DE2702966B2

DE2702966B2 -

Info

Publication number: DE2702966B2
Application number: DE2702966A
Authority: DE
Inventors: Sho Inoue; Koji Joyo Kitaguchi; Akira Sano
Original assignee: Nippon Shinyaku Co Ltd
Current assignee: Nippon Shinyaku Co Ltd
Priority date: 1976-08-31
Filing date: 1977-01-25
Publication date: 1978-10-19
Also published as: ES454587A1; BE848940A; DK139523B; JPS5329912A; SE7613350L; DK139523C; NL167968B; PT66025A; PT66025B; DK563176A; ATA49777A; AT353433B; GB1537350A; CA1065847A; CH632773A5; NL167968C; NL7613900A; FR2364929B1; FR2364929A1; DE2702966C3

Description

Die Erfindung betrifft ein neuartiges Verfahren zur Gewinnung von Steringlykosiden aus Pflanzen.

Es ist bekannt, daß Steringlykoside zusammen mit Estern, bei denen die Fettsäure in 6-Stellung an den Zucker gebunden ist, in der Pflanzenwelt weit verbreitet sind. Steringlykoside sind gewöhnlich aus Glukose aufgebaut, wobei in Abhängigkeit von der Pflanzenart zwei oder mehrere Sterine gemischt vorliegen. Repräsentative Beispiele dafür sind Campesterin, Stigmasterin, jS-Sitosterin u. dgl.

Diese aus Pflanzen gewonnenen Steringlykoside sind wirksame blutstillende und blutgefäßverstärkende Mittel.

Der Gehalt an Stennglykosiden kann gewöhnlich weniger als 0,04% betragen, bezogen auf das Trockengewicht der Pflanzen. Jedoch enthalten die Ölkuchen, die bei der industriellen Gewinnung von Pflanzenölen anfallen, Steringlykoside in hoher Konzentration. Beispielsweise enthält Rohlecithin aus Sojabohnen die Steringlykoside in einer Menge von mehr als 3%, so daß es einen wertvollen Rohstoff für die Gewinnung von Steringlykosiden darstellt.

Die Steringlykoside können aus den Ölkuchen dadurch erhalten werden, daß das Rohlecithin der Sojabohnen unter Verwendung organischer Lösungsmittel, wie Aceton, Methanol, Äther, Pyridin usw., sukzessiv behandelt und gereinigt wird, oder daß die Ölkuchen in Methanol mit Kaliumhydroxid zersetzt werden, wonach durch Säulenchromatographie getrennt und gereinigt wird. Diese Verfahren sind jedoch zur Gewinnung großer Mengen von Steringlykosiden nicht wirkungsvoll und wirtschaftlich. Sie erfordern umständliche Arbeitsgänge und verschiedene Arten von organischen Lösungsmitteln, so daß sie für die Gewinnung von großen Mengen an Steringlykosiden nicht geeignet sind.

Deshalb ist es Aufgabe der Erfindung, ein Verfahren anzugeben, nach dem Steringlykoside aus den Ölkuchen durch einfache Arbeitsgänge, in guten Ausbeuten und in wirtschaftlicher Weise in großen Mengen gewonnen werden können. Hierfür wurde erfindungsgemäß intensiv ein Verfahren untersucht, bei dem die Ölkuchen in einer kleinen Menge Methanol auf übliche Weise erhitzt und zersetzt werden und bei dem die darin gelösten Steringlykoside direkt selektiv und in hoher Ausbeute ausgefällt werden.

Bei diesen Untersuchungen wurde eine bemerkenswerte Fällungsreaktion gefunden, bei der die Steringlykoside gemeinsam mit Carbonaten, wie Kaliumcarbonat, Natriumcarbonat, Kaliumbicarbonat oder adäquaten anorganischen Salzen, wie Kaliumnitrat, in einem organischen Lösungsmittel ausfallen.

Diese Fällungsreaktion ist für die Steringlykoside ganz spezifisch. Erfindungsgemäß wurde festgestellt, daß die Steringlykoside beim Erhitzen bevorzugt und vollständig ausgefällt werden, wenn beispielsweise Kaliumcarbonat unter Erhitzen in der alkalischen, alkoholischen Zersetzungsflüssigkeit der Ölkuchen, die große Mengen an Fettsäuresalzen und anderen Verunreinigungen enthalten kann, gelöst wird.

Im allgemeinen wird bei dem Verfahren der Erfindung zur Gewinnung der Steringlykoside aus den Ölkuchen so vorgegangen, daß die Ölkuchen in der

ίο drei- bis vierfachen Menge Methanol (bezogen auf das Ölkuchengewicht) in Gegenwart von Alkali zur Entfernung von Verunreinigungen erhitzt und zersetzt werden, wonach beispielsweise Kaliumcarbonat zugesetzt und schließlich einige Stunden lang erhitzt wird.

υ Das vereinigte Produkt aus Steringlykosiden und Kaliumcarbonat wird dann selektiv und vollständig ausgefällt, während die Lösung noch heiß ist. Das in den ausgefällten Steringlykosiden vorhandene Kaliumcarbonat wird dann durch Waschen mit Wasser oder

2Ii mit Methanol, das eine kleine Menge Essigsäure enthält, leicht herausgelöst und entfernt.

Die auf diese einfache Verfahrensweise erhaltenen Steringlykoside enthalten nur geringe Mengen an Verunreinigungen und zeichnen sich durch eine sehr

2·-, hohe Reinheit aus. Beispielsweise beträgt die Reinheit von aus Sojabohnenlecithin erhaltenen Steringlykosiden 98% oder mehr. Erforderlichenfalls können die erhaltenen Rohkristalle leicht durch nur einmaliges Umkristallisieren aus üblichen organischen Lösungs-

_JU mitteln, wie Alkoholen, Dioxan oder Pyridin, noch weiter gereinigt werden.

Beispiele für erfindungsgemäß zu verwendende organische Lösungsmittel sind niedere Alkohole, wie Methanol, Äthanol und Propanol. Jedoch ist vom

J₅ Standpunkt der Wirtschaftlichkeit und der Löslichkeil der Carbonate aus gesehen Methanol am besten geeignet. Das verwendete Lösungsmittel kann zurückgewonnen und unverzüglich erneut eingesetzt werden. Wie vorstehend im einzelnen erläutert wurde, machl es die Erfindung möglich, die Steringlykoside in hohei Ausbeute und hoher Reinheit auf wirtschaftliche Weise durch einen einfachen Arbeitsgang, wie er bisher nichi möglich war, zuverlässig und in kurzer Zeit zu gewinnen.

Die nachfolgenden Beispiele veranschaulichen die Gewinnung von Steringlykosiden aus handelsüblichem Sojabohnenlecithin im einzelnen.

Beispiel 1

10 kg handelsübliches Sojabohnenlecithin wurde mil 401 Methanol vermischt, dem 1,6 kg Kaliumhydroxic beigefügt waren. Das Gemisch wurde bei Siedetemperatur drei Stunden lang erhitzt und gerührt, wonach die Verunreinigungen entfernt wurden, so lange das Gemisch noch heiß war. Das Gemisch wurde mii 0,5 kg wasserfreiem Kaliumcarbonat versetzt, und da: Ganze wurde bei Siedetemperatur weitere fünf Stunder lang erhitzt und gerührt. Die ausgefällten Kristalle wurden zusammen mit Kaliumcarbonat abfiltriert, se

ho lange das Gemisch noch heiß war, und zur Entfernung von noch anhaftender Reaktionsflüssigkeit mit einei kleinen Menge Methanol gewaschen. Dann wurde da; Produkt zur Entfernung des Kaliumcarbonats aus reichend mit Wasser gewaschen und getrocknet, wöbe

_b5 315 g Rohkristalle erhalten wurden. Die Rohkristallf wurden aus 101 Dioxan umkristallisiert, wobei 300 ( gereinigtes Steringlykosid in einer Ausbeute von 3°/ erhalten wurden (Fp. 274 C", Zers.). Die Dünnschicht

Chromatographie (Silikagel) ergab einen einzigen Fleck bei R_r 0,4 (Benzol: Äthanol = 5:1).

Elementaranalyse für CjSH₆₀O₆:

Berechnet: C = 72,85%, H = 10,49%;
gefunden: C = 72,26%, H = 10,29%.

Tabelle 1

Verbindung

ED₅₀ (mg/kg)
i.v. i. p.

p.o.

Beispiel 2

100 kg handelsübliches Sojabohnenlecithin wurden mit 500: Methanol vermischt, in dem 16 kg Kaliumhydroxid gelöst waren. Das Gemisch wurde bei Siedetemperatur drei Stunden lang erhitzt und gerührt, wonach die Verunreinigungen aus dem noch heißen Gemisch entfernt wurden. Dann wurde das Gemisch mit 5 kg Natriumhydrogencarbonat varsetzt und weitere fünf Stunden lang bei Siedetemperatur erhitzt und gerührt. Die ausgefallenen Kristalle wurden gemeinsam mit dem Natriumhydrogencarbonat abfiltriert, so lange das Gemisch noch heiß war, und zur Entfernung von noch anhaftender Reaktionsflüssigkeit mit einer kleinen Menge Methanol gewaschen. Dann wurde das Produkt zum Entfernen des Natriumhydrogencarbonats ausreichend mit Wasser gewaschen und getrocknet, wobei 3,1 kg Rohkristalle erhalten wurden. Diese wurden aus 1001 Dioxan umkristallisiert, wobei 3,0 kg gereinigtes Steringlykosid in einer Ausbeute von 3% erhalten wurden (Fp. 274 C, Zers.). Die Dünnschichtchromatographie (Silikagel) ergab einen einzelnen Fleck bei R_r 0,4 (Benzol: Äthanol = 5:1).

Elementaranalyse:
C --■ 72,14%, H = 10,29%.

Die hämostatische Wirksamkeit der erfindungsgemäß hergestellten Steryl-^ß-D-glukoside (SG) kann nach der Methode von Motohashi et al. (Tokyo Jikeikai Medical College Bulletin 75 [5], 1959) durch scharfe Amputation einer 1 cm langen Schwanzspitze von in Gruppen von je zehn Tieren eingeteilten Mäusen und Messen der Zeit, die vergeht, bis das fadenartige Bluten aus dem amputierten Schwanzende in Wasser vollständig beendet ist, ermittelt werden. Die erhaltenen Ergebnisse sind zusammen mit denen, die von bekannten hämostatischen Mitteln erhalten wurden, in der folgenden Tabelle zusammengestellt:

SG 0,082

Carbazochromnatrium- 3,6
sulfonat (Adona AC-17)
Konjugiertes Östrogen 14,5

(Premal.in)

0,110
5,4

1,66
36,0

Wie diese Ergebnisse zeigen, war SG etwa 45mal wirksamer bei intravenöser und intraperitonealer Verabreichung und etwa 22mal wirksamer bei peroraler Gabe als das Vergleichsmittel Carbazochromnatriumsulfonat und etwa 177mal wirksamer bei intravenöser Verabreichung als konjugiertes Östrogen (vgl. Literatur: Wallner et al., Med. Klin. 66, 1413 [1971]). Die überraschend gute gefäßstabilisierende Wirksamkeit der erfindungsgemäß hergestellten Verbindungen kann ebenfalls durch eine Reihe von anerkannten Methoden nachgewiesen werden. Eine davon wird nachstehend erläutert:
Der Grad der Pulmonarhämorrhagie bei Mäusen unter vermindertem Druck von 50±5mm Hg/15 see wurde nach der Kerbmethode (scoring method) ermittelt, wobei der ED₅₀-Wert von SG aus dem Verhältnis der Inhibitionsrate bei behandelten Tieren zu dem der VeTgleichsgruppe gemäß der Methode von

G. J. Mojovski et al. (J. Pharmacol. Exp. Therap. 80,1 [1944]) berechnet wurde.
Tabelle 2

Verbindung

ED₅₀ (mg/kg)
i.v. i.p.

p.o.

SG	2,00	1,70	58,0
Carbazochromnatrium-	80,0	112,0	400,0
sulfonat

Konjugiertes Östrogen

100,0

SG war demnach mehr als 40mal wirksamer bei intravenöser Verabreichung, etwa 55mal wirksamer bei intraperitonealer Verabreichung und mehr als 7mal wirksamer bei peroraler Verabreichung als Carbazochromnatriumsulfonat und mehr als 50mal wirksamer bei intraperitonealer Verabreichung als konjugiertes Östrogen.

Claims

27 02 968

Patentanspruch:

Verfahren zur Gewinnung von Steringlykosiden aus Pflanzen, dadurchgekennzeichnet, daß die Steringlykoside gemeinsam mit Carbonaten, wie Kaliumcarbonat oder Natriumhydrogencarbonat, oder mit gleichartig wirkenden anorganischen Salzen in einem organischen Lösungsmittel ausgefällt werden.