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7erfailren zum Gewinnen von hochgradig reinen
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Steringlykosiden Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Gewinnen
von einzelnen Steringlykosiden aus einem Gemisch von Steringlykosiden, die aus Naturstoffen
herstammen, wobei die Einzelglykoside rasch und in großer Menge erhalten werden.
Die erfindungsgemäß gewonnenen Stoffe sind hämostatisch und blutgefäßaabdichtend
wirksam, so daß sie nützliche Arzneimittel darstellen.
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Wie bereits gut bekannt ist, ist der in Steringlykosiden, die aus
Naturstoffen herstammen, eingebaute Zucker im allgemeinen Glukose, während das eingebaute
Sterin üblicherweise zu einer Gruppe von Sterinen mit außerordentlich ähnlicher
Struktur gehört, wie es bei natürlich vorkommenden freien Sterinen der Fall ist.
In Form von vollständig reinen Einzelverbindungen sind diese Steringlykoside bisher
noch nicht in Betracht gezogen worden.
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In der Vergangenheit ist zwar berichtet worden, daß aus bestimmten
Pflanzen isolierte Stoffe in Form einzelner Steringlykoside vorliegen würden, aber
inzwischen konnte aufgrund neuerer Forschungen sichergestellt werden (durch Gaschromatographie-Massenspektrometrie),
daß diese Substanzen ausnahmslos verschiedene Arten von Steringlykosiden enthalten.
Da die die Steringlykoside aufbauenden Sterine außerordentlich ähnliche Strukturen
haben, wie vorstehend schon gesagt wurde, haben es die bisher angewandten Reinigungsmethoden,
wie Umkristallisieren, verschiedene Arten der Flüssigkeitschromatographie, Fällungsreaktionen
mit Alkalimetallsalzen usw., lediglich möglich gemacht, ein Gemisch von Steringlykosiden
von anderen Stoffen
abzutrennen, die mit ihnen vermischt sind, aber
diese Methoden sind in bezug auf die Trennung der Steringlykoside voneinander völlig
wirkungslos. Deshalb war es bisher ein Problem, ein Gemisch von Steringlykosiden,
die von Naturstoffen herstammen, voneinander zu trennen und die einzelnen Steringlykoside
rein zu erhalten, wenn auch nur in geringster Menge, und es gibt bisher nicht das
kleinste Beispiel für Erfolg. Deshalb ist es Aufgabe der Erfindung, diese schwierige
Situation zu bewältigen und ein Verfahren anzugeben, mit dem es möglich ist, wahlweise
einzelne Steringlykoside nach Wunsch in hoher Reinheit und in wirtschaftlicher Weise
zu gewinnen.
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Die Erfindung wird nachstehend in der Reihenfolge der Herstellungsstufen
im einzelnen erläutert.
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1) Auswahl des Ausgangsstoffes Um ein bestimmtes Steringlykosid mit
Sicherheit in hoher Reinheit und großer Ausbeute abzutrennen und zu gewinnen, ist
es notwendig, die Arten und die Anteile der jeweiligen Bestandteile eines Steringlykosidgemisches
in dem ins Auge gefaßten Ausgangsmaterial genau zu kennen, weil selbst dann, wenn
die vorstehend erläuterte Flüssigkeitschromatographie angewandt wird, nur mit Einschränkungen
eine strikte Trennung erzielbar ist. Deshalb ist es notwendig, schon vor der Flüssigkeitschromatographie
ein Ausgangsmaterial auszuwählen, das keine Steringlykosidarten enthält, die von
dem gewünschten Steringlykosid schwierig zu trennen sind. Die Zusammensetzung von
Steringlykosidgemischen, die aus Naturstoffen herstammen, wird durch die Art des
jeweiligen Naturstoffes bestimmt, so daß auch die Arten und die Zusammensetzungen
unbegrenzt veränderlich und verteilt sind. Deshalb ist es trotz der Tatsache, daß
die Auftrennung mittels Flüssigkeitschromatographie Einschränkungen unterworfen
ist, möglich, durch Auswahl eines geeigneten Ausgangsstoffes alle Arten von Steringlykosiden
aus Naturstoffen zu isolieren.
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In Abhängigkeit von dem gewünschten Steringlykosid ist eine genaue
Analyse der Steringlykoside bei einer Anzahl von Ausgangsstoffen notwendig, um dasjenige
Ausgangsmaterial herauszufinden, das genau für den jeweiligen Zweck am geeignetsten
ist. Erfindungsgemäß konnte ein Verfahren entwickelt werden, nach dem die Sterinarten
und -anteile in den Steringlykosiden des Ausgangsstoffes auf einfache Weise, genau
und in kurzer Zeit ermittelt werden können, so daß das vorstehend erläuterte Problem
durch die Erfindung gelöst werden konnte.
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Die Erfindung beruht auf der Feststellung, daß die Arten und Anteile
an freien Sterinen, die in einer jeweiligen Probe stets neben den Steringlykosiden
vorliegen, genau mit denen der vorhandenen Steringlykoside übereinstimmen. Bisher
ist beispielsweise die Analyse eines Steringlykosidgemisches in einer Pflanze so
durchgeführt worden, daß zznächst das Steringlykosidgemisch extrahiert, abgetrennt,
gereinigt und danach in einem Alkohol der Zersetzung mit Säure unterzogen wurde.
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Die dabei erhaltenen freien Sterine wurden analysiert. Eine solche
Methode ist aber nicht nur mühsam im Ablauf und langwierig, sondern hat auch einen
entscheidenden Nachteil dahingehend, daß manche Sterine während der Säurebehandlung
zersetzt und andere wieder isomerisiert werden, so daß es unmöglih ist genau festzustellen,
welche Steringlykoside nun tatsächlich ursprünglich anwesend waren. Eeispielsweise
verwandeln sich 24(28)-Sterine, die in der Natur ziemlich weit verbreitet sind,
in Verbindungen, bei denen eine Doppelbindung verschoben ist, wie nachstehend erläutert
ist:
| 24(28) H+ ~\ 50 % 23<24) n24(25) |
| Alkohol + 50 ro , |
Somit wurde immer wieder über Ergebnisse berichtet, die den Anschein
erweckten, daß ein Unterschied bestünde zwischen den freien Sterinen und den Steringlykosiden
in derselben Pflanzenart. Wie jedoch nachstehend erläutert werden wird, ist aber
gemäß der direkten Analysemethode, wie sie erfindungsgemäß entwickelt wurde, ein
genauer Vergleich in bezug auf beide Sterine möglich, und die Ergebnisse dieser
Studien anhand einer Anzahl von Pflanzen sicherten erstmals klar, daß die Arten
und die Zusammensetzungen von beiden Sterinen genau übereinstimmen. In der folgenden
Tabelle 1 sind die Untersuchungsergebnisse, die mit einer Reihe von Ausgangsmaterialien,
wie Weizen usw., erhalten wurden, zusammengestellt.
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Tabelle 1 Campe- Stigma- ß-Sito- 24-Methylen- Avenasterin sterin
sterin cholesterin sterin Weizen F. 22 % - 72 % 1 % 5 % G. 20 % - 75 % 1 % 4 % Reis
F. 18 % 15 % 63 % 1 % 3 % G. 15 % 17 % 65 % 0,5 % 2,5 % Mais F. 23 % 7 % 66 % 1
% 3 % G. 20 % 9 % 68 % 1 % 2 % Soja- F. 22 % 20 % 54 % 1 % 3 % bohnen G. 23 % 19
% 55 % 1 % 2 % Kapok F. 9 % 8 % 80 % 0,5 % 2,5 % G. 10 % 9 % 78 % 0,5 % 2,5 % Baum-
F. 4 % - 95 % - 1 % woll- G. 4 % - 95 % -1@ saat Kaffee- F. 20 % 21 % 54 % 1 % 4
% bohnen G. 17 % 22 % 57 % 1 % 3 % Anmerkungen: F. = Freies Sterin G. = Steringlykosid
Die Analyse der freien Sterine erfordert keine besondere Behandlung, wie Säurezersetzung
usw., wie es bei den Steringlykosiden der Fall ist, und auch kleinste Probenmengen
erlauben ohne besondere Reinigung mit Hilfe von Gaschromatographie-tlassenspektrometrie
usw. in kurzer Zeit eine genaue Analyse, so daß man aufgrund der Analysenergebnisse
der freien Sterine sehr schnell in die Lage versetzt wird zu entscheiden, ob sich
das jeweilige Ausgangsmaterial zum Isoleren des gewünschten Steringlykosids eignet
oder nicht. In der Praxis ist es bei der
Entscheidung darüber, ob
das Ausgangsmaterial geeignet ist oder nicht, von grundlegender Bedeutung, ob #
- und Steringlykoside im Gemisch vorliegen oder nicht. Im Fall beispielsweise, wo
die Isolierung von 4 -Steringlykosiden angestrebt wird, sollte ein Ausgangsmaterial
ausgewählt werden, das nahezu keine ti7-Steringlykoside enthält, während für die
Isolierung von A7-Steringlykosiden ein Ausgangsmaterial nahezu ohne tS5-Steringlykoside
eingesetzt werden sollte, wie bei einer Reihe von Cucurbitaceae-Pflanzen usw.
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Im Falle vonPflanzen, deren Sterinzusammensetzung bereits ausreichend
untersucht ist, ist es möglich, diese Ergebnisse für die Auswahl eines Ausgangsstoffes
zugrunde zu legen, aber im Falle der vorliegenden Erfindung, wo die Isolierung hochreiner
Steringlykoside angestrebt wird, sollten verschiedene Arten von Steringlykosiden,
die schwierig zu trennen sind, nicht enthalten sein, selbst wenn ihre Menge 1 0
oder weniger beträgt, und selbst im Falle der Isolierung von repräsentativen Steringlykosiden,
wie sie nachstehend noch erläutert sind, sind die Ausgangsstoffe strikt gemäß den
vorstehenden Maßnahmen zur Lösung der gestellten Aufgabe ausgewählt.
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Von der Wirtschaftlichkeit her gesehen sind alle Ausgangsstoffe, die
von Naturstoffen herstammen und bereits kommerziell verarbetet werden, geeignet.
Auch eine große Anzahl anderer Stoffe, die leicht zugänglich sind, wie Ölpreßkuchen,
nutzlose Abfallstoffe, Nebenprodukte usw., können eingesetzt werden.
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2) Trennung eines Gemisches von Steringlykosiden und ihre Acetylierung
Die Abtrennung eines Gemisches von Steringlykosiden aus einem Ausgangsmaterial kann
nach bekannten Methoden vorgenommen werden, und es ist auch möglich, sie leicht
in hoher Reinheit mittels einer spezifischen Fällungsreaktion zwischen den
Steringlykosiden
und Alkalimetallcarbonat in einem niederen Alkohol zu gewinnen, (vgl. japanische
Patentanmeldung No. 9996/1975). Wenn auch Steringlykoside in den üblichen organischen
Lösungsmitteln schwer löslich sind, so werden docn zahlreiche der üblichen organischen
Lösungsmittel verwendbar, wenn man die Steringlykoside auf übliche weise in ihre
Tetraacetate umwandelt. Es wird so auch möglich, die Gruppe der bei der vlüssigkeitscilromatoÖraphie
als bewegliche In hasse verwendeten Flüssigkeiten zu vergrößern.
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3) Trennung eines Gemisches von Steringlykosidtetraacetaten mittels
Flüssigkeitschromatographie Wie vorstehend bereits erläutert wurde, gab es bisher
keine wirksamen Mittel, um ein Gemisch von Steringl ykosiden voneinandern zu trennen,
vielmehr war eine solche Auftrennung außerordentlich schwierig, aber erfindungsgemäß
wurden t.7ethoden zum Auftrennen von Steringlykosiden voneinander mittels einer
Flüssigkeitschromatographiemethode gefunden, und es ist möglich, mittels dieser
Methode ein Gemisch aus Steringlykosidtetraacetaten unter verschiedenen Bedingungen
zu trennen. Es hat sic herausgestellt, daß für die stationäre Phase, die die Trennung
bewirkt, Silikagel, silbernitratgetränktes Silikagel, Magnesiumoxid, Tonerde, Florisil
usw. dieselbe Trennfähigkeit haben wie gegenüber den freien Sterinen, und auch bei
Steringlykosiden wird die Trennung sehr effektiv durchgeführt, die im wesentlichen
auf den Unterschiedenen in den Strukturen der verschiedenen Sterine beruht.
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Die vorstehend genannte stationäre Phase kann für die Trennung von
Steringlykosiden auf genau dieselbe Weise wie bisher für freie Sterine durch Auswahl
eines geeigneten Lösungsmittels als bewegliche Phase verwendet werden.
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Erfindungsgemäß wurden auch die Trennbedingungen untersucht, die eine
leichtere und schnellere Trennung herbeiführen, und es wurde eine Trennmethode mittels
@ochleitungsflüssigkeitschromatographie gefunden, bei der ein stabiles mikrofeines
Silikagel-ODS (ein material, das durch chemische Bindung von Cctadecylgruppen an
Silikagel erhalten wird) als stationäre Phase und ein einziges Lösungsmittel, wie
Methanol, cetonitril usw., als bewegliche Phase verwendet wird. So wurde es erstmals
möglich, Cinolesteringlukosid, Brassicasteringlukoisd, Campsteringlukosid, Stigmasteringlukosid,
ß-Sitosteringlukosid und #7-Steringlukoside und die entsprechenden Reduktionsprodukte
aus Steringlykosidgemischen, die aus Naturstoffen herstammen, zu isolieren. Bine
solche Trennung ist mit den bisher bekannten Maßnahmen unmöglich gewesen. Ein Beispiel
für ein Hochleistungsflüssigkeitschromatogramm von Steringlykosidtetraacetaten,
wie es unter diesen Bedingungen aus Soialecithin erhalten wird, ist in der Figur
der beigefügten Zeichnung dargestellt.
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In dieser Figur gibt die Abszisse die Eluierzeit und die Ordinate
die Höhe einer Spitze an. Die Bedingungen waren wie folgt: Säule: Silikagel-ODS
(4 mm x 30 cm) Durchgegossene Probenmenge: 1 mg Bewegliche Phase: Acetonitril Druck:
50 kg/cm2 Durchflußmenge: 1,3 ml/min Detektor: Refraktometer Meßtemperatur: 25°C
Bedeutung der Kurvenspitzen: 1 = 24-Methylencholesteringlukosidtetraacetat 2 = avenasteringlukosidtetraacetat
3 = Stigmasteringlukosidtetraacetat 4 = Campesteringlukosidtetraacetat 5 = ß-Sitosteringlukosidtetraacetat
6 = Stigmasteringlukosidtetraacetat
Außerem ist diese Trennung
gemäß Hochleistungsflüssigkeitschromatographie mit allen Vorteilen ausgestattet,
die im großtechnischen @a@stab erforderlich sind, so daß eine Gewinnung auch aus
wirtschaftlicher Sicht möglich ist 4) Entacetylierung Wenn das erhaltene einzelne
Steringlykosidtetraacetat einer alkalischen Alkoholbehandlung auf übliche Weise
unterzogen wird, wird ein entacetyliertes, schwerlösliches Steringlykosid quantitativ
aus dem Alkohol ausgefällt, und es ist möglich, das angestrebte Steringlykosid rein
zu erhalten.
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Nachfolgend wird in Beispiel 1 die Isolierung von drei Arten ,on Steringlykosiden
erläutert, die in der Natur weit verbreitet sind, und in Beispiel 2 wird die Abtrennung
von kleinste Mengen von Steringlykosiden beschrieben.
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Beispiel 1 Isolierung von ß-Sitosteringlukosid (I), Stigmasterin-(lukosid
(II) und Campesteringlukosid (III) Bei den Acetonextrakten von etwa 10 Arten von
Pflanzen wurden die Gehalte an freien Sterinen mittels Gaschromatographie-Massenspektrometrie
analysiert, und Pflanzen, die nahezu kein #7-Steringlykosid enthielten, wie Kapoksaat,
Sojabohnen, Oliven, Mais und Weizen usw., wurden als für die Isolierung von (I)
geeignetes Ausgangsmaterial ausgewählt; Kartoffeln, die nahezu kein (III) enthalten,
welches schwierig mittels Hochleistungsflüssigkeitschromatographie abzutrennen ist,
wurde als Ausgangsmaterial für die Isolierung von (II) ausgewahlt; und Weizenkeime,
die nahezu kein (II) enthalten, wurden als Ausgangsmaterial für die Isolierung von
(III) ausgewählt.
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Diese Ausgangsmaterialien wurden nach der folgenden Prozedur die allen
gemeinsam ist, jeweils behandelt: Das entfettete und getrocknete Rohmaterial wurde
zweimal mit dem zweifachen Volumen Aceton extrahiert, bezogen auf das Gewicht des
Ausgangsmaterials, und dann das Aceton abdestilliert.
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10 % KOH enthaltendes Methanol in einer Menge des 20-fachen Volumens,
bezogen auf das Gewicht des Rückstandes, wurde zuge fügt. Nachdem 1 Stunde lang
am Rückfluß erhitzt worden war, wurde K2CO3 bis zur Sättigung zugesetzt, und danach
wurde nochmais 3 Stunden am Rückfluß erhitzt. Der erhaltene Niederschlag wurde mit
Methanol und dann nit Wasser gewaschen und getrocknet, wobei ein Gemisch von hochgradig
reinen Steringlykosiden erhalten vurde, welches dann mit Essigsäureanhydrid in Pyridin
auf übliche Weise in die Tetraacetate umgewandelt wurde. Die Tetraacetate wurden
als Proben für die Trennung mittels Hochleistungsflüssigkeitschromatographie verwendet.
Dabei herrschten folgende Bedingungen: Stationäre Phase: Silikagel-ODS (5/u) Säule:
10 mm x 30 cm Bewegliche Phase: Acetonitril (Durchflußmenge 10 ml/min) Unter diesen
Bedingungen ist für eine einmalige Behandlung von 0,1 g Probe eine Zeit von bis
zu 10 Minuten erforderlich.
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Bei einer solchen einmaligen Trennung konnte ie gewünschte Substanz
ohne jeglichen Verlust vollständig von den anderen Substanzen isoliert werden Die
den isolierten (I) bis (III) entsprechenden Tetraacetate sind zusammen mit dem gemäß
Beispiel 2 erhaltenen in Tabelle 2 erläutert.
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Durch Hydrolysieren der Tetraacetate mit 5 % KOH enthaltendem Methanol
konnten die Steringlykoside quantitativ aus Methanol ausgefällt und rein erhalten
werden.
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Leispiel -Abtrennung von 24-Methylencholesteringlukosid (IV) und Avenasteringlukosid
(V) (IV) unc; (V) liegen im allgemeinen in kleinen Mengen inSteringlykolsidgemischen
vor. bei diesem Beispiel wurde ein handelsübliches Sijalecithin als Ausgangsmaterial
vorwendet, und die Steringlykoside wurden daraus durch fällung mit K2CO3 in Methanol
abgetrennt (vgl. japanische Patentanmeldung 9996/1975), gereinigt und außerdem in
die Tetraacetate umgewandelt. Die darin enthalten Substanzen (IV) und (V) können
direkt durch jlochleistungsflüssigkeitschromatographie abgetrennt werden, jedoch
nur mit sehr geringer Wirksamkeit. So wurden sie säulenchromatographie unter Anwendung
von silbernitratgetränktem Silikagel als stationärer Phase behandelt, und die Hauptsteringlykoside
(I) bis (III), die anfänglich ausfiossen, wurden entfernt zur Gewinnung eines Gemisches,
das hauptsächlich aus den Tetraacetaten von (IV) und (V) allein bestand, welche
dann als Proben für die Hochleistungsflüssigkeitschromatographie verwendet wurden.
Bei der säulenchromatographischen Trennung mit silbernitratgetränktem Silikagel
wurde ein mit $;? % Silbernitrat getränktes Silikagel (4 cm s 4, cm) als stationäre
Phase und Chloroform/Cyclohexan (5:1) als bewegliche Phase (Lösungsmittel) verwendet.
Es wurden 5 g Probe auf einmal behandelt, wobei etwa 1 g eines Tetraacetatgemisches
von (IV) und (V) aus 25 g Probe erhalten wurde. AUsgehend von diesem Gemisch wurden
dann (IV) und (V) mittels Hochleistungsflüssigkeitschromatographie unter den in
Beispiel 1 beschriebenen Bedingungen voneinander getrennt.
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Außerdem wurde durch Hochleistungsflüssigkeitschromatographie und
Gaschromatographie festgestellt, daß die Reinheit von (IV) 99 % oder mehr und die
von (V) 97 97 oder mehr betrug. Die abgetrennten Tetraacetate sind in Tabelle 2
zusammengestellt. Sie konnten auf einfache Weise mit 5 , KOI enthaltendem Methanol
entacetyliert
werden, wobei in quantitativer Ausbeute die entsprechenden Steringlykoside ausgefillt
wurden.
Tabelle 2 Bei den isolierten Tetraacetaten ermittelte Werte
Isolierte Ausbeute Schmelz- Elementaranalyse **) Reinheit, ermittelt durch Substanz
(g) *) punkt @ochleistungsflüssigkeits-C H chromatographie und Gas-(°C) chromatographie
ß-Sitosterin- 69,48 9,@1 175-177 99 % oder mehr glukosid 69,32 9,2@ Stigma- 0,40
128-130 39,60 @,9@ " sterin- 69,54 8,89 glukosid Campe- 0,18 172-174 68,97 9,29
" sterin- 39,01 9,10 glukosid 24-Methylenchole- 0,41 166-163 69,03 @,98 " sterin-
69,23 9,90 glukosid Avena- 0,48 181-183 60,32 9,14 97 % oder mehr sterin- 69,54
8,39 glukosid *) Ausbeute, erhalten durch Behandeln von 1 g Probe mittels Nochleistungsflüssigkeitschromatographie
**) Oberer Wert: Gefunden, Unterer Wert: Berechnet.