DE2449885A1 - Chemisch modifizierte haemoglobinverbindungen und verfahren zu ihrer herstellung - Google Patents

Chemisch modifizierte haemoglobinverbindungen und verfahren zu ihrer herstellung

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DE2449885A1 DE19742449885 DE2449885A DE2449885A1 DE 2449885 A1 DE2449885 A1 DE 2449885A1 DE 19742449885 DE19742449885 DE 19742449885 DE 2449885 A DE2449885 A DE 2449885A DE 2449885 A1 DE2449885 A1 DE 2449885A1
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Description

Biotest-Serum-Institut GmbH, 6000 Frankfurt/M.-Niederrad, Flughafenstraße 4.
Chemisch modifizierte Hämoglobinverbindungen und Verfahren zu ihrer Herstellung.
Es ist bekannt, daß stroma-freie Lösungen von menschlichem Hämoglobin mit physiologischera Elektrolytgehalt zur Erzielung eines verstärkten Sauerstofftransportes intravenös appliziert werden können (vergleiche zum Beispiel S.F.Rabiner et coll.; J.Ex.Med. lj!6i, 1127 - 1142 [1967]). In der Praxis ist jedoch eine höhere Verweildauer der sauerstofftransportierenden Moleküle für eine länger anhaltende intravasale Wirkung, als bisher erreicht wurde, erwünscht, Teilchenvergrößerungen der Sauerstoffträger durch chemische Aneinanderkoppelung/beziehungsweise Ankoppelung an andere MoIeMIe7 hatten bisher immer Einbußen der physiologischen Sauerstoff-Bindungseigenschaften zur Folge (H.Fasold et al.; Angewandte Chemie 83^ 875 - 882 [1971]).
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-2-
•-a-
Es wurde nun überraschenderweise gefunden, daß eine Verlängerung der intravasalen Verweildauer bei weitgehender Erhaltung des Sauerstofftransportvermögens durch chemische Modifizierung von Hämoglobinmolekülen nach den besonderen Reaktionsbedingungen des erfindungsgemäßen Verfahrens möglich ist.
Gegenstand der Erfindung sind chemisch modifizierte haltbare Hämoglobinpräparate für den akuten Blutersatz und für Organperfusionen, bestehend aus einer Mischung von aneinander oder an andere Proteine gekoppelten Hämoglobinmolekülen, die dadurch gekennzeichnet sind, daß die aneinandergekoppel ten Moleküle eine etwa freiem Hämoglobin entsprechende Sauerstofftransportfähigkeit aufweisen. Diese Sauerstofftransportfähigkeit ist besonders gut bei aneinandergekoppelten Hämoglobinmolekülen.
Gegenstand der Erfindung ist des weiteren ein Verfahren zur Herstellung von chemisch modifizierten haltbaren Hämoglobinpräparaten für den akuten Blutersatz und für Organperfusionen, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man in bekannter Weise Hämoglobinlösungen in die sauerstoff-freie Desoxyform überführt und dann unter Sauerstoffausschluß Dialdehyde mit insbesondere geraden Kohlenstoffketten von 3 bis 8 C-Atomen zugibt, gegebenenfalls anschließend mit Ammoniumsulfat fraktioniert aussalzt und danach eine Kurzdialyse und Ionenaustausch mit Mischbettionenaustauschern durchführt.
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Zur Herstellung der sauerstoff-freien Desoxyform werden die Hämoglobinlösungen vorteilhaft unter Vakuum und Stickstoffbegasung gerührt. Die Zugabe der Dialdehyde, die das Hämoglobinmolekül chemisch so verändern, daß es eine erhöhte intravasale Verweildauer unter Wahrung einer niedrigen Sauerstoffaffinität (das bedeutet eine leichte Og-Abgabe an das Gewebe) gewinnt, erfolgt unter Konzentrations-, Temperatur- und pH-Wert-Verhältnissen, die jeweils einem optimalen Kompromiss zwischen Verweilzeiteffekt einerseits und Erhaltung von Sauerstoffbindungskapazität und -affinität sowie quantitativer Abreaktion des angewendeten Behandlungsmittels zu nicht-toxischen Derivaten andererseits entsprechend ausgewählt werden. Es hat sich gezeigt, daß auf diesem Wege sowohl eine Verknüpfung des Hämoglobinmoleküls
a) mit einem.oder mehreren weiteren Hämoglobinmolekülen,
b) mit Serumproteinmolekülen und
c) mit Molekülen von Gelatinederivaten zum gewünschten Erfolg führen.
Die im Kahinchenkreislauf nachgewiesene intravasale Verweildauer stieg in allen diesen Fällen auf 5 bis 10 Stunden (Halbwertszeit) an, gegenüber einer Verweildauer beim freien nativen Hämoglobin von nur 2 bis 3 Stunden.
Zur Erläuterung werden nachstehend die entsprechenden Werte von Ausscheidungs — Kurven aus dem Kaninchenkreislauf angeführt:
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Tabelle 1
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Halbwertszeit der intravasalen Verweildauer nach Blutaustausch von 15 ml pro kg Körpergewicht bei Kaninchen. Die Hämoglobinkonzentration der untersuchten Präparate betrug einheitlich 6 g pro 100 ml (nähere Einzelheiten der Methode vergleiche K.Bonhard; Anaesthesist 23, 78 - 82 [1974]).
Präparat
Zeit in Stunden Rohprodukte
hochmolekulare 1.Fraktion Gelchromat./Sephadex 6 150
Nicht modifiziertes 2 Hämoglobin
(Vergleichs substanz)
Dialdehyd-vernetztes Hämoglobin (wie in den 4,3 nachstehenden Beispielen
1-5,13 11.14)
An Albumin gekoppeltes Hämoglobin (wie in 8,3 Beispiel 6,7,11 u.12)
An Gelatine gekoppeltes Hämoglobin (wie in Beispiel 8 - 10 ) a
Als Verknüpfungsreagenz dienten höhere Homologe des Glyoxals, nämlich die Glieder der homologen Reihe Propandial, Butandial, Pentandial, Hexandial und Octandial, die der allgemeinen Formel OCH - (^g)n " CH0 entsPrecnen» in der η einen Wert von 1 bis .6 bedeutet.
(Das für die Gelfiltration verwendete Produkt Sephadex der Firma Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Schweden, ist ein modifiziertes Dextran mit dreidimensionaler Netzstruktur.)
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Den Erfolg einer Ankoppelung des sauerstofftransportierenden Hämoglobins an das Albumin zeigt das Elutionsdiagramm einer gelchromatographischen Auftrennung (siehe nachfolgend Beispiel 6) und die mehr als verdoppelte intravasale Verweilzeit des Chromoproteids im Kaninchenversuch.
Zur Gewinnung der erfindungsgemäßen Produkte wurde als Ausgangsmaterial neben menschlichem auch Hämoglobin verschiedener Säugetierarten wie Maus, Ratte, Kaninchen, Hund und Schwein zur Durchführung homologer Tierversuche und zur Gewinnung entsprechender Tierprodukte verwendet-Es wurden jeweils 3- bis 20%ige Hämoglobinlösungen eingesetzt, die vorzugsweise nach einem bekannten Verfahren aus den Erythrozyten gewonnen waren. Höhere Hämoglobinkonzentrationen erreicht man, indem man entweder mit einer entsprechend verringerten Menge an bidesti11iertem Wasser die Erythrozyten hämolysiert und dann in bekannter Weise aufarbeitet oder indem man die beschriebene 6%ige (Standard)Lösung durch ein bekanntes schonendes Ankonzentrierungsverfahren einengt.
Zur Anreicherung und zur Abtrennung des erfindungsgemäß modifizierten Hämoglobins vom nicht-modifizierten oder allzu stark modifizierten (schwerlöslichen) kann eine fraktionierte Aussalzung mit Ammoniumsulfat mit anschließender Kurzdialyse und Ionenaustausch durch Misch-
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bett-Austauscherbehandlung angewendet werden. Dabei werden Ammonium- und Sulfationen gegen Natrium- beziehungsweise Chloridionen ausgetauscht.
Die Hämoglobinverbindungen, die Gegenstand der Erfindung sind, sowie das Verfahren zu ihrer Herstellung werden durch die nachstehenden Beispiele erläutert. Wirksamkeit und Verträglichkeit im Organismus, das heißt, die Eigenschaften, länger in der Blutbahn zu bleiben und dabei vergleichbar mit freigelöstem Hämoglobin Sauerstoff dem Gewebe zuzuführen, wurden in vivo (Verweildauerbestimmungen, vergleiche Tabelle 1) und in vitro (Messung der Sauerstoffbindungskurve und -kapazität, vergleiche die nachstehende Tabelle 2) bewiesen. Die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellten Präparate erwiesen sich im Tierversuch als pyrogenfrei.
Tabelle 2
a) Sauerstoffbindungskapazität (Prozentsatz der theoretischen 02-Bindung von völlig nativem Hämoglobin),
b) PgQ-Werte (Sauerstoffpartialdruck in Torr, der zur Sauerstoffhalbsättigung des Präparates erforderlich ist). Temperatur 370C, pH-Wert 7,45.
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2AA988S
Präparat
a)
O2-Kapazität (% d.Th.) P50 (Torr)
Nicht modifiziertes
Hämoglobin
(Vergleichspräparat) 		Rohprodukt:
Fraktion4"'
gem.Beispiel 1: 		80 21-23
Dialdehyd-vernetz-
tes Hämoglobin
(Beispiele 1-5, 13
und 14) 		Rohprodukt:
Fraktion*'
gem.Beispiel 6: 		75
65 		18
15
An Albumin gekoppel
tes Hämoglobin
(Beispiele 6, 7, n
und 12) 		Rohprodukt:
Fraktion"1")
gem.Beispiel 10: 		70
70 		13
An-Gelatine gekoppel
tes Hämoglobin
(Beispiele 8-10) 		75
70 		15
13
' durch Ammoniumsulfatfraktionierung angereichertes "Doppelmoiekül".
Beispiel 1 Aneinanderkoppelung von Hämoglobinmolekülen mit Hilfe von Propandial (Malondialdehyd):
Vorarbeiten: Propandial wurde aus handelsüblichem acetalisiertem Derivat Malondialdehyd-bis(diäthylacetal) mit Hilfe von ln-Salzsäure freigesetzt. Dazu wurden 1 ml des Acetals mit 2 ml der Säure, bis zur Klärung der Emulsion gerührt und mit Wasser auf das Zwölffache zur "Reagenzlösung 1" verdünnt.
100 ml einer 3%igen Hämoglobinlösung wurden mit ln-Natronlauge auf einen pH-Wert von 9,0 eingestellt, auf 10 bis
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-8-
B 7Ä49883
150C gekühlt, bei Magnetrührung unter ein Vakuum von 20 bis 25 Torr gesetzt und mit Stickstoffgas sauerstoff-frei gespült. Unter dauernder Stickstoffspülung des Gasraumes über der Lösung wurden 2 ml der frisch bereiteten Reagenzlösung 1 innerhalb von 1 Minute dazugetropft. Gleichzeitig wurde ln-Natronlauge zur Aufrechterhaltung des pH-Wertes 9,0 eingerührt. Während lstündigem Rühren stieg die Temperatur der Reaktionsmischung auf 15 bis 200C. Nach Einstellung einerisotonischen Elektrolyt- beziehungsweise Glucosekonzentration (Zusatz von 3 g Glucose und 0,21 g Natriumbicarbonat) wurde mit Kationenaustauscher in der H -Form der pH-Wert auf 7,5 abgestumpft, das Präparat sterilfiltriert und im Kühlschrank (50C) aufbewahrt. Nach 3wöchiger Lagerung ließ sich das Präparat gelchromatographisch durch das Säulen-Elutions-Diagramm nach Figur 1 charakterisieren.
In dieser Abbildung kennzeichnet der Verlauf des Höhenprofils (Ultraviolett-Ahsorption) von links nach rechts den Austritt von Hämoglobinmolekülen sinkender Teilchengrößen. Der Gipfel bei G entspricht Hämoglobin, das an keine anderen Kolloidmoleküle angekoppelt ist. Letzteres ist jedoch der Fall bei den höhermolekularen Substanzen, denen die "Bergschulter" (S) links entspricht. Diese höhermolekularen Substanzen sind leichter ammoniumsulfatausfällbar, das heißt, sie lassen sich durch ein Fällungsfraktionierverfahren, das in Beispiel 2 näher beschrieben wird, anreichern. Mit Hilfe dieser Fällungsfraktionierung gewinnt man ein Präparat, das einen höheren Gehalt an
"Doppelmolekülen" (Nachweis durch Molekulargewichtsbestimmung mit dem Membran-Osmometer) enthält. Diesem angereicherten Präparat entsprach ein P5Q-Wert von 15 Torr (vergleiche Text zu Tabelle 2).
Beispiel 2
Aneinanderkopplung von Hämoglobinmolekülen mit Hilfe von Butandial (Succindialdehyd):
Vorarbeiten: Butandial wurde aus dem handelsüblichen cyclischen Acetal 2s5-Diäthoxy-tetrahydrofuran analog dem Propandial von Beispiel 1 freigesetzt. Die 1:2-Mischung Acetal/Salzsäure wurde jedoch anschließend auf das 18fache mit Wasser zur "Reagenzlösung 2" verd ü η η t.
100 ml einer 6 g Hämoglobin enthaltenden wässrigen Lösung mit pH 6,0 (Ansäuern mit H+-Form eines KatIonenaustauschers) wurden wie in Beispiel 1 gekühlt, sauerstofffrei gespült und entsprechend mit 4 ml der Reagenzlösung 2 innerhalb von 2 Minuten versetzt. Das gleichzeitige Zutropfen von Natronlauge erfolgte jedoch nur in dem Maße, daß ein pH-Wert von 6,0 aufrechterhalten wurde. Nach lstündigem Rühren bei Raumtemperatur unter Stickstof f atmosphäre wurde der pH-Wert auf 7,3 - 7,5 korrigiert und der Ansatz gemäß Beispiel 1 weitergeführt. Nach 3 Wochen Kühlschranklagerung ergab sich gel chromatographisch über Sepharose 6 B (Produkt der Firma Pharmacia Fine Chemicals AB, bestehend aus perlförmiger Agarose speziell für die Gelfiltration) eine Molekülgrößenverteilung (vergleiche Beispiel 1) gemäß Figur 2.
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Zur Anreicherung des "Doppelmolekülantei 1 s" (je 2 Kolloideinheiten sind aneinandergekoppelt) wurde generell nach folgendem Schema verfahren:
In die Reaktionslösung wurde unter Rühren bei Raumtemperatur soviel 4molare Ammoniumsulfatlösung eingetropft, bis sich eine bleibende Trübung ergab. Es wurde 10 Minuten weitergerührt, dann der gebildete Niederschlag abzentrifugiert. Seine Auflösung ergab ein betont hochmolekulares Profil I (vergleiche Beispiel 1) gemäß Figur 3.
Der klare überstand wurde allmählich mit weiterer 4molarer Ammoniumsulfatlösung bis zum gleichvolumigen Verhältnis von ursprünglicher Reaktionslösung zur Ammoniumsulfatlösung versetzt. Der dabei gebildete Niederschlag entsprach Profil II, aus dem man das gewünschte Obergewicht von Doppelmolekülen bei S ersieht. Im Oberstand dieser zweiten Fällung (Profil III) dominiert dagegen das nicht an Kolloide gekoppelte einfache Hämoglobin (G).
Der Pj-Q-Wert der Profil II entsprechenden Fraktion aus butandial-vernetztem Hämoglobin wurde mit 15,5 Torr bestimmt.
Beispiel 3 Aneinanderkopplung von Hämoglobinmolekülen mit Hilfe von Pentandial (Glutardialdehyd):
100 ml einer 10 g Hämoglobin enthaltenden Lösung vom pH 7,5 wurden mit 1,2 ml 10%iger Pentandiallösung (verdünnt aus wässriger 25%iger Lösung von Glutardialdehyd)
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wie in Beispiel 1 zur Reaktion gebracht. Das Präparat wurde 3 Wochen bei 50C gelagert. Danach ergab sich das gelchromatographische "Profil" (vergleiche Beispiel 1) dieses Rohproduktes (siehe Figur 4). Prg-Wert: 16,5 Torr.
Nach Anreicherung des Doppelmolekülanteils (vergleiche Beispiel 2: "Profil II") wurde durch Dialyse (Cellophanschläuche, dampfsterilisiert) bei Raumtemperatur gegen 2%ige Kochsalzlösung (Magnetrührung, 4facher Wechsel des jeweils lOfachen Volumens der Dialysierflüssigkeit im Vergleich zum Präparat innerhalb von 3 Stunden) und durch Passage eines sterilen Ionenaustauschermischbettes (je 100 g Na -, respektive Cl~-Form) das Fraktioniersalz (Ammoniumsulfat) vollständig entfernt. Nach Wiedereinstellung der Isotonie und des physiologischen pH-Wertes wurde nochmals sterilfiltriert. Das Präparat erwies sich als pyrogenfrei. Es verweilte 5,5 Stunden im Kaninchenkreislauf (Halbwertszeit) bei einem P5Q-Wert von 15 Torr. In Figur 5 wird das gelchromatographische Profil des Präparates aus pentandial-vernetzten! Hämoglobin nach Anreicherung des Doppelmolekülanteils gezeigt.
Beispiel 4 Aneinanderkopplung von Hämoglobinmolekülen mit Hilfe von Hexandial (Adipindialdehyd):
Vorarbeiten: Hexandial wurde frisch hergestellt analog K.W. Rosenmund und F. Zetzsche; Chem.Ber. J54-, 2888 [1921] aus Adipinsäure-dichlorid (vergleiche Beispiel 5). Der
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vom festen Katalysator abgetrennte, noch salzsaure Abdampfrückstand wurde im 6fachen Volumen Äthanol aufgenommen zur "Reaktionsmischung 4" mit einem pH-Wert von 2-3.
4 ml der Reagenzmischung 4 wurden unmittelbar nach der Herstellung analog Beispiel 1 auf 100 ml einer - allerdings - 14%igen Hämoglobinlösung vom pH-Wert 9 einwirken gelassen. Nach der üblichen Aufarbeitung und Ammoniumsulfatfraktionierung gemäß Beispiel 2 ergab sich das gel chromatographische Profil gemäß Figur 6. Der f^0~Wert betrug 16 Torr.
Beispiel 5
Aneinanderkopplung von Hämoglobinmolekülen mit Hilfe von Octandial (Suberaldehyd):
Vorarbeiten: Octandial wurde nach K.W. Rosenmund und F. Zetzsche, Chem.Ber. £4·, 2888 [1921], aus Korksäuredichlorid hergestellt. Dazu wurden 40 g Korksäure in 50 ml Thionylchlorid 2 Stunden unter Rückfluß gekocht. Nach nochmaligem Zusatz von 25 ml Thionylchlorid und weiteren 3 Stunden Sieden unter Rückfluß wurde das
Korksäuredichlorid im Vakuum von 10 Torr bei 143 - 1450C abdestilliert. Es folgte eine hydrogenolytische Umsetzung gemäß der vorstehend genannten Vorschrift zum Octandial, das im Verhältnis 1 g:10ml Äthanol zur
"Reagenzriiischung 5" angesetzt und unmittelbar mit Hämoglobin zur Reaktion gebracht wurde.
100 ml einer 14%igen Hämoglobinlösung vom pH 6 (wie in Beispiel 2) wurden mit 4,3 ml "Reagenzmischung 5" zur Reaktion gebracht. Nach entsprechender Aufarbeitung und Anreicherung des Doppelmol eklil antei 1 s durch Ammoniumsulfatfällung ergab sich ein Präparat mit einem gelchromatographischen Profil gemäS Figur 7.
Diesem Präparat entsprach ein P5Q-Wert von 14,5 Torr.
Be i s ρ i e1 6
Ankopplung von Hämoglobin an Serumalbumin:
In 100 ml einer 6 g Hämoglobin enthaltenden Lösung wurden 6,5 g Serumalbumin aufgelöst. Diese Bereitung wurde gemäß Beispiel 2 weiterbehandelt mit der Ausnahme, daß 5,1ml wässrige Butandiallösung ("Reagenzlösung 2") innerhalb 2 Minuten bei einem zuvor eingestellten pH-Wert von 8,5, der im Verlaufe von 2 Stunden Rühren bei Raum-Temperatur aufrecht erhalten wurde, hinzugesetzt wurden. Danach erfolgte eine pH-Korrektur (H -Form eines Kationenaustauschers) auf 7,3, Stern 1filtration und Kühlschranklagerung. Nach 3 Wochen ergab die gelchromatographische Charakterisierung anhand einer Säule von Sephadex G 150 ein Profil gemäß Figur 8.
Die Charakterisierung durch Folienelektrophorese (pH 8,6) ergab eine starke Bande des Kopplungsproduktes Hämoglobin-Albumin zwischen den schwächeren Banden des langsamer wandernden Hämoglobins und des rascher wandernden Albumins.
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Durch Ammoniumsulfatfraktionierung konnte das Kopplungsprodukt weiter angereichert werden. Nach Gelchromatographie über Sephadex 6 150 ergab sich ein Profil gemäß Figur 9. Das derart angereicherte Produkt hatte einen Prg-Wert von 13 Torr.
Beispiel 7 Ankopplung von Hämoglobin an Serumalbumin:
In 100 ml einer 6 g Hämoglobin enthaltenden Lösung wurden 6,5 g Serumalbumin aufgelöst. Diese Bereitung wurde gemäß Beispiel 6 weiterbehandelt mit der Ausnahme, daß 1,5 ml 10%ige Pentandiallösung innerhalb einer Minute bei einem zuvor eingestellten pH-Wert von 9, der im Verlaufe von 2 Stunden Rühren bei Raumtemperatur aufrecht erhalten wurde, hinzugesetzt wurden. Nach 3 Wochen ergab die gelchromatographische Charakterisierung anhand einer Säule von Sephadex G 150 ein Profil gemäß Figur 10. P50-Wert: 13,5 Torr.
Beispiel 8 Ankopplung von Hämoglobin an Oxypolygelatine:
100 ml einer 12%igen Hämoglobinlösung wurde ein 10%iges Konzentrat von Oxypolygelatine zugemischt. Diese Mischung wurde gemäß Beispiel 3 bei einem pH-Wert von 7,5, jedoch mit 1,5 ml 10%iger Pentandiallösung unter sonst analogen Bedingungen umgesetzt und gelagert. Gelchromatographie über Sephadex G 150 ergab davon ein Profil gemäß Figur Dieses Präparat wies einen PgQ-Wert von 15 Torr auf.
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Beispiel 9- .
Ankopplung von Hämoglobin an hydrolytisch abgebaute Gelatine:
Zu 50 ml einer 6%igen Hämoglobinlösung wurden 50 ml einer 6%igen Gelatinebereitung (Rinderknochengelatine) zugemischt, die zuvor durch Erhitzen bei pH 10 auf ein mittleres Molekulargewicht (M ) von 25.000 hydrolytisch abgebaut worden war. Dieses Gemisch wurde gemäß Beispiel 3 mit Pentandial umgesetzt, allerdings bei einem pH-Wert von 7 und mit einer Menge von 0,75 ml der 10%igen Pentandiallösung. Das analog Beispiel 3 aufgearbeitete unfraktionierte Endprodukt zeigte nach 3 Wochen Lagerung das gelchromatographische Profil gemäß Figur 12 und einen P^Q-Wert von 14 Torr.
Beispiel 10
Ankopplung von Hämoglobin an hydrolytisch abgebaute Gelatine:
Zu 50 ml einer 6%igen Hämoglobinlösung wurden 50 ml einer abgebauten Gelatinebereitung wie in Beispiel 9 zugemischt. Dieses Gemisch wurde gemäß Beispiel 4 mit Hexandial umgesetzt, allerdings bei einem pH-Wert von 7 und mit einer Menge von 0,6 ml der 16%igen Dialdehydbereitung ("Reagenzmischung 4"). Das analog Beispiel 4 aufgearbeitete Endprodukt zeigte nach Ammonsulfatfraktionierung einen Pj-Q-Wert von 13 Torr.
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Beispiel 11
Ankopplung von Hämoglobin an Serumproteine:
50 ml einer 10%igen Hämoglobinlösung wurden mit 50 ml Humanserum mit 5 % Proteingehalt gemischt und gemäß Beispiel 3 mit Pentandial zur Reaktion gebracht. Dazu wurden jedoch 1,4 ml der 10%igen Dialdehydlösung bei einem vorher eingestellten pH-Wert von 8,0 verwendet. Das nach üblicher Aufarbeitung anfallende Rohprodukt wurde durch das Gelfiltrations-Diagramm von Figur 13 charakterisiert. P^n-Wert: 13 Torr.
Beispiel 12
Ankopplung von Hämoglobin an Serumproteine:
50 ml einer 10%igen Hämoglobinlösung wurden mit 50 ml Humanserum mit 5 % Proteingehalt gemischt und analog Beispiel 5 mit Octandial, jedoch bei einem vorher eingestellten pH-Wert von 8,0 zur Reaktion gebracht. Dazu wurden 1,9 ml der Reagenzmischung 5 verwendet. Das nach üblicher Aufarbeitung anfallende Rohprodukt wurde durch das GeIfiltrations-Diagramm·von Figur 14 charakterisiert. PgQ-Wert: 13 Torr.
Beispiel 13
Bindung von Pyridoxalphosphat an aneinandergekoppelte Hämoglobinmoleküle:
Zu einem gemäß Beispiel 1 hergestellten fertigen Präparat wurden nach 3 Wochen Lagerung im Kühlschrank 0,1 g Pyridoxalphosphat pro 100 ml zugesetzt mit dem Ziel,
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die Sauerstoffaffinität zu erniedrigen. Nach weiterer 3monatiger Kühlschranklagerung wurde bei dem Präparat ein Pj-Q-Wert von 17 Torr gemessen. Das Rohprodukt zeigte nach Gel Chromatographie über Sephadex G 150 das Profil gemäß Figur 15.
Beispiel 14
Bindung von Pyridoxalphosphat an aneinandergekoppelte Hämoglobinmoleküle.
Zu einem gemäß Beispiel 3 hergestellten Rohprodukt wurden nach 3 Wochen Lagerung im Kühlschrank 0,1 g Pyridoxalphosphat pro 100 ml zugesetzt. Bei dem Präparat wurde ein PrQ-Wert von 16,5 Torr gemessen. Es zeigte nach Gelchromatographie über Sephadex G 150 ein Profil gemäß Figur 16.
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Claims (6)

Patentansprüche:
1.) Chemisch modifizierte, haltbare Hämoglobinpräparate für den akuten Blutersatz und für Organperfusionen, bestehend aus einer Mischung von aneinander oder an andere Protein=gekoppelten Hämoglobinmolekülen, dadurch gekennzeichnet, daß die aneinandergekoppelten Moleküle eine etwa freiem Hämoglobin entsprechende Sauerstofftransportfähigkeit aufweisen.
2.) Hämoglobinpräparate nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß sie eine mindestens doppelt so lange Verweilzeit in der Blutbahn haben wie natives, frei gelöstes Hämoglobin.
3.) Hämoglobinpräparate nach Ansprüchen 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß sie durch Behandlung von Hämoglobinlösungen in Anwesenheit oder Abwesenheit anderer Proteine mit Dialdehyden mit Kohlenstoffketten mit 3 bis 8 C-Atomen erhalten wurden.
4.) Verfahren zur Herstellung von Hämoglobinpräparaten gemäß Ansprüchen 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß man in bekannter Weise Hämoglobinlösungen in die sauerstoff-freie Desoxyform überführt und dann unter Sauerstoffausschluß Dialdehyde mit, insbesondere geraden, Kohlenstoffketten von 3 bis 8 C-Atomen zugibt, gegebenenfalls anschließend mit Ammoniumsulfat fraktioniert aussalzt und danach eine Kurzdialyse und Ionenaustausch
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mit Mischbettionenaustauschern durchführt, gegebenenfalls anschließend mit Pyridoxalphosphat versetzt.
5.) Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß man die 6 bis 18fache molare Menge Dialdehyd, bezogen auf das eingesetzte Hämoglobin, zugibt.
6.) Verfahren nach Ansprüchen 4 und 5, dadurch gekennzeichnet, daß man wässrige oder alkoholische, vorzugsweise 10%ige wässrige Dialdehydverdünnungen verwendet.
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DE2449885A 1974-10-21 1974-10-21 Verfahren zur Herstellung von chemisch modifizierten haltbaren Hämoglobinpräparaten sowie das nach diesem Verfahren hergestellte modifizierte Hämoglobinpräparat Expired DE2449885C3 (de)

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