats in die Polyäthylenimin-Lösung für eine Zeitdauer von 10 Minuten wurde das Granulat durch Saugfiltration gewonnen und, ohne es mit Wasser zu waschen, zu 100 ml einer Glutaraldehydlösung bestimmter Konzentration gegeben und darin während 30 Minuten'behandelt. Danach wurde .das Granulat durch Filtration gewonnen, ausreichend mit Wasser gewaschen und wiederholt für die Reaktion wie in dem oben beschriebenen Experiment eingesetzt, wobei die Änderungen der Saccharose-Umwandlungsrate während zwei Stunden verfolgt wurden. Es wurde bestätigt, daß entsprechend der Temperaturbedingung ca. 80 bis 90% der umgewandelten Saccharose in Palatinose umgewandelt worden war.

Die Ergebnisse des oben genannten Versuches über die Wirkung der Verwendung von Polyäthylenimin sind in Tabelle 2 aufgeführt. Als ein Vergleichsbeispiel für den Fall, bei dem ohne Polyäthylenimin gearbeitet wird, sind die Daten von Beispiel Nr. 5 der Tabelle 1 auch in Tabelle 2 wiedergegeben. Da sich Polyäthylenimin mit Glutaraldehyd verband, war eine relativ große Menge an GTutaraldehyd erforderlich.

Wie sich im Falle von Probe Nr. 10 ergibt, wird ein ausreichender Unbeweglichkeitseffekt nicht erhalten, wenn 0,1% Glutaraldehyd verwendet werden, und aus Probe Nr. 9 ergibt sich, daß das Ausmaß der Immobilisierung immer noch nicht genügend ist, wenn Konzentrationen von 0,2% Glutaraldehyd verwendet werden.

Bei Probe Nr. 7 wurde 1% Polyäthylenimin im Gel absorbiert und das Gel wurde mit 0,5% Glutaraldehyd behandelt. In diesem

A 19 205 - 13 -

Falle war die Anfangsaktivität hoch und stabil. Bei Probe Nr. 8 lag die absorbierte Menge an Polyäthylenimin bei 1,5% des Gels, und die Konzentration des Glutaraldehyds lag bei "\%. In diesem Falle war die Anfangsaktivität etwas niedrig aber die Stabilität sehr groß. Wenn man berücksichtiget, daß die angenommene Höhe der Konzentration von Polyäthylenimin in dem Gel mit einer beträchtlichen tlngenauigkeit behaftet ist, dann können die Bedingungen als optimal angesehen werden, wenn die Konzentration an Polyäthylenimin, bezogen auf die im Gel vorhandene Menge, im Bereich von 0,5 bis 1,5% liegt und die Konzentration der Glutaraldehyd-Lösung im Bereich von 0,5 bisl,0%. Wenn die Konzentration von Polyäthylenimin höher ist als der oben genannte Bereich, dann wird der Diffusionswiderstand für Saccharose und für das Reaktionsprodukt unerwünscht hoch, und wenn die Konzentration niedriger liegt als der vorgenannte Bereich, dann wird die Stabilität der Immobilisierung schlecht.

Das quantitative Verhältnis von Polyäthylenimin und Glutaraldehyd kann ebenfalls von Bedeutung sein, und es wurde gefunden, daß gute Ergebnisse erhalten werden, wenn die Menge an Glutaraldehyd in einem Bereich liegt, der 1_S5 bis 5-mal so groß ist wie·die Menge an Polyäthylenimin.

Im Falle der Probe Nr. 7 liegt die Menge an Polyäthylenimin im Gel in einem Bereich von 0,15 bis 0,3 g, während die Menge an verwendetem Glutaraldehyd 0,5 g beträgt. Im Falle der Probe Nr. 8 lag die Polyäthylenimin-Menge bei 0₉23 - 0,45 g, wogegen die Menge an Glutaraldehyd 1,0 g betrug.

Tabelle 2:

Versuchsergebnisse über die Wirkung der Verwendung von
Polyäthylenimin zusammen mit Glutaraldehyd

Proben- Nr.	Versuchsbedingung	(B)*	Saccharose-Umwandlungsrate {%) in 2 Stunden	ein mal	zwei mal	drei - mal	vier mal	fünf mal	sechs mal	sieben mal	acht mal
5 6 7 8 9 10	(A)*	0,5 0,5 0,5 1,0 0,2 0,1	7,6 11,0 24,8 11,4 36,3 41 ,3	15,0 17,7 30,4 18,3/ 40,0 35,4	14,5 18,1 30,1 18,0 35,5 34,2	16,1 17,3 29,8 18,1 33,3 22,3	10,5 16,6 26,7 18,3 28,4 15,4	10,3 15,4 26,7 17,6 24,9 13,7	9,4 12,3 26,0 16,3 22,5 11,2	7,5 12,0 24,5 16,4 20,0 9,2
0 0,5 1,0 1,5 1,0 1,0

(A): Die Konzentration von Polyäthylenimin im Gel nach dem Eintauchen
des Gels in die Polyäthyleniminlösung.

(B): Die Konzentration der Glutaraldehyd-Lösung.

A 19 205 - 15 -

Die Wirkung der gemeinsamen Verwendung von Polyäthylenimin zusammen mit Glutaraldehyd ist aus den in Tabelle 2 aufgeführten Daten eindeutig ersichtlich. Zur weiteren Klärung des Effektes wurde die Anzahl der Einsätze, bis die Aktivitat auf die Hälfte vermindert ist, und die Anzahl, bis die Aktivität um 75% vermindert ist_a aus den Daten der Tabellen 1 und 2 sowie aus Vergleichswerten der Produkt!vität_s bis die Aktivität um 75% vermindert ist, wie folgt berechnet:

Es wird angenommen, daß die Reaktion entsprechend der Geschwindigkeitsgleichung (1) einer Reaktion erster Ordnung abläuft:

K = - 1/t log (1 - χ) (1)

wobei K die Reaktionsgeschwindigkeitskonstante t die Reaktionszeit
χ die Umwandlungsrate von Saccharose bedeuten.

Wenn man davon ausgeht, daß in der Gleichung (1) K in Proportion zu der offensichtlichen Enzymaktivität in dem Reaktionssystem steht und t konstant ist, dann ist die offensichtliche Enzymaktivität in Proportion zu - log (1 - χ) und daher ist der Anfangswert von - log (1 - χ) von Probe Nr. 1 als 100 als Standard definiert, und es wurde dann die spezifische Aktivität einer jeden Probe,bezogen auf jeden Einsatz, berechnet. In der Annahme, daß die Verminderungsrate der Aktivität eines jeden Enzyms als konstant anzusehen ist, wurde die Aktivität in ein semi logarithmisches Diagramm eingetragen, dessen Abszisse die Nummer des Einsatzes und dessen Ordinate die spezifische Aktivität angaben, wobei nach einer Regression gesucht wurde und die Zahl aer Einsätze,bis die Aktivität 501 der maximalen Aktivität und

A 19 205

- 16 -

25% der maximalen Aktivität betrug, abgeleitet wurden. Da die maximale Aktivität häufig nach dem zweiten Mal auftrat, ist die Anzahl der Einsätze, bis die Aktivität 25% der maximalen Aktivität wird, nicht immer das Doppelte der Einsatzzahl, bis die Aktivität 50% der maximalen Aktivität beträgt. Die Produktivität ergibt sich aus der Summe der Werte der spezifischen Aktivität für jeden Einsatz. Die Ergebnisse sind in Tabelle 3 zusammengestellt.

Tabelle 3:

Vergleich der Einsatzzahlen und Produktivität

Proben-	Versuchs	(B)*	Zahl der brauch	25*	Produktivität
Nr.	bedingung	0	baren Einsätze	1	25*
	(A)*	0,025	50*	4	100
1	0	0,05	1	5	189
2	0	0,1	2	10	222
3	0	0,5	3	13	327
4	0	0,5	6	19	125
5	0	0,5	8	36	225
6	0,5	1,0	11	70	746
7	•i,o	0.2	19	12	749
8	1,5	0,1	36	6	360
9	1,0	7		197
TO	1,0	3

(A): Polyäthylenimin (%)

(B): Glutaraldehyd (%)

(50%): bis zu 50% Aktivität

(25%): bis -zu 25% Aktivität.

A 19 205 - 17 -

Die Ergebnisse in Tabelle 3 zeigen deutlich, daß die Unbeweglichkeitsbehandlung unter den oben beschriebenen Optimalbedingungen die Produktivität ganz erheblich verbessert.

Bei einer weiteren Ausführungsform des e-*findungsgemäßen Verfahrens zur Herstellung von Palatinose wird in einem Recycling-System eine Saccharose-Lösung aus einem Vorratstank mit Hilfe einer Pumpe einer Säule zugeführt, welche mit nach der oben genannten Methode unbeweglich gemachter oC-Glukosyltransferase bepackt ist. Die Reaktionsmischung wird vom Aus-IQ laß der Säule in den Vorratstank zurückgeführt, und der pH-Wert im Vorratstank und der pH-Wert der Recycling-Losung in den Rohrleitungen werden eingestellt.

Im nachfolgenden werden die Eigenschaften der unbeweglich gemachten oC-Glukosyltransferase, wie sie nach dem erfindungsgemäßen Verfahren erhalten wird, beschrieben.

Wie oben erwähnt, löst sich Calciumalginat in einer Lösung nur mit einem pH-Wert oberhalb 5,8 allmählich auf und daher soll die Reaktion bei einem pH-Wert unter 5*8 durchgeführt werden. Wenn der pH-Wert der Reaktionsmischung beispielsweise auf 7,0 neutralisiert wird, dann vermindert sich der pH-Wert schnell und wird stabilisiert, wenn er unter 5,8 kommt.

In der Zeichnung zeigt ein Diagramm die pH-Charakteristik der Enzymaktivität, die unter Verwendung einer 30£igen Saccharose (Gewicht pro Gewicht) gemessen wurde, gelöst in einer 0,02 M Essigsäure/Calciumacetatpuffer-Lösung. In der Figur bedeutet die durchgezogene Linie (A) das unbeweglich gemachte Enzym und die gestrichelte Linie (B) ein

A 19 205 - 18 -

freigesetztes Zellenzym. Der aktive pH-Bereich ist im Vergleich zu!^ freigesetzten Zellenzym in Richtung auf die saure Seite verschoben, es ist jedoch eindeutig, daß der pH-Wert während der Reaktion vozugsweise innerhalb eines Bereiches, der die Stabilität des Gels nicht vermindert, so hoch wie möglich gehalten wird. Deshalb wird der pH-Wert der Reaktions mischung in der Regel auf 5,0 bis 5,8, vorzugsweise auf etwa 5,5, gehalten.

Im nachfolgenden wird der Einfluß der Temperatur erläutert.

Das erfindungsgemäße unbeweglich gemachte-Enzym wurde in eine 30%ige Saccharose (Gewicht pro Gewicht), welche in einer0,02 M Essigsäure/Calciumacetat-Pufferlösung bei pH 5,5 aufgelöst war, eingetaucht und 30 Minuten lang bei einer definierten Temperatur gehalten, wonach das unbewegliehe Enzym durch Filtration abgetrennt und mit Wasser ausreichend gewaschen wurde. Danach wurde das unbewegliche Enzym mit einer Saccharose-Lösung der selben Zusammensetzung wie oben während zwei Stunden bei 30° C gehalten, wonach . seine verbliebene Aktivität gemessen wurde. Eine Verminderung der Aktivität findet bei 30° C noch nicht statt, jedoch bereits bei Temperaturen unterhalb von 35° C. Deshalb wird die Umwandlung von Saccharose in Palatinose wie im Falle der Verwendung des freigesetzten Zellenzyms zweckmäßigerweise bei Temperaturen unterhalb 30° C durchgeführt.

Für die praktische Durchführung des Verfahrens unter Verwendung des erfindungsgemäßen Enzyms kann ein Reaktionsgefäß mit einem Rührer verwendet werden, zur Verhinderung einer Zerstörung bzw. eines Abriebs des Granulats ist es jedoch günstiger, eine mit dem Granulat bepackte Säule, vorzugsweise eine Säule vom Festbett-Typ zu verwenden. Der

H * «β

133123

A 19 205 - 19 -

Druckverlust in der Säule ist sehr gering, und es kann eine recht hohe lineare Geschwindigkeit angewendet werden.

Wenn die Verweildauer in der Säule verlängert ist, dann vermindert eine pH-Verringerung die offensiihtliche aktivität des Enzyms, weshalb ein Recycling-System mit eine*- verkürzten Verweildauer bevorzugt angewendet wird und de* pH-Wert im Recycling-System außerhalb der Säule auf ca. 5,5 eingestellt wird. Ein solches Vorgehen wird als besonders geeignete Maßnahme im Zusammenhang mit der Verwendung ies Enzyms nach der Erfindung erachtet. Auch wird z^eckmäßigjrweise im Vergleich zu der Menge der zu behandelnden Lösung eine große Menge an unbeweglichen Enzympartikeln bzw. aranulatkörnern in eine Säule gepackt. Wird die zu behandelnde Lösung einmal durch die Säule geleitet, dann kann der größere Teil der Saccharose in Palatinose umgewandelt werden. Wenn mehr als 98% der Saccharose in die Folgeprodukte jmgewandelt sind, dann wird die Reaktion abgebrochen. Eine transparente Flüssigkeit kann durch ein einfaches Filter bzw. Sieb erhalten und direkt in die nachfolgende Stufe weitergeführt werden. Es bestehen also keinerlei Probleme wie in Falle der Verwendung von freigesetzem zellulärem Enzym.

Außerdem wird es durch die Erfindung ermöglicht, daß die anfängliche Saccharose-Konzentration in der Reaktionsmischung im Vergleich zur Verwendung herkömmlicher freigesetzter ZeI-len innerhalb eines von der Löslichkeit der Palatinose als Reaktionsprodukt zugelassenen Bereiches erhöht werden kann. Da Palatinose in der etwa 1,5-fachen Gewichtsmenge Wasser bei 30° C aufgelöst wird, kann die anfängliche Saccharose-Konzentration bei ungefähr 40% (Gewicht pro Gewicht) liegen.

A 19 205 - 20 -

Die Kosten für die Konzentrierung der Flüssigkeit in einer Kristallisationsstufe können auf diese Weise erheblich gesenkt werden.

Wenn ferner eine höhere Aktivität des unbeweglich gemachten Enzyms als diejenige, die in den obigen Beispielen erläutert ist, erhalten werden soll, dann kann die im Calciumalginat-Gel eingeschlossene Enzymmenge erhöht werden, was leicht erreicht werden kann.

Weitere Ausführungsformen und Einzelheiten der Erfindung ergeben sich aus der nachfolgenden detaillierten Beschreibung in Verbindung mit den Ansprüchen.

Beispiel 1

In ein 30 1 Fermentiergefäß werden 15 1 eines Kulturmediums mit einem pH 7 gegeben, das 5% Saccharose, 3% Maiswasser, 0,3% Dinatriumhydrogensuifat und 0,2% Natriumchlorid enthält. Nach Sterilisieren und nach Inokulieren von Serratia plymuthica NCIB Nr. 8285 wird die Fermentation bei einer einer Temperatur von 28° C während 16 Stunden mit einem Belüftungsgrad von 7,5 l/min, und einer Rührgeschwindigkeit von 400 u.p.m. durchgeführt, um ein Kulturmaterial mit einer hohen Aktivität an o6-61ukosyltransferase zu erhalten. Dieses wurde durch Zentrifugal abscheidung abgetrennt und man erhielt 2,5 1 einer das Enzym enthaltenden Zellaufschlämmung.

Die so erhaltene Zeilaufschlämmung bzw. -suspension wurde mit 2,5 1 einer wässrigen Lösung von 4% Natriumalginat

A 19 205 - 21 -

gut durchgemischt, und die Mischung wurde in einen zylindrischen Extruder gegeben, der mit einer Form mit einer Vielzahl von Poren mit einem Durchmesser von 0,6 mm am Kopf ende ausgerüstet ist. Die Mischung wurde nach unten durch die Form durch Anlegen eines Drucks extrudiert. Unterhalb des Extruders befand sich ein 20 1 Gefäß, das 10 1 einer wässrigen 0,15 M Calciumchlorid-LÖsung enthielt. Unter Rühren dieser Lösung mit einem Rührer wurden der Lösung die aus der Form fallenden Flüssigkeitstropfen der Mischung zu gegeben. Die Extrusion war nach 10 Minuten beendet. Die Caiciumchlorid-Lösung wurde 2 Stunden lang gerührt, um die physikalischen Eigenschaften der gebildeten Körnchen in der Lösung zu festigen. Danach wurde das erhaltene Granulat durch Filtration gewonnen und mit Wasser gewaschen. Das

15 Gewicht des erhaltenen Granulats betrug 5 kg.

Nach Verdünnen von 270 g 30%igem Polyäthylenimin mit ca. 3 1 Wasser wurde die dabei erhaltene Lösung mit verdünnter Salzsäure auf einen pH von 5,5 neutralisiert und danach die Gesamtmenge der Flüssigkeit auf 4 kg eingestellt. Die ge samte Menge des oben beschriebenen Granulats wurde der Lö sung zugegeben,und nach langsamem Rühren wurde das Granulat durch Filtration wiedergewonnen. Durch Feststoffanalyse der zurückbleibenden Lösung wurde berechnet, daß ca. 20 g Polyäthylenimin in die Granulatkörnchen eingedrungen war.

Dementsprechend wurden 10 1 einer 0,5%igen Glutaraldehydlösung, die 50 g Glutaraldehyd enthielt hergestellt, was dem 2,5-fachen der berechneten Menge entspricht. Das Polyäthylenimin enthaltende Granulat wurde der Lösung zugegeben und nach schwachem Rühren während 30 Minuten wurde das Gra nulat durch Filtration wiedergewonnen und mit Wasser aus reichend gewaschen. Die obigen Verfahrensschritte wurden durchweg bei einer Temperatur von ca. 25° C durchgeführt.

A 19 205 - 22 -

Die Menge an auf diese Weise erhaltener unbeweglich gemachter Glukosyltransferase betrug 3,3 kg. Das Enzym wurde in eine 5 1 Säule gepackt.

In 9 kg Wasser wurden 6 kg feingranulierter Zucker aufgelöst, wonach die Temperatur der Lösung auf 25° C eingestellt wurde. Die Lösung wurde durch die Säule umgewälzt, indem die Lösung der Säule mit einer Geschwindigkeit von 50 1 pro Stunde mit Hilfe einer Pumpe zugeführt und die Lösung vom unteren Außlaß der Säule in das ursprüngliche Gefäß rückgeführt wurde. Da der pH-Wert der Lösung während des Recyclings allmählich verringert wurde, wurde er mit einer wässrigen Natriumhydroxid-Lösung unter Verwendung eines automatischen pH-Reglers auf etwa 5,5 eingestellt. Nach einer Umwälzdauer von 21 Stunden waren mehr als 98% der Saccharose unter Bildung

15 von Palatinose umgesetzt.

Die Zuckerlösung wurde entnommen, und es wurde eine zweite Reaktion unter Verwendung einer frischen Zuckerlösung begonnen. Die Menge an Saccharose-Lösung war bis zur dritten Reaktion die gleiche,wonach jedoch die Menge an Zuckerlösung entsprechend der Verminderung der Aktivität allmählich verkleinert wurde. Es dauerte 25 Tage, bis die pro Tag zu behandelnde Menge an Saccharose auf die Hälfte vermindert war. Während dieser Zeitdauer betrug die Gesamtmenge an behandelter Saccharose 110 kg. Bei Fortführung des Versuches dauerte es 48 Tage, bis die Aktivität 1/4 der ursprünglichen Aktivität betrug, und die behandelte Saccharose-Menge lag bei 160 kg.

A 19 205 - 23

Beispiel 2

Es wurde eine 6%ige Natriumalginat-Lösung hergestellt, und 1,25 1 der Lösung wurden mit 2,5 1 einer wie in Beispiel 1 hergestellten Zeil aufschlämmung vermischt. Dann wurde die Mischung,wie in Beispiel 1 beschrieben ,tropfenweise durch einen Extruder in 8 1 einer 0,15 M Calciumchlorid-Lösung eingebracht, wobei 3 kg Granulat erhalten wurden.

Nach Einstellen des pH-Wertes von 3 1 einer 2,5%igen PoIyäthylenimin-Lösung auf 5,5 wurde das Granulat während 10 Minuten in diese Lösung getaucht, wobei 30 g Polyäthyleniminin die Granulatkörner eindrangen. Das Granulat wurde daraufhin während 30 Minuten mit 9 1 einer l%igen Glutaraldehyd-Lösung behandelt, die 90 g Glutaraldehyd enthielt, was der dreifachen Menge an Polyäthylenimin entspricht. Das Granulat wurde dann durch Filtration wiedergewonnen und mit Wasser gewaschen, wobei 2,5 kg unbeweglich gemachte oC-Glukosyltransferase erhalten wurden.

Das unbeweglich gemachte Enzym wurde in eine Säule gepackt und wie in Beispiel 1 verwendet. In diesem Falle betrug die in einem Tag behandelte Saccharose-Menge 5 kg zu Beginn der Behandlung, und nach 25 Tagen hatte die Säule noch eine Arbeitskapazität von 3 kg pro Tag. Die während 25 Tagen behandelte Saccharose-Menge betrug 95 kg, und es dauerte ca. 50 Tage, bis die Aktivität bei 1/4 der Anfangsaktivitat lag. Die Menge an behandelter Saccharose betrug 185 kg.

A 19 205 - 24 -

Beispiel 3

Protaminobacter rubrum CBS 57/477 wurde unter Verwendung eines Kulturmediums, das 5% Saccharose, 3% Maiswasser, 0,5% Hefeextrakt, 0,3% Dinatriumhydrogenphosphat und 0,2% Natriumchlorid enthielt ,während 20 Stunden bei einem Anfangs-pH von 7,0, einer Temperatur von 28° C, einer Belüftungsrate von 1/4 VoI /VoI χ min und einer Rührgeschwindigkeit von 300 u.p.m kultiviert, wobei 15 1 Kulturmaterial erhalten wurden. Das kultivierte Material wurde einer Zentrifugalabtrennung unterworfen, um 3 1 ZeI!aufschlämmung zu bilden, welche mit 1,5 1 einer 4%igen Natriumalginat-Lösung gut vermischt wurden. Die Mischung wurde wie in Beispiel 1 zur Bildung eines Granulats in eine Calciumchlorid-Lösung eingetropft, und das erhaltene Granulat mit Wasser gewaschen. Nach Eindringen von Polyäthylenimin in die Granulatkörner wurde das Granulat mit einer Glutaraldehyd-Lösung behandelt, um 2,6 kg fixierte <=6-Glukosyltransferase zu bilden_s welche in eine 5 1 Säule gepackt wurden.

Eine Lösung von Saccharose, aufgelöst in einer 0,01 M Essigsäure/Calciumacetat-Lösung, wurde in einer Konzentration · von 30% (Gewicht pro Gewicht) bei einer Temperatur von 25° C und einer Fließgeschwindigkeit von 2,5 1 pro Stunde durch die Säule geleitet. Der Anteil an Saccharose im Ausfluß wurde zu 0,5% bestimmt, was zeigt, daß der größte Teil der Saccharose in der Säule in Palatinose umgewandelt worden war. Wurde die Säule 30 Tage lang unter denselben Bedingungen wie oben eingesetzt, dann lag der Saccharosegehalt im Ausfluß im Bereich von 0,5 bis 1,5%. Die innerhalb von 30 Tagen behandelte Saccharose-Menge lag bei 540 kg.

A 19 205 - 25 -

Beispiel 4

100 g der unbeweglich gemachten oC-Glukosyltransferase, die wie in Beispiel 3 erhalten wurde, wurden in eine 200 ml Säule gepackt. Durch diese Säule wurden 2 1 einer 30%igen Saccharose-Lösung (Gewicht pro Gewicht) mit einer Geschwindigkeit von 500 ml pro Stunde hindurchgeleitet und wie in Beispiel 1 umgewälzt. Ein automatischer pH-Regler wurde mit dem Gefäß für die Saccharose-Lösung verbunden und der pH-Wert auf 5,5 +_ 0,1 unter Anwendung einer gesättigten Calciumhydroxid-Lösung eingestellt. Die Temperatur des Reaktionssystems wurde auf 25° C gehalten. Da die Konzentration an Saccharose in der Reaktionsmischung nach 20 Stunden unter 0,5% lag, wurde die Saccharose-Lösung erneuert und die Reaktion von neuem begonnen. Auf diese Weise wurde die Reaktion 20 mal durchgeführt, ohne daß eine merkliche Änderung in bezug auf die Enzymaktivität der Säule beobachtet wurde.

Beispiel 5

Ohne Verwendung der in Beispiel 4 genannten Säule wurden 100 g des unbeweglich gemachten Enzyms wie in Beispiel 4 zu 2 1 einer Saccharose-Lösung gegeben. Nach einer Reaktionsdauer von 20 Stunden unter Rühren und Einstellen des pH-Wertes auf 5,5 und unter Einhaltung einer Temperatur von 25° C lag die Saccharose-Konzentration bei 0,3%. Das Enzym wurde durch Filtration wiedergewonnen und für die nachfolgende Reaktion eingesetzt. Nach 20-maligem Einsetzen des Enzyms wurde keine merkliche Veränderung der Enzymaktivität beobachtet.

- a-

Leerseite

Claims

Ansprüche

1./Verfahren zur Herstellung von Palatinose, dadurch gekennzeichnet, daß Bakterienzellen, die oC-Glukosyltransferase enthalten, welche Palatinose aus Saccharose bildet, durch Einschluß in ein Calciumalginat-Gel granuliert werden, das Granulat in eine auf einen pH von 5,0 bis 5,9 neutralisierte Polyäthylenimin-Lösung getaucht wird, um Polyäthylenimin in das Granulat eindringen zu lassen, bis die Polyäthylenimin-Konzentration im Gel 0,5 bis 1,5 % beträgt, das Granulat mit einer Glutaraldehyd-Lösung behandelt wird, die die 1,5 bis 5fache Menge, bezogen auf das im Gel befindliche Polyäthylenimin, an Glutaraldehyd enthält, um unbeweglich gemachte oC-Glukosyltransferase zu bilden, und daß unter Einsatz der unbeweglich gemachten oC-Glukosyltransferase Palatinose aus Saccharose hergestellt wird.

A 19 205 - 2 -

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die unbeweglich gemachte oC-Glukosyltransferase zur Bildung von Palatinose in eine Säule gepackt· wird und eine Saccharose-Lösung aus einem Vorratstank durch die Säule im Kreislauf geführt wird, währenddessen der pH-Wert der umgewälzten Lösung im Tank und/oder in den Rohrleitungen eingestellt wird,

3. An Calciumalginat-Gel durch Umsetzung von Polyäthylenimin mit Glutaraldehyd gebundene ot-Glukosyltransferase in Granulatform.

4. Verwendung der gebundenen oi.-Glukosyltransferase nach Anspruch 3 zur Herstellung von Palatinose.