DE2728324A1

DE2728324A1 - Muramyldipeptidderivate und verfahren zu ihrer herstellung

Info

Publication number: DE2728324A1
Application number: DE19772728324
Authority: DE
Inventors: Ichiro Azuma; Tadamasa Hirayama; Tsuneo Kusama; Shoichi Kusumoto; Tetsuo Shiba; Yuichi Yamamura
Original assignee: Daiichi Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Daiichi Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 1976-06-23
Filing date: 1977-06-23
Publication date: 1978-01-12
Also published as: SE7707276L; NL7706948A; US4101536A; SE446740B; NL171063B; FR2375249B1; SU793384A3; FR2375249A1; DE2728324C2; CA1105005A; CH624124A5; NL171063C; GB1563561A

Description

PATENTANWÄLTE

PROF. DR. DR. J. REITSTÖTTER DR.-ING. WOLFRAM BUNTE DR. WERNER KINZEBACH 2728 3

D-eOOO MÜNCHEN 40. BAUERSTRASSE 22 ■ FERNRUF (ΟΘ9) 37 63 63 · TELEX B2IS2OS ISAR D POSTANSCHRIFT: D-8OOO MÜNCHEN 43. POSTFACH

München, 23. Juni 1977 M/18 184

DAIICHI SEIYAKU CO. , LTD. No. 14-10, Nihonbashi 3-chome

Chuo-ku

TOKIO / JAPAN

Muramyldipeptidderivate und Verfahren zuihrer Herstellung

Die Erfindung betrifft neue Muramyldipeptidderivate und ein Verfahren zu ihrer Herstellung. Im besonderen betrifft die Ei findung die Muramyldipeptidderivate der allgemeinen Formel I

(D

CH CHCO-Q

709S82/q791

M/18 184 -X-

in der Y eine Mycoloylgruppe oder einen synthetischen höheren Acylrest, der insgesamt 30 bis 50 Kohlenstoffatome und mindestens einen verzweigtkettigen höheren (langen) Alkylrest in *-Stel lung aufweist, und Q eine L-Alanyl-D-isogl utamin-, Glycyl-D-isoglutamin- oder L-Seryl-D-isoglutamingruppe bedeuten.

Die Erfindung betrifft ferner Salze der genannten Derivate und ein Verfahren zur Herstellung der Derivate und ihrer Salze. j

Die erfindungsgemäßen Verbindungen besitzen eine starke Immunoad· juvans-Wirkung und Antitumorwirkung gegenüber syngenen (syngene-_f j tischen) Mäuse-Tumorsystemen, wie MH134-Hepatomen bei C,H/He-

ι Mäusen und Melanomen B16 bei C57BL/6J-Mäusen, und eignen sich daher für die Immuntherapie von Krebs in der Human- und Veteri närmedi zi η.

-

'

ι Es ist bekannt, daß Bakterienzel!wände oder das mucopeptidj haltige Wachs D und eine Peptidglykolipidkomponente von Bakterienzellwänden Immunoadjuvans-Wirkung :

entfalten. Ausgedehnte Untersuchungen an diesen bekannten Substanzen haben ferner ergeben, daß die für die Ad- ; juvanswirkung verantwortliche kleinste Einheit N-Acetylmuramyl- : L-alanyl-D-isoglutamin (nachstehend als "Muramyldipeptid" bezeichnet) ist. Das Muramyldipeptid zeigte eine Immunoadjuvans- ! Wirkung,z.B. eine Stimulierung von erhöhten Serumantikörper-' spiegeln und induzierte eine verzögerte Hypersensitivität gegenüber einem Ovalminprotein-Antigen. Die Erfinder haben außerdem berichtet, daß 6-0-Stearoylmuramyldipeptid fast die glei- ! chen immunologischen Eigenschaften wie Muramyldipeptid aufweist. Diese beiden synthetischen Hilfsstoffe zeigten jedoch keine Adjuvanswirkung bei der Entstehung von durch Zellen vermittelten zytotoxischen Effektorzellen in der Milz von C57BL/6J-Mäusen

709882/0791

M/18 184 -Ji-

durch Immunisierung mit allogenem Antigen, d.h. Mastozytom-P815-X2-Ze!len in vivo. Die zellvermittelte zytotoxische Aktivität steht in enger Beziehung zu zellulären Immunreaktionen und zur Antitumorwirkung.Ferner wurde gezeigt, daß die erwähnten beiden Verbindungen keine Antitumorwirkung gegenüber syngenen Mäuse-Tumorsystemen, wie MH134-Hepatomen bei CjH/He-Mäusen und Melanomen B16 bei C57BL/6J-Mäusen, auf- { weisen.

Es war daher die Aufgabe der Erfindung, Verbindungen zur Ver- ! fügung zu stellen, welche Adjuvanswirkung bei der Induzie- j rung von verzögerter Hypersensitivitat und der Bildung von · zel lvermittelten zytotoxischen Effektorzellen in der Milz ■ von C67BL/6J-Mäusen durch Immunisierung mit allogenem Antigen, d.h. Mastozytom-P815-X2-Zellen in vivo, sowie Antitumorwirkung gegenüber syngenen Mäuse-Tumorsystemen, wie MH134-Hepatomen bei C-jH/He-Mäusen und Melanomen B16 bei C57BL/6J-Mäusen, aufweisen. Die Aufgabe der Erfindung besteht ferner'darin, Methoden zur Herstellung solcher Derivate und ihrer Salze ί zu schaffen.

Gegenstand der Erfindung sind die Muramyldipeptidderivate

der allgemeinen Formel I ;

Y-OCH₂

(D 3

CH₃CHCO-Q

in der Y eine Mycoloylgruppe oder einen synthetischen Acyl-

7098827G79T

M/18 184 - Jf-

rest, der insgesamt 30 bis 50 Kohlenstoffatome enthält und mindestens einen verzweigtkettigen höheren Alkylrest in V-Stellung aufweist, und Q eine L-Alanyl-D-isoglutamin-, Glycyl-D-isoglutamin- oder L-Seryl-D-isoglutamingruppe bedeuten, sowie die Salze dieser Muramyldipeptidderivate.

Ferner betrifft die Erfindung Methoden zur Herstellung der genannten Verbindungen.

Die erfindungsgemäßen Verbindungen können nach dem durch das folgende Reaktionsschema veranschaulichten Verfahren hergestellt werden:

7098827079T ■

M/18 184

CH, OH LI

(C

OZ

NHCOCH.

CH₃-CHCOOH

(II)

JS -

CH₂OH

—ο

CH₃CHCOOX

(HD

OZ NHCOCH.

CH₂OTS

OZ

NHCOCH,

CH₃CHCOOX

(IV) CH₂OY

j OZ NHCOCH.

CH₃CHCOOX

(V)

CH₂-OY

OZ

n'hcoch.

CH₃CHCOOH

(VI) CH₀OY

OZ-NHCOCH.

CH₃CHCO-Q¹

(VII)

Y-OCH.

NHCOCH,

CH₃CHCO-Q (I)

70918270791

Im obigen Reaktionsschema bedeuten: J

Z eine Benzylgruppe, die durch ein Halogenatom, eine Nitro- : gruppe oder einen Nieder-alkoxyrest substituiert sein kann, ;

X eine Schutzgruppe für die Carboxylgruppe, wie eine tert.- ' ßutyl- oder Diphenylmethylgruppe,

Y eine Mycoloylgruppe oder einen synthetischen höheren Acyl -

rest mit einer Gesamt-Kohlenstoffzahl von 30 bis 50 und

ι mindestens einem verzweigtkettigen höheren Alkyl rest in

«-Stellung, j

Q eine L-AIanyl-D-isoglutamin-, Glycyl-D-isoglutamin- oder ' L-Seryl-D-isoglutamingruppe und I

Q' eine geschützte L-Alanyl-D-isoglutamingruppe , geschützte Glycyl-D-isoglutamingruppe oder geschützte L-Seryl-D-isoglutamingruppe.

Die erfindungsgemäßen Verbindungen können dadurch hergestellt werden, daß man eine Mycoloylgruppe an der C-6-Hydroxylgruppe von Benzyl-N-acetylmuramid einführt, das erhaltene Mycoloylderivat mit Dipeptidbenzylester kuppelt und danach eine hydrogenolytische Schutzgruppenabspaltung vornimmt. Diese '· Synthese wird nachstehend näher erläutert.

Die Carboxylgruppe der Ausgangsverbindung, d.h. von Benzyl-N-acetyl-of-murami d (II), wird mit Hilfe einer geeigneten Schutzgruppe (wie einer Di phenylmethylgruppe) blockiert. Die Blockierung der Carboxylgruppe der Verbindung (II) ist zwar nicht obligatorisch, verhindert jedoch vermutlich in den darauffolgenden Stufen unerwünschte Nebenreaktionen. Anschließend wird die C-6-Hydroxylgruppe der Verbindung (III) nach Bedarf durch Umsetzung mit Tosylchlorid oder Methansulfonylchiorid in einem basischen Lösungsmittel (wie Pyrid in) aktiviert.

70988270791

Danach wird die Verbindung (IV) mit Al kaiimetallmycolat in einem geeigneten polaren Lösungsmittel (wie Dimethylformamid oder Dimethylsulfoxyd) bei einer Temperatur von etwa 100 bis 14O⁰C umgesetzt. Die Reaktion verläuft reibungslos, wenn man sie in einem nicht-polaren Lösungsmittel (wie Benzol) in Gegenwart einer katalytischen Menge einer cyclischen Polyäther-f Verbindung (wie 18-Crown-6) durchführt.

Die Schutzgruppe der Carboxylgruppe der auf diese Weise erhaltenen Verbindung (V) wird beispielsweise mit Trifluor- ! essigsaure abgespalten. Die dabei erhaltene Verbindung (VI) j wird in Gegenwart eines geeigneten Kondensationsmittels (wie von Dicyclohexylcarbodiimid oder N-Hydroxysuccinimid) mit einer Dipeptidkomponente, wie L-Alanyl-D-isoglutaminbenzylester, umgesetzt. Diese Reaktion wird gewöhnlich bei Raumtemperatur unter Rühren in einem geeigneten nicht-polaren Lösungsmittel, \ wie Äthylacetat, Benzol, Dioxan oder Tetrahydrofuran, durchge-, führt. Schließlich werden die Schutzgruppen der Verbindungen (VII) nach einer herkömmlichen Methode unter Erzielung der gewünschten Verbindung (I) abgespalten, beispielsweise durch Hydrierung in Gegenwart von kolloidalem Palladium (Palladium- j mohr) oder Platin oder durch Umsetzung mit einer Lösung von Bromwasserstoffsäure in Essigsäure. ;

Die gewünschte Verbindung kann auch durch Umsetzung der Ver- : bindung (II) mit der Dipeptidkomponente und anschließende Reaktion der erhaltenen Verbindung mit Mycolsäure oder einer synthetischen Fettsäure hergestellt werden.

Eine der Ausgangsverbindungen, d.h. Mycolsäure, kann nach

einer im folgenden näher erläuterten, herkömmlichen Methode '

erzeugt werden. Man erhält die Mycolsäure durch Hydrolyse von j

ganzen Bazillen, eines Wachs-D-Präparats (Peptidglykolipids) ι

70908 27Β7Π ^f

AO

oder enggebundenen Lipidpräparats verschiedener Arten von I Bakterien und Reinigen der hydrolysierten Produkte durch ! Chromatographie an aktivem Aluminiumoxyd oder Kieselgel. Mycol-j säure wird von Asselineau im wesentlichen als höhere Fettsäure mit einem langen, verzweigtkettigen Alkylrest in <y-Ste11ung ι und einer Hydroxylgruppe in ß-Stellung definiert (J.Asselineau, "The Bacterial Lipids", Hermann, Paris, 1966). Die erfindungsgemäß verwendete Mycolsäure kann jedoch eine einzelne Fettsäure¹ oder ein Gemisch höherer Fettsäuren sein, die insgesamt 28 bis ; 90 Kohlenstoffatome aufweisen und deren cV-Stellung durch einen höheren, verzweigtkettigen Alkylrest und deren ß-Stellung durch eine Hydroxylgruppe substituiert sind.

Das auf diese Weise erhaltene Präparat ist gewöhnlich ein Gemisch von mehreren Arten von Mycolsäure; nötigenfalls kann eine einzelne Mycolsäure durch weitere Reinigung isoliert wer- ^! den. Im Hinblick auf die biologische Aktivität im Sinne der Erfindung ist jedoch eine vollständige Reinigung bis'zu einer einzelnen Mycolsäure nicht erforderlich, und die genannten Gemische von mehreren Mycolsäurearten sind für die Verwendung ausreichend.

Im allgemeinen kann eine der höheren Klassen von Mycolsäure, d.h. Mycomycol säure, aus Mycobacterium tuberculosis, M.phlei oder M.smegmatis (Menschen-,Rinder- oder Vogeltyp) erhalten werden. Es handelt sich dabei um höhere Fettsäuren mit einer Gesamtkohlenstoffzahl von etwa 70 bis 90 und mindestens einem höheren, verzweigtkettigen Alkylrest (Cpo'Cp^-Alkylrest) in cv-Stel1ung und einer Hydroxylgruppe in ß-Stellung.

Andererseits können als mittlere Klasse von Mycolsäure Nocardomycolsäure, Corynomycolsäure und Arthrobactermycolsäure angeführt werden; dabei handelt es sich um mittlere Fettsäuren mit insgesamt etwa 28 bis 70 Kohlenstoffatomen und mindestens

M/18 184

einem höheren, verzweigtkettigen Alkylrest (Cg-C,g-Al kylrrjst) in or-Stellung sowie einer Hydroxylgruppe in ß-Stellung. ;

Beispiele für Bakterien der Gattung Nocardia, die sich zur j Gewinnung von Nocardomycolsäure eignen, sind Nocardia asteroi-ί des, N.rubra, N.brasi1iensis und N.polychromogenes. !

Beispiele für zur Gewinnung von Corynomycolsäure geeignete j Bakterien der Gattung Corynobacterium sind Coryno diphtheriae.i C.pseudotubercuiosis, C.xerosis, C.renale, Arthrobacter simplex und/oder A.f1avescens. i

Die in.der beschriebenen Weise erhaltenen erfindungsgemäßen | Verbindungen zeigen Adjuvanswirkung bei der Induzierung von verzögerter Hypersensitivität,wie Muramyldipeptid,sowie eine zel1vermittelte zytotoxische Wirkung und Antitumorwirkung, die von Muramyldipeptid nicht bekannt ist. Es kann somit vorausgesetzt werden, daß sich die erfindungsgemäßen Verbindungen für die Immunotherapie von Krebs in der Human- und Veterinärmedizin eignen, wie es von Zellwänden oder dem Zeilwandskelett von BCG und anderen Mycobakterien oder Nocardia erwartet wird. Ferner weisen die erfindungsgemäßen ■ Verbindungen folgende Eigenschaften auf: j

(a) Die Verbindungen der Erfindung besitzen im Vergleich zu Bakterien-Zel1 wänden oder -Zellwandskeletten eine einfache und definierte Struktur und können daher (wie es bei ; chemischen Verbindungen der Fall ist) als hochreine, einheitliche Komponenten synthetisch erzeugt werden;

(b) Da die erfindungsgemäßen Verbindungen in mit Phosphat gepufferter Kochsalzlösung suspendierbar sind, können sie; in Form einer Suspension intravenös verabreicht werden, \

709862/0791

ohne daß schwerwiegende Nebenwirkungen auftreten. Demgegenüber kann eine intradermale oder intramuskuläre Injektion einer öl-in-Wasser-Suspension von Bakterien-Zel1-wandskeletten (aus welchen keine derartige einheitliche Suspension hergestellt werden kann) zwangsläufig zu Nebeneffekten, wie einer schwerwiegenden Gewebereaktion, führen und

(c) die Verbindungen der Erfindung neigen weniger zur Entfaltung antigener Eigenschaften als herkömmliche Immunhilfsstoffe, wie der Test mit komplettem Freund-Adjuvans zeigt.

Um die Überlegenheit der erfindungsgemäßen Verbindungen aufzuzeigen, wurden die pharmakologischen Eigenschaften einiger typischer Vertreter jenen von Muramyldipeptid und Stearoylmuramyldipeptid (welche eine ähnliche Struktur wie die erfindungsgemäßen Verbindungen aufweisen) gegenübergesteTlt.

Die Ergebnisse sind in den nachstehenden Tabellen zusammengestellt. In den Tabellen 1 bis 3 werden die erfindungsgemäßen Verbindungen wie folgt abgekürzt:

j 6-0-Mycomycoloyl-N-acetyl muramyl-L-alanyl-D-isoglutamin, erhalten gemäß Beispiel 1 = Myco-L-Ala-D-isoGln.

6-0-Nocardomycoloyl-N-acetyl muramyl-L-alanyl-D-isoglutamin, erhalten gemäß Beispiel 2 = Nocardo-L-Ala-D-isoGln. !

6-0-Corynomycoloyl-N-acetyl muramyl-L-alanyl-D-isoglutamin, ! erhalten gemäß Beispiel 3 = Coryno-L-Ala-D-isoGln. !

6-0-Mycomycoloyl-N-acetylmuramyl-glycyl-D-isoglutamin , erhalten gemäß Beispiel 4 = Myco-Gly-D-isoGlη.

6-O-Mycomycoloyl-N-acetylmuramyl-L-ser-D-isoglutamin, erhal- j

ten gemäß Beispiel 5 = Myco-L-Ser-D-isoGlη ;

TABELLE 1 j Adjuvanswirkung von erfindungsgemäßen Verbindun- '.

gen bei der Induzierung von verzögerter Hypersensiti- !

vität gegenüber ABA-Tyr. i

Verbindung

Dosis , jig/Maus	Hautreaktion ABA-B^A nach mm +	bei 24 SE	100 ug Std.,
500	20,9 +	0,8
50	22,8 +	0,6
100	22,5 +	0,5
100	17,2 +	Γ, 2

Myco-L-Ala-D-isoGln

Muramyldipeptid
Stearoylmuramyldipeptid

Vergleichsverbindung
(ABA-Tyr allein)

Nocardo-L-Ala-D-isoGln 400 23,0 + 1,5

40 24,5 +_ 0,7

Coryno-L-Ala-D-isoGlη 300 22,0+0,6

30 21,2 + 1,9

Muramyldipeptid 100 24,0 + 0,7 Vergleichsverbindung

(ABA-Tyr allein) 0 0

Myco-L-Ser-D-isoGln 500 15,0 + 0,5

50 18,0 + 0,6

70988270ΤΪ1

M/18 184

	yi -	17,	1	27	2!
		12,	8
500		17,	5	± °	,5
50			+ 1	,6
100			+ 1	2

Myco-L-Ala-D-isoGln Muramyldipeptid

Vergleichsverbindung
(ABA-Tyr allein)

Myco-Gly-D-isoGln 500 15,3 +_ 0,6

50 2,7 + 0,7

Muramyldipeptid 100 22,8 _+ 1,5 Vergleichsverbindung

(ABA-Tyr allein) 0 0

SE = Standardfehler

Hartl ey-Meerschwei nchen wurden in vier FuSpolstern m,it 50 jjg N-Acetyl-L-tyrosin-3-azobenzol-4'-arsonsäure (ABA-Tyr) in inkomplettem Freund-Adjuvans und einer in phosphatgeDufferter Kochsalzlösung gelösten oder suspendierten Testverbindung immunisiert. Ferner wurden Vergleichsgruppen der Tiere mit ABA-Tyr allein in inkomplettem Freund-Adjuvans immunisiert.

Zwei Wochen später wurde ein Hauttest mit einer Kochsalzlösung von 100 ^jg ABA-Bakterien-a-amy 1 öse (ABA-BocA) durchgeführt. Die Hautreaktion wurde 24 Stunden nach intradermaler Injektion des Test-Antigens bestimmt.

M/18 184

AS

TABELLE

Adjuvanswirkung bei der Induktion zellvermittelter (cell-mediated) zytotoxischer Zellen in der Milz von allogenen Mäusen (C57BL/6J)

Verbindung Myco-L-Ala-isoGln Muramyldipeptid

Dosis, jjg/Haus

100 10

Steroylmuramyldipeptid 100 Vergleichsverbindung 100

Nocardo-L-Ala-D-isoGln 100

10 Coryno-L-Ala-D-isoGln 100

10 Myco-Gly-isoGln 100

10 Myco-L-Ser-D-isoGln 100

10

Muramyldipeptid 100 Vergleichsverbindung 100 Verabreichungsform

Zellen-Lysis mit spezifischem Target, %

phosphatgepufferte Kochsalzsuspension

69,7 3,9

2,2	3	,2
2,0	7	,6
4,2	14	,4
2,5-	5	,0
76,9 +	4	,0
21,0 +	3	,2
28,8 +	14	,0
16,1 +	15	,2
77,0 +	0	,5
39,3 +	0	,7
30,4 +
21,8 +
11,1 +
10,3 +

Drei oder vier Mäuse (C57BL/6J) jeder Gruppe werden immunisiert, indem man ihnen intraperitoneal ein Gemisch von Mastozytom-

P815-X2-Zellen (1 χ 10 ) und einer in phosphatgepufferter Kochsalzlösung gelösten oder suspendierten Testverbindung injiziert. Eine Kontrollgruppe wird ausschließlich mit Mastozytom-P815-X2-Zellen immunisiert.

Nach 11 Tagen wird die zellvermittelte Zytotoxizitat nach der Brunner-Methode (Immunology JJJ, 1970, S.501 bis 515) bestimmt. Tabelle 2 zeigt, daß die erfindungsgemäßen Verbindungen bei mit Mastozytom-P815-X2-Zellen immunisierten Mäusen eine starke Adjuvanswirkung entfalten.

TABELLE

Antitumorwirkung bezüglich der Hemmung von MH-134-Hepatomen bei C^H/He-Mäusen

Antitumorwirkung A/B* Tumorwachstum

10/10 5/10 6/10

10/10 7/10 0/10 0/10 0/10

0/10

Vergleichsverbindung

(phosphatgepufferte 0/10

Kochsalzlösung allein)

Verbindung	Dosis, pg
Myco-L-Ala-D-isoGln	100
Nocardo-L-Ala-D-isoGln	20
Coryno-L-Ala-D-isoGln	20
Myco-L-Ser-isoGlη	100
Myco-Gly-D-isoGln	100
Muramyldipeptid	20
	100
Stearoylmuramyldipeptid	20
	100

Al-

Man bestimmt die Antitumorwirkung der erfindungsgemäßen Verbindungen an MH134-Heptatomen bei syngenen C^H/He-Mäusen.

5 Ein Gemisch von Tumorzellen von MH134 (1 χ 10 ) und den in _: phosphatgepufferter Kochsalzlösung gelösten oder suspendierten Testsubstanzen (100 bzw. 20 /ig) wird C-jH/He-Mäusen intradermal verabreicht. An den Verabreichungsstellen wird das Tumorwachstum bestimmt.

*'In Tabelle 3 bedeuten:

A = Anzahl der Mäuse, bei denen das Tumorwachstum

völlig unterdrückt wird; und B = Anzahl der getesteten Mäuse.

Tabelle 3 zeigt, daß die phosphatgepufferten Kochsalzlösungen oder -suspensionen der erfindungsgemäßen Verbindungen das Tumorwachstum bei syngenen Mäusen im Vergleich zu Muramyldipeptid und 6-0-5tearoylmuramyldipeptid stark hemmen.

Herstellung mehrerer Arten von Mycolsäure als Ausgangsverbindüngen für die Synthese der erfindungsgemäßen Verbindungen

1. Wachs D, ganze Bazillen, Zellwände und Zellwandskelette von Mycobacterium tuberculosis, Stamm Aoyama B, werden mit Alkali hydrolysiert. Aus dem Produkt wird Mycolsäure durch Säulenchromatographie mit aktiviertem Aluminiumoxyd gewonnen.

Eine Lösung von 0,50 g Mycolsäure in 5 ml Chloroform wird mit einem Tropfen 1 %-iger Phenolphthaleinlösung versetzt. Man titriert das Gemisch mit 0,2 η methanolischer Kalilauge, wovon 2,405 ml benötigt werden. Daraus folgt, daß das Durchschnittsmolekulargewicht der Mycolsäure als einbasische Säure 1186 beträgt.

Nach Eindampfen unter vermindertem Druck versetzt man den Rückstand mit Methanol und filtriert die unlöslichen Substanzen ab. Man erhält 0,51 g Kaiiummycolat vom Fp. 71 bis 83⁰C (Ausbeute: 98 %).

Die Elementaranalyse der Mycolsäure ergibt folgende Werte:

(1) C 81,57 % H 13,48 %

(2) C 81,33 % H 13,62 % ," Mittelwert C 81,45 % H 13,55 % ]

Aus dem durch Titration und dem durch die Elementaranalyse ermittelten Durchschnittsmolekulargewicht bestimmt man die durchschnittliche Summenformel der Mycolsäure mit ^C80^H158°3,5 ■ ¹¹⁷⁶·

2. Ganze Bazillen von Nocardia asteroides 131 werden mit Alkali hydrolysiert, verestert (mit einer Methylgruppe), säulenchromatographisch an Kieselgel gereinigt und zu Mycolsäure mit mittlerem Molekulargewicht hydrolysiert.

Ein Gemisch von 1,24 g der erhaltenen Mycolsäure (Nocardomycolsäure) und 2 ml 3 η methanolischer Kalilauge wird 2,5 Stunden unter RückfluÖ gekocht. Der beim Eindampfen unter vermindertem Druck erhaltene Rückstand wird in 100 ml Diäthyläther gelöst. Die Lösung wird mit 1 η wässeriger Salzsäure und danach mit Wasser gewaschen. Anschließend wird die Lösung über dehydratisiertem Magnesiumsulfat getrocknet und danach unter vermindertem Druck eingedampft. ι Der dabei erhaltene Rückstand wird mit eiskaltem Äthanol ausgewaschen und unter vermindertem Druck über Phosphorpentoxyd getrocknet. Man erhält 0,89 g eines wachsartigen Produkts (Ausbeute: 73 %).

709882/0791

m/18 184 - y, - 272832A I

Elementaranalyse:

C 79,69 % H 12,76 % '·

Man versetzt 10 ml einer Chloroformlösung von 870 mg der \ in der vorstehend beschriebenen Weise erhaltenen Nocardo- ! mycolsäure mit einem Tropfen 1 %-iger Phenolphthaleinlösung ( und titriert das Gemisch mit 0,5 η methanolischer Kalilauge j

ί (f = 0,92), von welcher 2,465 ml benötigt werden. Daraus j berechnet man das Durchschnittsmolekulargewicht der Nocardomycolsäure als einbasischer Säure mit 767. Die Lösung wird
unter vermindertem Druck eingedampft. Man löst den Rück- . stand in Diethylether, filtriert unter Durchsaugen und
dampft das Filtrat unter vermindertem Druck ein. Man erhält
0,88 g eines wachsartigen Produktes (Ausbeute: 98 X).

Aus der Elementaranalyse und dem Durchschnittsmolekular- ' gewicht bestimmt man die Summenformel der Nocardomycolsäure mit C₅₁H₉₇O_{3 fi} = 768.

3. Ganze Bazillen von Corynobacterium diphtheriae PW8 werden j in derselben Weise wie Nocardia asteroides 131 zu Herstel- ! lung von Mycolsäure mit mittlerem Molekulargewicht behan- j

delt. !

Ein Gemisch von 0,53 g des Methylesters der Mycolsäure mit ! mittlerem Molekulargewicht (Corynomycolsäure) und 2 ml

3 η methanolischer Kalilauge wird 2,5 Stunden unter Rück- j

fluß gekocht. Der beim Eindampfen unter vermindertem Druck !

erhaltene Rückstand wird in 15 ml Diethylether gelöst. Man :

wäscht die Lösung mit 1 η wässeriger Salzsäure und danach ;

mit Wasser und trocknet sie hierauf über dehydratisiertem j

MgSO.. Dann dampft man neuerlich unter vermindertem Druck !

^H i

ein und löst den erhaltenen Rückstand in einer geringen i

Menge Methanol. Nach dem Abkühlen fällt ein wachsartiges Produkt aus, das durch Dekantation abgetrennt, mit kaltem Methanol ausgewaschen und unter vermindertem Druck getrocknet wird. Man erhält 0,41 g wachsartiges Produkt (Ausbeute: 80 %).

Elementaranalyse:

C 76,48 % H 12,69 %

Man versetzt 5 ml einer Chloroformlösung von 385 mg Corynomycolsäure mit einem Tropfen Phenolphthalein und ; titriert das Gemisch mit 0,5 η methanolischer Kalilauge (f = 1,00), von welcher 1,47 ml benötigt werden. Man be- j rechnet daraus das Durchschnittsmolekulargewicht von Corynomycolsäure als einbasischer Säure mit 524. Außer- ι dem dampft man die vorgenannte Lösung unter vermindertem Druck ein und löst den Rückstand in Diäthyläther; Hierauf ^! filtriert man unter Durchsaugen und dampft das Filtrat unter vermindertem Druck ein. Man erhält 412 mg eines wachsartigen Produktes (Ausbeute: 99 %). ,

Aus der Elementaranalyse und dem Durchschnittsmolekular- , gewicht bestimmt man die Summenformel von Corynomycolsäure ' ^{m1t C}33^H66°3,5 ^m ⁵¹⁹·

Beispiel 1

Man versetzt eine Lösung von 1 g Benzyl -N-acetyl-tV-muramid i in 10 ml Tetrahydrofuran mit 0,8 g Diphenyl diazomethan, rührt j das Gemisch 30 Minuten bei Raumtemperatur, trennt das Lösungs-j mittel ab und bringt den Rückstand durch Anreiben mit Hexan ! zur Kristallisation.

Das Produkt wird aus einem Gemisch von Äthylacetat und Hexan j umkristallisiert; dabei erhält man 1,3 g Ι-οί-0-Benzyl - ! N-acetylmuramsäure-diphenylmethylester. Das kristalline Produkt wird dann nochmals aus demselben Lösungsmittel umkristal-i lisiert; dabei erhält man reine Kristalle vom Fp. 155 bis ! ²² 3

156⁰C; Γ^Ί²² + 122⁰C (c 1,0, CHCI3)

JD
Elementaranalyse für

	67	C	6	H	2	N
ber. :	67	,74	6	.42	2	,55
gef. :	.62	.50	,52

Man löst 0,3 g 1-oC-O-Benzyl-N-acetylmuramsäure-diphenylmethyl ■ ester in 3 ml Pyridin, versetzt die Lösung mit 1,2 g Tosylchlorid, rührt sie eine Stunde und gießt sie dann in Wasser
ein. Danach extrahiert man mit Äthylacetat. Der Extrakt wird
nacheinander mit 0,3 η Natronlauge, Wasser, 1 η Salzsäure
und nochmals Wasser gewaschen und danach über Magnesiumsulfat getrocknet. Dann destilliert man das Lösungsmittel im Vakuum ab und reinigt dei Rückstand säulenchromatographisch an
Kieselgel (10 g). Die Elution mit Benzol/Äthylacetat (5:1)
liefert eine Fraktion mit einem Gehalt von 0,34 g reinem
1 -Of- 0-Benzy 1 -6-1 osy 1 - N- ace ty lmu ramsäure -diphenyl methyl ester
vom Fp. 68 bis 73⁰C; [oiJ^² + 84,4° (c 0,5, CHCl₃)

709885 /ÜTTI ~~

m/18 184 -af-

Elementaranalyse für C^oH₄₁O_1nNS

	64	C	H	N	4	S
ber. :	64	,85	5,87	1,99	4	,56
gef. :	,68	5,92	1,93	,31

Man gibt 0,38 g Kaiiummycomycolat zu einer Lösung von 0,33 g Ι-α-0-Benzyl-6-0-tosyl-N-acetyImuramsäure-dipheny!methyl ester und 0,02 g 18-Crown-6 in 10 ml Benzol und kocht das erhaltene Gemisch 3 Stunden unter Rückfluß. Danach dampft man das Lösungsmittel im Vakuum ab, wäscht den Rückstand mit Aceton aus und unterwirft die unlöslichen Substanzen einer Kieselgel-Säulenchromatographie.

Das mit einem Gemisch von Benzol und Äthylacetat (Volumenverhältnis 10:1) erhaltene Eluat wird bei Raumtemperatur mit einer Ätherlösung von Diazomethan versetzt. Die Methylveresterung der überschüssigen Mycolsäure erleichtert die chromatographische Reinigung der gewünschten Verbindung. Der nach dem Abdampfen des Lösungsmittels im Vakuum erhaltene Rückstand wird neuerlich der Kiesel gel-Säulenchromatographie unterworfen. Nach der Elution von Methylmycolat mit Benzol wird ein mit einem Gemisch von Benzol und Äthylacetat (10:1) erhaltenes Eluat aufgefangen. Man dampft das Lösungsmittel ab und kristallisiert den Rückstand aus Aceton um. Dabei erhält man 0,32 g l-<y-0-Benzyl-6-0-mycomycol oyl-N-acetylmycomuramsäure-diphenylmethylester vom Fp. 54 bis 57⁰C; [a]p² + 32,6 (C=O,5 CHCl₃)

Elementaranalyse für Ciii

	78	C	11	H	0	N	%
ber. :	78	.07	11	,27	0	.82	%
gef. :	.34 «· «% ,	.48	,85

Ein Gemisch von 0,3 g !-«-O-Benzyl-e-O-mycomycoloyl-N-acetylmuramsäure-diphenylmethylester und 1 ml Anisol wird in 20 ml
Chloroform gelöst. Man versetzt die eisgekühlte Lösung mit : 3 ml Trifluoressigsäure, rührt den Ansatz 30 Minuten, versetzt i das Reaktionsgemisch mit Aceton und dampft das Lösungsmittel j im Vakuum ab. Der Rückstand wird mit Äthanol gewaschen und j in 10 ml Tetrahydrofuran gelöst. Man versetzt die erhaltene j Lösung unter Rühren und Eisbadkühlung mit 75 mg N-Hydroxy- ■ succinimid, 65 mg L-Al any!-D-isoglutaminbenzylester-Hydrochlo- j rid, 24 mg Triethylamin (gelöst in 0,2 ml Tetrahydrofuran) j

j und 37 mg Dicyclohexylcarbodiimid. Das Rühren wird dann über ;

' Nacht fortgesetzt, wobei man die Temperatur des Gemisches Raumtemperatur erreichen läßt.

'

Anschließend filtriert man das Triäthylamin-Hydrochlorid und

'.. den N,N¹ -Dicyclohexylharnstoff ab. Anschließend dampft man !

ι das Lösungsmittel im Vakuum ab, entfernt die äthanollöslichen

j Substanzen und chromatographiert den Rückstand an Kieselgel.

j Das mit einem Gemisch von Benzol und Aceton (3:1) erhaltene j

ί Eluat wird aufgefangen, und das Lösungsmittel wird abgedampft.

Der Rückstand wird aus einem Benzol/Methanol-Gemisch umkristal-j lisiert. Dabei erhält man 0,124 g 1-of-O-Benzyl-6-0-mycomycoloyl!- N-acetylmuramyl-L-alanyl-D-isoglutaminbenzylester vom ; Fp. 171 bis 172⁰C; [^]" + 30,2 (c 0,5, CHCl₃). |

Elementaranalyse für

	74	C	11	H	3	N
ber.:	73	,13	11	,01	3	,06
gef. :	,63	,05	,18

76 mg l-jX-O-Benzyl-ö-O-mycomycoloyl-N-acetylmuramyi-L-al anylr |

D-isoglutaminbenzylester werden in 20 ml Tetrahydrofuran ge- |

3k

löst und in Gegenwart von Palladiummohr bei Raumtemperatur j hydrogenolysiert. Nach der Umsetzung wird das Lösungsmittel !

ι

im Vakuum abgedampft. Der Rückstand wird aus einem Äther/Ätha- j nol-Gemisch umkristallisiert. Dabei erhält man 64 mg 6-0-Myco-

mycoloyl-N-acetylmuramyl-L-alanyl-D-isoglutamin vom Fp. 137 ; bis 160⁰C. !

[ÖTjp² + 24,3⁰C (nach 9 Min., c 0,4, THF/H₂0 50:1) !

+ 25,8 (nach 20 Std., c 0,4, THF/H₂O 50:1) |

Elementaranalyse für ^cgg^Hi88^N13 5^N4*^H2°

	C	11	H	3	N
ber.:	71,26 *	11	,48	3	,36
gef. :	71,08	,40	,26

Beispiel 2

0,48 g l-tX-O-Benzyl-N-acetylmuramsäure-diphenylmethylester und 0,03 g 18-Crown-6 werden in 15 ml Benzol eingetragen. Die erhaltene Lösung wird mit 0,31 g Kaiiumcorynomycolat versetzt und danach 3 Stunden unter Rückfluß gekocht.

Das Reaktionsgemisch wird nach dem Abkühlen mit 0,1 η Salzsäure und mit Wasser gewaschen und anschließend getrocknet. Danach dampft man das Lösungsmittel im Vakuum ab und unterwirft den Rückstand einer Kieselgel-Säulenchromatographie. Das mit einem Benzol/Äthylacetat-Gemisch (5:1) erhaltene Eluat wird eingedampft; dabei erhält man 0,30 g l-of-O-Benzyl-6-0-corynomycoloy1-N-acetylmuramsäure-diphenyl methyl ester.

^{5 + 58}»⁴° (c !.O. CHCl₃)

7um7 rein

m/18 184

Elementaranalyse für ^54^99^10

	73	C	9	H	1	N
ber.:	72	,17	9	,50	1	,33
gef. :	,85	.27	,40

Man löst 0,22 g l-ot-O-Benzyl-ö-O-corynomycoloyl-N-acetylmuramsäure-diphenylmethylester und 0,1 ml Anisol in 10 ml Dichlor- ι methan und versetzt die eisgekühlte Lösung mit 1,6 ml Trifluor- j essigsäure. Nach 30 Minuten langem Rühren dampft man das Lö- ι sungsmittel im Vakuum ab und unterwirft den Rückstand der Kiesel,-ι gel-Säulenchromatographie. Nach Elution von Anisol und des als
j Nebenprodukt gebildeten Diphenylmethanols mit einem Benzol/Äthylacetat-Gemisch (5:1) wird das mit einem Chloroforra/Methanol-Ge-· misch (5:1) erhaltene Eluat aufgefangen und im Vakuum vom Lösungsmittel befreit. Dabei erhält man l-<*-0-Benzyl-6-0-coryno- _:' j mycoloyl-N-acetylmuramsäure. Man versetzt die Säure mit 89 mg ' L-Alanyl-D-isoglutaminbenzylester-Hydrochlorid und 0,036 ml
! Triäthylamin in 5 ml Tetrahydrofuran. Danach kühlt man das Gemisch mit Hilfe eines Eis/Salz-Bades (-15⁰C) und versetzt es
! mit 42 mg N-Hydroxysuccinimid und 46 mg Dicyclohexylcarbodiimid. Dann wird das Gemisch 1 Stunde bei der genannten Temperatur

' und hierauf über Nacht bei Raumtemperatur gerührt.

Das Triäthylamin-Hydrochlorid und der N,N'-Dicyclohexylharnstoff, die sich gebildet haben, werden abfiltriert. Anschließend dampft man das Lösungsmittel ab und wäscht den Rückstand mit

einem Methanol/Wasser-Gemisch (1:1) und danach mit Äther. '

Durch Urakristallisation aus einem Methanol/Wasser-Gemisch er- : hält man 0,13 g l-or-O-Benzyl-ö-O-corynomycoloyl -N-acetylmuramyl-L-alanyl-D-isoglutaminbenzylester vom Fp. 172 bis 174⁰C. I

+ 53,7⁰C (c 1,0. CHCl₃) !

Elementaranalyse für ^C66^H108°13 5^N4

	67	C	9	H	4	N
ber.:	67	,54	9	,28	5	.77
gef.:	,50	.10	.01

Man löst 105 mg l-a-O-Benzyl-ö-O-corynomycoloyl-N-acetylmuramyl-L-alanyl-D-isoglutaminbenzylester in 8 ml Tetrahydrofuran und unterwirft die Lösung bei 28⁰C der Hydrogenolyse in Gegenwart von Palladiummohr.

Nach der Umsetzung wird das Lösungsmittel im Vakuum abdampft. Durch Umkristal1 isation des Rückstands aus einem Methanol/Äther/ Aceton-Gemisch erhält man 59 mg 6-0-Corynomycoloyl-N-acetylmuramyl-L-alanyl-D-isoglutamin vom Fp. 152 bis 155⁰C.

E⁰Oi)^{1 + 31}»⁹°^c (^c °·⁸⁹» Tetrahydrofuran/^ 50:1, nach ; 46 Std.)

Elementaranalyse für C₅₂H₉₆O_{13 5}Ν₄·2,5Η₂0

	60	C	9	H	5	N
ber.:	59	.14	9	,80	5	.40
gef.:	.81	,60	,29

Beispiel 3

Aus 0,35 g l-Ä-0-Benzyl-N-acetylmuramsäure-diphenylmethylester und 0,31 g Kaiiumnocardomycolat werden analog Beispiel 0,34 g l-ot-O-Benzyl-e-O-nocardomycoloyl-N-acetylmuramsäurediphenylmethylester erhalten.

Wq⁷ + 46,7° (c 1,0, CHCl₃)

70988? /ÜTTT

j Elementaranalyse für ^C82^l30°10 6^N1

	75	C	10	H	1	N	%
ber.:	75	.79	10	,08	1	,08	%
gef. :	,38	.15	,03

Nach Umsetzung von 0,24 g l-tf-O-Benzyl-ö-O-nocardomycoloyl-N-acetylmuramsäure-diphenylmethylester mit Trifluoressigsäure j wird die freie Carbonsäure analog Beispiel 2 mit 75 mg L-AIaj nyl-D-isoglutaminbenzylester-Hydrochlorid verknüpft. Dabei

erhält man 0,14 g l-er-O-Benzyl-ö-O-nocardomycoloyl-N-acetyl muramyl-L-alanyl-D-isoglutaminbenzylester vom Fp. 164 bis ! 167⁰C.

⁷ + 44,7 (c 1,0, CHCl₃)
Elementaranalyse für ^C84

	70	C	9	H	3	N
ber.:	70	.91	9	,85	3	,94
gef. :	.99	.92	.92

84 mg des obigen Esters werden analog Beispiel 2 der Hydrogenolyse unterworfen. Dabei erhält man 51 mg 6-0-Nocardomycoloyl-N-acetylmuramyl-L-alanyl-D-isoglutamin vom Fp. 154 bis 157⁰C (Zersetzung).

EpGd° ^{+ 30}»°° (^{c 1}^⁰³' Tetrahydrofuran/H₂0 50:1, nach 24 Std.)

Elementaranalyse für C,qH,07^13 6^4"^»^HoO

	66	C	40	H	4	N	X
ber.:	66	.22	10	.32	4	.41	%
gef. :	.07	.58	.26

709882/0791

Fp. 164 bis 166⁰C.

^CHC13>

Beispiel 4 ■

Ein Gemisch von l-flr-O-Benzyl-S-O-mycomycoloyl-N-acetylmuramsäure-diphenylmethylester und 0,2 ml Anisol wird in 20 ml Dichlormethan gelöst. Man versetzt die Lösung mit 3 ml Tri- i f1uoressigsäure, rührt 30 Minuten und dampft das Lösungsmittel im "Vakuum ab. Der Rückstand wird der Kieselgel-Säulenchromatographie unterworfen. Nach Elution von Anisol und des als Nebenprodukt gebildeten Diphenylmethanols mit einem Benzol/Äthyl acetat-Gemisch (5:1) wird ein mit einem Chloroform/Methanol Gemisch (5:1) erhaltenes Eluat aufgefangen und im Vakuum vom Lösungsmittel befrejt; dabei erhält man 1-of-O-Benzyl -6-0-mycornycoloyl-N-acetylmuramsäure.

Man versetzt das Produkt mit 0,15 g O-Benzyl-L-seryl-D-isoglutaminbenzylester-Hydrochlorid und 0,05 ml Triäthylamin

j (gelöst in 10 ml Tetrahydrofuran) und kühlt die Lösung auf -10⁰C ab. Anschließend fügt man 50 mg N-Hydroxysuccinimid und

■ 69 mg Dicyclohexylcarbodiimid unter einstündigem Rühren bei derselben Temperatur zu. Danach wird der Ansatz weiter über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Anschließend filtriert man das Triäthylamin-Hydrochlorid und den N,N'-Dicyclohexylharnstoff, die sich als Nebenprodukte gebildet haben, ab. Hierauf wird das Lösungsmittel abdestilliert und der Rückstand der Ki es el gel-Saul enChromatograph ie unterworfen.

Das mit einem Chloroform/Methanol-Gemisch (30:1) erhaltene Eluat wird aufgefangen und vom Lösungsmittel befreit. Der Rückstand wird aus einem Benzol/Methanol-Gemisch umkristallisiert. Dabei erhält man 0,35 g Ι-οί-0-Benzyl-6-0-mycomycoloyl-N-acetylmuramyl-O-benzyl-L-seryl-D-isoglutaminbenzylester vom

709882/0791

M/18 184 - & - 27283ZH

Elementaranalyse für ^ci20^H206°14 5^N4

	74	C	10	H	2	N
ber.:	74	,39	10	.74	2	.89
gef.:	.41	.59	.87

Man löst 0,2 g des erhaltenen l-tf-O-Benzyl-ö-O-mycomycoloyl-N-acetylmuramyl-O-benzyl-L-seryl-D-isoglutaminbenzylesters in 20 ml Tetrahydrofuran und unterwirft die Lösung bei Raumtemperatur der Hydrogenolyse in Gegenwart von Palladiummohr. j

Nach der Umsetzung dampft man das Lösungsmittel im Vakuum ab i und kristallisiert den Rückstand aus einem Tetrahydrofuran/ j Methanol-Gemisch um. Dabei erhält man 0,14 g 6-0-Mycomycoloyl-· N-acetylmuramyl-L-seryl-D-isoglutamin vom Fp. 114 bis 120⁰C ■

⁰^

(Zers.); fcOo⁵⁰^³⁵»²⁰ <^{c 1>0}» Tetrahydrofuran/^ 50:1, nach 48 Std.).

Elementaranalyse für C₉₉

	71	C	11	H	3	N
ber. :	71	.33	11	.39	3	,36
gef. :	.03	.33	.42

Beispiel 5

Aus 0,5 g l-of-O-Benzyl-e-O-nocardomycoloyl-N-acetylmuramsäure-j diphenylmethylester wird analog Beispiel 4 6-0-Nocardomycoloylr N-acetylmuramyl-L-seryl-D-isoglutamin vom Fp. 125 bis 13O⁰C (Zers.) hergestellt; BOq⁵°^C+ 32,2 (c 1,0, Tetrahydro- ;

furan/H₂0 50:1, nach 48 Std.)

Elementaranalyse füi ^c7o^Hi27°14 6^N4^H2°

	C	10	H	4	N
ber. :	65,85	10	.21	4	.39
gef. :	65,62	,33	.48

Beispiel 6 ι

i In eine Lösung von 0,5 g Natrium in 15 ml wasserfreiem Metha- j nol werden 3,6 g Diäthylmalonat eingetragen. Man rührt die ; Lösung 20 Minuten bei 50⁰C und versetzt sie dann bei dieser
Temperatur mit 6 g Tetradecylbromid. Hierauf wird die Lösung ' 5 Stunden unter Rückfluß gekocht, abgekühlt und mit Äther versetzt. Das entstandene Natriumbromid wird abfiltriert. Danach ; destilliert man das Lösungsmittel ab und versetzt das zurückbleibende Dl mit 15 ml wasserfreiem Methanol, das 0,5 g
Natrium enthält. Man versetzt die Lösung weiterhin mit 6 g
Tetradecylbromid und kocht sie 5 Stunden unter Rückfluß. Nach
dem Abkühlen verdünnt man die Lösung mit Wasser und extrahiert mit Äther. Der Extrakt wird mit Wasser gewaschen und getrocknet. Der beim Abdampfen des Lösungsmittels erhaltene Rückstand wird aus Äthanol umkristallisiert. Dabei erhält man 6,7 g
Diäthyl-2,2-bis-tetradecylmalonat vom Fp. 30 bis 32⁰C.
6,5 g des Malonats werden in eine Lösung von 2,7 g KOH in
einem Gemisch von 10 ml Wasser und 20 ml Äthanol eingetragen. ' Die Lösung wird 10 Stunden unter Rückfluß gekocht und nach
dem Abkühlen mit 3m Schwefelsäure angesäuert. Dann extrahiert i man mit Äther. Der Extrakt wird mit Wasser gewaschen und getrocknet. Der beim Abdampfen des Lösungsmittels erhaltene
Rückstand wird 1 Stunde auf 190 bis 20O⁰C erhitzt und dann
aus Methanol umkristallisiert. Dabei erhält 4,9 g 2-Tetradecylhexadekansäure vom Fp. 73,5 bis 75⁰C.

709*Β2Υ©7Π

H/18 184

Elementaranalyse für ^C3q^H50°2 i

	79	C	13	H
ber.:	79	,57	13	,36
gef.:	,57	,35

Eine Lösung von 1 g 2-Tetradecylhexadekansäure und 0,79 g
Thionylchlorid in 5 ml Benzol wird 7 Stunden unter Rückfluß j gekocht. Nach dem Abdampfen des Benzols und Thionyl Chlorids I versetzt man den Rückstand mit wasserfreiem Benzol und destil- | liert dieses wiederum ab. Dieser Vorgang wird zur vollständi- ! gen Entfernung des Thionylchlorids dreimal wiederholt. Dann ; kristallisiert man den Rückstand aus wasserfreiem Hexan um, ; wobei man 0,75 g 2-Tetradecylhexadekanoylchlorid vom Fp. 51 ' ! bis 53⁰C erhält. Man versetzt eine Lösung von 0,85 g l-of-0-Benzyl-N-acetylmuramyl-L-alanyl-D-isoglutaminbenzylester in . ! 35 ml wasserfreiem Pyridin mit 4,9 g 2-Tetradecylhexadekanoyl- · chlorid, das bei 17 bis 18⁰C in 35 ml wasserfreiem Tetrahydrofuran gelöst wurde. Nach 45 Minuten fügt man 20 ml Wasser ' hinzu und rührt die Lösung 35 Minuten bei Raumtemperatur. Dann
stellt man die Lösung mit 1 m Salzsäure auf den pH-Wert 3
ein und extrahiert mit Chloroform. Der Extrakt wird mit ge- | sättigter Natriumchloridlösung gewaschen und getrocknet. j Hierauf dampft man das Lösungsmittel ab und unterwirft den
Rückstand der Kieselgel-Säulenchromatographie. Das mit einem ; Chloroform/Methanol-Gemisch (20:1) erhaltene Eluat wird eingedampft und der Rückstand aus Methanol umkristallisiert. Dabei _; erhält man 0,75 g 6-0-(2-Tetradecylhexadekanoyl )-l-o(-0-benzyl- ^! N-acetylmuramyl-L-alanyl-D-isoglutaminbenzylester vom Fp. 173
bis 174⁰C.

Elementaranalyse für C_sa

	68	C	9	H	5	N	%
ber.:	68	,39	9	,20	... 5	,06	%
gef.:	,04	,29	,03

709882/0791

Eine Lösung von 0,7 g des in der beschriebenen Weise erhalte- ; nen 6-0-(2-Tetradecylhexadkanoyl)-l-v-0-benzyl-N-acetylmuramyl L-alanyl-D-isoglutaminbenzylesters in 15 ml Tetrahydrofuran wird 15 Tage in einer Wasserstoffatmosphäre bei 30⁰C in Gegen-, wart von Palladiummohr gerührt. Das erhaltene Produkt wird der ι Kieselgel-Säulenchromatographie unterworfen und mit einem ; Gemisch von Chloroform, Methanol und Essigsäure (95:5:3) eluiert. Das Eluat wird eingedampft und der Rückstand in einem Dioxan/Wasser-Gemisch (1:1) gelöst. Durch Gefriertrocknung der Lösung erhält man 0,5 g 6-0-(2-Tetradecylhexadekanoyl)-N-acetylmuramyl-L-alanyl-D-isoglutamin vom Fp. 152 bis 155⁰C.

taranal	yse	für C₄	9^H87	°12^N/	_r2H₂0	N
		C		H		.82
ber. :	61	.16	9	.74	5	,83
gef. :	61	.10	9	,60	5

709882/0791

Claims

M/18 184 - Ii- Patentansprüche '

1. Muramyldipeptidderivate der allgemeinen Formel

Y-OH₇C

NHCOCH₃
CH₃CHCO-Q

in der Y eine Mycoloylgruppe oder einen synthetischen
höheren Acylrest, der insgesamt 30 bis 50 Kohlenstoffatome enthält und mindestens einen verzweigtkettigen, höheren
(langen) Alkylrest in «^-Stellung aufweist, und Q eine
L-Alanyl-D-isoglutamin-, Glycyl-D-isoglutamin- oder
L-Seryl-D-isoglutamingruppe bedeuten.

2. 6-0-Mycornycoloy1-N-acety 1 muramyl-L-alanyl-D-i soglutami η.

3. 6-0-Corynomycoloyl-N-acetyl muramyl-L-alanyl-D-isoglutamin.

4. 6-0-Nocardomycoloyl-N-acety1 muramyl-L-alanyl-D-isoglutamin.

5. 6-O-Mycornycoloyl-N-acetyl muramyl-L-seryl-D-isoglutamin.

6. 6-0-Nocardomycoloyl-N-acetylmuramyl-L-seryl-D-isoglutamin.

7. 6-0-(2-Tetradecylhexadekanoyl)-N-acetylmuramyl-L-alanyl-D-isoglutamin.

709882/0791

ORIGINAL INSPECTED

M/18 184 γ

8. Verfahren zur Herstellung der Verbindungen nach Anspruch 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß man Benzyl-N-acetyl-»- ί muramid mit einer Mycolsäure oder einer synthetischen \ höheren Fettsäure umsetzt und das erhaltene Derivat mit einem Dipeptid aus der Gruppe bestehend aus L-Alanyl-D-isoglutamin, Glycyl-D-isog!utamin und L-Seryl-D-isoglutamiη kuppelt.

9. Arzneimittel enthaltend wenigstens eine Verbindung nach den Ansprüchen 1 bis 7 in einem üblichen Träger gegebenenfalls neben üblichen Hi1fsstoffen.

70988 2/0791