DE69430079T2

DE69430079T2 - Verfahren zur Herstellung von Oenothein-B aus Epilobium Parviflorum

Info

Publication number: DE69430079T2
Application number: DE69430079T
Authority: DE
Inventors: Jean-Francois Gourvest; Alexander Kasal; Dominique Lesuisse; Jean-Georges Teutsch
Original assignee: Aventis Pharma SA
Current assignee: Aventis Pharma SA
Priority date: 1993-11-16
Filing date: 1994-11-15
Publication date: 2002-08-14
Anticipated expiration: 2014-11-16
Also published as: DE69430079D1; DE69423577T2; FR2712495A1; FR2712495B1; EP0657167A2; EP0657167A3; JP3958803B2; EP0947522A2; US5525594A; DE69423577D1; EP0947522A3; EP0947522B1; EP0657167B1; JP4249732B2; JPH07188275A; JP2005255693A

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Oenothein B aus Epilobium Parviflorum.
Es gibt ungefähr 200 verschiedene Arten von Epilobium (Familie der Onagraceae). Epilobium Parviflorum sowie andere Epilobium-Arten werden in der traditionellen Medizin als günstig bei allen Arten von Störungen, wie denjenigen der Blase, der Niere und spezieller der Prostata beschrieben (A. Hiermann, H. Juan und W. Sametz, J. Ethnopharmacol. 17 (1986) 161-167; V. E. TYLER Pharm. Int. (1986) 205).
Die Bestandteile von Epilobium sind vielfältig und haben komplexe Strukturen. Mehrere Analysen wurden bis heute versucht und zeigen verschiedene Verbindungstypen. Die Zusammensetzung bleibt jedoch schlecht bekannt.
So wurde die Gegenwart von Sterolen (A. Hiermann, Sci. Pharm. 51 (1985) 39), Triterpenen und Flavonoiden (Flavonolaglycone und -glycoside) (A. Hiermann und K. Mayr, Sci. Pharm. 51 (1983) 158) gefunden. Vor kurzem hat die Abtrennung der Flavonolglycoside aus Epilobium Panriflorum ermöglicht, die Gegenwart von Quercitrin, Myricitrin, Isomyricitrin, Gallussäure und Chlorogensäure zu zeigen (I. Slacanin, A. Marston, K. Hostettmann, N. Delabays und C. Darbellay, J. Chrom. 557 (1991) 391-398).
Die Anmelderin hat soeben entdeckt, dass Epilobium Parviflorum außerdem eine weitere besonders interessante Verbindung einschließt, die bis heute aus dieser Pflanze nie isoliert wurde, das Oenothein B.
Oenothein B ist ein hydrolysierbares oligomeres Tannin. Es wurde erstmals aus Blättern von Oenothera erythrosepala Borbas isoliert (T. Hatano et al., J. Chem. Soc., Perkin Trans. 1, (1990), 2735; 104th Annual Meeting of the Pharmaceutical Society of Japan, März 1984, Sendai und Chem. Pharm. Bull. (1989) 37(8) 2269-2271).
Oenothein B wurde dann in verschiedenen Onagraceae-Pflanzen und in Woodfordia fruticosa gefunden (T. Yoshida et al., Chem. Pharm. Bull. 38, 1211 (1990), die zur Familie der Lythraceae gehört. Schließlich wurde vor kurzem Oenothein B aus der getrockneten Frucht von Eucalyptus Alba REINW isoliert, der zur Familie der Myrtaceae gehört (T. Yoshida et al., Chem. Pharm. Bull. (1992) 40(7) 1750-1754).
Obwohl Oenothein B erst in jüngerer Zeit entdeckt wurde, ist es Gegenstand zahlreicher Untersuchungen gewesen, die seine Bedeutung als Medikament gezeigt haben. So besitzt Oenothein B eine bestimmte Anzahl biologischer und pharmakologischer Eigenschaften auf dem Gebiet der Virenhemmung und Tumorhemmung.

Tumorhemmende Aktivität:

Lead Chemical Co J62129220 (11/06/87) Pr: 85JP-270494 (30/11/85)
Nippon Kayaku Co J03123793 (27/05/91) Pr: 89JP-258708 (05/10/89)
Ken-ichi Miyamoto et al., Biol. Pharm. Bull. 16(4) 379-387 (1993)
A. Kuramochi-Motegi et al., Biochem. Pharm. 44(10) 1961-1965 (1992)
Yan-Jyu Tsai et al., The Journal of Biological Chemistry 267 (20) 14436-14442
Ken-ichi Miyamoto et al., Jpn. J. Cancer Res. 84, 99-103 (1993).

Virenhemmende Aktivität (Herpes):

K. Fukuchi et al., Antiviral Research 11 (1989) 285-298

Virenhemmende Aktivität (HIV):

Lead Chemical Co EP-297547 (04/01/89) Pr 87JP-161572 (29/06/87).
Bei der Untersuchung eines besonderen Extraktes (wässrige Fraktion) eines Dekokts von Epilobium Parviflorum hat die Anmelderin beobachtet, dass besagter Extrakt signifikant als Inhibitor des Enzyms Testosteron-5-α-Reduktase, ein Schlüsselenzym bei der Biosynthese bestimmter Androgene, insbesondere 4,5-α-Dihydrotestosteron (DHT), reagierte.
Diese Beobachtung führte die Anmelderin dazu, zu versuchen, das für diese Inhibierung verantwortliche Molekül zu identifizieren. Es zeigte sich, dass es Oenothein B ist.
Zusammengefasst wurde also zum ersten Mal Oenothein B als einer der Wirkstoffe von Epilobium Parviflorum isoliert und identifiziert.
Und es wurde zum ersten Mal festgestellt, dass Oenothein B als Inhibitor des Enzyms Testosteron-5-α-Reduktase wirkt, was aus dem Stand der Technik auf keinerlei Weise vorhersehbar war.
Oenothein B weist eine spezifische Aktivität als Inhibitor der 5-α-Reduktase auf. 5-α-Reduktase ist ein Enzym, das für die Umwandlung von Testosteron in Dihydrotestosteron (DHT), das am Rezeptor der Androgene (RA) eine höhere Affinität als Testosteron hat, verantwortlich ist.
Dieses Hormon ist beim Mann bei der Entwicklung der äußeren Geschlechtsorgane im Uterus und dann während der Pubertät beim Auftreten bestimmter sekundärer Geschlechtsmerkmale (Behaarung, Gesicht und Körper) wesentlich.
Man findet die 5-α-Reduktase im Wesentlichen in der Prostata und in der Haut, wo das Testosteron anscheinend in DHT umgewandelt werden muss, um zu wirken.
Ein DHT-Überschuss kann für Akne oder androgene Alopezie, Hirsutismus bei der Frau, und seine Anhäufung in der Prostata für gutartige Hyperplasie (HBP) oder Prostatakrebs verantwortlich sein. Man schätzt, dass 80% der Männer, die älter als 80 Jahre sind, eine HBP aufweisen und 70% Krebsherde.
Die Inhibierung dieses enzymatischen Schritts im Steroidmetabolismus bringt einen Abfall des DHT-Spiegels in vivo mit sich. Diese Verminderung des DHT- Spiegels hat zur Wirkung, die Größe der Prostata beim Mann zu vermindern und hat folglich eine günstige Wirkung bei der Behandlung der gutartigen Hyperplasie der Prostata, des Prostatakrebses und bestimmter androgenabhängiger Krankheiten.
Eine Behandlung, die die 5-α-Reduktase inhibiert, ist also sehr nützlich und weist die Nachteile eines Antiandrogens, das der Rezeptor blockiert, nicht auf.
Diese Eigenschaft, die 5-α-Reduktase zu inhibieren, macht also Oenothein B dafür geeignet, bei der Behandlung der an den Hyperandrogenismus gebundenen Störungen, insbesondere die der gutartigen Hyperplasie der Prostata (HBP), des Prostatakrebses, der Akne, der androgenetischen Alopezie, der Seborrhoe oder auch des Hirsutismus bei der Frau, eingesetzt zu werden.
Die Dosierung variiert in Abhängigkeit von dem zu behandelnden Leiden und vom Verabreichungsweg.
Sie kann beispielsweise von 5 bis 100 mg/kg und vorzugsweise von 10 bis 20 mg/kg und Tag beim Erwachsenen auf oralem Weg variieren.
Oenothein B kann also für die Herstellung von pharmazeutischen Zusammensetzungen, die es als Wirkstoff enthalten, eingesetzt werden und die Erfindung hat auch besagte pharmazeutische Zusammensetzungen zum Gegenstand.
Oenothein B gemäß der Erfindung kann auf gastrointestinalem, parenteralem oder lokalem Weg verwendet werden, beispielsweise auf transdermalem Weg. Es kann in Form von einfachen oder dragierten Tabletten, Kapseln, Granulat, Zäpfchen, injizierbaren Zubereitungen, Ovuli, Salben, Cremes, Gelen, Pflastern, die gemäß den üblichen Verfahren hergestellt werden, verordnet werden.
Der Wirkstoff kann darin zu üblicherweise in diesen pharmazeutischen Zusammensetzungen verwendeten Hilfsstoffen, wie Talk, Gummi Arabicum, Lactose, Stärke, Magnesiumstearat, Kakaobutter, den wässrigen oder nicht wässrigen Trägern, den Fetten tierischen oder pflanzlichen, Ursprungs, den Paraffinderivaten, den Glykolen, den verschiedenen Netz-, Dispersions- oder Emulsionsmitteln, den Konservierungsmitteln zugesetzt werden.
Die Erfindung hat ein Verfahren zur Herstellung von Oenothein B aus Epilobium Parviflorum zum Gegenstand, dadurch gekennzeichnet, dass man nacheinander ausführt:
a) eine Extraktion, indem man entweder Wasser oder ein Gemisch: wassermischbare Lösungsmittel/Wasser zu getrockneten Proben von Epilobium Parviflorum zugibt,
dann
b) eine Filtration und gegebenenfalls ein Konzentrieren unter vermindertem Druck bis zum Eindampfen des wassermischbaren Lösungsmittels, dann
c) entweder eine Gefriertrocknung der wässrigen Phase oder eine Extraktion mit einem polaren Lösungsmittel, das man bis zum Erhalt eines trockenen Extraktes eindampft, und
d) eine Reinigung des gefriergetrockneten Produkts oder des trockenen Extraktes entweder durch Inversed-Phase-HPLC oder durch eine Säule mit Polymergelen.
Das Verfahren zur Herstellung besteht also im Wesentlichen aus einer Extraktion mit anschließender Reinigung, die wie folgt durchgeführt werden:

Extraktion

Wasser oder ein Gemisch aus Wasser und wassermischbaren Lösungsmitteln, wie die Alkohole, die ausgewählt sind unter Methanol, Ethanol, Isopropanol, Butanol, oder Aceton, wird getrockneten Proben von Epilobium Parviflorum zugegeben. Es handelt sich vorzugsweise um Blätter von Epilobium Parviflorum.
Das bevorzugte wassermischbare Lösungsmittel ist Aceton.
Nach Rühren und Filtrieren wird das Filtrat gegebenenfalls unter vermindertem Druck bis zum Eindampfen des wassermischbaren Lösungsmittels konzentriert. Die verbleibende wässrige Phase wird entweder gefriergetrocknet oder mit verschiedenen polaren organischen Lösungsmitteln, die dem Fachmann bekannt sind, wie beispielsweise Diethylether, Ethylacetat oder Butanol, extrahiert. Vorzugsweise handelt es sich um Butanol. Diese Fraktionen werden dann unter vermindertem Druck bei einer Temperatur, die 50ºC nicht übersteigt, bis zum Erhalt eines trockenen Extraktes eingedampft.

Reinigung

Die Reinigung des Wirkstoffes erfolgt entweder durch Durchlaufen einer Säule mit Polymergelen oder durch Inversed-Phase-HPLC.

Reinigung durch eine Säule mit Polymergelen

Man löst den zuvor erhaltenen trockenen Extrakt oder das zuvor erhaltene gefriergetrocknete Produkt in destilliertem Wasser und man gießt auf eine Säule mit Polymergelen, beispielsweise vom Typ DIA ION HP20, SEPHADEX LH20, TOYOPEARL HW40.
Das Eluieren erfolgt mit destilliertem Wasser, dann einem Gemisch Alkoholdestilliertes Wasser in zunehmendem Verhältnis. Die Fraktion, die das Oenothein B enthält, wird durch HPLC identifiziert, dann gefriergetrocknet. Der verwendete Alkohol ist vorzugsweise Methanol.

Reinigung durch Inversed-Phase-HPLC:

Man löst den zuvor erhaltenen trockenen Extrakt oder das zuvor erhaltene gefriergetrocknete Produkt in destilliertem Wasser, dann reinigt man es mit Inversed- Phase-HPLC. Man eluiert mit einem Gradienten, der aus einem Gemisch von polarem und hydrophilem Lösungsmittel zusammengesetzt ist, wie dem Gemisch Acetonitril/Wasser, bei saurem pH, indem man eine Säure, wie Trifluoressigsäure (TFA), verwendet. Die Fraktion, die das Oenothein enthält, wird dann in Abhängigkeit von der Retentionszeit und seinem Spektrum, das durch Analyse mit dem Diodenarraydetektor (210-500 nm) oder dem UV Detektor erhalten wird, isoliert. Nach einer etwaigen zweiten Reinigung nimmt man eine Gefriertrocknung des erwarteten Produkts vor.
Die Erfindung hat spezieller ein Verfahren zur Herstellung von Oenothein B aus Epilobium Parviflorum, wie zuvor beschrieben, zum Gegenstand, dadurch gekennzeichnet, dass die Extraktion erfolgt, indem man getrockneten Proben von Epilobium Parviflorum ein Gemisch Aceton/Wasser zugibt.
Die folgenden Beispiele veranschaulichen die Erfindung, ohne sie jedoch einzuschränken.

Beispiel 1: Extraktion der Blätter und Zweige von Epilobium Parviflorum mit dem Gemisch Aceton/Wasser und Erhalt von rohem Oenothein B.

In einen 100 Liter-Reaktor gibt man 1275 g getrocknete und gebrochene Blätter und Zweige von Epilobium Parviflorum. Man fügt dazu 20 Liter eines Gemischs Aceton/Wasser 7-3 hinzu. Man rührt das Gemisch mit einem mechanischen Rührer 60 Stunden lang. Das Gemisch wird filtriert und die Blätter werden mit 4 Litern Aceton gespült. Das Filtrat wird unter vermindertem Druck bei 35ºC bis auf ein Volumen von etwa 6 Litern konzentriert, um das Aceton einzudampfen. Die verbleibende wässrige Phase wird nacheinander mit 2 · 1 Liter Diethylether, 2 · 1 Liter Ethylacetat und 2 · 0,5 Liter Butanol extrahiert. Man erhält nach Eindampfen dieser beiden ersten Fraktionen unter vermindertem Druck bei einer Temperatur von 35ºC 100 g schwarzes Harz bzw. 10 g eines braunen bröckeligen Schaums und nach Eindampfen der 3. Fraktion unter stark vermindertem Druck bei einer Temperatur von 50ºC 45 g eines schwarzen Harzes. Diese letztere Fraktion ist die an Oenothein B reichste.

Beispiel 2: Extraktion der Blätter und Zweige von Epilobium Parviflorum mit Wasser und Erhalt von rohem Oenothein B.

20 g zerstoßene Blätter und Zweige von Epilobium Parviflorum werden mit 350 ml Wasser bei 65ºC bedeckt. Man belässt dann das Gemisch unter mechanischem Rühren 20 Stunden lang bei Raumtemperatur. Man filtriert das Gemisch und spült die Blätter mit 100 ml destilliertem Wasser. Man erhält so 450 ml einer klaren schwarzen Lösung. Eine Gefriertrocknung von 50 ml dieser Lösung liefert 500 mg eines blassgrünen Pulvers, das reich an erwartetem Produkt ist.

Beispiel 3: Identifizierung und Reinigung des Oenothein B.

Das gemäß Beispiel 2 hergestellte gefriergetrocknete Produkt wird gelöst (2 mg/ml destilliertes Wasser). 10 ml (20 mg) werden auf eine präparative Säule vom Typ NOVAPACKTM (C18 6 u 7,8 · 300 mm) gespritzt. Das Eluieren erfolgt mit einem Lösungsmittelgradienten mit einem Durchsatz von 5 ml/min unter den folgenden

Bedingungen (in Volumenprozent):

0-2 min Probe
2-7 min 100% Wasser mit 0,1% Vol% Trifluoressigsäure (TFA),
7-57 min linearer Gradient von 0 bis 10% Vol-% Acetonitril mit 0,1% Vol-% TFA,
57-77 min linearer Gradient von 10 bis 25% Vol-% Acetonitril mit 0,1% Vol-% TFA,
77-97 min linearer Gradient von 25 bis 90% Vol% Acetonitril mit 0,1% Vol% TFA.
Die Detektion erfolgt über ein Diodenarray mit Wellenlängen von 210 nm bis 400 nm.
Von den 43 gewonnenen Fraktionen hat eine einzige eine Aktivität gegenüber der 5-α-Reduktase, die Retentionszeit liegt zwischen 36 und 38 min.
Nach Reinheitskontrolle wird diese Fraktion gefriergetrocknet. Das erwartete Produkt wird sofort mit NMR und Massenspektrometrie analysiert. (Die NMR- und Masseanalysen dieser Fraktion sind mit denjenigen vergleichbar, die in der Literatur beschrieben sind: T. HATANO et al., J. Chem. Soc. Perkin Trans. 1 (1990) 2735-2743).

NMR

250 MHz,
Lösungsmittel: Aceton-d&sub6; bei 45ºC. Ref. SiMe&sub4;, δ (ppm), J (Hz)
siehe Liste Beispiel 4.

Massenspektrum

m/z MALDI (Matrix Assisted Laser Desorption Ionisation)
1569 [(M+H)]&spplus;
1591 [(M+Na)]&spplus;
1607 [(Mi+K)]&spplus;

Beispiel 4: Reinigung von Oenothein B

Man verwendet eine präparative Microbondapack-Säule (C18 10 u, Länge 50 cm, Durchmesser 2 cm (1 Zoll)). Man spritzt 1 g gemäß Beispiel 2 hergestelltes gefriergetrocknetes Produkt, gelöst in 50 ml Wasser, ein. Man eluiert mit einem Elutionsgemisch Wasser-Acetonitril mit 0,1% Trifluoressigsäure. Man führt ein Ansteigen im Gradienten der Konzentration an Acetonitril von 15% Vol-% in 30 Minuten aus. Man detektiert die Produkte mit einem UV-Detektor (Wellenlänge 305 nm). Das erwartete Produkt tritt mit einer Retentionszeit von 27 Minuten aus. Nach Gefriertrocknung der Fraktionen gewinnt man etwa 35 mg reines erwartetes Produkt in Form eines beigen Pulvers.

UV

MeOH/HCl 0,1 N 218 nm (&epsi; = 120000) und 266 nm (&epsi; = 55000)
MeOH 218 nm (log&epsi; = 5,09) und 265 nm (log&epsi; = 4,77)
MeOH/NaOH 0,1 N 285 nm (&epsi; = 33000) und Infl. 315 und 473 nm
nicht reversible Veränderung.

Cirkulardichroismus

MeOH/HCl 0,1 N Max. 219 nm (θ) = +3,8 105
Infl. 236 nm (θ) = +1,7 105
Max. 259 nm (θ) = -4,5 104
Infl. 282 nm (θ) = +9,5 104

NMR

bei 400 (C13) MHz
Lösungsmittel: D&sub2;O
Temperatur: 297 K für Proton
318 K für Kohlenstoff 13
Referenz: TSP bei 0 ppm
Abkürzungen: δ (ppm) chemische Verschiebung in ppm
J (Hz) Kopplungskonstante in Hz.

Multiplizitäten:

s Singulett
sl Singulett, breit
d Dublett
dd Dublett eines Dubletts
t Triplett Oenothein B
a - die Zuordnungen können untereinander vertauscht werden
b - die Zuordnungen können untereinander vertauscht werden
c - die Zuordnungen können untereinander vertauscht werden

MASSENSPEKTROMETRIE

Experimenteller Teil

- Das für diese Untersuchung verwendete Gerät ist ein doppelfokussierendes Dreifach-Sektoren-Spektrometer "VG Autospec E" (Fison Instrument).
- Die Molekülmasse der Probe wird unter LSIMS-Ionisierung (Liquid Secondary Ion Mass Spectrometry) im positiven und negativen Modus bestimmt. Die Probe wird zuvor in einer "Magic Ballet/TFA" genannten Matrix gelöst, bevor sie mit einem Strahl primärer Ionen aus einer Cs&spplus;-Kanone beschossen wird. Dieser Strahl wird unter einer Spannung von 30 kV beschleunigt und hat eine Stärke von 2 bis 3 uAmpère.
- Die Sekundärionen (Probe) werden unter einer Spannung von 8 kV beschleunigt.
- Die Untersuchung der Fragmentierung erfolgt durch gekoppeltes Rastern (Linked scan) gemäß dem Modus B/E = Cte. Dazu wird das "parent"-Ion durch Kollision in einer Zelle fragmentiert, die im ersten feldfreien Raum (1 FFR) liegt. Das in diese Zelle eingeführte Kollisionsgas ist Luft, deren Druck derjenige ist, der notwendig ist, um die Anfangsintensität des "parent"-Ions zu halbieren.
- Diese Untersuchung wird in zwei Schritten durchgeführt:
a) Fragmentierung des Quasi-Molekülions (MH&spplus;)
b) aufeinanderfolgende Fragmentierungen von jedem der zuvor erhaltenen Ionen.

Ergebnisse:

A) positiver LSIMS-Modus

MH&spplus; = 1569 Da

B) negativer LSIMS-Modus

(M-H)&supmin; = 1567 Da

C) Fragmentierung des Ions MH&spplus; = 1569 Da

Die in diesem Spektrum beobachteten Hauptionen sind:
1399&spplus; - 1237&spplus; - 767&spplus; - 453&spplus;

D) Fragmentierung des Ions 1237&spplus;

Die in diesem Spektrum beobachteten Hauptionen sind:
1085&spplus; - 767&spplus; - 453&spplus;

E) Fragmentierung des Ions 767&spplus;

749&spplus; - 615&spplus; - 471&spplus; - 453&spplus; - 315&spplus; - 152&spplus;

F) Fragmentierung des Ions 453&spplus;

Wenig charakteristisches Spektrum, das vor Allem das Ion 435 Da (Wasserabspaltung) hervorbringt).

Beispiel 5: Reinigung von Oenothein B

710 mg des gemäß Beispiel 1 erhaltenen schwarzen Harzes werden, indem man die Butanolfraktion konzentriert, in 5 ml destilliertem Wasser gelöst und auf eine Säule mit Harz DIA ION HP20 (20 cm · 2 cm) gegossen.
Man eluiert mit 200 ml destilliertem Wasser und dann 200 ml eines Gemischs destilliertes Wasser-Methanol 80-20. Diese zweite Fraktion wird gefriergetrocknet, um 58 mg Oenothein B in Form eines pulverförmigen beigen Feststoffs zu liefern. Weitere Fraktionen enthalten auch Oenothein B.
Die NMR, UV, CD- und Massenspektrometrieanalysen sind mit den in Beispiel 4 beschriebenen identisch.

Pharmakologische Untersuchung von Oenothein B

Der Versuch zur Messung der 5-α-Reduktase-Aktivität erfolgt in vitro, indem man das Enzym und sein Substrat (das Testosteron) inkubiert und indem man die Menge an gebildeten 5-α-reduzierten Metaboliten (Dihydrotestosteron (DHT) und 5-α-Androstan-diol) durch HPLC-Chromatographie misst.
Man verwendet Homogenate von menschlichen Prostatae, die durch radikale Prostatektomien wegen gutartiger Hyperplasie der Prostata (HBP) erhalten wurden.

Verfahren

Herstellung des Homogenats:

Die Prostata wird gleich am Ausgang des Operationstrakts in Empfang genommen und in Aluminiumpapier gewickelt, das in einen mit CO&sub2;-Eis gefüllten Behälter gelegt wird. Im Labor kann die Prostata, wenn das Homogenat nicht sofort hergestellt wird, bei -80ºC aufbewahrt werden.
Man schneidet die Prostata auf Eis in sehr kleine Stücke, dann zerkleinert man in einem Medium A (20 mM Kaliumphosphat, pH 6,5; 0,32 M Sucrose; 1 mM Dithiothreit (DTT); 50 uM Triphosphopyridin-nukleotid Natriumsalz Hydrat NADPH) im Polytron, dann im Glas-Glas-Potter. Nach Zentrifugieren mit 140000 g 60 min lang bei 4ºC suspendiert man wieder in 10 bis 20 ml Medium B (20 nM Kaliumphosphat, pH 6,5; 20% Glycerin; 1 mM Dithiothreit). Man verteilt in Nunc-Röhrchen und bewahrt bei -80ºC auf.
Man führt für seine spätere Verwendung im Versuch eine Bestimmung der Proteine an ein wenig Homogenat aus und man vergewissert sich so, dass man wenigstens 10 mg Proteine/ml Homogenat hat.

Messung der 5-α-Reduktase-Aktivität

Die Inkubation erfolgt bei pH 5,5 mit einer Menge von 1 ml Medium/Röhrchen in Gegenwart von Citrat (normales Medium der Prostata).
1) Herstellung des Substrats (S), das heißt des Gemischs von "kaltem" Testosteron und von "tritiiertem" Testosteron mit einer Isotopenverdünnung von 100 in einem tri-Natriumcitrat-Puffer pH 5,0:
a) Tri-Natriumcitrat-Puffer 40 mM: Man wiegt 11,76 g Na&sub3;-citrat·2H&sub2;O (Merck Ref. Art 6448) ab, die man in 1 Liter destilliertem Wasser (Milli-Q) auflöst, und man stellt auf pH 5,0 ein.
b) Gemisch von "kaltem" Testosteron und von "tritiiertem" Testosteron mit einer Isotopenverdünnung von 100: Um eine Testosteronlösung mit 1 mM zu erhalten, wiegt man 2,88 mg "kaltes" Testosteron ab, die man in 10 ml Ethanol auflöst. Diese Lösung wird auf 0,9911000 verdünnt, das heißt 9,9 ul in 10 ml Citrat-Puffer (= 10&supmin;&sup6;M Lösung). Man fügt 9 ul Testosteron-³H (NET-370) zu 10 ml der vorherigen Lösung hinzu (= Isotopenverdünnung von 100). Das Substrat (S) ist fertig.

2) Herstellung des Gemischs Enzym + DTT + NADPH

a) Kaliumphosphat-Puffer, 40 mM, pH 6,5:

Man wiegt 5,44 g KH&sub2;PO&sub4; (Riedel de Haen Ref. 30407) ab, die man in 1 l destilliertem Wasser (Milli-Q) auflöst, und man stellt auf pH 6,5 ein.

b) DTT 1 mM (Sigma)

Man wiegt 3,1 mg DTT ab und man löst in 1 ml Phosphat Puffer auf.

c) NADPH 500 uM (Sigma)

Man wiegt 8,33 mg NADPH ab und man löst in 1 ml Phosphat-Puffer auf.

d) Gemisch Enzym + DU + NADPH (E):

Für einen Versuch mischt man bei 4ºC 0,5 mg Proteine des Prostatahomogenats, 50 ul DU und 50 ul NADPH. Man füllt mit dem Phosphat-Puffer auf 500 ul auf.

3) Inkubation:

Man bereitet so viele Röhrchen wie Versuche vor. In jedes Röhrchen gibt man 500 ul (S) und 10 ul Inhibitor in der gewünschten Konzentration (oder Ethanol für die Vergleichsversuche).
Man erhitzt die Röhrchen, die das Gemisch (S) enthalten, und den Kolben, der das Gemisch (E) enthält, die vorinkubiert werden müssen, 3 bis 5 min im Wasserbad.
Um die Reaktion zu starten, überführt man schnell 500 ut E in jedes Röhrchen, das S + den Inhibitor enthält, und man inkubiert 30 min lang bei 37ºC mit einem leichten Schütteln. Die Reaktion wird am Ende der Inkubation angehalten, indem man die Röhrchen in Eis gibt.

4) Extraktion

Sobald die Reaktion angehalten wurde, gibt man 2 ml Ethylacetat in jedes Röhrchen und man schüttelt 1 min lang im Mehrröhrchen-Verwirbler. Man lässt 10 min lang dekantieren, dann sammelt man in anderen Röhrchen 1,6 ml der organischen (oberen) Phase des Extraktes (=80%). Nach vollständigem Verdampfen des Ethylacetats gibt man in jedes Röhrchen 800 ul der mobilen Phase, die man für die HPLC braucht.

5) HPLC-Chromatographie:

Die Messung der Gehalte an Metaboliten, die während der Inkubation erzeugt wurden, wird ausgeführt, indem man die gebildeten Verbindungen durch Inversed- Phase-Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC) trennt. Man verwendet eine ODS-Hypersil-Säule (Durchmesser der Teilchen = 5 um) und eine mobile Phase, die aus MeOH/THF/H&sub2;O in einem Verhältnis von 45/15140 zusammengesetzt ist. Der nach der Extraktion gewonnene Extrakt wird automatisch in die HPLC-Anlage eingespritzt und dank des Online-Systems zur Messung der Radioaktivität (Berthold) misst man nur die radioaktiven Metaboliten, die folglich aus dem markierten Testosteron des Substrats gebildet wurden. Diese Messung ist sehr empfindlich und eliminiert alle eventuellen endogenen Produkte.

Ausdruck der Ergebnisse und Rechenverfahren:

Die Gehalte an gebildeten Metaboliten werden in Bezug auf eine Eichkurve, die in die MT2-Betriebssoftware der HPLC eingegeben ist, berechnet. Aus der MT2 werden sie in pmol/eingespritzte ul ausgegeben. Es existieren Eichkurven für Testosteron, DHT und Androstan-diol, die beiden 5-α-reduzierten Metaboliten des Testosterons.
Die Gehalte werden in Mol gebildete Produkte/mg Homogenatproteine ausgedrückt, wobei jeder Versuch doppelt ausgeführt wird, und man berechnet den Prozentsatz an 5-α-Reduktase-Restaktivität in Bezug auf die Vergleichsversuche:

Ergebnis:

Die Cl&sub5;&sub0;-Inhibierung der 5-α-Reduktase-Aktivität der Vergleichsprobe beträgt für Oenothein B 2,2·10&supmin;&sup5; M.

Claims

1. Ein Verfahren zur Herstellung von Oenothein B aus Epilobium Parviflorum dadurch gekennzeichnet, dass man nacheinander ausführt:

a) eine Extraktion, indem man entweder Wasser oder ein Gemisch: wassermischbare Lösungsmittel/Wasser zu getrockneten Proben von Epilobium Parviflorum zugibt, dann

b) eine Filtration und gegebenenfalls ein Konzentrieren unter vermindertem Druck bis zum vollständigen Verdampfen des wassermischbaren Lösungsmittels, dann

c) entweder eine Gefriertrocknung der wässrigen Phase oder eine Extraktion mit einem polaren Lösungsmittel, das man bis zum Erhalt eines trockenen Extraktes verdampft, und

d) eine Reinigung des gefriergetrockneten Produkts oder des trockenen Extraktes entweder durch Inversed Phase HPLC oder durch eine Säule mit Polymergelen.

2. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Extraktion erfolgt, indem man getrockneten Proben von Epilobium Parviflorum ein Gemisch Aceton/Wasser zugibt.