DE2722644A1

DE2722644A1 - Kristallisiertes kaliumsalz von adenosin-5'-diphosphorsaeure- und verfahren zu seiner herstellung

Info

Publication number: DE2722644A1
Application number: DE19772722644
Authority: DE
Inventors: Herbert Dipl Ing Brustmann; Erich Haid; Heinrich Traeger
Original assignee: Boehringer Mannheim GmbH
Current assignee: Roche Diagnostics GmbH
Priority date: 1977-05-18
Filing date: 1977-05-18
Publication date: 1978-11-23
Also published as: JPH0116838B2; IE45684L; US4151348A; DE2722644C3; IE45684B1; IT1086089B; JPS53144599A; NL7800020A; GB1531108A; DE2722644B2

Description

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Patentanwälte Dipl.-Ing. H. Weickmann, Dipl.-Phys. Dr. K.Fincke

Dipl.-Ing. F. A.Weickmann, Dipl.-Chem. B. Huber

8 MÜNCHEN 86, DEN POSTIACH 860 820 ^HCH MÖHLSTRASSE 22, RUFNUMMER 9« 3921/22

int. Nr. 2138

BOEHRINGER MANNHEIM GMBH Sandhof er Straße 112,-132, 6800 Mannheim

Kristallisiertes Kaliumsalz von Adenosin-5'-diphosphorsäure-

und Verfahren zu seiner Herstellung

Die Erfindung betrifft kristallisiertes Kaliumsalz von Adenosin-5 '-diphosphorsäure und ein Verfahren zur seiner Herstellung.

Adenosin-5'-diphosphorsäure (ADP) kommt natürlich als Zwischenprodukt bei Gärungsprozessen vor und entsteht auch im Muskel aus ATP unter der Einwirkung der Adenosintriphosphatase. ADP wird für wissenschaftliche Zwecke, als Ausgangssubstanζ zur Synthese von ATP sowie als Bestandteil von Reagentienkompositionen ins-

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- 9T-

besondere für die klinische Diagnose in großem Umfange verwendet.

Die bisher bekannten Formen des ADP, welches im wesentlichen in Form seiner Salze verwendet wird, sind amorph und weisen eine ungenügende Haltbarkeit auf. Sie zeigen nämlich die Neigung, sich unter Bildung von Adenosinmonophoshat (AMP) und von Adenosintriphosphat (ATP) zu zersetzen. So bilden sich beispielsweise bei dreiwöchiger Lagerung von Dinatrium-ADP in amorpher Form bei 33°C 10 % AMP und mehr als 3 % ATP. Diese Instabilität ist von erheblichem Nachteil, insbesondere für die erwähnten Reagentienkompositionen.

Es besteht daher Bedarf an einer stabileren Form von ADP.

Nunmehr wurde gefunden, daß es möglich ist, ein kristallisiertes Monokaliumsalz von ADP herzustellen, welches eine deutlich überlegene Stabilität aufweist.

Gegenstand der Erfindung ist daher kristallines orthorhombisches Kaliumsalz der Adenosin-5'-diphosphorsäure mit der Raumgruppe P2₁2₁2 und den Elementarzellenkonstanten a - 28,53 + 0,03 8, b = 10,49 + 0,02 8,c = 6,33 + 0,02 8, 0( = β ■ X - 90,0°, Volumen = 1894,4 S³.

Die Bestimmung dieser Werte erfolgte aus je vier Reflexabständen auf Präzisionsfilmen, mit Ni-gefilterter CuK₀^ -Strahlung (Λ= 1,54182 8) bei einem FiIm-Kristall-Abstand von 75,0 rom. Nach den Analysenwerten handelt es sich um ein Monokaliumsalz-Dihydrat.

Aus Nature 262, 234 bis 236 (1976) ist zwar bereits ein kristallisiertes Rubidiumsalz von ADP bekannt. Für diese* bekannte kristallisierte Salz ist jedoch eine überlegene Beständigkeit nicht bekannt und außerdem wird dort ausdrücklich darauf hingewiesen,

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daß es nicht gelungen ist, andere mono- oder divalente ADP-SaI-ze zu kristallisieren.

Die überlegene Beständigkeit des erfindungsgemäßen kristallisierten Salzes gegenüber dem handelsüblichen amorphen ADP-Na₃-SaIz zeigt nachstehende Tabelle.

	«ach	Präpa-	AMP	ATP	,56	Slach	1 Wo	ATP	,3	!Jach	2 Wo	ATP	,9	Nach	3 Wo-	ATP
		ration	1,7	0		ehe ]	bei	2		ehe η	bei	2		chen	bei	3,3
		ADP			,09	f 33«	³C		,09	f 33⁽	⁰C		,11	f 33	⁰C
	86,9	0,25	0	ADP	AMP	O	ADP	AMP	0	ADP		0,07
Amorphes			79,6	5,9	75,2	9,4	72,5
ADP-Na, Krist. ADP-K	87,7
		89,4	0,29	89,2	0,35	88,3
				AMP
		10,0

	0,72

Die in der obigen Tabelle angegebenen Zahlenwerte sind analytisch bestimmte Prozentgehalte.

Man erkennt daraus, daß im beschleunigten Alterungstest das erfindungsgemäße kristallisierte Salz praktisch keiner Zersetzung unterliegt, während beim bekannten amorphen Natriumsalz eine sehr deutliche Zersetzung auftritt.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung des kristallinen Kaliumsalzes von ADP. Dieses Verfahren besteht darin, daß man Adenosin-5'-diphosphorsäure in Form der freien Säure oder eines ihrer Salze in eine verdünnte, wäßrige Lösung des Kaliumsalzes überführt und bei einem pH-Wert von 1,4 bis 6, vorzugsweise 2,7 bis 2,9, mit einem wasserlöslichen organischen Lösungsmittel bis zur beginnenden Trübung versetzt und dabei so lange rührt, bis eine Kristallisation einsetzt, und nach Beendigung der Kristallisation die Kristalle isoliert oder daß man konzentrierte Lösungen der freien Säure und eines leichtlöslichen Kaliumsalzes mischt und das sich direkt bilden de Kristallisat gewinnt. Eine Kristallisation ist auch ohne

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Rühren möglich, allerdings ist dann ein erheblich größerer Zeitaufwand zur Restkristallisation erforderlich.

Vorzugsweise benutzt man als hydrophiles organisches Lösungsmittel Methanol im Verhältnis ADP-K-Lösung zu Lösungsmittel wie 1 : 0,2 bis 4, vorzugsweise 1 : 0,8 bis 2, arbeitet bis zur beginnenden Kristallisation bei konstanter Temperatur und erniedrigt anschließend bis zur vollständigen Kristallisation von ADP-K bis etwa O⁰C bis 4° C. Als konstante Temperatur wird Raumtemperatur bevorzugt.

Im allgemeinen hat die wäßrige ADP-K-Lösung vor der Kristallisation eine Konzentration von 1 bis 35 %, vorzugsweise 8 bis 12 %.

Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren können als hydrophile Lösungsmittel außerdem verwendet werden: niedere Alkenole, z. B. Äthanol, Propanol; Äther, z. B. Dioxan; Nitrile, z. B. Acetonitril, sowie Ketone wie Aceton und Mischungen der genannten Lösungsmittel.

Die verwendeten hydrophilen organischen Lösungsmittel müssen in Wasser in ausreichender Weise mischbar sein, so daß ein homogenes Wasser-Lösungsmittel-Gemisch-System zur Kristallisation von ADP-K erhalten werden kann.

Gewöhnlich ist die Kristallisation im wesentlichen 2 bis 40 Stunden nach der beginnenden Kristallbildung beendet, obwohl dies von der Art und Menge der in der Lösung vorliegenden Verunreinigungen, von der Art der wasserlöslichen organischen Lösungsmittel, von der Temperatur und dergleichen abhängt. Der Zusatz von Impfkristallen ist zur Beschleunigung der Kristallisation vorteilhaft und zwar besonders dann, wenn größere Mengen an Verunreinigungen wie AMP oder ATP in der Lösung vorhanden sind.

Außer in der oben beschriebenen Weise kann das erfindungsgemäße kristalline Salz von ADP auch aus reinem Wasser erhalten werden,

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wenn man die wäßrige Lösung bei einer Konzentration von 30 bis 100 % einige Zeit stehen läßt. Allerdings sind dabei größere Ausbeuteverluste festzustellen. Durch die Erfindung werden Kristalle geschaffen, die sich gegenüber den bisher bekannten amorphen Formen von ADP, wie ADP-Na₂ oder ADP-freie Säure, durch eine höhere Reinheit, sehr viel bessere Stabilität und keinerlei Hygroskopizität auszeichnen.

Eine weitere Möglichkeit ADP-K kristallin zu erhalten, besteht darin, eine wäßrige Lösung von ADP (freie Säure) mit der stöchiometrischen Menge KCl oder einem ähnlichen Kaliumsalz zu versetzen. Das hierbei anfallende kristalline ADP-K weist allerdings einen höheren Kristallwassergehalt auf.

Die nachfolgenden Beispiele erläutern die Erfindung. Beispiel 1

10 g ADP-freie Säure (99 %) werden in 70 ml entsalztem H₂O gelöst und unter Rühren mit verdünnter KOH auf pH = 2,8 eingestellt. Nach Verdünnen der Lösung auf 99 ml (Konzentration an ADP = 10 %) werden unter Rühren bei Raumtemperatur ca. 100 ml Methanol zugegeben, dabei wird die Lösung schwach trüb. Nach ca. 30 Minuten setzt die Kristallisation von ADP-K ein, die durch weiteren Zusatz von 50 ml Methanol innerhalb 1 Stunde vervollständigt wird. Anschließend wird die Mischung ohne Rühren über Nacht bei + 4°C (Kühlschrank) kaltgestellt. Nach ca. 20 Stunden wird das Kristallisat abgesaugt, in etwas Aceton gewaschen und im Vakuum ohne Trockenmittel getrocknet.

Die Ausbeute beträgt ca. 11 g ADP-K (95 % der Theorie). Beispiel 2

5 g kristallisiertes ADP-K werden in 55 ml H₂O gelöst (Konzen-

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tration an ADP-K = 9 %) und bei Raumtemperatur unter Rühren mit ca. 50 ml Acetonitril versetzt. Nach ca. 2 Stunden beginnt Kristallisation von ADP-K. Zur Vervollständigung der Kristallisation werden noch ca. 10 ml Acetonitril zugesetzt und die Suspension anschließend ohne Rühren in den Kühlschrank (+ 4°C) gegeben. Nach ca. 20 Stunden wird das Kristallisat abgesaugt, in etwas Aceton gewaschen und im Vakuum ohne Trockenmittel getrocknet.

Die Ausbeute beträgt ca. 4,5 g ADP-K (90 % der Theorie). Beispiel 3

55 ml einer 9 %-igen ADP-K-Lösung werden unter Rühren mit 40 ml Dioxan versetzt. Nach ca. 1 Stunde beginnt Kristallisation von ADP-K. Zur Vervollständigung der Kristallisation wird die Suspension 20 Stunden ohne Rühren bei + 4°C gelagert. Anschließend wird das Kristallisat abgesaugt, in wenig Aceton gewaschen und im Vakuum O.hne Trockenmittel getrocknet.

Die Ausbeute beträgt ca. 4,6 g ADP-K (93 % der Theorie). Beispiel 4

100 ml einer 10 %-igen ADP-K-Lösung werden mit ca. 80 ml Aceton unter Rühren bis zur Trübung versetzt. Nach ca. 6 Stunden beginnt ADP-K zu kristallisieren. Anschließend wird die Suspension ohne Rühren bei + 4°C kaltgestellt. Nach ca. 20 Stunden werden weitere 20 ml Aceton zugesetzt und das Kristallisat anschließend abgesaugt, in wenig Aceton gewaschen und im Vakuum ohne Trockenmittel getrocknet.

Die Ausbeute beträgt ca. 8,7 g ADP-K (87 % der Theorie).

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- ψ

Beispiel 5

2 g ADP als freie Säure werden in 10 ml H-O gelöst. Anschließend werden 350 mg KCl, in wenig H₂O gelöst, unter Rühren zugegeben. Nach ca. 15 Minuten beginnt Kristallisation von ADP-K, die nach etwa 1 Stunde beendet ist.

Das Kristallisat wird abgesaugt, in wenig Methanol und Aceton gewaschen und im Vakuum ohne Trockenmittel getrocknet.

Die Ausbeute beträgt ca. 2 g ADP-K (85 % der Theorie).

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Claims

Patentansprüche

1. Orthorhombisches Kaliumsalz von Adenosin-5'-diphosphorsäure mit der Raumgruppe P2..2..

2 und den Elementarzellenkonstanten

a = 28,53 + 0,03 8
b = 10,49 + 0,02 8
C= 6,33 + 0,02 8
Ok = β = V= 90,0°

Volumen = 1894,4 8 .

\2) Verfahren zur Herstellung eines kristallinen Kaliumsalzes von Adenosin-5'-diphosphorsäure, dadurch gekennzeichnet, daß man Adenosin-5'-diphosphorsäure in Form der freien Säure oder eines ihrer Salze in eine verdünnte wäßrige Lösung des Kaliumsalzes überführt und bei einem pH-Wert von 1,4 bis 6 mit einem wasserlöslichen organischen Lösungsmittel bis zur beginnenden Trübung versetzt und dabei so lange rührt, bis eine Kristallisation einsetzt, und nach Beendigung der Kristallisation die Kristalle abtrennt oder daß man konzentrierte Lösungen der freien Säure und eines leichtlöslichen Kaliumsalzes mischt und das sich direkt bildende Kristallisat gewinnt.

3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Lösung auf pH 2,7 bis 2,9 eingestellt wird.

4. Verfahren nach Anspruch 2 oder 3, dadurch gekennzeichnet, daß ein Verhältnis von ADP-Kaliumsalz-Lösung zu hydrophilem organischem Lösungsmittel von 1 : 0,2 bis 4 Vol.-Teile eingehalten wird.

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ORIGINAL INSPECTED

5. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Temperatur bis zur beginnenden Kristalli sation konstant gehalten und danach auf 0 bis 4°C herabgesetzt wird.

6. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß eine 1 bis 35 %-ige wäßrige ADP-Kalium-Lösung verwendet wird.

7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß eine 8 bis 12 %-ige wäßrige ADP-Kalium-Lösung verwendet wird.

8. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß als hydrophiles organisches Lösungsmittel ein niederer Alkanol, A'ther, Nitril oder Keton oder eine Mischung davon verwendet wird.

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