JPH07188275A - アンドロゲン過多症と関連した障害の治療用薬剤を得るためのイーノセインｂ、それを含有する製薬組成物及びエピロビウム・パルビフロラムからの製造法 - Google Patents
アンドロゲン過多症と関連した障害の治療用薬剤を得るためのイーノセインｂ、それを含有する製薬組成物及びエピロビウム・パルビフロラムからの製造法Info
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- JPH07188275A JPH07188275A JP6305664A JP30566494A JPH07188275A JP H07188275 A JPH07188275 A JP H07188275A JP 6305664 A JP6305664 A JP 6305664A JP 30566494 A JP30566494 A JP 30566494A JP H07188275 A JPH07188275 A JP H07188275A
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Abstract
(57)【要約】
【目的】 イーノセインＢの単離法と薬剤としての新規
な用途を提供する。 【構成】 イーノセインＢをエピロビウム・パルビフロ
ラム（アカバナ科）から水又は水／水混和性溶媒混合物
により抽出することによって製造し、構造を決定し、そ
の薬理効果を検討した。イーノセインＢはアンドロゲン
過多症と関連した障害の治療用薬剤として使用される。
な用途を提供する。 【構成】 イーノセインＢをエピロビウム・パルビフロ
ラム（アカバナ科）から水又は水／水混和性溶媒混合物
により抽出することによって製造し、構造を決定し、そ
の薬理効果を検討した。イーノセインＢはアンドロゲン
過多症と関連した障害の治療用薬剤として使用される。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】この発明は、アンドロゲン過多症
（ｈｙｐｅｒａｎｄｒｏｇｅｎｉｓｍ）と関連した障害
の治療用薬剤を得るためのイーノセインＢ（ｏｅｎｏｔ
ｈｅｉｎｅＢ）、それを含有する製薬組成物及びエピロ
ビウム・パルビフロラムからの製造法に関する。
（ｈｙｐｅｒａｎｄｒｏｇｅｎｉｓｍ）と関連した障害
の治療用薬剤を得るためのイーノセインＢ（ｏｅｎｏｔ
ｈｅｉｎｅＢ）、それを含有する製薬組成物及びエピロ
ビウム・パルビフロラムからの製造法に関する。
【０００２】
【発明の背景】エピロビウム属（Ｅｐｉｌｏｂｉｕｍ）
（アカバナ科）にはほぼ２００もの異なった種が存在す
る。エピロビウム・パルビフロラム（Ｅｐｉｌｏｂｉｕ
ｍ Ｐａｒｖｉｆｌｏｒｕｍ）並びにエピロビウムのそ
の他の種は、あらゆる種類の障害、例えば膀胱、腎臓の
障害、特に前立腺の障害に有益であるとして慣用医薬品
の中に説明されている（Ｈ．ヒアーマン、Ｈ．ジュアン
及びＷ．サメツ、Ｊ．Ｅｔｈｎｏ−ｐｈａｒｍａｃｏ
ｌ．１７（１９８６），１６１−１６７；Ｖ．Ｅ．タイ
ラー、Ｐｈａｒｍ．Ｉｎｔ．（１９８６），２０５）。
エピロビウムには多くの成分が含まれていて、それらは
複雑な構造を有する。今日までにいくつかの分析が試み
られ、各種の化合物の存在が示された。しかし、組成は
まだ周知ではない。
（アカバナ科）にはほぼ２００もの異なった種が存在す
る。エピロビウム・パルビフロラム（Ｅｐｉｌｏｂｉｕ
ｍ Ｐａｒｖｉｆｌｏｒｕｍ）並びにエピロビウムのそ
の他の種は、あらゆる種類の障害、例えば膀胱、腎臓の
障害、特に前立腺の障害に有益であるとして慣用医薬品
の中に説明されている（Ｈ．ヒアーマン、Ｈ．ジュアン
及びＷ．サメツ、Ｊ．Ｅｔｈｎｏ−ｐｈａｒｍａｃｏ
ｌ．１７（１９８６），１６１−１６７；Ｖ．Ｅ．タイ
ラー、Ｐｈａｒｍ．Ｉｎｔ．（１９８６），２０５）。
エピロビウムには多くの成分が含まれていて、それらは
複雑な構造を有する。今日までにいくつかの分析が試み
られ、各種の化合物の存在が示された。しかし、組成は
まだ周知ではない。
【０００３】しかして、ステロール類（Ａ．ヒアーマ
ン、Ｓｃｉ．Ｐｈａｒｍ．５１（１９８５），３９）、
トリテルペン及びフラボノイド類（アグリコン及びグリ
シドフラボノール類）（Ａ．ヒアーマン及びＫ．メイ、
Ｓｃｉ．Ｐｈａｒｍ．５１（１９８３），１５８）の存
在がわかった。最近なって、エピロビウム・パルビフロ
ラムからグリコシドフラボノール類が分離されてからケ
ルシトリン、ミリシトリン、イソミリシトリン、没食子
酸及びクロロゲン酸の存在が明らかにされた（Ｉ．スラ
カニン、Ａ．マーストン、Ｋ．ホステットマン、Ｎ．デ
ラベイズ及びＣ．ダーベレイ、Ｊ．Ｃｈｒｏｍ．５５７
（１９９１），３９１−３９８）。
ン、Ｓｃｉ．Ｐｈａｒｍ．５１（１９８５），３９）、
トリテルペン及びフラボノイド類（アグリコン及びグリ
シドフラボノール類）（Ａ．ヒアーマン及びＫ．メイ、
Ｓｃｉ．Ｐｈａｒｍ．５１（１９８３），１５８）の存
在がわかった。最近なって、エピロビウム・パルビフロ
ラムからグリコシドフラボノール類が分離されてからケ
ルシトリン、ミリシトリン、イソミリシトリン、没食子
酸及びクロロゲン酸の存在が明らかにされた（Ｉ．スラ
カニン、Ａ．マーストン、Ｋ．ホステットマン、Ｎ．デ
ラベイズ及びＣ．ダーベレイ、Ｊ．Ｃｈｒｏｍ．５５７
（１９９１），３９１−３９８）。
【０００４】本願発明者は、エピロビウム・パルビフロ
ラムがこの植物から今日までに単離されることが決して
なかった特に有益な別の化合物、即ちイーノセインＢを
さらに含有することを発見した。イーノセインＢは加水
分解性のオリゴマータンニンである。それは、イーノセ
ラ・エリスロセパラ（Ｏｅｎｏｔｈｅｒａ ｅｒｙｔｈ
ｒｏｓｅｐａｌａ Ｂｏｒｂａｓ）から初めて単離され
た（Ｔ・ハタノ他、Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｐｅｒｋｉ
ｎ Ｔｒａｎｓ．１（１９９０），２７３５；日本薬学
会第１０４回年会、１９８４年３月、仙台；Ｃｈｅｍ．
Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．３７（８）（１９８９），２２
６９−２２７１）。次いで、イーノセインＢは、種々の
アカバナ科（Ｏｎａｇｒｅａｃｅａｅ）、そしてミソハ
ギ科（Ｌｙｔｈｒａｃｅａｅ）の一員であるウッドホル
ジア・フルチコサ（Ｗｏｏｄｆｏｒｄｉａ ｆｒｕｔｉ
ｃｏｓａ）に見出された（Ｔ．ヨシダ他、Ｃｈｅｍ．Ｐ
ｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．３８，１２１１（１９９０）。さ
らに、最近になって、イーノセインＢは、フトモモ科
（Ｍｙｒｔａｃｅａｅ）の一員であるユーカリプタス・
アルバ（Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ ａｌｂａ ＲＥＩＮ
Ｗ）の乾燥果実から単離された（Ｔ．ヨシダ他、Ｃｈｅ
ｍ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．４０（７），１７５０−１
７５４（１９９２）。
ラムがこの植物から今日までに単離されることが決して
なかった特に有益な別の化合物、即ちイーノセインＢを
さらに含有することを発見した。イーノセインＢは加水
分解性のオリゴマータンニンである。それは、イーノセ
ラ・エリスロセパラ（Ｏｅｎｏｔｈｅｒａ ｅｒｙｔｈ
ｒｏｓｅｐａｌａ Ｂｏｒｂａｓ）から初めて単離され
た（Ｔ・ハタノ他、Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｐｅｒｋｉ
ｎ Ｔｒａｎｓ．１（１９９０），２７３５；日本薬学
会第１０４回年会、１９８４年３月、仙台；Ｃｈｅｍ．
Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．３７（８）（１９８９），２２
６９−２２７１）。次いで、イーノセインＢは、種々の
アカバナ科（Ｏｎａｇｒｅａｃｅａｅ）、そしてミソハ
ギ科（Ｌｙｔｈｒａｃｅａｅ）の一員であるウッドホル
ジア・フルチコサ（Ｗｏｏｄｆｏｒｄｉａ ｆｒｕｔｉ
ｃｏｓａ）に見出された（Ｔ．ヨシダ他、Ｃｈｅｍ．Ｐ
ｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．３８，１２１１（１９９０）。さ
らに、最近になって、イーノセインＢは、フトモモ科
（Ｍｙｒｔａｃｅａｅ）の一員であるユーカリプタス・
アルバ（Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ ａｌｂａ ＲＥＩＮ
Ｗ）の乾燥果実から単離された（Ｔ．ヨシダ他、Ｃｈｅ
ｍ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．４０（７），１７５０−１
７５４（１９９２）。
【０００５】最近発見されたが、イーノセインＢはその
薬剤として用途を立証する多くの研究の主題となってき
た。しかして、イーノセインＢは抗ウイルス剤及び抗腫
瘍剤の領域において多くの生物学的及び薬理学的性質を
持っている。抗腫瘍活性 ・リードケミカルＣｏ：特開昭６２−１２９２２０（１
１／０６／８７）；優先権主張：特願昭６０−２７０４
９４（３０／１１／８５） ・日本化薬：特開平３−１２３７９３（２７／０５／９
１）；優先権主張：特願平１−２５８７０８（０５／１
０／８９） ・ケンイチミヤモト他：Ｂｉｏｌ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌ
ｌ．１６（４），３７９−３８７（１９９３） ・Ａ．クラモチ−モギ他：Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈａｒ
ｍ．４４（１０），１９６１−１９６５（１９９２） ・ヤン−ジュ ツァイ他：Ｔｈｅ Ｊｏｕｒ．Ｂｉｏ
ｌ．ｏｆ Ｃｈｅｍ．：２６７（２０），１４４３６−
１４４４２ ・ケンイチミヤモト他：Ｊｐｎ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒ
ｅｓ．８４，９９−１０３（１９９３）抗ウイルス活性 （ヘルペス） ・Ｋ．フクチ他：Ａｎｔｉｖｉｒａｌ Ｒｅｓｅａｒｃ
ｈ １１（１９８９），２８５−２９８抗ウイルス活性 （ＨＩＶ） ・リードケミカルＣｏ：ヨーロッパ特許２９７５４７
（０４／０１／８９）；優先権主張：特願昭６２−１６
１５７２（２９／０６／８７）
薬剤として用途を立証する多くの研究の主題となってき
た。しかして、イーノセインＢは抗ウイルス剤及び抗腫
瘍剤の領域において多くの生物学的及び薬理学的性質を
持っている。抗腫瘍活性 ・リードケミカルＣｏ：特開昭６２−１２９２２０（１
１／０６／８７）；優先権主張：特願昭６０−２７０４
９４（３０／１１／８５） ・日本化薬：特開平３−１２３７９３（２７／０５／９
１）；優先権主張：特願平１−２５８７０８（０５／１
０／８９） ・ケンイチミヤモト他：Ｂｉｏｌ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌ
ｌ．１６（４），３７９−３８７（１９９３） ・Ａ．クラモチ−モギ他：Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈａｒ
ｍ．４４（１０），１９６１−１９６５（１９９２） ・ヤン−ジュ ツァイ他：Ｔｈｅ Ｊｏｕｒ．Ｂｉｏ
ｌ．ｏｆ Ｃｈｅｍ．：２６７（２０），１４４３６−
１４４４２ ・ケンイチミヤモト他：Ｊｐｎ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒ
ｅｓ．８４，９９−１０３（１９９３）抗ウイルス活性 （ヘルペス） ・Ｋ．フクチ他：Ａｎｔｉｖｉｒａｌ Ｒｅｓｅａｒｃ
ｈ １１（１９８９），２８５−２９８抗ウイルス活性 （ＨＩＶ） ・リードケミカルＣｏ：ヨーロッパ特許２９７５４７
（０４／０１／８９）；優先権主張：特願昭６２−１６
１５７２（２９／０６／８７）
【０００６】エピロビウム・パルビフロラムの煎じ汁か
らの特定の抽出物（水性画分）がある種の男性ホルモ
ン、特に４，５−α−ジヒドロテストステロン（ＤＨ
Ｔ）の生合成における重要な酵素であるテストステロン
酵素５−α−レダクターゼの阻害剤として有意に応答す
ることを本願発明者が観察したのはこの抽出物の研究中
であった。この観察によって本願発明者はこの阻害の原
因となる分子を同定しようと試みるに至った。これによ
りこのものがイーノセインＢであることが示された。要
するに、イーノセインＢがエピロビウム・パルビフロラ
ムの活性成分の一つとして単離され同定されたのはこれ
が最初である。さらに、イーノセインＢが従来技術にお
いて決して予見されなかったテストステロン酵素５−α
−レダクターゼの阻害剤として作用することが決定され
たのはこれが最初である。イーノセインＢは５−α−レ
ダクターゼの阻害剤としての特異的な活性を有する。５
−α−レダクターゼは、アンドロゲン受容器（ＡＲ）に
対してテストステロンよりも大きな親和性を有するジヒ
ドロテストステロン（ＤＨＴ）にテストステロンを変換
させる原因となる酵素である。
らの特定の抽出物（水性画分）がある種の男性ホルモ
ン、特に４，５−α−ジヒドロテストステロン（ＤＨ
Ｔ）の生合成における重要な酵素であるテストステロン
酵素５−α−レダクターゼの阻害剤として有意に応答す
ることを本願発明者が観察したのはこの抽出物の研究中
であった。この観察によって本願発明者はこの阻害の原
因となる分子を同定しようと試みるに至った。これによ
りこのものがイーノセインＢであることが示された。要
するに、イーノセインＢがエピロビウム・パルビフロラ
ムの活性成分の一つとして単離され同定されたのはこれ
が最初である。さらに、イーノセインＢが従来技術にお
いて決して予見されなかったテストステロン酵素５−α
−レダクターゼの阻害剤として作用することが決定され
たのはこれが最初である。イーノセインＢは５−α−レ
ダクターゼの阻害剤としての特異的な活性を有する。５
−α−レダクターゼは、アンドロゲン受容器（ＡＲ）に
対してテストステロンよりも大きな親和性を有するジヒ
ドロテストステロン（ＤＨＴ）にテストステロンを変換
させる原因となる酵素である。
【０００７】このホルモンは、男性においては、外部生
殖器官の子宮内発現に対して、次いで青春期からはある
種の第二次性徴（顔及び体の毛の系統）の発生に対して
必須である。５−α−レダクターゼは、テストステロン
が活性であるようにＤＨＴに変換されなばならない思わ
れる前立腺及び皮膚に主として見出される。しかし、過
剰なＤＨＴはざそう又はアンドロゲン性脱毛症、女性の
多毛症の原因となろうし、また前立腺に蓄積すると前立
腺の良性肥大（ＢＨＰ）又は癌の原因となろう。８０才
以上の男性の８０％はＢＨＰを有し、７０％は癌性の病
巣を有するものと推定される。スタロイド代謝における
この酵素段階の阻害はインビボでのＤＨＴのレベルの低
下を伴う。このＤＨＴレベルの低下は、男性の前立腺の
大きさを減少させるという効果を有し、従って前立腺の
良性肥大、前立腺癌及びある種のアンドロゲン依存性の
疾病の治療において有益な効果を有する。従って、５−
α−レダクターゼを阻害する治療は非常に有用であっ
て、受容器をブロックする抗男性ホルモンの欠点を現わ
さない。従って、５−α−レダクターゼのこの阻害性
は、イーノセインＢをアンドロゲン過多症と関連した障
害の治療に、特に前立腺の良性肥大（ＢＨＰ）、前立腺
癌、ざそう、アンドロゲン性脱毛症、脂漏又は女性の多
毛症の治療に使用するのを可能ならしめるものである。
殖器官の子宮内発現に対して、次いで青春期からはある
種の第二次性徴（顔及び体の毛の系統）の発生に対して
必須である。５−α−レダクターゼは、テストステロン
が活性であるようにＤＨＴに変換されなばならない思わ
れる前立腺及び皮膚に主として見出される。しかし、過
剰なＤＨＴはざそう又はアンドロゲン性脱毛症、女性の
多毛症の原因となろうし、また前立腺に蓄積すると前立
腺の良性肥大（ＢＨＰ）又は癌の原因となろう。８０才
以上の男性の８０％はＢＨＰを有し、７０％は癌性の病
巣を有するものと推定される。スタロイド代謝における
この酵素段階の阻害はインビボでのＤＨＴのレベルの低
下を伴う。このＤＨＴレベルの低下は、男性の前立腺の
大きさを減少させるという効果を有し、従って前立腺の
良性肥大、前立腺癌及びある種のアンドロゲン依存性の
疾病の治療において有益な効果を有する。従って、５−
α−レダクターゼを阻害する治療は非常に有用であっ
て、受容器をブロックする抗男性ホルモンの欠点を現わ
さない。従って、５−α−レダクターゼのこの阻害性
は、イーノセインＢをアンドロゲン過多症と関連した障
害の治療に、特に前立腺の良性肥大（ＢＨＰ）、前立腺
癌、ざそう、アンドロゲン性脱毛症、脂漏又は女性の多
毛症の治療に使用するのを可能ならしめるものである。
【０００８】
【発明の概要】従って、本発明の主題は、イーノセイン
Ｂからなるアンドロゲン過多症と関連した障害の治療用
の薬剤にある。薬量は治療しようとする疾病及び投与経
路によって変わる。従って、それは、例えば成人の場合
に経口投与により１日当たり５〜１００ｍｇ／ｋｇ、好
ましくは１０〜２０ｍｇ／ｋｇであろう。
Ｂからなるアンドロゲン過多症と関連した障害の治療用
の薬剤にある。薬量は治療しようとする疾病及び投与経
路によって変わる。従って、それは、例えば成人の場合
に経口投与により１日当たり５〜１００ｍｇ／ｋｇ、好
ましくは１０〜２０ｍｇ／ｋｇであろう。
【０００９】従って、イーノセインＢはこれを活性成分
として含有する製薬組成物を調製するのに使用すること
ができ、従って本発明の主題はこのような製薬組成物に
ある。本発明に従うイーノセインＢは、消化器経路で、
非経口的に又は局所的に、例えば経皮的に使用すること
ができる。これは固体でも液体でもよく、人の医薬とし
て慣用されている製剤形状で、例えば無味若しくは糖衣
錠剤、カプセル、顆粒、座薬、注射用調合剤、ペッサリ
ー、軟膏、クリーム、ゲル及び貼り薬の形状で提供でき
る。これらは通常の方法により製造される。活性成分
は、これらの製薬組成物に通常使用される補助剤、例え
ばタルク、アラビアゴム、ラクトース、でんぷん、ステ
アリン酸マグネシウム、ココアバター、水性若しくは非
水性のビヒクル、動物性若しくは植物性の脂肪物質、パ
ラフィン誘導体、グリコール類、各種の湿潤、分散若し
くは乳化剤、保存剤と配合することができる。
として含有する製薬組成物を調製するのに使用すること
ができ、従って本発明の主題はこのような製薬組成物に
ある。本発明に従うイーノセインＢは、消化器経路で、
非経口的に又は局所的に、例えば経皮的に使用すること
ができる。これは固体でも液体でもよく、人の医薬とし
て慣用されている製剤形状で、例えば無味若しくは糖衣
錠剤、カプセル、顆粒、座薬、注射用調合剤、ペッサリ
ー、軟膏、クリーム、ゲル及び貼り薬の形状で提供でき
る。これらは通常の方法により製造される。活性成分
は、これらの製薬組成物に通常使用される補助剤、例え
ばタルク、アラビアゴム、ラクトース、でんぷん、ステ
アリン酸マグネシウム、ココアバター、水性若しくは非
水性のビヒクル、動物性若しくは植物性の脂肪物質、パ
ラフィン誘導体、グリコール類、各種の湿潤、分散若し
くは乳化剤、保存剤と配合することができる。
【００１０】また、本発明の主題は、 ａ）エピロビウム・パルビフロラムの乾燥試料に水か又
は水と混和性の溶媒と水との混合物のいずれかを添加す
ることにより抽出し、 ｂ）ろ過し、要すれば減圧下に水と混和性の溶媒の蒸発
が達成されるまで濃縮を行い、 ｃ）水性相の凍結乾燥を行うか又は極性溶媒による抽出
を行い、その極性溶媒を乾燥抽出物が得られるまで蒸発
させ、 ｄ）凍結乾燥物又は乾燥抽出物を逆相ＨＰＬＣ又は重合
体ゲルのカラムにより精製する 工程を順次に行うことを特徴とする、エピロビウム・パ
ルビフロラムからイーノセインＢを製造する方法にあ
る。
は水と混和性の溶媒と水との混合物のいずれかを添加す
ることにより抽出し、 ｂ）ろ過し、要すれば減圧下に水と混和性の溶媒の蒸発
が達成されるまで濃縮を行い、 ｃ）水性相の凍結乾燥を行うか又は極性溶媒による抽出
を行い、その極性溶媒を乾燥抽出物が得られるまで蒸発
させ、 ｄ）凍結乾燥物又は乾燥抽出物を逆相ＨＰＬＣ又は重合
体ゲルのカラムにより精製する 工程を順次に行うことを特徴とする、エピロビウム・パ
ルビフロラムからイーノセインＢを製造する方法にあ
る。
【００１１】したがって、本発明の製造方法は、下記の
ように行われる抽出、次いで精製から本質的になってい
る。
ように行われる抽出、次いで精製から本質的になってい
る。
【００１２】抽出 エピロビウム・パルビフロラムの乾燥試料に水か又は水
と混和性の溶媒、例えばメタノール、エタノール、イソ
プロパノール、ブタノールのようなアルコール又はアセ
トンと水との混合物を添加する。乾燥試料は好ましくは
エピロビウム・パルビフロラムの葉である。水と混和性
の溶媒の好ましいものはアセトンである。撹拌し、ろ過
した後、要すればろ液を減圧下に水と混和性の溶媒が蒸
発されるまで濃縮する。残った水性相を凍結乾燥するか
又は当業者に周知の各種の極性溶媒、例えばジエチルエ
ーテル、酢酸エチル又はブタノールによって抽出する。
ブタノールを使用するのが好ましい。次いでこれらの画
分を集めて５０℃を越えない温度で減圧下に乾燥抽出物
が得られるまで蒸発させる。
と混和性の溶媒、例えばメタノール、エタノール、イソ
プロパノール、ブタノールのようなアルコール又はアセ
トンと水との混合物を添加する。乾燥試料は好ましくは
エピロビウム・パルビフロラムの葉である。水と混和性
の溶媒の好ましいものはアセトンである。撹拌し、ろ過
した後、要すればろ液を減圧下に水と混和性の溶媒が蒸
発されるまで濃縮する。残った水性相を凍結乾燥するか
又は当業者に周知の各種の極性溶媒、例えばジエチルエ
ーテル、酢酸エチル又はブタノールによって抽出する。
ブタノールを使用するのが好ましい。次いでこれらの画
分を集めて５０℃を越えない温度で減圧下に乾燥抽出物
が得られるまで蒸発させる。
【００１３】精製 活性成分の精製は、重合体ゲルのカラムに通すか又は逆
相ＨＰＬＣにより行う。重合体ゲルのカラムによる精製 上記で得た乾燥抽出物又は凍結乾燥物を蒸留水に溶解
し、生じた混合物を重合体ゲルのカラム、例えばダイア
イオンＨＰ２０、セファデックスＬＨ２０又はトヨパー
ルＨＷ４０型のカラムに注ぎ入れる。溶出を蒸留水、次
いでアルコールの割合を順次に増大させたアルコール／
蒸留水混合物により行う。イーノセインＢを含有する画
分はＨＰＬＣにより同定し、次いで凍結乾燥する。使用
するアルコールは好ましくはメタノールである。逆相ＨＰＬＣによる精製 上で得た乾燥抽出物又は凍結乾燥物を蒸留水に溶解し、
次いでこれを逆相ＨＰＬＣにより精製する。溶出をアセ
トニトリル／水混合物のような極性親水性溶媒の混合物
からなる勾配でもって、トリフルオル酢酸（ＴＦＡ）の
ような酸を使用する酸性ｐＨにおいて行う。次いで、イ
ーノセインＢを含有する画分を、保持時間及びダイオー
ドアレイ検出器（２１０−５００ｎｍ）又はＵＶ検出器
を使用する分析により得たスペクトルの関数として単離
する。場合により二回目の精製の後、所期生成物の凍結
乾燥を行う。
相ＨＰＬＣにより行う。重合体ゲルのカラムによる精製 上記で得た乾燥抽出物又は凍結乾燥物を蒸留水に溶解
し、生じた混合物を重合体ゲルのカラム、例えばダイア
イオンＨＰ２０、セファデックスＬＨ２０又はトヨパー
ルＨＷ４０型のカラムに注ぎ入れる。溶出を蒸留水、次
いでアルコールの割合を順次に増大させたアルコール／
蒸留水混合物により行う。イーノセインＢを含有する画
分はＨＰＬＣにより同定し、次いで凍結乾燥する。使用
するアルコールは好ましくはメタノールである。逆相ＨＰＬＣによる精製 上で得た乾燥抽出物又は凍結乾燥物を蒸留水に溶解し、
次いでこれを逆相ＨＰＬＣにより精製する。溶出をアセ
トニトリル／水混合物のような極性親水性溶媒の混合物
からなる勾配でもって、トリフルオル酢酸（ＴＦＡ）の
ような酸を使用する酸性ｐＨにおいて行う。次いで、イ
ーノセインＢを含有する画分を、保持時間及びダイオー
ドアレイ検出器（２１０−５００ｎｍ）又はＵＶ検出器
を使用する分析により得たスペクトルの関数として単離
する。場合により二回目の精製の後、所期生成物の凍結
乾燥を行う。
【００１４】本発明のさらに特別の主題は、エピロビウ
ム・パルビフロラムの乾燥試料にアセトン／水混合物を
添加することにより抽出を行うことを特徴とする、前記
のようなエピロビウム・パルビフロラムからイーノセイ
ンＢを製造する方法にある。
ム・パルビフロラムの乾燥試料にアセトン／水混合物を
添加することにより抽出を行うことを特徴とする、前記
のようなエピロビウム・パルビフロラムからイーノセイ
ンＢを製造する方法にある。
【００１５】
【実施例】下記の実施例は本発明を例示するものであっ
て、それを何ら制限するものではない。
て、それを何ら制限するものではない。
【００１６】例１：アセトン／水混合物によるエピロビ
ウム・パルビフロラムの葉及び枝からの抽出並びに粗製
のイーノセインＢの取得 １２７５ｇのエピロビウム・パルビフロラムの乾燥し破
砕した葉及び枝を１００リットルの反応器に導入する。
２０リットルのアセトン−水混合物（７−３）を添加す
る。混合物を機械的撹拌機を使用して６０時間撹拌す
る。混合物をろ過し、葉を４リットルのアセトンにより
すすぐ。ろ液を減圧下に３５℃で、アセトンが蒸発する
ようにして約６リットルの容積まで濃縮する。残った水
性相を２×１リットルのジエチルエーテル、２×１リッ
トルの酢酸エチル及び２×０．５リットルのブタノール
により続けて抽出する。これらのうち最初の二つの画分
を減圧下に３５℃の温度で蒸発させた後、１００ｇの黒
色樹脂状物及び１０ｇの脆い褐色発泡体をそれぞれ得
た。また、第三の画分をさらに低い減圧下に５０℃の温
度で蒸発させた後、４５ｇの黒色樹脂状物を得た。この
最後の画分がイーノセインＢに最も富んでいた。
ウム・パルビフロラムの葉及び枝からの抽出並びに粗製
のイーノセインＢの取得 １２７５ｇのエピロビウム・パルビフロラムの乾燥し破
砕した葉及び枝を１００リットルの反応器に導入する。
２０リットルのアセトン−水混合物（７−３）を添加す
る。混合物を機械的撹拌機を使用して６０時間撹拌す
る。混合物をろ過し、葉を４リットルのアセトンにより
すすぐ。ろ液を減圧下に３５℃で、アセトンが蒸発する
ようにして約６リットルの容積まで濃縮する。残った水
性相を２×１リットルのジエチルエーテル、２×１リッ
トルの酢酸エチル及び２×０．５リットルのブタノール
により続けて抽出する。これらのうち最初の二つの画分
を減圧下に３５℃の温度で蒸発させた後、１００ｇの黒
色樹脂状物及び１０ｇの脆い褐色発泡体をそれぞれ得
た。また、第三の画分をさらに低い減圧下に５０℃の温
度で蒸発させた後、４５ｇの黒色樹脂状物を得た。この
最後の画分がイーノセインＢに最も富んでいた。
【００１７】例２：水によるエピロビウム・パルビフロ
ラムの葉及び枝からの抽出並びに粗製のイーノセインＢ
の取得 ２０ｇのエピロビウム・パルビフロラムの破砕した葉及
び枝を６５℃で３５０ｍｌの水により覆う。次いで混合
物を周囲温度で２０時間機械的に撹拌し続ける。次いで
混合物をろ過し、葉を１００ｍｌの蒸留水によりすす
ぐ。このようにして、４５０ｍｌの透明な黒色溶液を得
た。この溶液の５０ｍｌを凍結乾燥すると、所期の生成
物に富む５００ｍｇの淡緑色粉末が得られた。
ラムの葉及び枝からの抽出並びに粗製のイーノセインＢ
の取得 ２０ｇのエピロビウム・パルビフロラムの破砕した葉及
び枝を６５℃で３５０ｍｌの水により覆う。次いで混合
物を周囲温度で２０時間機械的に撹拌し続ける。次いで
混合物をろ過し、葉を１００ｍｌの蒸留水によりすす
ぐ。このようにして、４５０ｍｌの透明な黒色溶液を得
た。この溶液の５０ｍｌを凍結乾燥すると、所期の生成
物に富む５００ｍｇの淡緑色粉末が得られた。
【００１８】例３：イーノセインＢの同定及び精製 例２に従って製造した凍結乾燥物を蒸留水に溶解する
（蒸留水１ｍｌ当たり２ｍｇ）。１０ｍｌ（２０ｍｇ）
をノバパック（ＮＯＶＡＰＡＣＫ：商標）型の分取クロ
マトグラフィーカラム（Ｃ１８ ６μ ７．８×３００
ｍｍ）に注入する。溶出を下記の条件下で溶媒勾配によ
って５ｍｌ／ｍｉｎの流量で行う（容量％）。 ・０〜２分：試料 ・２〜７分：０．１％ｖ／ｖのトリフルオル酢酸（ＴＦ
Ａ）を含む１００％の水 ・７〜５７分：０．１％ｖ／ｖのＴＦＡを含むアセトニ
トリルの０から１０％ｖ／ｖまでの線形勾配 ・５７〜７７分：０．１％ｖ／ｖのＴＦＡを含むアセト
ニトリルの１０から２５％ｖ／ｖまでの線形勾配 ・７７〜９７分：０．１％ｖ／ｖのＴＦＡを含むアセト
ニトリルの２５から９０％ｖ／ｖまでの線形勾配 検出は、２１０ｎｍ〜４００ｎｍの範囲の波長でダイオ
ードアレイを使用して行う。集められた４３個の画分の
うち１個だけが５−α−レダクターゼに対して活性を有
し、保持時間は３６〜３８分の間であった。純度を検査
した後、この画分を凍結乾燥する。所期の物質をＮＭＲ
及び質量分析計によりただちに分析する（この画分のＮ
ＭＲ及び質量分析値は、文献：Ｔ．ハタノ他、Ｊ．Ｃｈ
ｅｍ．Ｓｏｃ．Ｐｅｒｋｉｎ Ｔｒａｎｓ．１（１９９
０），２７３５−２７４３に記載のものと比較でき
る）。ＮＭＲ ２５０ＭＨｚ 溶媒：アセトン−ｄ6 、４５℃、参照物質ＳｉＭｅ4 、
ｐｐｍ、Ｊ（Ｈｚ）α−グルコース Ｈ−１；６．２０ｄ；Ｊ＝３．５ Ｈ−２；５．８７ｄｄ；Ｊ＝３．５−１０．５ Ｈ−３；６．１１ｄｄ；Ｊ＝１０．５ Ｈ−４；５．５９ｔ；Ｊ＝１０．５ Ｈ−５；４．５７ｄｄ；Ｊ＝６−１０ Ｈ−６；５．２４ｄｄ；Ｊ＝６−１３ ３．６３ｄ；Ｊ＝１３ β−グルコース Ｈ−１；４．４２ｄ；Ｊ＝８ Ｈ−２；５．１６ｄｄ；Ｊ＝８−９．５ Ｈ−３；５．４５ｔ；Ｊ＝９．５ Ｈ−４；４．９０ｔ；Ｊ＝９．５ Ｈ−５；４．１３ｄｄ；Ｊ＝５−９．５ Ｈ−６；５．０１ｄｄ；Ｊ＝５−１３ ３．８４ｄ；Ｊ＝１３ 例４の式を参照質量スペクトル ｍ／ｚＭＡＬＤＩ（マトリックスアシストレーザー脱着
イオン化） １５６９［（Ｍ＋Ｈ）］+ １５９１［（Ｍ＋Ｎａ）］+ １６０７［（Ｍ＋Ｋ）］+
（蒸留水１ｍｌ当たり２ｍｇ）。１０ｍｌ（２０ｍｇ）
をノバパック（ＮＯＶＡＰＡＣＫ：商標）型の分取クロ
マトグラフィーカラム（Ｃ１８ ６μ ７．８×３００
ｍｍ）に注入する。溶出を下記の条件下で溶媒勾配によ
って５ｍｌ／ｍｉｎの流量で行う（容量％）。 ・０〜２分：試料 ・２〜７分：０．１％ｖ／ｖのトリフルオル酢酸（ＴＦ
Ａ）を含む１００％の水 ・７〜５７分：０．１％ｖ／ｖのＴＦＡを含むアセトニ
トリルの０から１０％ｖ／ｖまでの線形勾配 ・５７〜７７分：０．１％ｖ／ｖのＴＦＡを含むアセト
ニトリルの１０から２５％ｖ／ｖまでの線形勾配 ・７７〜９７分：０．１％ｖ／ｖのＴＦＡを含むアセト
ニトリルの２５から９０％ｖ／ｖまでの線形勾配 検出は、２１０ｎｍ〜４００ｎｍの範囲の波長でダイオ
ードアレイを使用して行う。集められた４３個の画分の
うち１個だけが５−α−レダクターゼに対して活性を有
し、保持時間は３６〜３８分の間であった。純度を検査
した後、この画分を凍結乾燥する。所期の物質をＮＭＲ
及び質量分析計によりただちに分析する（この画分のＮ
ＭＲ及び質量分析値は、文献：Ｔ．ハタノ他、Ｊ．Ｃｈ
ｅｍ．Ｓｏｃ．Ｐｅｒｋｉｎ Ｔｒａｎｓ．１（１９９
０），２７３５−２７４３に記載のものと比較でき
る）。ＮＭＲ ２５０ＭＨｚ 溶媒：アセトン−ｄ6 、４５℃、参照物質ＳｉＭｅ4 、
ｐｐｍ、Ｊ（Ｈｚ）α−グルコース Ｈ−１；６．２０ｄ；Ｊ＝３．５ Ｈ−２；５．８７ｄｄ；Ｊ＝３．５−１０．５ Ｈ−３；６．１１ｄｄ；Ｊ＝１０．５ Ｈ−４；５．５９ｔ；Ｊ＝１０．５ Ｈ−５；４．５７ｄｄ；Ｊ＝６−１０ Ｈ−６；５．２４ｄｄ；Ｊ＝６−１３ ３．６３ｄ；Ｊ＝１３ β−グルコース Ｈ−１；４．４２ｄ；Ｊ＝８ Ｈ−２；５．１６ｄｄ；Ｊ＝８−９．５ Ｈ−３；５．４５ｔ；Ｊ＝９．５ Ｈ−４；４．９０ｔ；Ｊ＝９．５ Ｈ−５；４．１３ｄｄ；Ｊ＝５−９．５ Ｈ−６；５．０１ｄｄ；Ｊ＝５−１３ ３．８４ｄ；Ｊ＝１３ 例４の式を参照質量スペクトル ｍ／ｚＭＡＬＤＩ（マトリックスアシストレーザー脱着
イオン化） １５６９［（Ｍ＋Ｈ）］+ １５９１［（Ｍ＋Ｎａ）］+ １６０７［（Ｍ＋Ｋ）］+
【００１９】例４：イーノセインＢの精製 ミクロボンダパック分取クロマトグラフィーカラム（Ｃ
１８ １０μ、長さ５０ｃｍ、直径２ｃｍ（１イン
チ））を使用する。例２に従って製造した１ｇの凍結乾
燥物を５０ｍｌの水に溶解してなるものを注入する。溶
出を０．１％のトリフルオル酢酸を含有する水−アセト
ニトリル溶離剤混合物によって行う。アセトニトリルの
濃度勾配は、３０分毎に１５％ｖ／ｖづつ増大させる。
生成物をＵＶ検出器（波長３０５ｎｍ）により検出す
る。所期の物質は２７分の保持時間で現れた。画分を凍
結乾燥した後、約３５ｍｇの純粋な所期物質がベージュ
色粉末として回収された。ＵＶ ＭｅＯＨ／ＨＣｌ ０．１Ｎ ２１８ｎＭ（＝１２００００）及び２６６ｎＭ（＝５５
０００） ＭｅＯＨ ２１８ｎＭ（ｌｏｇ＝５．０９）及び２６５ｎＭ（ｌｏ
ｇ＝４．７７） ＭｅＯＨ／ＮａＯＨ ０．１Ｎ ２８５ｎＭ（＝３３０００）及びｉｎｆｌ．３１５及び
４７３ｎＭ 不可逆的変化円二色性 ＭｅＯＨ／ＨＣｌ ０．１Ｎ Ｍａｘ．２１９（ｎＭ）；（０）＝＋３．８ １０５ Ｉｎｆｌ．２３６（ｎＭ）；（０）＝＋１．７ １０５ Ｍａｘ．２５９（ｎＭ）；（０）＝−４．５ １０４ Ｉｎｆｌ．２８２（ｎＭ）；（０）＝＋９．５ １０４ＮＭＲ ４００ Ｃ１３ ＭＨｚ 溶媒：Ｄ2 Ｏ 温度：プロトンについて２９７Ｋ 炭素１３について３１８Ｋ 参照：ＴＳＰ、０ｐｐｍ 略号：ｐｐｍ：ｐｐｍで表わした化学シフト Ｊ（Ｈｚ）：Ｈｚで表わしたカップリング定数多重線 ｓ：シングレット ｗｓ：広いシングレット ｄ：ダブレット ｄｄ：ダブレットのダブレット ｔ：トリプレット
１８ １０μ、長さ５０ｃｍ、直径２ｃｍ（１イン
チ））を使用する。例２に従って製造した１ｇの凍結乾
燥物を５０ｍｌの水に溶解してなるものを注入する。溶
出を０．１％のトリフルオル酢酸を含有する水−アセト
ニトリル溶離剤混合物によって行う。アセトニトリルの
濃度勾配は、３０分毎に１５％ｖ／ｖづつ増大させる。
生成物をＵＶ検出器（波長３０５ｎｍ）により検出す
る。所期の物質は２７分の保持時間で現れた。画分を凍
結乾燥した後、約３５ｍｇの純粋な所期物質がベージュ
色粉末として回収された。ＵＶ ＭｅＯＨ／ＨＣｌ ０．１Ｎ ２１８ｎＭ（＝１２００００）及び２６６ｎＭ（＝５５
０００） ＭｅＯＨ ２１８ｎＭ（ｌｏｇ＝５．０９）及び２６５ｎＭ（ｌｏ
ｇ＝４．７７） ＭｅＯＨ／ＮａＯＨ ０．１Ｎ ２８５ｎＭ（＝３３０００）及びｉｎｆｌ．３１５及び
４７３ｎＭ 不可逆的変化円二色性 ＭｅＯＨ／ＨＣｌ ０．１Ｎ Ｍａｘ．２１９（ｎＭ）；（０）＝＋３．８ １０５ Ｉｎｆｌ．２３６（ｎＭ）；（０）＝＋１．７ １０５ Ｍａｘ．２５９（ｎＭ）；（０）＝−４．５ １０４ Ｉｎｆｌ．２８２（ｎＭ）；（０）＝＋９．５ １０４ＮＭＲ ４００ Ｃ１３ ＭＨｚ 溶媒：Ｄ2 Ｏ 温度：プロトンについて２９７Ｋ 炭素１３について３１８Ｋ 参照：ＴＳＰ、０ｐｐｍ 略号：ｐｐｍ：ｐｐｍで表わした化学シフト Ｊ（Ｈｚ）：Ｈｚで表わしたカップリング定数多重線 ｓ：シングレット ｗｓ：広いシングレット ｄ：ダブレット ｄｄ：ダブレットのダブレット ｔ：トリプレット
【００２０】イーノセインＢの構造を以下に示す。
【化１】
【００２１】イーノセインＢのＮＭＲデータを以下の表
に示す。
に示す。
【表１】
【表２】
【表３】 上記の表において ａ：属性がそれらの間で反転する場合があり得る ｂ：属性がそれらの間で反転する場合があり得る ｃ：属性がそれらの間で反転する場合があり得る ことを示す。
【００２２】質量スペクトル 実験の部 この研究に使用した装置は、トリプルセクター−ダブル
フォーカス "ＶＧオートスペックＥ" 質量分析計（フィ
ソン・インスツルメント社製）であった。試料の分子質
量はＬＳＩＭＳ（液体二次イオン化質量分析計）による
正帯電及び負帯電モードでのイオン化の下で決定する。
試料は予め "マジックバレット／ＴＦＡ" と称するマト
リックスに溶解してからＣｓ+ ガンからの一次イオンビ
ームにより衝撃させる。このビームは３０ＫＶの電圧の
下で加速し、２〜３μＡｍｐの能力を有する。二次イオ
ン（試料）を８ＫＶの電圧の下で加速する。フラグメン
ト化の研究は、Ｂ／Ｅ＝一定の方法に従ってリンクされ
たスキャンにより行う。このために、 "ペアレント" イ
オンを場の第一自由領域（１ＦＦＲ）に位置させたセル
において衝突によりフラグメント化させる。このセルに
導入される衝突ガスは空気であって、その圧力は "ペア
レント" イオンの初期強度を半分だけ低下させるのに必
要なものである。この研究は次に二つの段階、 ａ）準分子イオン（ＭＨ+ ）のフラグメント化 ｂ）前に得られたイオンのそれぞれについての連続フラ
グメント化で行った。
フォーカス "ＶＧオートスペックＥ" 質量分析計（フィ
ソン・インスツルメント社製）であった。試料の分子質
量はＬＳＩＭＳ（液体二次イオン化質量分析計）による
正帯電及び負帯電モードでのイオン化の下で決定する。
試料は予め "マジックバレット／ＴＦＡ" と称するマト
リックスに溶解してからＣｓ+ ガンからの一次イオンビ
ームにより衝撃させる。このビームは３０ＫＶの電圧の
下で加速し、２〜３μＡｍｐの能力を有する。二次イオ
ン（試料）を８ＫＶの電圧の下で加速する。フラグメン
ト化の研究は、Ｂ／Ｅ＝一定の方法に従ってリンクされ
たスキャンにより行う。このために、 "ペアレント" イ
オンを場の第一自由領域（１ＦＦＲ）に位置させたセル
において衝突によりフラグメント化させる。このセルに
導入される衝突ガスは空気であって、その圧力は "ペア
レント" イオンの初期強度を半分だけ低下させるのに必
要なものである。この研究は次に二つの段階、 ａ）準分子イオン（ＭＨ+ ）のフラグメント化 ｂ）前に得られたイオンのそれぞれについての連続フラ
グメント化で行った。
【００２３】結果 Ａ）正帯電モードでのＬＳＩＭＳ ＭＨ+ ＝１５６９Ｄａ Ｂ）負帯電モードでのＬＳＩＭＳ （Ｍ−Ｈ）- ＝１５６７Ｄａ Ｃ）ＭＨ+ イオン＝１５６９Ｄａのフラグメント化 このスペクトルで観察された主なイオンは１３９９+ −
１２３７+ −７６７+−４５３+ であった。 Ｄ）１２３７+ イオンのフラグメント化 このスペクトルで観察された主なイオンは１０８５+ −
７６７+ −４５３+ であった。 Ｅ）７６７+ イオンのフラグメント化 このスペクトルで観察された主なイオンは７４９+ −６
１５+ −４７１+ −４５３+ −３１５+ −１５２+ であ
った。 Ｆ）４５３+ イオンのフラグメント化 特に４３５Ｄａイオン（脱水）を生じる特徴的でないス
ペクトル。
１２３７+ −７６７+−４５３+ であった。 Ｄ）１２３７+ イオンのフラグメント化 このスペクトルで観察された主なイオンは１０８５+ −
７６７+ −４５３+ であった。 Ｅ）７６７+ イオンのフラグメント化 このスペクトルで観察された主なイオンは７４９+ −６
１５+ −４７１+ −４５３+ −３１５+ −１５２+ であ
った。 Ｆ）４５３+ イオンのフラグメント化 特に４３５Ｄａイオン（脱水）を生じる特徴的でないス
ペクトル。
【００２４】例５：イーノセインＢの精製 例１に従って得た７１０ｍｇの黒色樹脂状物を５ｍｌの
蒸留水に溶解し、ダイアイオンＨＰ２０樹脂カラム（２
０ｃｍ／２ｃｍ）に注ぎ入れる。溶出を２００ｍｌの蒸
留水で、次いで２００ｍｌの蒸留水−メタノール混合物
（８０−２０）で行う。この第二画分を凍結乾燥して５
８ｍｇのイーノセインＢを粉末状のベイジュ色固体のと
して得た。ＮＭＲ、ＵＶ、ＣＤ及び質量分析計による分
析は例４に記載したものと同等であった。
蒸留水に溶解し、ダイアイオンＨＰ２０樹脂カラム（２
０ｃｍ／２ｃｍ）に注ぎ入れる。溶出を２００ｍｌの蒸
留水で、次いで２００ｍｌの蒸留水−メタノール混合物
（８０−２０）で行う。この第二画分を凍結乾燥して５
８ｍｇのイーノセインＢを粉末状のベイジュ色固体のと
して得た。ＮＭＲ、ＵＶ、ＣＤ及び質量分析計による分
析は例４に記載したものと同等であった。
【００２５】イーノセインＢの薬理学的研究 酵素とその基質（テストステロン）をインキュベーショ
ンし、形成された５−α−還元代謝産物（ジヒドロテス
トステロン（ＤＨＴ）及び５−α−アンドロスタンジオ
ール）の量をＨＰＬＣにより測定することによって５−
α−レダクターゼ活性を測定するための試験をインビト
ロで行う。前立腺の良性肥大（ＢＨＰ）のために前立腺
切除術を行って得たヒト前立腺のホモジネートを使用す
る。
ンし、形成された５−α−還元代謝産物（ジヒドロテス
トステロン（ＤＨＴ）及び５−α−アンドロスタンジオ
ール）の量をＨＰＬＣにより測定することによって５−
α−レダクターゼ活性を測定するための試験をインビト
ロで行う。前立腺の良性肥大（ＢＨＰ）のために前立腺
切除術を行って得たヒト前立腺のホモジネートを使用す
る。
【００２６】方法 ホモジネートの調製 前立腺を一連の手術室を出た直後に集め、ドライアイス
を満たした容器内に置いたアルミニウムペイパーで包装
する。実験室では、ホモジネートが直ちに調製できない
場合には、前立腺は−８０℃に貯蔵することができる。
前立腺を氷の上で非常に薄い切片に切断し、次いでポリ
トロン、次いでポッターガラスにおいて媒質Ａ（２０ｍ
Ｍの燐酸カリウム、ｐＨ６．５；０．３２Ｍのサッカロ
ース；１ｍＭのジチオトレイット（ＤＴＴ）；５０μＭ
のトリホスホピリジンヌクレオチドの水和ナトリウム塩
（ＮＡＤＰＨ））内で粉砕する。１４０，０００Ｇで４
℃で６０分間遠心処理した後、生成物を１０〜２０ｍｌ
の媒質Ｂ（２０ｍＭの燐酸カリウム、ｐＨ６．５；２０
％のグリセリン；１ｍＭのジチオトレイット）に再懸濁
させる。生成物をナンクチューブに分け、−８０℃に貯
蔵する。ホモジネートの少量についてこれを試験におい
て将来使用するためにたんぱく質の量を定量し、これに
よりホモジネート１ｍｌ当たり少なくとも１０ｍｇのた
んぱく質を有するようにする。
を満たした容器内に置いたアルミニウムペイパーで包装
する。実験室では、ホモジネートが直ちに調製できない
場合には、前立腺は−８０℃に貯蔵することができる。
前立腺を氷の上で非常に薄い切片に切断し、次いでポリ
トロン、次いでポッターガラスにおいて媒質Ａ（２０ｍ
Ｍの燐酸カリウム、ｐＨ６．５；０．３２Ｍのサッカロ
ース；１ｍＭのジチオトレイット（ＤＴＴ）；５０μＭ
のトリホスホピリジンヌクレオチドの水和ナトリウム塩
（ＮＡＤＰＨ））内で粉砕する。１４０，０００Ｇで４
℃で６０分間遠心処理した後、生成物を１０〜２０ｍｌ
の媒質Ｂ（２０ｍＭの燐酸カリウム、ｐＨ６．５；２０
％のグリセリン；１ｍＭのジチオトレイット）に再懸濁
させる。生成物をナンクチューブに分け、−８０℃に貯
蔵する。ホモジネートの少量についてこれを試験におい
て将来使用するためにたんぱく質の量を定量し、これに
よりホモジネート１ｍｌ当たり少なくとも１０ｍｇのた
んぱく質を有するようにする。
【００２７】５−α−レダクターゼ活性の測定 試験管１本当たり１ｍｌの媒質の割合でｐＨ５．５でく
えん酸塩（前立腺の標準媒質）の存在下にインキュベー
ションを行う。 １）基質（Ｓ）、即ち、くえん酸三ナトリウム緩衝液ｐ
Ｈ５．０中の１００の同位体希釈度を持つ "未標識" テ
ストステロンと "トリチウム化" テストステロンとの混
合物の調製 ａ）４０ｍＭのくえん酸三ナトリウム緩衝液：１１．７
６ｇのくえん酸３Ｎａ・２Ｈ2 Ｏ（Ｍｅｒｋ ｒｅｆ．
Ａｒｔ ６４４８）を秤量し、これを１リットルの蒸留
水（ミリキュウ−Ｑ社製）に溶解し、ｐＨを５．０に調
節する。 ｂ）１００の同位体希釈度を持つ "未標識" テストステ
ロンと "トリチウム化" テストステロンとの混合物：テ
ストステロンの１ｍＭ溶液を得るために、２．８８ｍｇ
の "未標識" テストステロンを秤量し、これを１０ｍｌ
のエタノールに溶解する。この溶液を１０ｍｌのくえん
酸塩緩衝液中で０．９９／１０００、即ち９．９μｌま
で希釈する（＝１０-6Ｍ溶液）。上記の溶液の１０ｍｌ
に９μｌのテストステロン− 3Ｈ（ＮＥＴ−３７０）を
添加する（＝１００の同位体希釈度）。基質（Ｓ）は使
用できる状態にある。 ２）酵素＋ＤＴＴ＋ＮＡＤＰＨ混合物の調製 ａ）燐酸カリウム緩衝液、４０ｍＭ、ｐＨ６．５：５．
４４ｇのＫＨ2 ＰＯ4（Ｒｉｅｄｅｌ ｄｅ Ｈａｅｎ
ｒｅｆ．３０４０７）を秤量し、これを１リットルの
蒸留水Ｂに（ミリキュウ−Ｑ社製）に溶解し、ｐＨを
６．５に調節する。 ｂ）ＤＴＴ、１ｍＭ（シグマ社製）：３．１ｍｇのＤＴ
Ｔを秤量し、これを１ｍｌの燐酸塩緩衝液に溶解する。 ｃ）ＮＡＤＰＨ、５００μＭ（シグマ社製）：８．３３
ｍｇのＮＡＤＰＨを秤量し、これを１ｍｌの燐酸塩緩衝
液に溶解する。 ｄ）酵素＋ＤＴＴ＋ＮＡＤＰＨ混合物（Ｅ）：０．５ｍ
ｇの前立腺ホモジネートのたんぱく質、５０μｌのＤＴ
Ｔ及び５０μｌのＮＡＤＰＨを各試験のために４℃で混
合する。この混合物を燐酸塩緩衝液により５００μｌに
する。 ３）インキュベーション 試験の数と同じ数の試験管を準備する。５００μｌの基
質（Ｓ）及び１０μｌの阻害剤を所望の濃度で（又は対
照例についてはエタノール）を各試験管に入れる。予備
インキュベーションすべき混合物（Ｓ）を入れた試験管
及び混合物（Ｅ）を入れた小びんを水浴で３〜５分間加
熱する。反応を開始させるために、混合物（Ｓ）と阻害
剤を入れた各試験管に５００μｌの混合物（Ｅ）を素早
く移し、３７℃でゆっくりと撹拌しながら３０分間イン
キュベーションを行う。インキュベーションの終わりに
試験管に氷を入れて反応を停止させる。 ４）抽出 反応を停止させたならば直に各試験管に２ｍｌの酢酸エ
チルを添加し、マルチチューブ渦巻発生器により１分間
撹拌する。試験管を１０分間デカンテーションし、次い
で抽出物（＝８０％）の（上部）有機相の１．６ｍｌを
別の試験管に回収する。酢酸エチルを全部蒸発させた
後、ＨＰＬＣにおいて使用する８００μｌの易動相を各
試験管に添加する。 ５）ＨＰＬＣクロマトグラフィー 形成された化合物を逆相高性能液体クロマトグラフィー
（ＨＰＬＣ）により分離することによりインキュベーシ
ョン中に生成した代謝産物の量を測定した。ＯＤＳ−ハ
イパーシルカラム（粒子直径＝５μｍ）及び４５／１５
／４０の比率のＭｅＯＨ／ＴＨＦ／Ｈ2 Ｏからなる易動
相を使用する。抽出後に集めた抽出物をＨＰＬＣ系に自
動的に注入し、線形放射能測定系（ベルソルド社製）に
よって放射性代謝産物のみ、従って基質により標識され
たテストステロンから形成された代謝産物のみを評価し
た。この測定は非常に敏感であり、存在し得る内生的生
成物の全てを除去する。
えん酸塩（前立腺の標準媒質）の存在下にインキュベー
ションを行う。 １）基質（Ｓ）、即ち、くえん酸三ナトリウム緩衝液ｐ
Ｈ５．０中の１００の同位体希釈度を持つ "未標識" テ
ストステロンと "トリチウム化" テストステロンとの混
合物の調製 ａ）４０ｍＭのくえん酸三ナトリウム緩衝液：１１．７
６ｇのくえん酸３Ｎａ・２Ｈ2 Ｏ（Ｍｅｒｋ ｒｅｆ．
Ａｒｔ ６４４８）を秤量し、これを１リットルの蒸留
水（ミリキュウ−Ｑ社製）に溶解し、ｐＨを５．０に調
節する。 ｂ）１００の同位体希釈度を持つ "未標識" テストステ
ロンと "トリチウム化" テストステロンとの混合物：テ
ストステロンの１ｍＭ溶液を得るために、２．８８ｍｇ
の "未標識" テストステロンを秤量し、これを１０ｍｌ
のエタノールに溶解する。この溶液を１０ｍｌのくえん
酸塩緩衝液中で０．９９／１０００、即ち９．９μｌま
で希釈する（＝１０-6Ｍ溶液）。上記の溶液の１０ｍｌ
に９μｌのテストステロン− 3Ｈ（ＮＥＴ−３７０）を
添加する（＝１００の同位体希釈度）。基質（Ｓ）は使
用できる状態にある。 ２）酵素＋ＤＴＴ＋ＮＡＤＰＨ混合物の調製 ａ）燐酸カリウム緩衝液、４０ｍＭ、ｐＨ６．５：５．
４４ｇのＫＨ2 ＰＯ4（Ｒｉｅｄｅｌ ｄｅ Ｈａｅｎ
ｒｅｆ．３０４０７）を秤量し、これを１リットルの
蒸留水Ｂに（ミリキュウ−Ｑ社製）に溶解し、ｐＨを
６．５に調節する。 ｂ）ＤＴＴ、１ｍＭ（シグマ社製）：３．１ｍｇのＤＴ
Ｔを秤量し、これを１ｍｌの燐酸塩緩衝液に溶解する。 ｃ）ＮＡＤＰＨ、５００μＭ（シグマ社製）：８．３３
ｍｇのＮＡＤＰＨを秤量し、これを１ｍｌの燐酸塩緩衝
液に溶解する。 ｄ）酵素＋ＤＴＴ＋ＮＡＤＰＨ混合物（Ｅ）：０．５ｍ
ｇの前立腺ホモジネートのたんぱく質、５０μｌのＤＴ
Ｔ及び５０μｌのＮＡＤＰＨを各試験のために４℃で混
合する。この混合物を燐酸塩緩衝液により５００μｌに
する。 ３）インキュベーション 試験の数と同じ数の試験管を準備する。５００μｌの基
質（Ｓ）及び１０μｌの阻害剤を所望の濃度で（又は対
照例についてはエタノール）を各試験管に入れる。予備
インキュベーションすべき混合物（Ｓ）を入れた試験管
及び混合物（Ｅ）を入れた小びんを水浴で３〜５分間加
熱する。反応を開始させるために、混合物（Ｓ）と阻害
剤を入れた各試験管に５００μｌの混合物（Ｅ）を素早
く移し、３７℃でゆっくりと撹拌しながら３０分間イン
キュベーションを行う。インキュベーションの終わりに
試験管に氷を入れて反応を停止させる。 ４）抽出 反応を停止させたならば直に各試験管に２ｍｌの酢酸エ
チルを添加し、マルチチューブ渦巻発生器により１分間
撹拌する。試験管を１０分間デカンテーションし、次い
で抽出物（＝８０％）の（上部）有機相の１．６ｍｌを
別の試験管に回収する。酢酸エチルを全部蒸発させた
後、ＨＰＬＣにおいて使用する８００μｌの易動相を各
試験管に添加する。 ５）ＨＰＬＣクロマトグラフィー 形成された化合物を逆相高性能液体クロマトグラフィー
（ＨＰＬＣ）により分離することによりインキュベーシ
ョン中に生成した代謝産物の量を測定した。ＯＤＳ−ハ
イパーシルカラム（粒子直径＝５μｍ）及び４５／１５
／４０の比率のＭｅＯＨ／ＴＨＦ／Ｈ2 Ｏからなる易動
相を使用する。抽出後に集めた抽出物をＨＰＬＣ系に自
動的に注入し、線形放射能測定系（ベルソルド社製）に
よって放射性代謝産物のみ、従って基質により標識され
たテストステロンから形成された代謝産物のみを評価し
た。この測定は非常に敏感であり、存在し得る内生的生
成物の全てを除去する。
【００２８】結果の表示及び計算方法 形成された代謝産物の量を、ＨＰＬＣのＭＴ２ソフトウ
ェアに入力した参照曲線と比較して計算する。ＭＴ２の
レベルでは、これらは注入量１μｌ当たりのｐモル数で
現れる。テストステロン、ＤＨＴ及びアンドロスタンジ
オール、テストステロンの２種の５−α−還元代謝産物
について参照曲線が存在する。量はホモジネートたんぱ
く質１ｍｇ当たりの生成物のモル数で表わされ（各試験
は２回行う）、対照例試験と比較した残留５−α−レダ
クターゼ活性の割合（％）は次式により計算される。
ェアに入力した参照曲線と比較して計算する。ＭＴ２の
レベルでは、これらは注入量１μｌ当たりのｐモル数で
現れる。テストステロン、ＤＨＴ及びアンドロスタンジ
オール、テストステロンの２種の５−α−還元代謝産物
について参照曲線が存在する。量はホモジネートたんぱ
く質１ｍｇ当たりの生成物のモル数で表わされ（各試験
は２回行う）、対照例試験と比較した残留５−α−レダ
クターゼ活性の割合（％）は次式により計算される。
【数１】 結果 イーノセインＢについて、対照例の５−α−レダクター
ゼ活性を阻害するＩＣ50は２．２×１０-5Ｍであった。
ゼ活性を阻害するＩＣ50は２．２×１０-5Ｍであった。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ドミニク・ルズュイス フランス国パリ、リュ・カゾット、２ (72)発明者 ジャンジョルジュ・トゥーチ フランス国パンタン、リュ・ラボワジェ、 ３、レジダンス・ラボワジェ、バティマン ３
Claims (4)
- 【請求項１】 イーノセインＢからなるアンドロゲン過
多症と関連した障害の治療用薬剤。 - 【請求項２】 請求項１記載のイーノセインＢを活性成
分として含有する製薬組成物。 - 【請求項３】 ａ）エピロビウム・パルビフロラム（Ｅ
ｐｉｌｏｂｉｕｍＰａｒｖｉｆｌｏｒｕｍ）の乾燥試料
に水か又は水と混和性の溶媒と水との混合物のいずれか
を添加することにより抽出し、 ｂ）ろ過し、要すれば減圧下に水と混和性の溶媒の蒸発
が達成されるまで濃縮を行い、 ｃ）水性相の凍結乾燥を行うか又は極性溶媒による抽出
を行い、その極性溶媒を乾燥抽出物が得られるまで蒸発
させ、 ｄ）凍結乾燥物又は乾燥抽出物を逆相ＨＰＬＣ又は重合
体ゲルのカラムにより精製する 工程を順次に行うことを特徴とする、エピロビウム・パ
ルビフロラムからイーノセインＢを製造する方法。 - 【請求項４】 エピロビウム・パルビフロラムの乾燥試
料にアセトン／水混合物を添加することにより抽出を行
うことを特徴とする請求項３記載の方法。
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| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| FR9313623A FR2712495B1 (fr) | 1993-11-16 | 1993-11-16 | Application de l'Óoenotheine B pour obtenir un médicament destiné au traitement des troubles liés à l'hyperandrogénie, et les compositions pharmaceutiques le contenant. |
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|---|---|---|---|
| JP2005164196A Division JP4249732B2 (ja) | 1993-11-16 | 2005-06-03 | アンドロゲン過多症と関連した障害の治療用薬剤であるイーノセインｂをエピロビウム・パルビフロラムから製造する方法 |
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| JP3958803B2 JP3958803B2 (ja) | 2007-08-15 |
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ID=9452879
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| JP2005164196A Expired - Lifetime JP4249732B2 (ja) | 1993-11-16 | 2005-06-03 | アンドロゲン過多症と関連した障害の治療用薬剤であるイーノセインｂをエピロビウム・パルビフロラムから製造する方法 |
Family Applications After (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2005164196A Expired - Lifetime JP4249732B2 (ja) | 1993-11-16 | 2005-06-03 | アンドロゲン過多症と関連した障害の治療用薬剤であるイーノセインｂをエピロビウム・パルビフロラムから製造する方法 |
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Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2021177660A1 (ko) * | 2020-03-05 | 2021-09-10 | 주식회사 메타이뮨텍 | 오에노테인 b 유사체를 유효성분으로 포함하는 체중 감량용 조성물 |
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|---|---|---|---|---|
| FR2712594B1 (fr) * | 1993-11-16 | 1996-12-27 | Roussel Uclaf | Procédé de préparation de l'oenotheine B à partir d'Epilobium Parviflorum. |
| US5879711A (en) * | 1997-11-07 | 1999-03-09 | Sequeira; Joel A. | Stable antiandrogenic gel composition |
| US20010024664A1 (en) * | 1999-03-19 | 2001-09-27 | Obukowicz Mark G. | Selective COX-2 inhibition from edible plant extracts |
| FR2791255B1 (fr) * | 1999-03-26 | 2003-05-16 | Greentech Sa | Complexe vegetal entrant dans des compositions cosmetiques et dermopharmaceutiques limitant le developpement du bulbe pileux, stimulant le systeme capillaire et s'utilisant pour le traitement des peaux seborrheiques |
| CA2282185A1 (en) * | 1999-09-10 | 2001-03-10 | Warren Steck | Oenothein medicaments |
| KR20030040451A (ko) | 2000-09-12 | 2003-05-22 | 닛카우위스키가부시키가이샤 | 야생사과 열매 폴리페놀 및 그의 제조방법 |
| AUPR600601A0 (en) * | 2001-07-05 | 2001-07-26 | Greenhaven Limited | Therapeutic compositions |
| GB0205826D0 (en) * | 2002-03-13 | 2002-04-24 | Bryant Andrew E | Therapeutic compositions and methods |
| WO2006058430A1 (en) * | 2004-12-02 | 2006-06-08 | Testa Hair Holdings Inc. | Composition for treating hair and scalp and method for preparing same |
| US20070009621A1 (en) * | 2005-07-07 | 2007-01-11 | Annie Eng | Correcting systemic androgen levels using Eurycoma longifolia |
| FR3099701B1 (fr) * | 2019-08-08 | 2022-03-25 | BASF Beauty Care Solutions FR | Nouvelle utilisation cosmétique d’une combinaison d’oenothéine-B et de quercétine-3-O-glucuronide |
| CN114315923A (zh) * | 2022-01-13 | 2022-04-12 | 青海民族大学 | 一种柳兰水提物中获得月见草素b有效部位方法及应用 |
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|---|---|---|---|---|
| JPS62129220A (ja) * | 1985-11-30 | 1987-06-11 | Riide Chem Kk | 制癌剤 |
| JPS646289A (en) * | 1987-06-29 | 1989-01-10 | Lead Chem Co Ltd | Pharmaceutical composition for remedy and crisis-prevention of acquired immunodeficiency syndrome |
-
1993
- 1993-11-16 FR FR9313623A patent/FR2712495B1/fr not_active Expired - Lifetime
-
1994
- 1994-11-14 US US08/340,025 patent/US5525594A/en not_active Expired - Lifetime
- 1994-11-15 EP EP99200220A patent/EP0947522B1/fr not_active Expired - Lifetime
- 1994-11-15 DE DE69430079T patent/DE69430079T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1994-11-15 EP EP94402575A patent/EP0657167B1/fr not_active Expired - Lifetime
- 1994-11-15 DE DE69423577T patent/DE69423577T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1994-11-16 JP JP30566494A patent/JP3958803B2/ja not_active Expired - Lifetime
-
2005
- 2005-06-03 JP JP2005164196A patent/JP4249732B2/ja not_active Expired - Lifetime
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2021177660A1 (ko) * | 2020-03-05 | 2021-09-10 | 주식회사 메타이뮨텍 | 오에노테인 b 유사체를 유효성분으로 포함하는 체중 감량용 조성물 |
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