DE1920177C - Verfahren zur Gewinnung von Cymann - Google Patents

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren lur Herstellung von Cymarin hohen Reinheitsgrades.

Cymarin wird als oral resorbierbares Strophantus-Glykosid in der Therapie von Herzkrankheiten eingeletzt. Technisch wird es hauptsächlich aus dem Samen

H₃C H

OHC

o-

OH

OH

von Strophantus kombe gewonnen; es entsteht bei der Fermentation der Samen durch Einwirkung der im Samen enthaltenen Strophanthobiase aurk-Strophantosid bzw. k-Strophanthin-,/. Has Aglykon dieser drei. Glykoside ist k-Strophantidin.

/=O

Cymarose

/f-Glukose

»ι-Glukose

Säure Strophantho- «-Glukosidase

biase

V Cymarin

k-Strophanthin-/f

k-Strophantosid

Im Extrakt der Strophantus-kombe-Fermentation sind neben Cymarin noch andere, diesem strukturell sehr ähnliche Cardenolide enthalten. Der Anteil dieser — in vorliegendem Fall unerwünschten — Glykoside Cymarol, Emicymarin und Periplocymarin ist in verschiedenen Samenlieferungen unterschiedlich, er kann über 50% betragen (W. B 1 ο m e, A. K a t ζ und T. Reichstein, Pharm. Acta HeIv., 21, 325 (1946).

Hf If

R₁ = D-Cymarose, R₂ = CH₂OH .Cymarol R ι = D-Digitalose, R₂ = CH₃: Emicymarin R, = D-Cymarose, R₂ = CH₃: Periplocymarin

Außerdem kommen im Glykosid-Extrakt noch wechselnde Mengen dersogenanntenAllo-Cardenolide vor. Diese Verbindungen sind Isomere der natürlichen Herzglykoside, sie entstehen während der Fermentation durch Umlagerung des Cardenolid-Ringes am Cn aus der //- in die u-Stellung unter dem Einfluß eines im Samen enthaltenen Allomerisierungs-Fcrmentes,

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Das bei der Fermentation der Strophantus-kombe-

Samen anfallende Glykosidgemisch besteht also aus Cymarin, Cymarol, Emicymarin, Periplocymarin sowie den entsprechenden Alloverbindungen dieser Monoglykoside. Außerdem können noch geringe Mengen der natürlichen Di- und Trisaccharide dieser Verbindungen sowie ihre Aglykone Strophantidin. Strophanthidol und Periplogenin vorhanden sein.

Da alle diese Stoffe sehr ähnliche physikalische und chemische Eigenschaften besitzen, ist die Reindarstellung des allein verwertbaren Cymarins mit be- sonderen Schwierigkeiten verbunden. Die im Handel befindlichen Cymarinpräparate enthärten noch etwa 15 bis 20% andere Cardenolide.

Die Begieitglykoside des Cymarins unterscheiden sich in ihrer physiologischen Wirkung vom Cymarin

z. B. durch ihre therapeutische Breite, ihre Resorptionsgeschwindigkeit und -quote bei oraler Verabreichung, durch die Geschwindigkeit des Wirkungseintritts, die Wirkungsintensität sowie durch die Geschwindigkeit der Ausscheidung bzw. des Abbaues und die Neigung zur Kumulation. Für die Therapie müßte deshalb die Möglichkeit der Verwendung eines exakt dosierbaren reinen Cymarins an Stelle des üblichen Glykosid- und Aglykongemischcs als großer Vorteil bezeichnet werden. Diese Forderung scheiterte

fro jedoch bisher an dem Fehlen eines technisch durchführbaren Verfahrens zur Herstellung von reinem Cymarin aus Strophantus kombc.

In der Patentliteratuf ist bereits ein Verfahren zur Gewinnung von gereinigtem Cymarin aus den Wurzein von Apocynumcanabinum L. (Kanadischer Hanf) beschrjeben (DL-Patentschrift 35 688). Dieses Verfahren beruht auf der Anwendung einer multiplikativen O'Keeffe·Verteilung. Angaben hinsichtlich der

Reinheit des derart erhältlichen Cymarins wurden nicht gemacht. In dieser Patentschrift wird aber ausgeführt, daß die Trennkapazität von AI₂O, zur Abtrennung von Cymarin nicht ausreicht.

Demgegenüber betrifft nun die Erfindung ein Verfahren zur Gewinnung von Cymarin mit einem Reinheitsgrad von über 99,5% aus einer Lösung von Rohcymarin, das durch Umkristallisation aus Methanol des rohen Glykosidgemisches nach der Fermentation von Strophantus-kombe-Samen gewonnen worden ist, dadurch gekennzeichnet, daß man das Rohcymarin in Chloroform oder in Mischungen aus Chloroform mit Lösungsmitteln, die diesem in der eluotropen Reihe benachbart sind, gelöst an Aluminiumoxid nach brockmann, Aktivitätsstufe 11 bis 111, chromatographiert.

Die Hauptverunreinigungen sind Allocymarin, Cymarol. 10-,,;- Hydroxy- 19-norperipiogenin-cymaiosid und Cymary!säure. Während die ersten beiden Verbindungen Primärprodukte der Fermentation sind, entstehen die beiden letzten während der Fermentation und Aufarbeitung.

Die CtQ-Oxo-cardenolide besitzen in Lösung eine ausgeprägte Neigung zur Autoxydation (J. B i η k e r t, E. A η g 1 i k e r und A. von Wartburg, HeIv. Chim. Acta, XLV, 2122 [1962]). Die Geschwindigkeit dieser Autoxydation ist beim Cymarin besonders groß, größer als beispielsweise beim Strophantidin und beim ConvaUatoxin. Die Autoxydation findet in allen gebräuchlicnen Lösungsmitteln und auch in Wasser statt. Ihre Geschvindig' iit ist zwar in den einzelnen Lösungsmitteln unterschiedlich, jedoch immer relativ hoch. So entstehe:, in einer l%igen Lösung von Cymarin in Chloroform bei freiem Luftzutritt nach 8 Stunden schon etwa 1 % und nach 24 Stunden bereits etwa 20% Oxydationsprodukte. Die Autoxydation läßt sich durch typische Antioxydantien. wie Butylhydroxyanisol und Hydrochinon, hemmen. Bei der Reindarstellung des Cymarins sind also nicht nur die vorhandenen Begleitglykoside ?u entfernen, sondern es gilt insbesondere die Bildung neuer Verunreinigungen zu vermeiden. Aus den gewonnenen Erkenntnissen ergibt sich in bezug auf die säulenchromatographische Reinigung des Cymarins im technischen Maßstab die Forderung, daß die Strophantus-glykoside nur solange wie unbedingt nötig in Lösung gehalten werden dürfen.

Das nach der Fermentation der Strophantuskombe-Samen anfallende Rohglykosidgemisch wird in an sich bekannter Weise aus Methanol umkristallisiert, wodurch ein etwa 80%iges Rohcymarin erhalten wird, das in seiner Zusammensetzung dem Cymarin des Handels entspricht.

Vorzugsweise wird dann im einzelnen wie folgt vorgegangen :

a) Die Lösung des Rohcymarins wird jeweils erst kurz vor dem Aufbringen auf die Säule hergestellt, und zwar ohne Erhitzen, Bei großen Volumina wird durch Zusatz von Hydrochinon zur aufzubringenden Phase eine zusätzliche Stabilität erreicht.

b) Die Laufgeschwindigkeit der Säule wird möglichst groß gehalten.

c) Die einzelnen Fraktionen werden sofort nach dem AufTangen schonend im Vakuum zur Trockne eingedampft.

Erfindungsgemäß ist es möglich, durch einmalige Säulenchromatographie in 90 bis 95% Ausbeute Cymarin mit einer Reinheit von über 99,5% herzustelien. Als Lösungs- und Eluierungsmittel werden Chloroform oder Mischungen von Chloroform mit Lösungsmitteln, die diesem in der eluotropen Reihe

j benachbart sind, wie Benzol, Äthylacetat, verwendet. Als stationäre Phase wird Aluminiumoxid (nach Brockmannl eingesetzt. Die eingedampften Fraktionen werden anschließend getrennt analysiert. Der Gehalt des Cymarins an anderen Cardenoliden wird

ίο wegen des Fehlens einer spezifischen quantitativen Bestimmungsmöglichkeit dünnschichtchromatographisch bestimmt.

Die noch erkennbare Menge an Begleilcardenoliden hängt von der aufgetragenen Substanzmenge und der Empfindlichkeit der Anfärbereagenzien ab. Von den in Frage kommenden Sprühreagenzien ergibt 3,5-Dinitrobenzoesäure mit Cardenoliden die stärksten Anfärbungen. Es können noch 1 ;· Cymarin, Strcphantidin. Cymarol, Allocymarin. Cymarylsäure, 10-,.'-Hydroxy-19-norperiplogenincymarosid und andere Cardenolide sichtbar gemacht werden.

Das nach dem beschriebenen Verfahren gereinigte Cymarin ist, sofern es trocken und bei normaler Temperatur aufbewahrt wird, über längere Zeit stabil.

Beispiel

40,0 g Rohcymarin mit einem Gehalt von 80 bis 85% Cymarin. etwa 5% Cymarol, etwa 12% Allocymarin und 1 Ws 2% anderen Cardenoliden werden

in 100 ml Chloroform gelöst und sofort auf eine Chromatographiesäule (4,8 cm Durchmesser. 90 cm Länge), die mit 1,6 kg Aluminiumoxid (nach Brockm a η η. Aktivitätsstufe II bis III) gefüllt ist. gegeben. Die Säule ist mit einem Isoliermantel umgeben. Nachdem die Cymarinlösung in die Schicht eingezogen ist. wird mit Chloroform eluiert. Die Chromatographiergeschwindigkeit beträgt 1 bis 2 !, h. Es werden Fraktionen von jeweils etwa 500ml aufgefangen. Jede Fraktion wird sofort schonend ;ur Trockne und der amorphe Rückstand durch Zugabe von wenig Methanol zur Kristallisation gebracht. Die Cardenolide werden in der Reihenfolge Cymarin. Cymarol. Allocymarin eluiert. Die einzelnen Fraktionen werden dUnnschichtchromatographisch auf Reinheit geprüft.

Dazu werden jeweils 100 ; des Fluatrückstandes. gelöst in Äthanol, auf Kieselgelplatten aufgetragen. Als Steigmittel dient Methanol Methylenchlorid (I f 9). entwickelt wird mit alkalischer 3.5-Dinitrobenioesäurelösung. Cymarin erscheint als rotvioletter Spot

mit einem Rf-Wert von etwa 0.6. Das erhaltene reine C ymarin zeigt beim Auftragen von 500; keinen

Nebenfleck: es besitzt demnach eine Reinheit von über 99.5%.

Die aus reinem Cymarin bestehenden Fraktionen werden vereinigt, anschließend wird eine Gesamtanalyse durchgeführt

Die Ausbeute an Reincymarin beträgt 31 g. das entspricht 95% des Cymuringehaltcs des eingesetzten Rohcymarins.

Ao Das Reincymarin kristallisiert aus Methanol in farblosen Säulen vom Schmelzpunkt 148 C (I.eitz-Heizmikroskop).

[„] = +37 (<· = I in Methanol); /. J,¹,";"¹-'217. 303 nm (log/ = 4.2O;4I).

Elementaranalyse (CwH₄₄O, · C H,OfI):

Berechnet ... C 64,12. H 8.33. O 27.56; gefunden .... C 64,11. H 8,20, O 27.67.

Claims (1)

1. Patentanspruch:

   Verfahren zur Gewinnung von C'ymarin mit einem Reinheitsgrad von über 99,5% aus einer Lösung von Rohcymarin, das durch Umkrisiallisation aus Methanol des rohen Cilykosidgemisches nach der Fermentation von Strophantus-komne-Samen gewonnen worden ist, dadurch gekennzeichnet, daß man das Rohcymarin in Chloroform oder in Mischungen aus Chloroform mit Lösungsmitteln, die diesem in der eluotropen Reihe benachbart sind, gelost an Aluminiumoxid nach Brockmann, Aktivitiitsstufe Il bis III, chromatographiert.