JPH07188275A - アンドロゲン過多症と関連した障害の治療用薬剤を得るためのイーノセインb、それを含有する製薬組成物及びエピロビウム・パルビフロラムからの製造法 - Google Patents
アンドロゲン過多症と関連した障害の治療用薬剤を得るためのイーノセインb、それを含有する製薬組成物及びエピロビウム・パルビフロラムからの製造法Info
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- JPH07188275A JPH07188275A JP6305664A JP30566494A JPH07188275A JP H07188275 A JPH07188275 A JP H07188275A JP 6305664 A JP6305664 A JP 6305664A JP 30566494 A JP30566494 A JP 30566494A JP H07188275 A JPH07188275 A JP H07188275A
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Abstract
な用途を提供する。 【構成】 イーノセインBをエピロビウム・パルビフロ
ラム(アカバナ科)から水又は水/水混和性溶媒混合物
により抽出することによって製造し、構造を決定し、そ
の薬理効果を検討した。イーノセインBはアンドロゲン
過多症と関連した障害の治療用薬剤として使用される。
Description
(hyperandrogenism)と関連した障害
の治療用薬剤を得るためのイーノセインB(oenot
heineB)、それを含有する製薬組成物及びエピロ
ビウム・パルビフロラムからの製造法に関する。
(アカバナ科)にはほぼ200もの異なった種が存在す
る。エピロビウム・パルビフロラム(Epilobiu
m Parviflorum)並びにエピロビウムのそ
の他の種は、あらゆる種類の障害、例えば膀胱、腎臓の
障害、特に前立腺の障害に有益であるとして慣用医薬品
の中に説明されている(H.ヒアーマン、H.ジュアン
及びW.サメツ、J.Ethno−pharmaco
l.17(1986),161−167;V.E.タイ
ラー、Pharm.Int.(1986),205)。
エピロビウムには多くの成分が含まれていて、それらは
複雑な構造を有する。今日までにいくつかの分析が試み
られ、各種の化合物の存在が示された。しかし、組成は
まだ周知ではない。
ン、Sci.Pharm.51(1985),39)、
トリテルペン及びフラボノイド類(アグリコン及びグリ
シドフラボノール類)(A.ヒアーマン及びK.メイ、
Sci.Pharm.51(1983),158)の存
在がわかった。最近なって、エピロビウム・パルビフロ
ラムからグリコシドフラボノール類が分離されてからケ
ルシトリン、ミリシトリン、イソミリシトリン、没食子
酸及びクロロゲン酸の存在が明らかにされた(I.スラ
カニン、A.マーストン、K.ホステットマン、N.デ
ラベイズ及びC.ダーベレイ、J.Chrom.557
(1991),391−398)。
ラムがこの植物から今日までに単離されることが決して
なかった特に有益な別の化合物、即ちイーノセインBを
さらに含有することを発見した。イーノセインBは加水
分解性のオリゴマータンニンである。それは、イーノセ
ラ・エリスロセパラ(Oenothera eryth
rosepala Borbas)から初めて単離され
た(T・ハタノ他、J.Chem.Soc.Perki
n Trans.1(1990),2735;日本薬学
会第104回年会、1984年3月、仙台;Chem.
Pharm.Bull.37(8)(1989),22
69−2271)。次いで、イーノセインBは、種々の
アカバナ科(Onagreaceae)、そしてミソハ
ギ科(Lythraceae)の一員であるウッドホル
ジア・フルチコサ(Woodfordia fruti
cosa)に見出された(T.ヨシダ他、Chem.P
harm.Bull.38,1211(1990)。さ
らに、最近になって、イーノセインBは、フトモモ科
(Myrtaceae)の一員であるユーカリプタス・
アルバ(Eucalyptus alba REIN
W)の乾燥果実から単離された(T.ヨシダ他、Che
m.Pharm.Bull.40(7),1750−1
754(1992)。
薬剤として用途を立証する多くの研究の主題となってき
た。しかして、イーノセインBは抗ウイルス剤及び抗腫
瘍剤の領域において多くの生物学的及び薬理学的性質を
持っている。抗腫瘍活性 ・リードケミカルCo:特開昭62−129220(1
1/06/87);優先権主張:特願昭60−2704
94(30/11/85) ・日本化薬:特開平3−123793(27/05/9
1);優先権主張:特願平1−258708(05/1
0/89) ・ケンイチミヤモト他:Biol.Pharm.Bul
l.16(4),379−387(1993) ・A.クラモチ−モギ他:Biochem.Phar
m.44(10),1961−1965(1992) ・ヤン−ジュ ツァイ他:The Jour.Bio
l.of Chem.:267(20),14436−
14442 ・ケンイチミヤモト他:Jpn.J.Cancer R
es.84,99−103(1993)抗ウイルス活性 (ヘルペス) ・K.フクチ他:Antiviral Researc
h 11(1989),285−298抗ウイルス活性 (HIV) ・リードケミカルCo:ヨーロッパ特許297547
(04/01/89);優先権主張:特願昭62−16
1572(29/06/87)
らの特定の抽出物(水性画分)がある種の男性ホルモ
ン、特に4,5−α−ジヒドロテストステロン(DH
T)の生合成における重要な酵素であるテストステロン
酵素5−α−レダクターゼの阻害剤として有意に応答す
ることを本願発明者が観察したのはこの抽出物の研究中
であった。この観察によって本願発明者はこの阻害の原
因となる分子を同定しようと試みるに至った。これによ
りこのものがイーノセインBであることが示された。要
するに、イーノセインBがエピロビウム・パルビフロラ
ムの活性成分の一つとして単離され同定されたのはこれ
が最初である。さらに、イーノセインBが従来技術にお
いて決して予見されなかったテストステロン酵素5−α
−レダクターゼの阻害剤として作用することが決定され
たのはこれが最初である。イーノセインBは5−α−レ
ダクターゼの阻害剤としての特異的な活性を有する。5
−α−レダクターゼは、アンドロゲン受容器(AR)に
対してテストステロンよりも大きな親和性を有するジヒ
ドロテストステロン(DHT)にテストステロンを変換
させる原因となる酵素である。
殖器官の子宮内発現に対して、次いで青春期からはある
種の第二次性徴(顔及び体の毛の系統)の発生に対して
必須である。5−α−レダクターゼは、テストステロン
が活性であるようにDHTに変換されなばならない思わ
れる前立腺及び皮膚に主として見出される。しかし、過
剰なDHTはざそう又はアンドロゲン性脱毛症、女性の
多毛症の原因となろうし、また前立腺に蓄積すると前立
腺の良性肥大(BHP)又は癌の原因となろう。80才
以上の男性の80%はBHPを有し、70%は癌性の病
巣を有するものと推定される。スタロイド代謝における
この酵素段階の阻害はインビボでのDHTのレベルの低
下を伴う。このDHTレベルの低下は、男性の前立腺の
大きさを減少させるという効果を有し、従って前立腺の
良性肥大、前立腺癌及びある種のアンドロゲン依存性の
疾病の治療において有益な効果を有する。従って、5−
α−レダクターゼを阻害する治療は非常に有用であっ
て、受容器をブロックする抗男性ホルモンの欠点を現わ
さない。従って、5−α−レダクターゼのこの阻害性
は、イーノセインBをアンドロゲン過多症と関連した障
害の治療に、特に前立腺の良性肥大(BHP)、前立腺
癌、ざそう、アンドロゲン性脱毛症、脂漏又は女性の多
毛症の治療に使用するのを可能ならしめるものである。
Bからなるアンドロゲン過多症と関連した障害の治療用
の薬剤にある。薬量は治療しようとする疾病及び投与経
路によって変わる。従って、それは、例えば成人の場合
に経口投与により1日当たり5〜100mg/kg、好
ましくは10〜20mg/kgであろう。
として含有する製薬組成物を調製するのに使用すること
ができ、従って本発明の主題はこのような製薬組成物に
ある。本発明に従うイーノセインBは、消化器経路で、
非経口的に又は局所的に、例えば経皮的に使用すること
ができる。これは固体でも液体でもよく、人の医薬とし
て慣用されている製剤形状で、例えば無味若しくは糖衣
錠剤、カプセル、顆粒、座薬、注射用調合剤、ペッサリ
ー、軟膏、クリーム、ゲル及び貼り薬の形状で提供でき
る。これらは通常の方法により製造される。活性成分
は、これらの製薬組成物に通常使用される補助剤、例え
ばタルク、アラビアゴム、ラクトース、でんぷん、ステ
アリン酸マグネシウム、ココアバター、水性若しくは非
水性のビヒクル、動物性若しくは植物性の脂肪物質、パ
ラフィン誘導体、グリコール類、各種の湿潤、分散若し
くは乳化剤、保存剤と配合することができる。
は水と混和性の溶媒と水との混合物のいずれかを添加す
ることにより抽出し、 b)ろ過し、要すれば減圧下に水と混和性の溶媒の蒸発
が達成されるまで濃縮を行い、 c)水性相の凍結乾燥を行うか又は極性溶媒による抽出
を行い、その極性溶媒を乾燥抽出物が得られるまで蒸発
させ、 d)凍結乾燥物又は乾燥抽出物を逆相HPLC又は重合
体ゲルのカラムにより精製する 工程を順次に行うことを特徴とする、エピロビウム・パ
ルビフロラムからイーノセインBを製造する方法にあ
る。
ように行われる抽出、次いで精製から本質的になってい
る。
と混和性の溶媒、例えばメタノール、エタノール、イソ
プロパノール、ブタノールのようなアルコール又はアセ
トンと水との混合物を添加する。乾燥試料は好ましくは
エピロビウム・パルビフロラムの葉である。水と混和性
の溶媒の好ましいものはアセトンである。撹拌し、ろ過
した後、要すればろ液を減圧下に水と混和性の溶媒が蒸
発されるまで濃縮する。残った水性相を凍結乾燥するか
又は当業者に周知の各種の極性溶媒、例えばジエチルエ
ーテル、酢酸エチル又はブタノールによって抽出する。
ブタノールを使用するのが好ましい。次いでこれらの画
分を集めて50℃を越えない温度で減圧下に乾燥抽出物
が得られるまで蒸発させる。
相HPLCにより行う。重合体ゲルのカラムによる精製 上記で得た乾燥抽出物又は凍結乾燥物を蒸留水に溶解
し、生じた混合物を重合体ゲルのカラム、例えばダイア
イオンHP20、セファデックスLH20又はトヨパー
ルHW40型のカラムに注ぎ入れる。溶出を蒸留水、次
いでアルコールの割合を順次に増大させたアルコール/
蒸留水混合物により行う。イーノセインBを含有する画
分はHPLCにより同定し、次いで凍結乾燥する。使用
するアルコールは好ましくはメタノールである。逆相HPLCによる精製 上で得た乾燥抽出物又は凍結乾燥物を蒸留水に溶解し、
次いでこれを逆相HPLCにより精製する。溶出をアセ
トニトリル/水混合物のような極性親水性溶媒の混合物
からなる勾配でもって、トリフルオル酢酸(TFA)の
ような酸を使用する酸性pHにおいて行う。次いで、イ
ーノセインBを含有する画分を、保持時間及びダイオー
ドアレイ検出器(210−500nm)又はUV検出器
を使用する分析により得たスペクトルの関数として単離
する。場合により二回目の精製の後、所期生成物の凍結
乾燥を行う。
ム・パルビフロラムの乾燥試料にアセトン/水混合物を
添加することにより抽出を行うことを特徴とする、前記
のようなエピロビウム・パルビフロラムからイーノセイ
ンBを製造する方法にある。
て、それを何ら制限するものではない。
ウム・パルビフロラムの葉及び枝からの抽出並びに粗製
のイーノセインBの取得 1275gのエピロビウム・パルビフロラムの乾燥し破
砕した葉及び枝を100リットルの反応器に導入する。
20リットルのアセトン−水混合物(7−3)を添加す
る。混合物を機械的撹拌機を使用して60時間撹拌す
る。混合物をろ過し、葉を4リットルのアセトンにより
すすぐ。ろ液を減圧下に35℃で、アセトンが蒸発する
ようにして約6リットルの容積まで濃縮する。残った水
性相を2×1リットルのジエチルエーテル、2×1リッ
トルの酢酸エチル及び2×0.5リットルのブタノール
により続けて抽出する。これらのうち最初の二つの画分
を減圧下に35℃の温度で蒸発させた後、100gの黒
色樹脂状物及び10gの脆い褐色発泡体をそれぞれ得
た。また、第三の画分をさらに低い減圧下に50℃の温
度で蒸発させた後、45gの黒色樹脂状物を得た。この
最後の画分がイーノセインBに最も富んでいた。
ラムの葉及び枝からの抽出並びに粗製のイーノセインB
の取得 20gのエピロビウム・パルビフロラムの破砕した葉及
び枝を65℃で350mlの水により覆う。次いで混合
物を周囲温度で20時間機械的に撹拌し続ける。次いで
混合物をろ過し、葉を100mlの蒸留水によりすす
ぐ。このようにして、450mlの透明な黒色溶液を得
た。この溶液の50mlを凍結乾燥すると、所期の生成
物に富む500mgの淡緑色粉末が得られた。
(蒸留水1ml当たり2mg)。10ml(20mg)
をノバパック(NOVAPACK:商標)型の分取クロ
マトグラフィーカラム(C18 6μ 7.8×300
mm)に注入する。溶出を下記の条件下で溶媒勾配によ
って5ml/minの流量で行う(容量%)。 ・0〜2分:試料 ・2〜7分:0.1%v/vのトリフルオル酢酸(TF
A)を含む100%の水 ・7〜57分:0.1%v/vのTFAを含むアセトニ
トリルの0から10%v/vまでの線形勾配 ・57〜77分:0.1%v/vのTFAを含むアセト
ニトリルの10から25%v/vまでの線形勾配 ・77〜97分:0.1%v/vのTFAを含むアセト
ニトリルの25から90%v/vまでの線形勾配 検出は、210nm〜400nmの範囲の波長でダイオ
ードアレイを使用して行う。集められた43個の画分の
うち1個だけが5−α−レダクターゼに対して活性を有
し、保持時間は36〜38分の間であった。純度を検査
した後、この画分を凍結乾燥する。所期の物質をNMR
及び質量分析計によりただちに分析する(この画分のN
MR及び質量分析値は、文献:T.ハタノ他、J.Ch
em.Soc.Perkin Trans.1(199
0),2735−2743に記載のものと比較でき
る)。NMR 250MHz 溶媒:アセトン−d6 、45℃、参照物質SiMe4 、
ppm、J(Hz)α−グルコース H−1;6.20d;J=3.5 H−2;5.87dd;J=3.5−10.5 H−3;6.11dd;J=10.5 H−4;5.59t;J=10.5 H−5;4.57dd;J=6−10 H−6;5.24dd;J=6−13 3.63d;J=13 β−グルコース H−1;4.42d;J=8 H−2;5.16dd;J=8−9.5 H−3;5.45t;J=9.5 H−4;4.90t;J=9.5 H−5;4.13dd;J=5−9.5 H−6;5.01dd;J=5−13 3.84d;J=13 例4の式を参照質量スペクトル m/zMALDI(マトリックスアシストレーザー脱着
イオン化) 1569[(M+H)]+ 1591[(M+Na)]+ 1607[(M+K)]+
18 10μ、長さ50cm、直径2cm(1イン
チ))を使用する。例2に従って製造した1gの凍結乾
燥物を50mlの水に溶解してなるものを注入する。溶
出を0.1%のトリフルオル酢酸を含有する水−アセト
ニトリル溶離剤混合物によって行う。アセトニトリルの
濃度勾配は、30分毎に15%v/vづつ増大させる。
生成物をUV検出器(波長305nm)により検出す
る。所期の物質は27分の保持時間で現れた。画分を凍
結乾燥した後、約35mgの純粋な所期物質がベージュ
色粉末として回収された。UV MeOH/HCl 0.1N 218nM(=120000)及び266nM(=55
000) MeOH 218nM(log=5.09)及び265nM(lo
g=4.77) MeOH/NaOH 0.1N 285nM(=33000)及びinfl.315及び
473nM 不可逆的変化円二色性 MeOH/HCl 0.1N Max.219(nM);(0)=+3.8 105 Infl.236(nM);(0)=+1.7 105 Max.259(nM);(0)=−4.5 104 Infl.282(nM);(0)=+9.5 104NMR 400 C13 MHz 溶媒:D2 O 温度:プロトンについて297K 炭素13について318K 参照:TSP、0ppm 略号:ppm:ppmで表わした化学シフト J(Hz):Hzで表わしたカップリング定数多重線 s:シングレット ws:広いシングレット d:ダブレット dd:ダブレットのダブレット t:トリプレット
に示す。
フォーカス "VGオートスペックE" 質量分析計(フィ
ソン・インスツルメント社製)であった。試料の分子質
量はLSIMS(液体二次イオン化質量分析計)による
正帯電及び負帯電モードでのイオン化の下で決定する。
試料は予め "マジックバレット/TFA" と称するマト
リックスに溶解してからCs+ ガンからの一次イオンビ
ームにより衝撃させる。このビームは30KVの電圧の
下で加速し、2〜3μAmpの能力を有する。二次イオ
ン(試料)を8KVの電圧の下で加速する。フラグメン
ト化の研究は、B/E=一定の方法に従ってリンクされ
たスキャンにより行う。このために、 "ペアレント" イ
オンを場の第一自由領域(1FFR)に位置させたセル
において衝突によりフラグメント化させる。このセルに
導入される衝突ガスは空気であって、その圧力は "ペア
レント" イオンの初期強度を半分だけ低下させるのに必
要なものである。この研究は次に二つの段階、 a)準分子イオン(MH+ )のフラグメント化 b)前に得られたイオンのそれぞれについての連続フラ
グメント化で行った。
1237+ −767+−453+ であった。 D)1237+ イオンのフラグメント化 このスペクトルで観察された主なイオンは1085+ −
767+ −453+ であった。 E)767+ イオンのフラグメント化 このスペクトルで観察された主なイオンは749+ −6
15+ −471+ −453+ −315+ −152+ であ
った。 F)453+ イオンのフラグメント化 特に435Daイオン(脱水)を生じる特徴的でないス
ペクトル。
蒸留水に溶解し、ダイアイオンHP20樹脂カラム(2
0cm/2cm)に注ぎ入れる。溶出を200mlの蒸
留水で、次いで200mlの蒸留水−メタノール混合物
(80−20)で行う。この第二画分を凍結乾燥して5
8mgのイーノセインBを粉末状のベイジュ色固体のと
して得た。NMR、UV、CD及び質量分析計による分
析は例4に記載したものと同等であった。
ンし、形成された5−α−還元代謝産物(ジヒドロテス
トステロン(DHT)及び5−α−アンドロスタンジオ
ール)の量をHPLCにより測定することによって5−
α−レダクターゼ活性を測定するための試験をインビト
ロで行う。前立腺の良性肥大(BHP)のために前立腺
切除術を行って得たヒト前立腺のホモジネートを使用す
る。
を満たした容器内に置いたアルミニウムペイパーで包装
する。実験室では、ホモジネートが直ちに調製できない
場合には、前立腺は−80℃に貯蔵することができる。
前立腺を氷の上で非常に薄い切片に切断し、次いでポリ
トロン、次いでポッターガラスにおいて媒質A(20m
Mの燐酸カリウム、pH6.5;0.32Mのサッカロ
ース;1mMのジチオトレイット(DTT);50μM
のトリホスホピリジンヌクレオチドの水和ナトリウム塩
(NADPH))内で粉砕する。140,000Gで4
℃で60分間遠心処理した後、生成物を10〜20ml
の媒質B(20mMの燐酸カリウム、pH6.5;20
%のグリセリン;1mMのジチオトレイット)に再懸濁
させる。生成物をナンクチューブに分け、−80℃に貯
蔵する。ホモジネートの少量についてこれを試験におい
て将来使用するためにたんぱく質の量を定量し、これに
よりホモジネート1ml当たり少なくとも10mgのた
んぱく質を有するようにする。
えん酸塩(前立腺の標準媒質)の存在下にインキュベー
ションを行う。 1)基質(S)、即ち、くえん酸三ナトリウム緩衝液p
H5.0中の100の同位体希釈度を持つ "未標識" テ
ストステロンと "トリチウム化" テストステロンとの混
合物の調製 a)40mMのくえん酸三ナトリウム緩衝液:11.7
6gのくえん酸3Na・2H2 O(Merk ref.
Art 6448)を秤量し、これを1リットルの蒸留
水(ミリキュウ−Q社製)に溶解し、pHを5.0に調
節する。 b)100の同位体希釈度を持つ "未標識" テストステ
ロンと "トリチウム化" テストステロンとの混合物:テ
ストステロンの1mM溶液を得るために、2.88mg
の "未標識" テストステロンを秤量し、これを10ml
のエタノールに溶解する。この溶液を10mlのくえん
酸塩緩衝液中で0.99/1000、即ち9.9μlま
で希釈する(=10-6M溶液)。上記の溶液の10ml
に9μlのテストステロン− 3H(NET−370)を
添加する(=100の同位体希釈度)。基質(S)は使
用できる状態にある。 2)酵素+DTT+NADPH混合物の調製 a)燐酸カリウム緩衝液、40mM、pH6.5:5.
44gのKH2 PO4(Riedel de Haen
ref.30407)を秤量し、これを1リットルの
蒸留水Bに(ミリキュウ−Q社製)に溶解し、pHを
6.5に調節する。 b)DTT、1mM(シグマ社製):3.1mgのDT
Tを秤量し、これを1mlの燐酸塩緩衝液に溶解する。 c)NADPH、500μM(シグマ社製):8.33
mgのNADPHを秤量し、これを1mlの燐酸塩緩衝
液に溶解する。 d)酵素+DTT+NADPH混合物(E):0.5m
gの前立腺ホモジネートのたんぱく質、50μlのDT
T及び50μlのNADPHを各試験のために4℃で混
合する。この混合物を燐酸塩緩衝液により500μlに
する。 3)インキュベーション 試験の数と同じ数の試験管を準備する。500μlの基
質(S)及び10μlの阻害剤を所望の濃度で(又は対
照例についてはエタノール)を各試験管に入れる。予備
インキュベーションすべき混合物(S)を入れた試験管
及び混合物(E)を入れた小びんを水浴で3〜5分間加
熱する。反応を開始させるために、混合物(S)と阻害
剤を入れた各試験管に500μlの混合物(E)を素早
く移し、37℃でゆっくりと撹拌しながら30分間イン
キュベーションを行う。インキュベーションの終わりに
試験管に氷を入れて反応を停止させる。 4)抽出 反応を停止させたならば直に各試験管に2mlの酢酸エ
チルを添加し、マルチチューブ渦巻発生器により1分間
撹拌する。試験管を10分間デカンテーションし、次い
で抽出物(=80%)の(上部)有機相の1.6mlを
別の試験管に回収する。酢酸エチルを全部蒸発させた
後、HPLCにおいて使用する800μlの易動相を各
試験管に添加する。 5)HPLCクロマトグラフィー 形成された化合物を逆相高性能液体クロマトグラフィー
(HPLC)により分離することによりインキュベーシ
ョン中に生成した代謝産物の量を測定した。ODS−ハ
イパーシルカラム(粒子直径=5μm)及び45/15
/40の比率のMeOH/THF/H2 Oからなる易動
相を使用する。抽出後に集めた抽出物をHPLC系に自
動的に注入し、線形放射能測定系(ベルソルド社製)に
よって放射性代謝産物のみ、従って基質により標識され
たテストステロンから形成された代謝産物のみを評価し
た。この測定は非常に敏感であり、存在し得る内生的生
成物の全てを除去する。
ェアに入力した参照曲線と比較して計算する。MT2の
レベルでは、これらは注入量1μl当たりのpモル数で
現れる。テストステロン、DHT及びアンドロスタンジ
オール、テストステロンの2種の5−α−還元代謝産物
について参照曲線が存在する。量はホモジネートたんぱ
く質1mg当たりの生成物のモル数で表わされ(各試験
は2回行う)、対照例試験と比較した残留5−α−レダ
クターゼ活性の割合(%)は次式により計算される。
ゼ活性を阻害するIC50は2.2×10-5Mであった。
Claims (4)
- 【請求項1】 イーノセインBからなるアンドロゲン過
多症と関連した障害の治療用薬剤。 - 【請求項2】 請求項1記載のイーノセインBを活性成
分として含有する製薬組成物。 - 【請求項3】 a)エピロビウム・パルビフロラム(E
pilobiumParviflorum)の乾燥試料
に水か又は水と混和性の溶媒と水との混合物のいずれか
を添加することにより抽出し、 b)ろ過し、要すれば減圧下に水と混和性の溶媒の蒸発
が達成されるまで濃縮を行い、 c)水性相の凍結乾燥を行うか又は極性溶媒による抽出
を行い、その極性溶媒を乾燥抽出物が得られるまで蒸発
させ、 d)凍結乾燥物又は乾燥抽出物を逆相HPLC又は重合
体ゲルのカラムにより精製する 工程を順次に行うことを特徴とする、エピロビウム・パ
ルビフロラムからイーノセインBを製造する方法。 - 【請求項4】 エピロビウム・パルビフロラムの乾燥試
料にアセトン/水混合物を添加することにより抽出を行
うことを特徴とする請求項3記載の方法。
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