DE2635948A1

DE2635948A1 - Verfahren zur entfernung von formylgruppen von n-formylaminosaeureestern und n-formylpeptidestern mit freien carboxylgruppen

Info

Publication number: DE2635948A1
Application number: DE19762635948
Authority: DE
Inventors: Yasuo Ariyoshi; Fusayoshi Kakizaki; Tadashi Takemoto
Original assignee: Ajinomoto Co Inc
Current assignee: Ajinomoto Co Inc
Priority date: 1975-08-14
Filing date: 1976-08-10
Publication date: 1977-03-03
Also published as: US4071511A; FR2320934A1; AU1663676A; AU499510B2; CA1075680A; JPS5223001A; CH613687A5; FR2320934B1; DE2635948C2; JPS5726588B2; GB1497248A; NL7608965A

Description

DR. E. WIEGAND DIPL-ING. W. NIEMANN 2635948

DR. M. KÖHLER DIPL.-ING. C GERNHARDT

MÖNCHEN HAMBURG

TELEFON: 55547Ä . 8000 M ö N C H E N 2,

TELEGRAMME: KARPATENT MATH I LDENSTRASSE 12

TELEX : 5 29 068 KARPD

Io. August 1976 Vi 42 625/76 7/az

Ajinomoto Co., Inc. Tokyo (Japan)

Verfahren zur Entfernung von rormylgruppen von N-Formylaminosäuraestem und N-Foraiylpeptidestern mit freien Carboxylgruppen

Die Erfindung bezieht sich auf die Entfernung von maskierenden Formyl gruppen- von /tfriinosäure- und Peptidestern mit freien Carboxylgruppen«

Während die Aminogruppen von Aminosäure- und. Peptidestern mit freien Carboxylgruppen leicht durch Formylgrunpen maskiert werden, v;ar es bisher übliche Praxis, Benzyloxycarbonylund tert«-Butyloxycarbonylgruppen für diesen Zweck bei der Synthese von Peptiden und ähnlichen Reale-

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ORIGINAL INSPECTED

tionen anzuwenden. Die bekanntea Maskierungsgruppen erfordern Phosgen für ihre Einführung, ein gefährliches giftiges Gas, aber sie haben den Vorteil, daß sie leicht entfernt werden, wenn sie nicht langer erforderlich sind. Vor der Erfindung stand kein praktisches Verfahren zur Entfernung von Formylgruppen von den Stickstoffatomen von Aminosäureestern oder Peptidestern mit freien Carboxylgruppen zur Verfugung.

Eine Säurehydrolyse in Wasser und/oder Methanol ist das übliche Verfahren der Entfernung von Formylgruppen von Aminogruppen und ist z,B, bei Aminosäuren wirksam. Dieses Verfahren hat jedoch_; wenn es auf Ester von Ar.iinosaur.en oder Peptiden mit freien Carboxylgruppen angewendet wird, die Neigung, den Alkoholteil· von dem Ester zu entfernen oder die freie Carboxyigruppe zu verestern.

Es ist gefunden worden, daß Formylgruppen von den Aminogruppen von Aminosäureestern und Peptides-tern mit freien Carboxylgruppen ohne größere Nebenreaktionen entfernt werden können, indem man die Ester mit einer starken Säure in einer Mischung von Wasser und einem spezifischen organischen Lösungsmittel in Berührung bringt. Das Verfahren gemäß der Erfindung ist insbesondere anwendbar auf die Herstellung von L-Aspartylaminosäure-niedrige-Alkylester, wie oC-L-Aspartyl-L-phenylalanin-niedrige-Alkylester und o^-L-Aspartyl-L-tyrosin—niedrige-Alkylester, die als kalorienarme Süßungsmittel bekannt sind, aus den entsprechenden N-Formy!derivaten.

Die bei de.'i Verfahren gemäß der Erfindung verwendeten starken Säuren sind Säuren mit einer ersten Dissoaiationskonstanten von nicht weniger als Ι,ο χ Io ~ bei 25 C, Geeignete Säuren umfassen die üblichen Mineralsäuren wie Salzsäure und Schwefelsäure, sie sind jedoch darauf nicht beschränkte

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(Asparagin)-

Starke organische Säuren wie Benzolsulfonsäure, Trifluoressigsäure und Monomethylschv/efelsäure sind gleichermaßen wirksam, sie bieten jedoch keine Vorteile, welche ihre hohen Kosten rechtfertigen würden..

Die Aminogruppe, von der eine maskierende Formylgruppe erfindungsgemäß abgestreift werden soll, kann diejenige irgendeines Aminosäureesters oder Peptidesters mit freier Carboxylgruppe sein und das Ergebnis wird nicht durch viele andere reaktionsfähige Anteile in dem Ester wie einer Amid- oder Thiolgruppe oder einer Aminogruppe beeinträchtigt. Der Alkoholteil des Esters hat keine signifikante Bedeutung hinsichtlich der Entfernung der Formylgruppe von einem maskierten Stickstoffatom« Die Ester der niedrigen Alkanole mit bis zu 3. .Kohlenstoffatomen und von Benzylalkohol werden im weiten Umfang in dieser Technik angewendet und diese Alkohole schaffen typische,wenn auch nicht notwendige Anteile für die Ester, die als Ausgangsmaterialieji für das Verfahren gemäß der Erfindung dienen können. Es ist kein Aminosäure- oder Peptidester mit freie Carboxylgruppe eines primären oder sekundären Alkohols bekannt, von dem nicht mit Erfolg eine maskierende Formylgruppe nach dem Verfahren gemäß der Erfindung abgestreift werden könnte.

Die spezifischen organischen Lösungsmittel, die bei dem Verfahren gemäß der Erfindung verwendet werden, umfassen einwertige Alkanole mit 3 oder 4 Kohlenstoff atoiaen, aliphatische Ketone mit 3 bis 5 Kohlenstoffatomen, Acetonitril und eine Mischung von diesen Lösungsmitteln. Unter diesen organischen Lösungsmitteln werden Isopropanol, sek .-Butanol, tert.-Butanol, Aceton, Methyläthylketon und Acetonitril bevorzugt. Besonders bevorzugte organische Lösungsmittel sind Methyläthylketon

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und Acetonitril. Das bevorzugte Verhältnis des spezifischen organischen Lösungsmittels zu Wasser hängt von der Art des organischen Lösungsmittels ab, es kann jedoch leicht durch Versuche bestimmt werden. Wasser wird gewöhnlich in einem Volumen von 5 bis 3o% des spezifischen organischen Lösungsmittels verwendet. Die bei der Erfindung angewendeten gemischten Lösungsmittel können andere organische Lösungsmittel wie Kohlenwasserstoffe (Benzol, Toluol) halogenierte Kohlenwasserstoffe (Chloroform, Äthylendichlorid) und Äther (Tetrahydrofuran, Dioxan) enthalten. Diese anderen organi- ■ sehen Lösungsmittel können sogar die Ausbeute des gewünschten Esters,der frei von maskierenden Gruppen ist, verbessern.

Die Reaktion gemäß der Erfindung geht glatt vor sich, wenn der maskierte Ester mit einer freien Carboxylgruppe unter Rühren mit einer starken Säure mit einer Mischung aus Wasser und dem spezifischen organischen Lösungsmittel in Berührung gebracht wird. Die Temperatur beeinflußt die Reaktionsgeschwindigkeit in üblicher Weise. Die Temperatur der Mischung liegt gewöhnlich zwischen 2o und 8o° C während des Inberührungbringens. Wenn ein optisch aktives Produkt gewünscht wird, wird die höchste Temperatur, die keine signifikante Razemierung verursacht, für eine kurze Reaktionszeit bevorzugt. Die maximale Ausbeute wird bei 7o C in ein bis drei Stunden in den meisten Fällen erhalten, während vier bis Io Stunden bei 5o°C und ein bis drei Tage bei etwa 25 C benötigt werden können.

Die Menge an starker Säure ist nicht, kritisch, die Verwendung einer großen Menge führt jedoch zu einer Entfernung des Säureteils von dem Ester und/oder zur Brechung der

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Peptidbindung soweit eine solche vorhanden ist. Eine starke Säure wird gewöhnlieh in einer Menge von o,5 bis 4 Hol je Mol der Formylgruppen in dem Ester angewendet. Die starke Säure kann der Reaktionsmischung zu irgendeiner Zeit während der Reaktion zugesetzt werden. Die gesamte Säure kann zu Beginn der Reaktion eingesetzt werden, während es auch möglich is'c_f die Säure in einige Teilmengen zu unterteilen und dann diese der Reaktionsmischung im Verlauf des Fortschritts der Reaktion zuzufügen.

Falls die Reaktionsmischung nicht unmittelbar in einer weiteren Reaktion verwendet wird, können der Aminosäureester oder Peptidester mit freien Carboxylgruppen, der frei von maskierenden Formylgruppen ist, durch an sich übliche Verfahren wie Erniedrigung der Temperatur der Mischung, Zusatz von Lösungsmitteln, die mit dem Medium nicht mischbar sind, partielle Verdampfung des Mediums od.dgl. gewonnen werden.

Die Erfindung wird nachstehend anhand von Beispielen näher erläutert.

Beispiel 1

3,2 g N-Formyl-Pd-L-Aspartyl-L-phenylalaninmethy!ester und 3 ml 4N-SaIzsäure wurden zu einer Mischung von 6ο ml tert.-Butanol und 5 ml Wasser zugegeben, und die Lösung wurde bei 65°C Io Stunden gerührt.

Eine Teilmenge der Reaktionsmischung wurde verdünnt und durch einen Aminosäureautoanalysator analysiert. Es wurde gefunden, daß sie oC-L-Aspartyl-L-phenylalaninmethylester in einer Ausbeute von 7o%, bezogen auf den Ausgangsester ₍ enthielt.

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Beispiele 2 bis 8

Eine Arbeitsweise ähnlich derjenigen von Beispiel 1 wurde wiederholt bei 5o°C unter den in Tabelle I angegebenen Bedingungen. Die Ergebnisse wurden in der Tabelle I zusammengefaßt.

Beispiele 9 und Io

Eine Arbeitsweise ähnlich derjenigen von Beispiel 1 wurde bei 5o°C unter den in Tabelle Il angegebenen Bedingungen wiederholt, wobei 3,52 g Il-Formyl-c<-L-aspartyl-L-tyrosinäthylester anstelle des N-Formyl- oc-L-aspartyl-L-phenylalaninmethylesters verwendet wurden.

Die Ergebnisse sind in Tabelle II zusammengefaßt«

Beispiel 11

14,3 g N-Formyl-L-asparaginsäureanhydrid (o,l Mol) wurden in einer Mischung von loo ml Methylethylketon und 24,o g Essigsäure (o,4 Mol) zugegeben, und die Lösung wurde bei Raumtemperatur 15 Minuten gerührt. Eine Lösung von 17,9 g L-Phenylalaninmethylester (o,l Mol), in 2oo ml Methylethylketon gelöst, wurde zu der oben genannten Lösung zugegeben und bei Raumtemperatur sechs Stunden zur Erzeugung von N-Formyl- °<C-L-asparty 1-L-phenylalaninmethylester gerührt.

Gemäß dem Verfahren nach der Erfindung wurds die P.eaktionsmischung mit 3oo ml Methyläthylketon, 5o ml Wasser und 3o ml 4n-Salzsäure versetzt und bei 5o°C Io Stunden zur Entfernung der Formylgruppe gerührt,

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Die Reaktionsmischung wurde mit loo ml Wasser versetzt und auf einen pH-Wert von 2, ο mit Natriumcarbonat eingestellt· Die Methyläthylketonschicht wurde von der wäßrigen Schicht abgetrennt und zweimal mit loo ml Wasser gewaschen. Die wäßrige Schicht und die Waschwässer wurden vereinigt und unter verringertem Druck konzentriert. Der Rückstand wurde mit 3o,5 ml konz. Salzsäure und Wasser versetzt, bis das ganze Volumen 135 ml betrug. Die Lösung wurde über Nacht in. einem Kühlschrank aufbewahrt um Kristalle von oC-L-Aspartyl-L-phenyialaninmethylesterhydrochlorid auszufällen. Die Kristalle wurden abfiltriert und wogen 17,5 g.

Die Kristalle wurden in 13o ml Wasser gelöst. Wenn die Lösung auf einen pH-Wert von 4,8 eingestellt und über Nacht in dem Kühlschrank gelagert wurde, ergab sich ein Niederschlag von 12,4 g freien oC-L-aspartyl-L-phenylalaninmethylestern (41% Ausbeute, bezogen auf das Ausgangs N-Formyl-L-asparaginsäureanhydrid)·

C**J Q° = + 31,7° (C = 1, Essigsäure)

Der Niederschlag wurde als freier oC-L-Aspartyl-L-phenylalaninmethylester durch einen Aminosäureautoanalysator identifiziert.

Beispiel 12

Eine Arbeitsweise ähnlich der von Beispiel 11 wurde wiederholt, wobei Acetonitril in dem gleichen Volumen anstelle von Methyläthylketon angewendet wurde.

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12,6 g freier reinere£-L-Asparty1-L-phenylalaninmethy1-ester wurde erhalten (42% Ausbeute, bezogen auf das Ausgangs· N-Formyl-L-asparaginsäureanhydrid).

= + 31,6° (C = 1, Essigsäure) .

Tabelle

Bei-	Lösungsmittel	4n-Saiz-	Reak	Aus-
spiel-	(ml)	saure	tions	.beute
Nr.		(ml)	zeit	(%)
			(h)
2	Acetonitril (3o)	3	8	73
	+ Wasser (5)
3	Acetonitril (6o)	3	Io	76
	+ Wasser (5)
4	Methyläthylketon (3o)	3 .	8	69
	+ Wasser (5)
5	Methyläthylketon (6o)	3	Io	73
	+ Wasser (5)
6	Aceton (3o)
	+ Wasser (5)	3	8	56
7	Isopropanol (2o)
	+ Benzol (lo)	3	8	65
	+ Wasser (5)
8	sek.-Butanol (3o)	3	8	63
	+ Wasser (5)
Kon
trolle 1	Wasser (35)	3	8	49
Kon- ₉
trolle *	Methanol (3o)	3	8	54
	+ Wasser (5)

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	Tabelle	II	^-Salz säure (ml)	Reak tions zeit (h)	Aus beute (%)
Bei spiel Nr.	Lösungsmittel (ml)		3 3	Io Io	74 73
9 Io	Acetonitril (6o) +Wasser (5) Methvläthvlketon

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Claims

- lo- Patentansprüche

1.) Verfahren zur Entfernung der Formylgruppe von den Stickstoffatom eines N-Formylaninosäureesters oder N-Formylpeptidesters mit einer freien Carboxylgruppe, dadurch gekennzeichnet, daß man den Ester mit einer starken Säure in einer Mischung von Wasser und einem spezifischen organischen Lösungsmittel in Berührung bringt, wobei die starke Säure eins erste Dissoziationskonstante von nicht weniger als Ι,ο χ Io bei 25°C hat, das spezifische organische Lösungsmittel aus einwertigen Alkanolen mit 3 bis 4 Kohlenstoffatomen, aliphatischen Ketonen mit 3 bis 5 Kohlenstoffatomen oder Acetonitril besteht, und das Wasser in einem Volumen von 5 bis 3o% des spezifischen organischen Lösungsmittels angewendet wird. . . ;

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die starke Säure Salzsäure oder Schwefelsäure ist, und in einer Menge von o,5 bis 4 Mol je Mol der Formylgruppen in dem Ester angewendet wird.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß das organische Lösungsmittel aus Isopropanol sek.-Butanol, tert.-Butanol, Aceton, Methyläthylketon oder Acetonitril besteht.

4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß der Alkoholteil des Esters aus Alkyl mit bis zu 3 Kohlenstoffatomen oder Benzyl besteht.

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5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß der Ester ein Ester eines primären oder sekundären Alkohols ist.

6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß der Ester «-L-Aspartyl-L-phenylalaninalkylester oder c£-L-Asparty 1-L-tyrosinalkylester
ist, wobei die Alkylgruppe bis zu 3 Kohlenstoffatome hat.

7· Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß die Temperatur der Mischung zwischen 2o und 8o°C während der Berührung liegt.

8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß der gebildete Aminosäureester
oder Peptidester mit einer freien Carboxylgruppe aus der Reaktionsmischung gewonnen wird»

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