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Verfahren zur Hertellung von reinem Cymarin Die vorliegende betrifft
ein Verfahren zur Herstellung von Cymarin hohen Reinheitsgrades.
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Cymarin wird als oral resorbierbares Strophanthus-Glykosid in der
Therapie von Herzkrankheiten eingesetzt. Technisch wird es hauptsächlich aus dem
Samen von Strophantus kombe gewonnen; es entsteht bei der Fermentation der Samen
durch Einwirkung der im Samen enthaltenen Strophanthobiase auf k-Strophantosid bzw.
k-Strophanthin-ß. Das Aglykon dieser drei Glykoside ist k-Strophantidin.
| Q |
| M |
| OHO |
| OH |
| O CymaroaeßGlukose7Mo:-Glukose |
| Säure Strophantho- a-Glukosidase |
| biase |
| Cymarin |
| k-8trophanthin-ß |
| c |
| k.Strophantosid |
Im Extrakt der Strophantus kombe - Fermentation sind neben Cymarin
noch andere, diesem strukturell sehr ähnliche Cardenolide enthalten. Der Anteil
dieser - in. unserem Fall unerwünschten -Glykoside Cymarol, Emicymarin und Periplocymarin
ist in verschiedenen Samenlieferungen unterschiedlich, er kann über 50% betragen
(Ref .1)
R1 = D-Cymarose, R2=CH2HO : Cymarol R1 = D-Digitalose, R2=CH3 : Emicymarin R1 =
D-Cymarose, R2= CH3 : Periplocymarin Ausserdem kommen im Glykosid-Extrakt noch wechselnde
Mengen der sog. Allo-Cardenolide vor. Diese Verbindungen sind Isomere der natürlichen
Herzglykoside, sie entstehen während der Fermentation durch Umlagerung des .Cardenolid-Ringes
am G, 7 aus der ß- in die a-Stellung unter dem Einfluß eines im Samen enthaltenen
Allomerisierungs-Fermentes.
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Das bei der Fermentation der Strophantus-kombe-Samen anfallende Glykosidgemisch
besteht also aus Cymarin, Cymarol, Emicymarin, Periplocymarin sowie den entspechenden
Alloverbindungen dieser Monoglykoside. Ausserdem kennen noch geringe Mengen der
natarlichen Di- und Trisaccharide dieser Verbindungen sowie ihre Aglykone Strophantidin,
Strophanthidol und reriplogenin vorhanden sein.
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Da alle diese Stoffe sehr ähnliche physikalische und chemische Eigenschaften
besitzen, ist die Reindarstellung des allein verwertbaren Cymarins mit besonderen
Schwierigkeiten verbunden.
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Die im Handel befindlichen Cymarinpräparate enthalten noch ca.
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15-20 andere Cardenolide.
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Die Begleitglykoside des Cymarins unterscheiden sich in ihrer physiologischen
Wirkung vom Cymarin z.B. durch ihre therapeutische Breite, ihre Resorptionsgeschwindigkeit
und -quote bei oraler Verabreichung, durch die Geschwindigkeit des Wirkungseintritts,
die Wirkungsintensität sowie durch die Geschwindigkeit der Ausscheidung bzw. des
Abbaues und die Neigung zur Kumulation. Far die Therapie masse deshalb die M8glichkeit
der Verwendung eines exakt dosierbaren reinen Cymarins anstelle des üblichen Glykosid-und
Aglykongemisches als grosser Vorteil bezeichnet werden. Diese Forderung scheiterte
Jedoch bisher an dem Fehlen eines technisch durchführbaren Verfahrens zur Herstellung
von reinem Cymarin aus Strophantus kombi.
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In der Patentliteratur ist bereits ein Verfahren zur Gewinnung von
gereinigtem Cymarin aus den Wurzeln von Apocynum canabinum L.
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(Kanadischer Hanf) beschrieben (Ref. 2). Dieses Verfahren beruht auf
der Anwendung einer multiplikativen O'Keeffe-Verteilung.
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Angaben hinsichtlich der Reinheit des derart erhältlichen Cymarins
wurden nicht gemacht. Überraschenderweise wurde nun gefunden, dass sich reines Cymarin
mittels eines technisch leicht durchfahrbaren säulenchromatographischen Trennverfahrens
herstellen iässt, sofern man bestimmte, erfindugsgemässe Bedingungen einhält. Der
Unkenntnis dieser Bedingungen ist offenbar auch das Versagen dieser Trennmethode
in den Händen der Autoren von Ref.2 zuzuschreiben.
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Die Hauptverunreinigungen sind Allocymarin, Cymarol, 10-ß-Hydroxy-19-norperiplogenin-cymarosid
und Cymarylsäure. Während die ersten beiden Verbindungen Primärprodukte der Fermentation
sind, entstehen die beiden letzten während der Fermentation und Aufarbeitung.
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Die C19-Oxo-cardenolide besitzen in t8sung eine ausgeprägte Neigung
zur Autoxydation (Ref.3). Die Geschwindigkeit dieser Autoxydation ist beim Cymarin
besonders gross, grdsser als beispielsweise beim Strophantidin und beim Convallatoxin.
Die Autoxydation findet in allen gebräuchlichen Lösungsmitteln und auch in Wasser
statt. Ihre Geschwindigkeit ist zwar in den einzelnen Lösungsmitteln unterschiedlich,
Jedoch immer relativ hoch. So entstehen in einer l-prox Lösung von Cymarin in Chloroform
bei freiem Luftzutritt nach 8 Stunden schon ca. 1% und nach 24 Stunden bereits ca.
2O Oxydationsprodukte. Die Autoxydation lässt sich durch typische Antioxydantien
wie Butylhydroxyanisol und Hydrochinon hemmen. Bei der Reindarstellung des Cymarins
sind also nicht nur die vorhandenen Begleitglykoside zu entfernen , sondern es gilt
insbesondere die Bildung neuer Verunreinigungen zu vermeiden. Aus den gewonnenen
Erkenntnissen ergibt sich in Bezug auf die säulenchromatographische Reinigung des
Cymarins im technischen Maßstab die Forderung, dass die Strophantus-glykoside nur
so lange wie unbedingt nötig in Lösung gehalten werden dürfen.
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Das nach der Fermentation der Strophantus kombe-Samen anfallende Rohglykosid-Gemisch
wird in an sich bekannter Weise aus Methanol umkristallisiert, wodurch ein ca 8O-proz.
Rohcymarin erhalten wird, welches in seiner Zusammensetzung dem Cymarin des Handels
entspricht.
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Erfindunggemäß wird dann im Einzelnen wie vorgegangen: a) Die Lösung
des Rohcymarins wird Jeweils erst kurz vor dem Aufbringen auf die Säule hergesstellt,
und zwar ohne Erhitzen. Bei grossen Volumina wird durch Zusatz von Hydrochion zur
aufzubringenden Phase eine zusätzliche Stabilität erreicht.
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b) Die Laufgeschwindigkeit der Säule wird möglichst gross gehalten.
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o) Die einzelnen Fraktionen werden sofort nach dem Auffangen schonend
im Vakuum zur Trockne eingedampft.
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Sofen diese Bedingungen eingehalten werden, ist es möglich, durch
einmalige Säulenchromatographie in 90-95% Ausbeute Cymarin mit einer Reinheit von
über 99,5% herzustellen.
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Als Lösungs- und Eluierungsmittel werden Chloroform oder Mischungen
von Chloroform mit Lösungsmitteln, welche diesem in der eluotropen Reihe benachbart
sind, wie Benzol, Ä Athyl acetat uOa. verwendet Als stationäre Phase wird Aluminiumoxid
(n.Brockmann) eingesetzt, Dei eingedampften Fraktionen werden anschließend getrennt
analysihert. Der Gehalt des Cymarins an anderen Cardenoliden wird wegen des Fehlens
einer spezifischen quatitativen Bestimmungsmöglickeit dünnschichtchromatographisch
bestimmt.
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Die noch erkennbare Menge an Begleittcardenoliden hängt von der aufgetragenen
Substanzmenge und der Empfindlichkeit der Anfärbereagenzien ab. Von den in Frage
kommenden Sprühreagenzien ergibt 3,5-Dinitrobenzoesäure mit Cardenoliden die stärksten
Anfärbungen. Es können noch ly Cymarin, Strophantidin, Cymarol, Allocymarin, Cymarylsäure,
10-ß-Hydroxy-19-norperiplogenincymarosid und andere Cardemolide sichtbar gemacht
werden.
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Das nach dem beschriebenen Verfahren gereinigte Cymarin ist, sofen
es troken und bei normaler Temperaturen aufbewahrt wird, über längere Zeit stabil.
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Stand der Entwicklung: 1) Cymarol, ein neues herzaktives Glykosid
aus Strophantus kombe.
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W. Blome, A. Katz und T. Reichstein, Pharm.Acta Helv. 21, 325 (1946)
2)
Verfahren zur Gewinnung von Rein-Cymarin.
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W. Grundmann u# R. Gießner, DDR Patentschrift Nr. 35 688 K 30 h,
2/30. Ausgabetag 5.1.65 3) über die Autoxydation des Strophantidins.
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J. Binkert, E. Angliker uO A. von Wartburg, Helv.Chim.Acta XLV, 2122
(1962) Beispiel: 40.0 g Rohcymarin mit einem Gehalt von 80-85%Cymarin, ca. 5% Cymarol,
ca. 21 % allocymarin und 1-2% anderen Cadenoliden werden in 100 ml Chloroform gelöst
und sofort auf eine Chromatographie-Säule (4,8 cm Durchmesser, 90 cm Länge), welche
mit 1,6 kg Aluminiumoxid (nach Brockmann, Akt.St. II-III) gefüllt ist gegeben. Die
Säule ist mit einem Isoliermantel umgeben. Nachdem die Cymarinlösung in die Schicht
eingezogen ist, wird mit Chloroform eluiert.
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Die Chromatographiergeschwindigkeit beträgt 1-2 1/h. Es werden Fraktionen
von jeweils ca. 500 ml aufgefangen. Jede Fraktion wird sofort schonend zur Trockne
und der amorphe Rückstand durch Zugabe von wenig Methanol zur Krtistallisation gebracht.
Die Cardenolide werden in der Reihenfolge Cymarin, Cymarol, Allocymarin eluiert.
Die einzelnen Fraktionen werden dünnschichtchromatographisch auf Reinheit geprüft.
Dazu werden Jeweils 100 Y des Eluatrückstandes, gelöst in Äthanol, auf Kieselgelplatten
aufgetragen. Als Steigmittel dient Methanol/Methylenchlorid (1+9) ; entwickelt wird
mit alkalischer 3,5-Dinitrobenzoesäurelösung. Cymarin erscheint als rotvioletter
Spot mit einem Rf-Wert von ca.
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0,6. Das erhaltene reine Cymarin zeigt beim Auftragen von 500 # keinen
Nebenfleck, es besitzt demnach eine Reinheit von über 99,5%
Die
aus reinem Cymarin bestehenden Fraktionen werden vereinigt, anschließend wird eine
Gesamtanalyse durchgeführt.
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Die Ausbeute an Reincymarin betrugt 31 g, das entspricht 95% des Cymaringehaltes
des eingesetzten Rohcymarins.
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Das Rein-Cymarin kristallisiert aus Methanol in farblosen -Säulenvom
Schmelzpunkt 148°C (Leitz-Heizmikroskop). [α]D20 = + 37° (c=1 in Methanol).
#maxÄthanol 217, 303nm (log# = 4.20; 1.41).
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Elementaranalyse (C30H44O9 . CH3OH): C H O Ber.: 64.12 8.33 27.56
Gef. 64.11 8.20 27.67 Anlage: IR-Spektrum des Rein-Cymarins