DE2547349A1 - Verfahren zur behandlung von lactoserum aus kaesereien, insbesondere in hinsicht auf die extraktion von glycoproteiden und sialinsaeure - Google Patents

Verfahren zur behandlung von lactoserum aus kaesereien, insbesondere in hinsicht auf die extraktion von glycoproteiden und sialinsaeure

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DE2547349A1 DE19752547349 DE2547349A DE2547349A1 DE 2547349 A1 DE2547349 A1 DE 2547349A1 DE 19752547349 DE19752547349 DE 19752547349 DE 2547349 A DE2547349 A DE 2547349A DE 2547349 A1 DE2547349 A1 DE 2547349A1
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Description

Patentanwälte *VILCK EN * !.AUFER
OR. HUGO WlLCKEN · DIFL.-INO. THOMAS WILCXEN · DIPU CHEM. DR. WOLFGANG LÄUFER LOBECK LOBECK MÖNCHEN
UNION COOPERATIVE AORICOLE LAITIEPE DE LA MANCHE Sottevast 508^C) BRIX £
Verfahren zur Behandlung von Lactoserum aus Käsereien, insbesondere in Hinsicht auf die Extraktion von <"!lycoproteiden und Sialinsäure."
Die Erfindung betrifft im allgemeinen die ^ehandlune von Lactnserum aus Käsereien und insbesondere ein Verfahren zur Extraktion ν λ η ^Ij/coproteid^n. und /oder Sial ins??ure aus einen solchen Lactoseruir.
copy
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J* LUlECK I Br*.!.. 5'i.ifte SZ-54 · r.iefon (0451) 758B8 * «MÜNCHEN IO · Primr»j«i».nilroe· 74 · T«Mon (0«9) 477344
■O;'tdmck Hamburg ''SM W.JQ4 ■ Bnnktn-, Cair.rn«rzbank lOb«dc !BlZ 2304OG22) Kta -Nr. 390187 · Deufjrh« Bank MOndi·« (BLZ 70070010) Kto.-Nr.
Es ist bekannt, da' day in -""^"FfLeri ^'f rn^ne Lan te se ruin eine <?:elbliohe Flüssigkeit ist, "11° räch Fntfernunr von "ettstcfCer· mittels Zentrifupiierunr, hauptsächlich v.j? Lactose, Proteine:; und Mineralsalzen besteht. .
Es ist bereits vorp;e schlauer worifr, das tr '^' ;ογρ1 '"ϊ Lactoserum zu-behandeln, um dt« iwr-.h ^espf· verursachte Verunreinigungen zu beseitigen um: die nmt"ine -.•'!»•ler/.urewinnen,-die im Lactoserum enthalten sin.'', '.«κ !,iftoserur; wird in den Milehhtffen und Käsereien in. r.r·.'." *r Zentren prevnnnen, v/o hei das Lactoserum in den K:"'.sereien vc-ri einer MiI^h herstarrnt, die einer enzymatischem 3ehan''Iun^ unterv-'.r^er wori^n ist- und zw^r Insbesondere nach dem '-!erk^tnl Lehen A.uanresser; (emiresurafe) . ^s ist ebenfalls vorgeschlagen worien, Ii" Pr-.f.eine des Lactoseru'ns mittels Ultrafiltration zu entfernen.
Jedoch ist bis zum heutigen Zeitpunkt die I1It ra ^l It rat ion nicht verwendet worden, um bestimmte vfic^-hip-e Proteine oder andere interessante Verbir:iunq;en abzutrennen und zu isolieren.-
Die oben erwShnte Sialinsilure wird auch nr^zise als N-Ace+.ylneuraminsSure bezeichnet (sieh^· Merck Index, 7. Ausgabe, Seite 715). Es ist bekannt, da? die Siallnsäure in den Kohlenhydrat-Proteinkomplexen bei Tieren vorhanden ist. Diese Verbindungen werden zur Zeit entvreder aus Naturstoffen hergestellt wie beisrielov/eise aus den Submaxillaris-Drüser· von Rinder: oder Schaf !-τ ■ " d'.;r"h
'■'fr^alir-n ζην Γυ·~Ι ierwT* und ^esti·"—"j"-'·· *-r"»p. "furaTiir.ivIuren sind in der Liter-itursteZ Li-* ".V. \'hi^»h--...-i« :·.·:Ί. F. Γΐ17Ik*η "Tsolaticr •tr.-J Detf»MP.lT5t I ^r :C 1Ie J---tr.! ^i" '·;':.!" ;" acl'i'i", ^f*;*,*» Ms 2^r. in η·'>ε>-.;-·-ί.-. -τρ ~ U. ?he":l ■ ~t. -.χτ:·\ Ly: I.*»", "^nd VZT Tn* er.ic {"rice , r· -:r λ'1 1 f»;r Γ- --t r es ■":■.!. -v -".
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8ADOR«*MMAL
Diese Verfahren zur Ferst«! Iu:"1" 'er* ΓΜ ^1 '.viS"ur« .".ir. i 'iuReryt kostspielig, was sie'-! s:ir>h h"! '«>rt 7«r./-iuf 3r rei ^e:; Tii'.i^erx-.-.'rlKpt Bezüglich der bes*.irr.":t»η V*-r···.'·■·r ■'.;;■,^s·■-". >· 11 -;hV^i'■:>·r, der "1.-il! n — sauren und insbesorv.Iert; 3er 'r- "oe^ylr'—"jt>^!Tiir:3-"iiv>e wiri au** folgende Litera
-" Coagulation ^ ^ ".ait -:.ηγ rg "--"r art·: A et techniques"
GARNIER, MOCQUGT, ^BAH^atj _ πτ""ΑΓ· t H'·'"»'::!."? - AT'.de Nutrition
Alimentaire, IQi:3, ??, ρ. ίιος . » r.?, "
- SVENNERHOLM L. A^ta Scr. ?<«d. τΓπ^,η.ΐ L«rsis, Cl,7= (IQ^^) ■ Arkiv, TCemi., 10,577 (l9r>f)
-WARREN L.J. F.iol. "hem. ?7:3, 19?1 (195^) -
-WERNER, I., und L. ODIN, äctc "or. Yei.. Unaaliensis ^7, .
230 (195?) "
-AMINOPP, D. (19fl) BI O^ "EM .1. '0L, 3^^ -"The Sensitivity of the Neura'ainoßidic Ltn^-ap-e in ""uoosubstances towards Acid ard towards NTeuraminidase libbons".
biochemistry Journal (19^3) fl9,^0O.
-" Structure studies on the wiyxovirus Hema.^plutination Inhibitor of Human Erythrocytes"
Ralph H. Kathan and Richards J. Winzler..
Journal of Biological chemistry (1963) VoI 2?P No. 1 p. 21 -"Studies an- the Neuraminidase of Influenza virus II additional prooerties of the enzymes from the Asian and PR 8 Strains; n!ax E Rafelson, .T.R. Michael Schneir and Wannie W. Wilson, J.P. Archives of Biochemistry and Biophysics 103 C196j?)
ArA'-rt- .'-.-iiche Verw^ndunptsarten der Sialins-iure sind in der
Literatur zu finden-
Antre:.riun.t- und Isolierung der Glycoproteine ist insbesondere --At)*, v'..i der Hprst^nurp von kosmetischen Pr/Inaraten.
6U9819/084 8 C0^ BAD ORIG1NAl.
-Jr-
Der vorliegenden Erfindung \nr, die Aufrabe zup-rnnde, ein Verfahren zur Behandlung von in K?iserelr>r gewonnenen Lao.toserum zu entwickeln, das die Gewinnung von Sialins-Iure bzw. N-Acetylneuraminsäure zusammen nit Ilycooeptiden und einer Proteinfraktion ermöglicht, die aus Olycoproteinen besteht.
Die Erfindung betrifft daher ein Verfahren zur Behandlung von In Käsereien gewonnenem Lactoserum und insbesondere die Extraktion .von ßlycoproteinen, OlycoDepti-ien und Sialinsäure mittels Ultrafiltration des Lactoserums, das durch folgende Verfahrensabschnitte gekennzeichnet ist: . - .
(a) Ultrafiltration des aus den Käsereien stammenden Lactoserums auf Membranen, deren Trennkraft etwa bei einen Molekülarsrewicht von 10 000 bis 50 000 lieisrt, dadurch Gewinnung eines Ultrafiltrats, das Im wesentlichen die Lactose, die Mineralsalze und die Ilycopeotide enthalt sowie eines Rückstandes bzw. eines Sediments (re*tentat), das die Proteine enthalt und die Sialinsäure ,
(b) Ausflockung der Proteine aus dem Rückstand, wodurch ein erster Proteinniederschlag und ein erster überstand gewonnen werden, wobei der letztere abgetrennt und aufgenommen wird,
(c) Behandlung des ersten Überstandes mittels Phosphorwolframsäure, unter Bedingungen unter denen sich ein zweiter überstand und ein zweiter Proteinniederschlag bilden, wobei der letztere abgetrennt und aufgenommen wird,
(d) Hydrolyse des zweiten Hiederschlages, wodurch ein dritter Niederschlag und ein dritter überstand erhalten werden,wobei der letztere abgetrennt und weiter bearbeitet wird,
(e) Behandlung des dritten Überstandes zur Extraktion der darin enthaltenen Sialinsäure durch bekannte Verfahrenswelsen, wobei Im wesentlichen "neutralisiert wird, der· letzte überstand über einen kationischen Harz geleitet wird, die Sialinsimre mittels eines ani^nischen Harzes fixiert wird, die so fixierte
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Siallnsäure eluiert wirrt und f-'.re SIa ·.. ins-'iur-e ersonnen wird, die lyophilisiert werden kar.n.
Als Ausgangsrnaterial für 1Ia? V* r-fa^r«.-- n?ir:h df-τ ^rfin^ung verwendet man Lactoseren aus K"ser«if^, die vcn der vilch von Wiederkäuern..abstammen- -wie beispielsweise ;nien, Ziehen, ilch'dfe, Büffel und dergleichen. Diese Lactoseren erhalt iv.hn insbesondere nach einer enzymatischen Trans"orm.ation und insbesondere nach einem Abpress ^empresurage) der "Hch. In gleicher Weise lässt sich ein entwässertes Lactoserum verwenden, dem man Wasser zusetzt, bevor man es rekonstituiert um es als flüssiges Lactoserum für das Verfahren nach der Erfindung zu verwenden.
In dem Verfahrensabschnitt na" wird ias lactoserum einer Ultrafiltration auf Membranen unterwarfen, deren mittlere Trennkraft (pouvoir de co r- ve moyen) in Molekulargewicht ausgedrückt wird und etwa zwischen 10 000 und 50 000 liegt. Zu diesen Zwecken können die auf dem Markt befindlichen Membranarten verwendet werden. Es können beispielsweise organische, anorganische oder auch keramische oder metallische Membranen sein. Solche Membranen lassen die Moleküle der Lactose, der MineralsSuren sowie der frlycopeptide durchgehen und halten die Proteine zurück. "R1Ur industrielle Zwecke ist es interessant, da» Ultrafiltrat in einer komplementären Behandlung wiederzugewinnen.
Bei der Ultrafiltration werden die bekannten praktischen Bedingungen angewendet, die vom Fachmann entsprechend angepasst werden k";-;nen. Man lässt das Lactoserum beispielsweise bei einer ausreichenden Umdrehgeschwindigkeit laufen und unter einem Druck in der Größenordnung von 3 Bar. Das mit der Membran in Kontakt kommende Produkt wird so lange.rezykliert, bis der Proteingehalt im Rückstand optimal geworden 1st, wodurch man auch den Portschritt
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der Ultrafiltration feststellen kann. Für die Ultrafiltration' werden beispielsweise Membranen verwendet, die von der französischen Firma PHONE POULENC unter der Rpzeichnung IFIS 30^2 vertrieben werden und die eine Trennkraft von etwa 15 000 in Ultrazentrifugen besitzen, die ebenfalls von RHONE POULENC vertrieben werden.
Man kann ebenfalls Membranen verwenden, die von der Firma AMICON (EUA) unter der Bezeichnung DIAFLO oder DIAFLO XN 50 (Trennkraft bei 50 000), DIAFLO PM 30 (Trennkraft = 30 000) und DIAFLO PM 10 ' oder UM (Trennkraft = 10 000) vertrieben werden.
Das Ultrafiltrat"wird im Verlaufe einer Komplementärbehandlung bzw. eines Nebenverfahrens in vorteilhafter Weise einer weiteren Ultrafiltration mit Membranen unterworfen,die eine Trennkraft zwischen 1000 und 5000 haben (ausgedrückt in Molekulargewicht), wie beispielsweise bei einer Trennkraft von 2IOOO. Dazu kann man eine Membran verwenden, die DIAFLO UN 2 (Trennkraft = 1000) bezeichnet wird.Diese Ultrafiltration führt zu einem Rückstand der die Glycopeptide enthält und diese Produkte sind insbesondere wertvoll als zusätzliche Nahrungsmittel für die menschliche und tierische Ernährung. Es genügt den Rückstand zu konzentrieren,um einen praktisch verwendbaren fllycopeptidsirup zu erhalten. Die bei dieser Ultrafiltration ebenfalls anfallende Lactose kann nach Konzentration ebenfalls wiedergewonnen werden. Der Rückstand kann alternativ anstelle der Wiedergewinnung der Glycooeptide einer Extraktionsbehandlung unterworfen werden um auch daraus Sialinsäure zu gewinnen.
Der aus dem Verfahrensabschnitt na" herstammende Rückstand enthält SiallnsSure bzw. N-Acetjlneuraminsäure. Bevor der Rückstand den folgenien Verfahrensabschnitt "b" unterworfen wird, kann man in vorteilhafter Weise die Konzentration der darin enthaltenden Proteine einstellen. Dies kann beispielsweise durch Verdünnung
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mittels Wasser geschehen bis ein Trockengehalt in der ordnung von 10 % erreicht wird.
Im Verfahrensabschnitt (b) führt man eine selektive Denaturirung der löslichen Proteine durch eine thermische Ausflockung durch. Dadurch werden die Albumine und Globuline ausgefällt. Im überstand bleiben als Glycoproteine die Proteasen und Peptone zurück. Bei dieser Behandlungsstufe wird über einen ausreichenden Zeitraum und bei einer Temperatur erwärmt, die ausreichen, um die Ausfällung der Proteine zu erhalten mit der Ausnahme der Slaloglycoproteine.
Beispielsweise wird dabei/liner Temperatur von 95°C 30 Minuten lang thermisch behandelt. Palis, man bei einer niedrigeren Temperatur arbeitet, muß die Behandlungsdauer entsprechend verlängert werden. Auf diese Weise erhält man einen isolierbaren Proteinniederschlag und einen überstand, der die N-Acetylneuraminsäure enthält. Um die Abtrennung zu erleichtern, wird das Produkt beispielsweise bis auf eine Temperatur von ^0C abgekühlt. Dies kann In einem normalen Eisschrank geschehen. Der überstand und der Proteinniederschlag können dann anschließend in üblicher Weise und vorzugsweise durch Zentrifugierung getrennte werden. Der aus dem Verfahrensabschnitt B herstammende überstand wird anschließend mit einem Reaktionsmittel in Kontakt gebracht, das alle darin fctothaltenen Proteine ausfällt. Zu diesem Zweck verwendet man Phosphorwolframsäure. Die für die Ausfällung von Proteinen bekannte Trichloressigsäure eignet sich nicht bei dem vorliegenden Verfahren, da es nur einen 4PeIl der Proteine aus dem überstand ausfällt. Die Bedingungen bei der Verwendung der Phosphorwolframsäure sind nicht kritisch, man arbeitet jedoch in vorteilhafter Weise bei Raumtemperatur.
Man kann ineinem sauberen Milieu arbeiten, wie beispielsweise in der Gegenwart von Schwefelsäure. Die Konzentration der
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Phosphorwolframs^ure kann 1.n einen Vor^ersuo.H fVs werden. Normalerweise verwendet m.'-m 5 ·τ Pho-snhnrwolframsuure Je Liter des (!berstanies. ^r''"'S er«; "er ^f; η P'nosnhorwolfrqms/lurf» trln^pn keine Verteile ur.i ^."suen Jam i~- Verlaufe des weiteren Verfahrens miteresrv,lepnt werden. Man T^sst T.it "der Phosphorwolframsaure'so larip;^ rearierer, bis die "roteine. · · aus dem Überstand ausgefüllt worden sind. nei dem vorliegenden Fall dauert das einige .Minuten, wie.beispielsweise 5 Minuten bei ?5°C
Nach der Behandlung mit Phosphorwolframsiture wird der Proteinniederschla^ in herkömmlicher '-.'eise vom Oherstand getrennt vrie beispielsweise durch Absauren. Der fJiedernchlap· wird so gewonnen,, und der überstand verworfen. Ιτι Verlaufe des Verfahrens-' abschnittes "d" hydrolysiert.man den It Verfahrensabschnitt "c" ab~f?trennten- Niederschl??;. Die Hydrolyse kann mittels o^uren," Alkalien oder en?ynati3ch durchr.eführt werden, ^a wirr»· Jedoch vorzugsweise eine saure Hydrolyse durchgeführt. .Als SSure „wird vorzugsweise Schwefelsäure verwendet, es können jedoch auch. ., alle anderen Säuren benutzt werden, wobei nach der Weutrali- . sation leicht ausfällbare Salze gebildet werden sollen. Tn dieser Hinsicht elrnet .sieh .die .Salzsäure weniger, da die ^hlorionen schwer zu entfernen sind. Die Hydrolyse kann in vorteilhafter Weise bei höheren Temperaturen durchgeführtwerden, soll Jedoch die Temperatur von 9B°C nicht überschreiten. Normalerweise wird etwa bei 9O0C Rearbeitet. Die.SSurewtrd in einer mittleren Konzentration verwendet wie beispielsweise unter 0,5 N und vorzugsweise bei 0,1 ?I (0,1 normal). Die Dauer der Hydrolyse soil ausreichen, um eine vollständige Hydrolyse zu erreichen* Dieser Zeitraum lie?t bei etwa einer Stunde.
Das Hydrolyseprodukt wi r-1 dann abgekühlt und es-bildet; si cH ein Niederschlag. f)er Niederschlag und der überstand ;werden in herkömmlicher Welse fretrennt wie beisnielsw^iso durch eine Zentrlfugieruno:. Her..Niederschlag:, wird verworfen, wfhrend der Wberetand weiter verwendet wird, . . .",-- , ;'zy-,-,Xi,v,.
-Q-
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In dem Verfahrensabschnitt "e" des Verfahrens nach der wird der Oberstand in verschiedener Vf»i se behandelt, u-η die N-AcetylneuraminsMure zu extrahieren. 7UH5IChS* wird eine Neutralisierung des Überstandes durchgeführt, um die freien SO^-~ Ionen die noch im überstand enthalten sind, als unlösliche Salze zu entfernen. Dies erreicht man amlbesten durch Zusatz von Rariumhydroxyd im Überschuß, um die Sulfat ionen der Schwefels-Mure zu entfernen.
Dabei wird mit einem überschuft an 3ariumicnen etwa beim Nfeutralpunkt gearbeitet. Anschließend werden die auswfüllten Salze nämlich die Bariumsulfatsalze entfernt. Der überstand wird gegebenenfalls konzentriert und dann über Harzs'iulen geführt. Zunächst wird mit einem kationischen Harz geleitet, um die Demineralisierung des Überstandes durchzuführen. Dazu verwendet man beispielsweise den unter der Bezeichnung "DOWEX" A<? 50 WX 8 H 4- vertriebenen Harz. Anschließend wird der überstand über eine Säule mit einem anionischen Harz geführt, um die N-Acetylneuraminsäure zu fixieren. Dazu wird der unter der Bezeichnung "DOWEX" Aft IX 5 POrmiat vertriebene Harz verwendet. Anschließend wird die Säule mit destilliertem Wasser gewaschen und die. N-Acetylneuraminsäule mittels Ameisensäure eluiert, falls man einen anionischen Harz in der Formiatform verwendet. Dazu wird beispielsweise eine 0,3molare Ameisensäure verwendet.
Man erhält schließlich eine Lösung, aus der man mittels Lyophilisation ein N-Acetylneuraminsäure-Pulver mit hohem Reinheitsgrad isolieren kann. Der Verfahrensabschnitt "e" kann in .verschiedener Weise durchgeführt werden. BeiSDielsweise kann nach der Neutralisation, der Abtrennung des Bariumsulfates und der Erklärung des Überstandes der letztere zu trocken eingedampft werden. Das dabei erhaltene Pulver wird· dann einer Lösungsmittelextraktion unterworfen, d.h. daß das Pulver durch ein Lösungsmittel oder durc* ein L^sungsmittelgemisch aufgenommen wird, indem die N-Acetylneuramins^ture löslich ist. Dies kann bei-
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spielsweise mittels Xtha"öl od<?r einer A-*.;·' on-Wnfj geschehen. Die N-Aeetylneuramlns'Iur'i wir·.·! anschließend durnh Abdamnfen des L" κ jr-o-STiihtelF i .··.'■· 1 iert.
Die beiliegende "Stelle besch?·" Lb4. die e'.PKelnen stufen des Verfahrens nach de»·· F.rfindunp· in Tr.^rsi^.tlicher· '-/eis^. Als Ausgangsmaterial wird ein in el-i^r K^se-r·^!. -T* -erzeVJrV*a Lactoserum verwendet ":1er ein Lan'.'öerum-Pulfr 3 f, das .-"ehydratisiert wird. Aus 1er Tabe 1Ί'■* ist klar zu eT.f^n, da^ das bei der Ultrafiltration 1 erhaltene TIltrafiitrat einer weiteren Ultrafiltration 1-2 unterworfen wir!. Der dabei erhaltene Rückstand enthält die Olycooeptide,"die ein der bei dem Verfahrer nach der Erfindung Gewonnenen Produkte darstellt..
Nach der Verfahrensstufe ^ (Abtrerrunt?) erhält "nn einen i)berstand, der die Glycoproteine erh"!+·, die ein welterss wertvolles Proi'ikt darstellen. . ·
In der Verfahrenss' ·."»' Γ bedeutet die Abkürzung APT die · , Phoäphorwolframsiture. In der letzten Stufe des Verfahrens (Lyophilisation 21) erhalt man dJe ?i-AcetylneuraminsHure als weiteres wesentliches und wertvollen Produkt des Verfahrens nach der Erfindung·. .
In den folgenden Beispielen werden bevor^ucte Aus^ilhrunrsformen : des Verfahrens nach der Frfindunp; im einzelnen erläutert. :
Beispiel 1 · .
Aus lOO'j Liter Kuhmilch wurden in herk^-ητ.Ιicher Weise 900 Liter Lactoserum in der Käserei hergestellt, "Dies» 900 Liter Lactosermr wurden in einer Ultrazertrifur*e (PHOM^ PQTILENC), die mit t?in»r Meini-rcin IRI? ΐθ^? ausgestattet vhv- und eilne Trennkraft von \~. OCO hatte, ültraf 11triert. Das r,aotosorun wurde in die Ultra-
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zentrifuge unter ein^n Drue·' von 3 ^r ei nref "I hrt ι;η^ hr>i einer Temperatur, die etwa hei "..'tuv-t
In dieser Verfahrensstufe erhielt rr-r, °""; T.lter Ul tra^i] trat das die niycopeotide enthielt. Dieses T.!: traf11 trat wurde bei einer weiteren Ultrazentrifuge sue-efl^rt,-die *nit einer Membran mit einer Trennkraft" von 3000 ausgestattet, war. Der: bei ,dieser Ultrafiltration erhaltene .FHckstand kupt» krnze-.trlert, wodurch man 3700 g eines Sirups erhielt, der einen Tr^kenrehalt von 30 % besaß und im wesentlichen aus ^lyon^ntide bestand..Der bei der ersten Ultrafiltration erhaltene Rückstand bestand aus einem Proteinkonzentrat mit einem 20 lipen "ehalt an Peststoffen, der etwa 100 p; N-Acetylneuramins-Iure enthielt. r-«r pückstand wurde verdünnt, bis man einen Trockenpehalt von 10 t erhielt. Anschließend wurden die Proteine durch ErwSrmunp; auf 950C über einen Zeitraum von 30 Sekunden ausgeflockt. Dann wurde bei 4°C gekühlt und zentrifugiert, wobei man einen Überstand erhielt, der 60 % anfänglichen Volumens ausmachte. Dies entspricht etwa 50 g N-Acetylneuraminsäure. Der Oberstand wurde durch Zup-abe von 'Phosphorwolframsäure behandelt t wobei 5 g dieser Verbindung auf Je ein' Liter des fJberstandes zugesetzt wurden und die Reaktion wurde unter Rühren 5 Minuten lan? bei 250C durchgeführt. Der dabei erhaltene Niederschlag wurde abgetrennt und der Überstand verworfen. Der Niederschlag enthielt 22 g M-Acetylneuraminsäure»
Die*er Niederschlag wurde einer sauren Hydrolyse unterworfen wobei man eine 0,1 normale Schwefelsäure 60 Minuten lang bei 900C einwirken Heß. Um die Abtrennung des Niederschlages zu erlelchtern,wurde auf M0C abgekühlt und anschließend der Niederschlag vom überstand mittels Zentrifugierune1 abgetrennt. Der Niederschlag wurde verworfen und der überstand, der etwa ?0 % N-Acetylneuraminsfture enthielt, weiter bearbeitet. Dieser / überstand wird neutralisiert indem eine wässrige gesättigte * Lösung von Rariumhydroxyd zugesetzt wird, bis ein neutraler "\-
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pH-'.'.'ert erreicht*, wurde, iiaduroh wurden dt-> '"ih^r.sn'r'lssi^en Ionsulfaten ausgefällt und zwar In 1Or1Ti y η %ir 1 u-nsuJ fat. Anschließend wurde p;.ekl?'rt und das "ariumsulpat entfernt. Der dabei erhaltene Überstand' enthielt 19 f, N-Aoety I neuraTi ns':'.ire. "Heaer Überstand wurde konzentriert und zwar !"'isOJelsweise jnd"m sein Volumen um vier bis sochsmHl reduzier', wurde. Dies kann in vorteilhafter Weise erreicht werden iurch "r'*r'vif»ndun£ e! nes Rotationsverdampfers, wobei unter Vakuum, bei ein^r T^mceratur von H^0C unl bei einem Druck von ?0 bis 30 mm Hr gearbeitet wurde. Anschließend liisst die so erhaltene konzentriert° Lösunr- zwecks P^mineral isierung über eine SHuIe laufen, die mit einem kationischen Harz beladen war wie beispielsweise DOWEX Af! 50 WX R H 4- . Anschließend lief?· man die erhaltene Lösunr über eine Sa1UIe laufen, die mit einem anionischen Harz wie DOWF.X An ι χ « -Pormiat geladen war, um die H-Acetylneuraminsflure zu fixieren» Anschließend wurde die SPuIe mit bidestillierten Wasser gewaschen und die N-Acetylneuraminsäure mittels einer 0,3 molaren Ameisensäure eluiert. Auf diese Weise konnten 70 % der auf dem anionischen Harz fixierten TI-Acetylneuraminsäure wiedergewonnen werden. Die Lyoohilisation der ameisensäurenhaltigen Lösung ergab 13 ζ eines sehr reinen N-Acetylneuraminsäurenulvers (purissime).
Beispiel 2
Bei diesem Beispiel wurde unter identischen Bedingungen wie im Beispiel 1 gearbeitet, es wurde Jedoch von 1000 Liter Schafsmilch ausgegangen. Bei diesem Feisniel erhielt man fast äquivalente Ergebnisse.
Beispiel 3
Bei diesem BeisDiel wurde wie in Beisniel 1 gearbeitet mit der
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Ausnahme, daft von einem flüssigen La^tnserum aus ^e <>■.·> nf?f.\n wurde, das durch Regenerierung vrn ou1 verf'3rrrii"em Lactosi-ru'n hergestellt wurde. Pflr die Herstellung· von 0!~!0 Litern f"lüsslrem Lactoserurn mussten 50 kr: Lactcserumoulver verwendet werden.
Patentansnrüche:
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Claims (17)

Patentansprüche
1. Verfahren zur Behandlung von in Käsereien gewonnenem Lactoserum und insbesondere zur Extraktion von rciycoproteinen, Glycopeptiden und Sialins^ure mittels Ultrafiltration des ■ Lactoserums, gekennzeichnet durch
(a) Ultrafiltration des Lactoserums auf Membranen mit einer Trennkraft von etwa 10 000 bis 50 000 in Molekulargewichten, wodurch ein Ultrafiltrat erhalten wird, das im wesentlichen die Lactose, die Mineralsalze und die prlycopenti:le enthält, und ein Proteinriickstand, der außerdem die Glalins-ture enthält, - ■■■.-·.■ ■-■.■■■
(b) Ausflockung der Proteine des Rückstandes, wodurch ein erster Proteinniederschlag und ein erster Überstand erhalten werden, wobei der letztere abgetrennt und weiterverarbeitet wird, ■"■'·" . ■ · ' :
(c) Behandlung des ersten Überstandes mit Phosphorwolframsäure unter Bedingungen, -um einen zweiten überstand und einen zweiten Proteinniederschlag zu bilden, wobei der letztere abgetrennt und weiterbearbeitet wird,
(d) Hydrolyse des zweiten Niederschlages, wodurch ein dritter Niederschlag und einer dritter überstand erzeugt werden, wobei . der letztere abgetrennt und weiterbearbeitet wird,
(e) Behandlung des dritten Überstandes zwecks Extraktion der darin enthaltenen Sialinsäure bzw. N-Acetylneuraminsäure in bekannter Weise mittels Neutralisation, Durchlauf des letzten überstanJes über einen kationischen Harz, Fixierung der Sialinsäure mittels eines Durchlaufes über einen anionischen Harz, Eluierung der fixierten Sialins^ure und Gewinnung einer sehr, reinen Sialinsäure, die lyophllislert werden kann. -
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2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet , daß als Auspanp-smp.terialie'-; in herkömmlicher Weise aus Milch von Wiederkäuern (Kühe, :'!eo;en, Schien, Rüffel, und dergleichen) gewonnenes Lactose Γ.υη-. c.i^r rekorstituiertes Lactoserum, das durch Zusatz von './asser ^u einem dehydratisiertp Lactoserum erzeugt wird, verwendet v/erden.
3. Verfahren nach Ansprüchen '. jder ?, dadurch gekennzeichnet , da?> die Membranen, dessen mittlere Trennkraft zwischen ca. 10 OCO und etwa 50 000 liegt, organische, anorganische, keramische oder metallische 'Membranen sind.
4. Verfahren nach Ansprüchen 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß bet der Ultrafiltration im Verfahrensabschnitt (a) man da3 Lactoserum auf die Membran unter Druck zirkulieren l£ss*- (beispielsweise bei etwa 3 Bar), wobei -'τ ■ mit der Membran in Kontakt gebrachte Produkt rezyklierf. v/ird, bis der behalt an Proteinrückstand optimal geworden ist.
5. Verfahren nach Ansprüchen 1 bis 4, dadurch gekenn zeichnet , daft das aus dem Verfahrensabschnitt (a) herstammende Ultrafiltrat einer weiteren Ultrafiltration mit Membranen unterworfen wird, die eine Trennkraft zwischen etwa 1000 oder etwa 5000 besitzen (ausgedrückt in Molekulargewichten) und vorzugsweise bei einer Trennkraft von MOOO, wodurch ein Rückstand erhalten wird, der die Glycopeptide enthalt und ein Ultrafiltrat, das im wesentlichen die Lactose und die*Mineralsalze enthält. ■
6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet', daß der Rückstand wiedergewonnen wird, um ein ^lycopeptidkonzentrat herzustellen, oder einer Behandlung zur Extraktion der Sialins/iure unterworfen wir-1 und zwar bei
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ähnlichen Bedingungen wie beim Nip-ierschlap^der Im Verfahrensabschnitt (a) erhalten wird.
7. Verfahren nach Ansprüchen 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet , daß vor der Etappe (b) der in der Etappe (a) erhaltene Niederschlag mittels Zugabe von Wasser verdünnt wird, um die Proteinkonzentration einzustellen und zwar bis ein Gehalt an Trockenmaterial in der Größenordnung· von 10 % erhalten wird. .....--"_ . .- '" · ·
8. Verfahren nach Ansprüchen 1 bis 7, dadurch pr e k e η η zeichnet , daß im Verlauf des Verfahrpnsabschnittes (b) eine selektive Denaturierung der löslichen Proteine des Rück-Standes durchgeführt wird, der gegebenenfalls verdünnt worden ist, mittels thermischer Ausflockung, wobei die Bedingungen in der Behandlung eine Erhitzung auf eine Temperatur und während eines Zeitraumes erfordern, die ausreicht, um die Ausfällung der Albumine und der Globuline zu erreichen, ohne die Protease-Peptone (Sialoglycoproteine) zu denaturieren. ; ν :
9. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch g e k e η η zeichnet ,daß die thermische Behandlung des Rückstandes bei einer Temperatur von etwa 950C und in einem Zeitraum von 30 Minuten durchgeführt wird. ■ ; ,
10. Verfahren nach Ansprüchen 1 bis 9» dadurch g e k e η η zeichnet , daü das Produkt gekühlt und vorzugsweise auf k°C gekühlt wird, um die Abtrennung der Ausflockung aufgrund der thermischen Behandlung zu erleichtern. .....-.--..
11. Verfahren nach Ansprüchen 1 bis 10, dadurch ge Jc e η η ζ e i c h η et, daß die Behandlung mit der Phosphorwolframsäure im sauren Milieu durchgeführt wird undjvorzugsweise im schwefelsauren Milieu.
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12. Verfahren nach Annnr-'ichfin 1 hir 1 ι., .-Ki-irch >r <■* '.<■ e μ t zeichnet , daß in dem Verf^hrf r!S'»h · λkr.11f■ Co ) ^t. ν;η 5 g Phosphorwolframsiiure .}e Lit.^r i^s 'tbf»rst;indfis v-jrw^nde*". werden.
13. Verfahren nach Ansprüchen 1 bis 1", dadurch g e k e η η zeichnet, daß im Verlauf des Verfahrensabschnittes (d) der Im Verfahrensabschnitt fc) abgetrennte MIederschlap; hydrolysiert wird, wobei der SSurehydrolyse, Alkalihydrolyse oder eine enzyraatische Hydrolyse durchgeführt werden.
I1I. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet , daß bei der sauren Hydrolyse Schwefelsäure verwendet wird, In einer unter '0,5 f>I liegenden Konzentration und beispielsweise bei einer Konzentration von 0,1 N.
15. Verfahren nach Ansprüchen 13 und I1I, dadurch <? e kennzeichnet, daß die Hydrolyse bei einer höheren Temperatur durchgeführt wird, die Jedoch 9B0C nicht überschreitet und beispielsweise bei etwa 95°C liegt.
16. Verfahren nach Ansprüchen 1 bis 15, dadurch gekennzeichnet, daß im Verlauf des VerTahrensabschnlttes (e)der Überstand neutralisiert wird, um die freien sauren Ionen in Form von Salzen auszufällen und zwar vorzugsweise mittels Zusatz von überschüssigem Bariumhydroxyd, um die Sulfationen auszufällen. '
17. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis Ift dadurch gekennzeichnet , daß im Verlauf des Verfahrensabschnittes (e) der überstand neutralisiert und geklärt wird, gegebenenfalls konzentriert wird, über einen kationischen ' Har2 geführt wird, anschließend über einen anionischen Harz geführt wird, um die am anionischen Harz fixierte
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1^. .ν«rfahrer, p'xoh "Ansp-r'tche-t; 1 bis 1^', 'lalurch "- « k e η ι1 ν. e i c h η e t , ii)p. .Ir-. WrI5UiTe des V'irfahrenoab-3chnlttt'.i (e) 1*τ ne.:tr:il lsi ijrt.e 'jri-1 c.e'^lärte iMerst τη* >etrooknet. viflroi uni -!as iab"l ■ orhni tene Pulver .e»;1η»ίΓ, L^sun.rfvmlt. n» 1· extraktion unterworpe"! wirri, w'-.-hf»! ias Pulver &ut nit einem Lösungsmittel oder einer-, .L^RM-nrhnitt^lTii r^hnnr- behandelt .v/ird, in -1er oder In ie^eri die N-Aofv.yi neuramins-':<.ire !"all -M Ist, wie beisrielaweise athanol oder eine
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