DE212006000025U1

DE212006000025U1 - Dermatologische Verwendung von Milchproteinen

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Publication number: DE212006000025U1
Application number: DE212006000025U
Authority: DE
Original assignee: FrieslandCampina Nederland Holding BV
Current assignee: FrieslandCampina Nederland Holding BV
Priority date: 2005-03-15
Filing date: 2006-03-14
Publication date: 2008-01-03
Anticipated expiration: 2016-03-15
Also published as: TWI383797B; AU2008100926A4; AU2008100926B4; US20080193551A1; KR20070110518A; AU2008100924A4; CN101166535A; AU2006223754B2; DE602006000511D1; RU2445105C2; US8147875B2; AU2006223754A1; AU2008100924B4; ES2301152T3; DE602006000511T2; JP2008533134A; RU2007137845A; DK1833495T3; EP1833495B1; KR101242428B1

Abstract

Verwendung einer Lactoferrin enthaltenden Molkenproteinfraktion für die Herstellung einer oralen Zusammensetzung zur Behandlung von Akne.

Description

Die Erfindung betrifft die Verwendung von fraktionierten Milchproteinen für die Herstellung einer oralen Zusammensetzung zur Behandlung von Akne.
Hintergrund
Akne
Acne vulgaris ist eine leicht erkennbare Hauterkrankung. Sie ist eine der häufigsten Hauterkrankungen mit einer Verbreitung, die bei Heranwachsenden annähernd 100 % beträgt. Kleinere nicht-entzündliche Akneläsionen können nicht mehr als kleinere Unannehmlichkeiten darstellen, während sich jedoch bei Personen mit stärkerer entzündlicher knotiger Akne, Wundsein, soziale Beeinträchtigung und physische als auch psychische Narben das Leben verändern kann.
Die früheste mikroskopisch sichtbare Läsion, die man bei Acne vulgaris beobachtet, ist das Mikrokomedon. Diese Läsion ist gekennzeichnet durch eine Follikelverstopfung der Leitung einer Haartalgeinheit (die aus einem Haarfollikel und einer Talgdrüse besteht). Talg wird in der Haartalgeinheit produziert und Teile davon können zusammen mit keratinösem Material unter dem Keratinpfropfen eingeschlossen werden, was zu einer Vergrößerung des Follikels führt. Im Stadium des Mikrokomedons sind eine Hyperproliferation des Follikelepitheliums (Hyperkeratosis), eine Follikelverstopfung sowie eine Hyperaktivität der Talgdrüsen zu beobachten.
Das Mikrokomedon ist der Vorläufer anderer Akneläsionen: In dem Maße, in dem die Läsion zunimmt, wird sie klinisch sichtbar und bildet ein nicht entzündetes geschlossenes oder offenes Komedon (weißer bzw. schwarzer Mitesser). Im Verlaufe der Zeit kann sich das (Mikro)Komedon mit Propionibacterium acnes-Bakterien füllen, die chemotaktische und proinflammatorische Zellwandungen und biologische Nebenprodukte abscheiden. Als Folge davon umgeben entzündete Zellen das Follikel, treten durch die Follikelwandung hindurch und erzeugen Enzyme, die die Follikelwandung aufbrechen. Dies führt wiederum zu größeren und häufig entzündlichen Läsionen, wie Papeln, Pusteln und knotigen zystischen Läsionen. Andere Faktoren, wie genetische Prä disposition, Stress und die Ernährung, können ebenfalls die Entwicklung und die Schwere der Akne beeinflussen.
Häufige Therapien
Topische und systemische Therapien bilden zwei der heutigen hauptsächlichen therapeutischen Strategien zur Behandlung von Akne. In Abhängigkeit von der Schwere der Läsionen wird eine einfache oder kombinierte Therapie angewandt. Im allgemeinen zielen die topischen und systemischen Therapien darauf ab, die Hyperkeratose und die Follikelverstopfung zu inhibieren, die Talgproduktion zu verringern sowie die Bakterienbelastung und die entzündlichen Reaktionen zu vermindern.
Die Hauptwirkstoffe der topischen Therapien (in Gel-, Salben- und Lösungsformulierungen) umfassen topische Retinoide und topische Antibiotika. Systemische und orale Therapien werden überwiegend bei Individuen mit mittleren bis schweren Formen von entzündlicher Akne angewandt. Bei sowohl Männern als auch Frauen schließen diese Therapien die Verwendung oraler Antibiotika und oraler Retinoide ein. Gelegentlich wird eine hormonelle Behandlung einschließlich der Anwendung von oralen Kontrazeptiva für die meisten Typen von Akne sowohl bei erwachsenen als auch heranwachsenden Frauen angewandt.
Jedoch ergibt sich eine Vielzahl von nachteiligen Nebenwirkungen bei der Anwendung der oben erwähnten Therapien, die sich von Trockenheit, Rötung und Reizung der Haut bei Anwendung der Retinoide bis zu einer erhöhten Resistenz gegen Antibiotika bei der Verwendung von Antibiotika erstrecken und bis zu einer Gewichtszunahme und von Thrombosen bei der Verwendung oraler Kontrazeptiva. Die letztgenannte Behandlung ist ersichtlich für männliche Individuen nicht geeignet.
Stand der Technik
Die US 2004/0214750 offenbart eine topisch anwendbare Anti-Aknecreme, die Rinder-Lactoferrin und von Pflanzen abgeleitete Komponenten umfaßt, und die nach der Verabreichung während 10 Wochen eine Verbesserung der Akne zeigt. Weiterhin wurde berichtet, daß die kombinierte Verabreichung dieser topisch anwendbaren Creme mit einem oral zu gebenden Produkt, welches Lactoferrin in Sonnenblumenöl enthält, zu einer signifikanten Verbesserung des Hautzustands führt. Jedoch werden weder der Ursprung und die Art des Lactoferrins noch die angewandte Dosis offenbart. Dieses Dokument sieht die Bedeutung der topischen Behandlung vor und macht keinerlei Hinweis auf lediglich eine orale Verabreichung.
Die WO 98/44940 beschreibt Verfahren zur Inhibierung der Aktivität von Interleukin 1β durch die Verabreichung von Lactoferrin. Es wird eine große Vielzahl von Allergen-induzierten Zuständen erwähnt, wie Arthritis, Asthma, Sinusitis, Rhinitis und Bronchitis und auch Hauterkrankungen, wie Dermatitis, Psoriasis, UV-induzierte Entzündungen, Windelwundheit und Falten. Die bevorzugten oral zu gebenden Dosierungen an "aktiven Bestandteile" erstrecken sich von 50 mg bis 500 mg pro kg Körpergewicht pro Tag, was etwa 3 bis 40 g pro Tag beim Erwachsenen entspricht. Für die Behandlung von Hauterkrankungen werden lediglich topische Formulierungen angesprochen. Untersuchungen weisen darauf hin, daß Lactoferrin eine inhibierende Wirkung auf die Synthese des Tumornekrosefaktors α besitzt, von dem berichtet worden ist, daß er eine Wirkung gegen Allergen-induzierte Erkrankungen aufweist, jedoch gibt es keinen experimentellen Nachweis dafür, daß Lactoferrin gegen Hauterkrankungen wirksam ist, wie Akne.
Die JP-A 7-300425 beschreibt Getränke und andere Zusammensetzungen, die Lactoferrin enthalten, für die Verhinderung der Adhäsion von pathogenen Bakterien (beispielsweise E. coli) und kariogenen Pilzen. Es wird auch eine Lotion für die Vorbeugung von Hautentzündungen und Pickeln beschrieben.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung von Mitteln und Methoden für die Behandlung von Akne unter Verwendung von natürlichen oder naturartigen Mitteln mit verbesserter Wirksamkeit.
Beschreibung der Erfindung
Es hat sich im Rahmen der Erfindung gezeigt, daß Akne in wirksamer Weise durch die Verabreichung eine oralen Zusammensetzung behandelt werden kann, die eine Molkenproteinfraktion umfaßt, welche Lactoferrin enthält. Eine zusätzliche topische Behandlung ist nicht erforderlich und in der Tat uner wünscht. Demzufolge bezieht sich die Erfindung auf die Verwendung einer Lactoferrin enthaltenden Molkenproteinfraktion für die Herstellung einer oralen Zusammensetzung zur Behandlung von Akne.
Das erfindungsgemäß verwendete Lactoferrin ist vorzugsweise natives Rinder-Lactoferrin. Rinder-Lactoferrin ist ein Eisen-bindendes Glykoprotein mit 80-kDa, welches in exokrinen Sekreten vorhanden ist, die üblicherweise normaler Flora ausgesetzt sind: Milch, Tränen, Nasenauswurf, Bronchialschleim, Magen-Darm-Flüssigkeiten, Zervikovaginalschleim, Samenflüssigkeit und Speichel. Die übliche Quelle für Rinder-Lactoferrin ist Kolostrum, Milch oder Molke. Ein besonders vorteilhaftes Material ist eine an Lactoferrin angereicherte Molkenproteinfraktion, die zwischen 50 und 98 Gew.-% Lactoferrin, bevorzugter zwischen 60 und 95 % Lactoferrin und als Rest andere Molkenproteine oder Peptide enthält. Man kann auch höhere Gehalte als 95 % oder sogar 98 % verwenden, was jedoch zu keinem zusätzlichen Vorteil führt, jedoch andererseits die Kosten erhöht. Bei besonderen Ausführungsformen liegt der Lactoferringehalt der Fraktion zwischen 75 und 90 Gew.-% oder alternativ zwischen 90 und 98 Gew.-%. In dieser Hinsicht werden Proteine und Peptide, wie GMP (Glykomakropeptid) und Proteosepeptone, die aus dem Kasein der Milch stammen, ebenfalls als Molkenproteine bezeichnet. Es ist bevorzugt, daß die anderen Molkenproteine basisch sind, d. h. aus einem sauren Ionenaustauscherharz eluiert werden können und isoelektrische Punkte oberhalb pH 6, insbesondere oberhalb 7, aufweisen. Es ist weiterhin bevorzugt, daß die anderen Molkenproteine ein Molekulargewicht zwischen 10 kD und 60 kD aufweisen.
Vorzugsweise besitzen die Molkenproteine oder Molkenpeptide eine N-terminale Sequenz, die aus der folgenden Gruppe ausgewählt ist:

– Ile-Gln-Arg-Pro-Pro-Lys-Ile-Gln-Val-Tyr
– Xaa-Pro-Val-Thr-[Asp oder Arg]-Glu-Asn-Thr-Pro-Ile (Xaa ist irgendeine Aminosäure, insbesondere Gly, Ala, Arg, Met, Val, Phe oder Thr)
– Xab-Lys-Glu-Thr-Asn-Tyr-Pro-Asn-Lys-Gly (Xab steht für Ser, Gly oder Asp).

Es ist festzuhalten, daß bei den obigen Sequenzen eine oder zwei der einzelnen Aminosäurereste durch andere Aminosäurereste ausgetauscht sein können und daß weiterhin der N-Terminus mit ein oder zwei zusätzlichen Aminosäureresten versehen sein kann.
Vorzugsweise enthält die Molkenproteinfraktion weniger als 5 Gew.-% Immunoglobuline, insbesondere weniger als 2 Gew.-%. Weiterhin ist es bevorzugt, daß die Fraktion einen geringen Gehalt an Lactoperoxidase enthält, d. h. von weniger als 10 Gew.-%, insbesondere weniger als 4 Gew.-%. Vorzugsweise beträgt das Gewichtsverhältnis zwischen Lactoperoxidase und Lactoferrin weniger als 0,4 und liegt insbesondere zwischen 0,01 und 0,2.
Das Lactoferrin der Molkenproteinfraktion besitzt vorzugsweise einen Eisengehalt von zwischen 50 und 400 ppm Eisen (Fe³⁺), bevorzugter zwischen 75 und 300 ppm und am bevorzugtesten zwischen 100 und 200 ppm, bezogen auf reines Lactoferrin. Der Eisengehalt der Molkenproteinfraktion als solcher liegt vorzugsweise zwischen 40 und 350 ppm, bevorzugter zwischen 60 und 250 ppm und am bevorzugtesten zwischen 80 und 180 ppm, bezogen auf das Molkenproteingewicht. Das Lactoferrin ist vorzugsweise nativ, d. h. im wesentlichen nicht-denaturiert.
Die Lactoferrin enthaltende Fraktion kann durch Fraktionierung von Molkenproteinen durch Affinitätschromatographie, Ionenaustauschchromatographie, Ultrafiltration und dergleichen oder Kombinationen davon erhalten werden. Das Verfahren geht im allgemeinen von einem Milchprodukt aus, das im allgemeinen zunächst entfettet wird, beispielsweise durch Mikrofiltration oder durch Zentrifugation. Das Verfahren kann weiterhin das Auftragen auf ein saures Ionenaustauscherharz, Waschen, Eluieren einer basischen Fraktion, Einengen, Entsalzen der basischen Fraktion und Trocknen (beispielsweise Sprühtrocknen) umfassen.
Die Quelle für das Milchprodukt können Menschen, Kühe, Ziegen, Schafe, Lamas, Yaks, Büffel, Pferde etc. sein. Das Milchprodukt kann Milch, konzentrierte Milch, lactosefreie Milch, pasteurisierte Milch, thermisch behandelte Milch; Molke, entfettete Molke, Käsemolke, Kaseinmolke, Milchsäuremolke, konzentrierte Molke, lactosefreie Molke, ultrafiltrierte oder nanofiltrierte Molke, WPC (Molkenproteinkonzentrate) und andere Milchfraktionen umfassen, welche die meisten oder sämtliche Milchproteine ausgenommen intaktes Kasein, umfassen.
Das Ionenaustauscherharz kann ein stark saurer Typ sein (Sulfonsäure-Typ) oder ein schwach saurer Typ (Carbonsäure-Typ). Der letztere Typ ist bevorzugt. Bevorzugt sind makroporöse, synthetische Polymere, die beispielsweise auf Polymethacrylat basieren. Beispiele für solche Harztypen schließen Sepabeads FP-SP von Mitsubishi (Italien) und Amberlite IRC 50 von Röhm & Haas (USA) ein.
Wenngleich natives Rinder-Lactoferrin ein bevorzugter Bestandteil der als Wirkstoff zu verwendenden Molkenproteinfraktion darstellt, kann ein Teil davon (beispielsweise bis zu 50 Gew.-% oder mehr) oder das gesamte Material durch andere Lactoferrine ersetzt werden, wie Lactoferrin von anderen Säugern (Menschen und anderen Primaten, Pferden, Ziegen, Kamelen oder dergleichen), rekombinantes Lactoferrin (Mensch, Rind und dergleichen), welches in Tieren oder Pflanzen erzeugt worden ist, gespaltenes Lactoferrin, von Lactoferrin abgeleitete Peptide (Lactoferricin, Lactoferrampin und dergleichen), säurebehandeltes Lactoferrin, wie es in der Patentanmeldung PCT/ EP2004/001849 beschrieben ist, und immobilisiertes Lactoferrin, wie es in der WO 0072874 beschrieben wird. Das Lactoferrin kann insbesondere ein Bestandteil von Lactoferrin-haltigen Flüssigkeiten sein (Molke, Milch, Kolostrum) oder eine Zusammensetzung, die Lactoferrin und von Milch abgeleitete Wachstumsfaktoren umfaßt, wie es in der EP 869 134 A1 beschrieben ist.
Lactoferrin und andere Molkenproteine können als solche oder in Kombination mit anderen Wirkstoffen oder Trägermaterialien eingesetzt werden. Nicht einschränkende Beispiele für zu verwendende zusätzliche Bestandteile sind von Säugern abgeleitete biologisch aktive Proteine (wie Lactoperoxidase), Glykoproteine, Enzyme, Kohlenhydrate, Polysaccharide (beispielsweise Pektin, Carboxymethylcellulose, Karragheenan, Heparine), Fettsäuren, Peptide, Aminosäuren, Wachstumsfaktoren, Lysozym, Histatine, Cystatine, Kasein, Kasein-phosphopeptide (CPP), Peptide oder Peptidmischungen, die an einer oder mehreren spezifischen, beispielsweise (gegebenenfalls) essentiellen Aminosäu ren angereichert sind, wie Glutamin, Cystein, Glycin, Arginin, Tryptophan etc.; antihypertensive Peptide, Retinoide, Vitamine und Hormone; nicht-tierische Verbindungen, d. h. pflanzlichen, rekombinanten, chemischen oder anderen Ursprungs, Antibiotika, Fasern, Probiotika, Präbiotika, Retinoide, Vitamine, Hormone, Bakteriocine, Milchsäure und Kräuter.
Die Lactoferrin enthaltende Proteinfraktion kann in einer Weise hergestellt werden, die für die Herstellung von oralen pharmazeutischen oder ernährungsmäßigen Zubereitungen üblich ist. Wenn die zu verabreichende Zusammensetzung eine Nahrungszusammensetzung ist, kann sie eine Nahrungsmittelergänzung sein, wie ein Riegel, ein Getränk, ein Joghurt, eine Süßigkeit, ein Kaugummi etc. Solche Nahrungsmittelprodukte enthalten mindestens einen der Bestandteile Kohlenhydrate und Nicht-Molkenproteine, wie Kasein, gegebenenfalls zusammen mit weiteren Nahrungsmittelbestandteilen, wie Fetten, Fasern, Vitaminen, Mineralstoffen und optionalen Zusätzen, wie Aromastoffen, Süßungsmitteln, Stabilisatoren und dergleichen. Vorzugsweise liegt das Gewichtsverhältnis zwischen Lactoferrin enthaltender Molkenproteinfraktion und dem Kohlenhydrat und/oder Nicht-Molkenprotein zwischen 1:4 und 1:100, bevorzugter zwischen 1:9 und 1:49.
Wenn die Zusammensetzung eine pharmazeutische Zusammensetzung ist, kann sie beispielsweise eine Tablette, Granulat, Pulver, Sirup, Kapsel, Lösung, Gel, Lutschtablette etc. sein, die übliche Hilfsstoffe, wie Wasser, Stärke, Stärkederivate (beispielsweise Natriumstärkeglykolat) oder Stärkefraktionen, mikrokristalline Cellulose oder Cellulosederivate, Pektin oder andere Polysaccharide, Lactose, andere Zucker etc. enthält. Tabletten, insbesondere Kautabletten, stellen eine bevorzugte Ausführungsform der erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zubereitung dar, da die Absorption über die Mundschleimhaut den Magen-Darm-Trakt vermeidet, was als ein zusätzlicher Vorteil angesehen wird. Eine Kautablette ist vorzugsweise weich und besitzt vorzugsweise ein Gesamtgewicht von mindestens 750 mg pro Einheit. Es ist bevorzugt, daß in den Tabletten der Gehalt an (reduzierenden) Zuckern relativ niedrig ist (beispielsweise weniger als 25 Gew.-%, insbesondere weniger als 10 Gew.-% der trockenen Tablettenmasse beträgt), und daß die Hilfsstoffe aus beispielsweise nicht-reduzierenden Zuckern, Polysacchariden und Zuckeralkoholen zu mindestens 50 Gew-% oder selbst mindestens 70 Gew.-% der Zusammensetzung ausgewählt werden. Feste Dosierungsformen können auch mit einem magenresistenten Überzug beschichtet werden. Wenngleich andere systemische Verabreichungswege geeignet sind, wie die rektale, nasale oder parenterale Verabreichung, ist der bevorzugte Verabreichungsweg der orale.
Die Dosis hängt von verschiedenen individuellen Faktoren ab, wie dem Alter, dem physischen und ernährungsmäßigen Zustand und der Schwere der Akne, und kann durch den medizinisch-technischen Assistenten oder den Arzt bestimmt werden. Typische Dosierungen liegen im Bereich zwischen 10 mg und 2 g Lactoferrin enthaltender Molkenproteinfraktion pro Patient pro Tag, vorzugsweise zwischen 20 mg und 1,2 g. Für eine wirksame Behandlung sind Dosierungen von mindestens 40 mg oder vorzugsweise mindestens 60 mg oder sogar 80 mg pro Tag bevorzugt, beispielsweise zwischen 40 und 800 mg oder bis zu 600 mg Lactoferrin pro Patient pro Tag. Bezogen auf das Körpergewicht liegen die Dosierungen im allgemeinen zwischen 0,1 und 50 mg Lactoferrin pro kg pro Tag, vorzugsweise zwischen 0,25 und 25 mg, bevorzugter zwischen 0,5 und 15 mg/kg·Tag oder sogar zwischen 1 und 10 mg/kg·Tag.
Die täglichen Dosierungen können in einer einzigen Dosiseinheit oder vorzugsweise von mehreren täglichen Verabreichungen, beispielsweise 2- bis 4-mal täglich gegeben werden. Demzufolge enthält die Dosiseinheit, wenn eine einzige Dosierungseinheit (beispielsweise eine Tablette) pro Tag verwendet wird, mindestens 10 mg, vorzugsweise jedoch mindestens 40 mg Lactoferrin pro Einheit. Im Fall von zwei täglich zu verabreichenden Dosierungseinheiten enthält die Dosierungseinheit mindestens 10 mg, vorzugsweise jedoch mindestens 20 mg und noch bevorzugter mindestens 30 mg pro Einheit. Bei der Anwendung häufigerer täglicher Verabreichungen ist die Menge des Lactoferrins pro Einheit ähnlich, so daß die gesamte tägliche Menge vorzugsweise mindestens 40 mg, bevorzugter mindestens 80 mg beträgt.
Die Behandlung kann während einer Zeitdauer erfolgen, die sich von mehreren Tagen bis zu mehreren Monaten erstreckt, beispielsweise zwischen 1 Woche und 6 Monaten oder sogar länger, wenn erforderlich. Die Dosierungen können über die Behandlungsdauer konstant gehalten werden. Alternativ und mit Vorteil kann die Behandlung mit relativ hohen Dosierungen beginnen, beispielsweise mit einer Dosierung zwischen den oben angegebenen Mengen und einem doppelten dieser Menge, während einer ersten Periode von beispielsweise zwischen 1 und 6 Wochen, gefolgt von relativ niedrigen Dosierun gen, beispielsweise der Hälfte der angegebenen Dosierungen, während einer zweiten Periode von beispielsweise zwischen 4 Wochen und 1 Jahr oder mehr. Die Behandlung kann an irgendeinem Patienten erfolgen, der an Akne leidet oder dafür prädisponiert ist. In Fällen einer schweren Akne, die ohne Behandlung mit der Zeit zunimmt, kann die Behandlung auch dazu dienen, eine weitere Ausbreitung der Akne zu inhibieren. Die Anti-Aknebehandlung kann erforderlichenfalls auch während der Menstruationsperiode erfolgen.
Die Erfindung betrifft weiterhin eine Lactoferrin enthaltende Zusammensetzung, die weiterhin zwischen 2 und 25 Gew.-% – bezogen auf die gesamte Proteinbasis – basische Proteine mit einem Molekulargewicht zwischen 10 und 60 kD, wie oben beschrieben, enthält. Die Erfindung betrifft schließlich eine orale Dosierungseinheit, die mindestens 10 mg Lactoferrin oder die oben angesprochenen höheren Mengen davon enthält, in Abhängigkeit von dem Verabreichungsweg (einmalige oder mehrfache tägliche Verabreichung). Die Dosierungseinheit kann eine pharmazeutische Zubereitung (beispielsweise eine Tablette) oder eine Nahrungsmittelzusammensetzung sein, wie es oben beschrieben worden ist.
Beispiele
Beispiel I: Herstellung einer Lactoferrin enthaltenden Molkenproteinfraktion
Man behandelt Cheddar-Molke während 20 Sekunden durch Erhitzen auf 60 °C und konzentriert das Material dann durch umgekehrte Osmose um den Faktor 3–5. Der Konzentrationsschritt erfolgt bei einer Maximaltemperatur von 30 °C bei einem pH-Wert von 6,2. Die konzentrierte Molke wird über eine Säule geführt, die mit einem sauren Ionenaustauscherharz vom Typ Amberlite IRC-50 beschickt ist. Die Beladung der Säule erfolgt mit 6–8 Bettvolumen pro Stunde und weniger als 20 Bettvolumen pro Zyklus. Bei diesen Bedingungen binden sich bis zu etwa 2 g Lactoferrin pro Liter des Ionenaustauscherharzes. Anschließend wird das Harz mit mindestens 4 Bettvolumen Wasser gewaschen, gefolgt von einem Waschen mit einer Salzlösung, die eine Konzentration von weniger als 0,5 M NaCl aufweist. Die gewünschte Fraktion wird unter Verwendung von 1 M NaCl oder mehr eluiert. Es ist nicht erforderlich, dem Elutionspuffer einen Puffer zuzusetzen. Die eluierte Fraktion wird entsalzt und unter Anwendung von Ultrafiltration/Diafiltration in an sich be kannter Weise aufkonzentriert. Anschließend wird das Konzentrat mikrofiltriert und sprühgetrocknet. Die Analyse des Produkts erfolgt mit Hilfe einer PAGE-Gelelektrophorese (20 % Acrylamid) und Western Blotting des Gels auf eine PVFD-Membran. Anschließend werden die Hauptbanden ausgeschnitten und einer automatisierten Sequenz Edman-Abbaumethode unterworfen zur Bestimmung der ersten 10 N-terminalen Aminosäuren des Peptids oder Proteins.
Beispiel II: Tabletten enthaltend die in Beispiel I erhaltene Zusammensetzung

Man verwendet die folgenden Bestandteile zur Herstellung von Tabletten, die 50 mg Lactoferrin enthalten.

Bestandteil	mg pro Tablette
Sorbitol P60W	700
Mannitol DS200	200
Primojel (Natriumstärkeglykolat; DMV International)	40
Produkt von Beispiel 1 (79,6% Lactoferrin)	62,8
Äpfelsäure	6
Mg-Stearat (Witco Regular)	5
Orangenaroma (natürlich) Ottens S-627	3,2
Orange Farbe FD&C Yellow #6, Alaunlösung 35–42 %	1,4
Summe	1018,4

Herstellung der Tabletten:
Man vermischt sämtliche Bestandteile mit Ausnahme von Magnesiumstearat während 10 Minuten. Dann gibt man das Stearat zu und setzt das Vermischen während 3 Minuten fort. Man bereitet durch direktes Verpressen Kautabletten der Größe 5/8.
Beispiel III: in vivo-Untersuchung der Wirkung der Molkenproteinfraktion auf die Bekämpfung von Akne
An der Untersuchung haben vierundvierzig Teenager teilgenommen (23 männliche und 21 weibliche mit einem Durchschnittsalter von 15,3 Jahren (Be reich 13 bis 19)). Die Personen erhielten während 12 aufeinanderfolgenden Wochen täglich vier Kautabletten, welche die (gemäß Beispiel I) hergestellte Lactoferrin enthaltende Rinder-Molkenproteinfraktion enthielten, in einer Menge von 251 mg Molkenproteinfraktion pro Tag (200 mg Lactoferrin pro Tag), wobei zwei Tabletten morgens und zwei Tabletten am Abend eingenommen wurden. Von den Personen wurden Profilfotografien aufgenommen und durch einen Dermatologen bewertet. Die Daten wurden in der Woche 1 erfaßt, das heißt vor Beginn der Behandlung, und nach 2, 4, 8 und 12 Wochen. Die Untersuchung war auf 12 Wochen angelegt, wobei die Fotografien bis zur Woche 8 bewertet wurden und die Teenager in der Woche 12 befragt wurden. Die Anzahl der schwarzen Mitesser (offenen Komedonen) und nicht-schwarzen Mitesser (einschließlich weißer Mitesser (geschlossene Komedonen), Papeln, Pusteln und nodulozystischen Läsionen) wurden auf der Stirn, der linken Backe, der rechten Backe, dem Kinn und der Nase ausgezählt. Die Zahl der schwarzen und nicht-schwarzen Mitesser wurde bei jeder Person jede Woche über den Gesichtsbereich aufaddiert. Die Ergebnisse sind in der nachfolgenden Tabelle 1 dargestellt. Sämtliche Unterschiede sind höchst signifikant (P < 0,001 in sämtlichen Fällen).

Bei der Befragung in der 12. Woche berichteten 80 % der Teenager von einer Verbesserung, d. h. eine verminderte Akne, und wünschten die Fortsetzung der Therapie. Mehr als 90 % der Population der Teenageruntersuchung würde die Therapie anderen empfehlen, die an Akne leiden. Weiterhin berichteten die Teenager auch von zusätzlichen vorteilhaften Effekten. Sie fühlten sich gesünder, waren weniger krank oder überhaupt nicht krank (im Vergleich zu Familienmitgliedern oder Freunden, die kein Lactoferrin nahmen). Tabelle 1 Auszählung von schwarzen Mitessern, nicht-schwarzen Mitessern (einschließlich weißer Mitesser (geschlossene Komedonen), Papeln, Pusteln und nodulocystischen Läsionen) und Gesamthautfehlern (schwarze + nicht schwarze Mitesser) pro Woche.

Ergebnis	Woche	Durchschnittswert (Standardabweichung)	Minimum	Median	Maximum
schwarze Mitesser	1	56 (72)	0	33	404
	2	25 (43)	0	12	267
	4	18 (32)	0	9	194
	8	4 (7)	0	1	27
nicht-schwarze Mitesser	1	16 (18)	0	8	77
	2	8 (8)	0	5	35
	4	5 (5)	0	2	21
	8	1 (3)	0	0	12
Gesamtzahl der Hautflecken	1	71 (81)	2	44	452
	2	33 (48)	1	18	302
	4	22 (34)	0	11	207
	8	5 (8)	0	1	30

Die anhand der Teenager-Untersuchung ermittelten Daten zeigen, daß die orale Verabreichung von Rinder-Lactoferrin dazu geeignet ist, Acne vulgaris in wesentlichem Maße zu verringern. Bei der Anwendung von Regressionsmodellen konnte kein Nachweis dafür gefunden werden, daß die Veränderungen im Laufe der Zeit durch das Geschlecht oder das Alter bedingt waren. Dies bedeutet, daß männliche und weibliche Personen ähnlichen zeitlichen Mustern folgten, wie Patienten über dem gesamten Altersbereich von 13 bis 19 Jahren. Es konnten keine Nebenwirkungen beobachtet werden. Die Mehrheit der Untersuchungspopulation berichtete über die günstigen Wirkungen der Aufnahme der Molkenproteinfraktion. Sie stellte eine verringerte Akne fest, fühlte sich besser und gesünder und wollte die Einnahme der Tabletten fortsetzen.
Insgesamt gesehen bildet das Ergebnis der Untersuchung eine solide Basis dafür, daß die Einnahme der Lactoferrin enthaltenden biologisch aktiven Molkenzubereitung, die von Rindermilch abgeleitet ist, eine neue Strategie darstellt zur Vorbeugung und Behandlung von Acne vulgaris. Im Gegensatz zu herkömmlichen systemischen und topischen Therapien (auf der Grundlage von Antibiotika, Retinoiden und anderen Verbindungen), wird die Verabreichung der Lactoferrin/Molke-Zusammensetzung nicht von Nebenwirkungen begleitet und kann langanhaltend angewandt werden.
Beispiel IV: In vivo Untersuchung von unterschiedlichen Verabreichungsformen von Lactoferrin zur Behandlung von Akne

Man bereitet Kautabletten A und B (die 6,25 beziehungsweise 25 mg Lactoferrin pro Tablette enthalten) unter Anwendung der in der nachfolgenden Tabelle angegebenen Mengen (wobei die Mengen in mg pro Tablette angegeben sind). Die Tabletten wurden nach der in Beispiel 1 beschriebenen Weise hergestellt.

	A (6,25 mg)	B (25 mg)
Sorbitol P60W	756,7	732,4
Mannitol SD200	200	200
Natriumstärkeglykolat	40	40
Lactoferrin Produkt; 77,2% Lactoferrin	8,1	32,4
Apfelsäure	6,0	6,0
Magnesiumstearat (Witco Regular)	5,0	5,0
Orangenaroma (natürlich) (Ottens S-627)	3,2	3,2
Orange Farbe D&C Yellow #6, Alaunlösung 35–42 %	1,4	1,4
Summe	1020,4	1020,4

Eine topische Creme wurde aus den folgenden Bestandteilen hergestellt (Mengen in g).

Phase 1	C
Tefose 63 nicht-ionischer Emulgator: (PEG-6 Stearat, Glykolstearat & PEG-32 Stearat)	200,0
Labrafil M 1944 CS (Oleoyl-macrogol-6 Glyceride)	30,0
Mineralöl	30,0
entionisiertes Wasser (steril filtriert)	616,9
Phosphorsäure 80%	1,6
Phase 2
Lactoferrin (77,2% Lactoferrin), 15%-ige Lösung in Wasser	121,5
Gesamtgewicht	1000,0

Man vermischt die Phase 1 und erhitzt sie auf 75°C. Dann kühlt man die Mischung langsam unter Rühren ab. Man gibt die Phase 2 bei 50°C zu und verteilt die erhaltene Mischung, die 14,2 mg Lactoferrin enthält, in 30 g Tuben.
Es wurden vierzig (40) weibliche und männliche Personen mit einem Alter von 12–19 Jahren, die die folgenden Kriterien erfüllen:

– schwache bis mäßige Akne;
– keine Einnahme von oralen Präparaten oder keine OTC-Medikation zur Behandlung von Akne;
– keine chronische Erkrankung mit Gesichtshautmanifestation;
– keine Behandlung mit Antibiotika während 1 Monat vor Untersuchung;
– keine Schwangerschaft, kein Stillen oder auch keine Intention schwanger zu werden;
– keine bekannte Allergie gegen Kuhmilch oder Milchprodukte;

Gruppe 1 (N = 14; 9 männliche und 5 weibliche Personen mit einem Durchschnittsalter von 15,0 Jahren; durchschnittliche Akne-Dauer 3,9 Jahre): Die Personen erhielten die Lactoferrin enthaltenden Tabletten A mit einer empfohlenen Einnahme von 2 Tabletten am Morgen und 2 am Abend, entsprechend 25 mg Lactoferrin pro Tag während insgesamt 6 Wochen.
Gruppe 2 (N = 14; 7 männliche und 7 weibliche Personen, mit einem Durchschnittsalter von 15,1 Jahren; durchschnittliche Akne-Dauer 3,8 Jahre): Die Personen erhielten die Lactoferrin enthaltenden Tabletten B mit einer empfoh lenen Einnahme von 2 Tabletten am Morgen und 2 am Abend, entsprechend 100 mg Lactoferrin pro Tag während insgesamt 6 Wochen.
Gruppe 3 (N = 12; 6 männliche und 6 weibliche Personen, mit einem Durchschnittsalter von 15,2 Jahren; durchschnittliche Akne-Dauer 3,6 Jahre): Die Personen erhielten die Lactoferrin enthaltenden Tabletten A mit einer empfohlenen Einnahme von 2 Tabletten am Morgen und 2 am Abend, entsprechend 25 mg Lactoferrin pro Tag und die topische Lactoferrin enthaltende Creme C, die in einer Menge von 2,45 ml pro Tag topisch aufgetragen werden mußte.

Am Tag T = 0 wurden Photographien der Frontprofile der Personen aufgenommen und durch einen unabhängigen Dermatologen bewertet und es wurde eine Untersuchung von entzündeten Bereichen und Hautflecken auf dem Gesicht durchgeführt. Die Personen erhielten die Tabletten oder die Tabletten und die Creme mit Instruktionen zu deren Verwendung sowie Fragebögen zum Festhalten ihrer Ergebnisse während der Untersuchung, einschließlich ein brennendes oder juckendes Gefühl.
2, 4 und 6 Wochen später wurden die Personen erneut photographiert und befragt und ihre ausgefüllten Frageböden wurden eingesammelt.

Wegen möglicher saisonaler Effekte konnten lediglich zwei Ergebnisse bewertet werden, die in den folgenden Tabellen 2 und 3 zusammengefaßt sind: Tabelle 2 Gesamte dermatologische Bewertung der Akne (Komedonen, Papeln, Pusteln, Knoten und Zysten) nach 2 Wochen und Medianwert der gesamten Bewertung (Mittelwerte) und nicht entzündliche Phänomene (Komedonen nach einer Behandlung während 6 Wochen (mediane Werte).

	Δ 2-0 Gesamt mittel (%)	Δ 6-0 Median nicht entzündlich (%)
Gruppe 1 (oral 25)	+21	+12
Gruppe 2 (oral 100)	–12	–10
Gruppe 3 (oral 25 + topisch)	+19	+7

Tabelle 3 Dermatologische Bewertung der offenen Komedonen, geschlossenen Komedonen und subjektiven Bewertungen des Juckens nach einer 6-wöchigen Behandlung (Medianwerte)

	Veränderung an offenen Komedonen (%)	Veränderung an geschlossenen Komedonen (%)	Veränderung des Juckens (%)
Gruppe 1 (oral 25)	+14	–16	+50
Gruppe 2 (oral 100)	–36	–37	0
Gruppe 3 (oral 25 + topisch	+35	–27	+67

Die Ergebnisse zeigen, daß die orale Behandlung mit 25 mg Lactoferrin pro Tag keinen merkbaren Gesamteffekt ergibt und einen mäßig günstigen Effekt auf geschlossene Komedonen erzeugt, wenn man saisonale Effekt nicht miteinbezieht. Die zusätzliche topische Behandlung mit 35 mg Lactoferrin pro Tag führt zu keiner Verbesserung des Effekts und kann in der Tat kontraproduktiv sein, insbesondere im Hinblick auf die Wirkung gegenüber offenen Komedonen und das Jucken. Die orale Behandlung mit 100 mg Lactoferrin pro Tag besitzt jedoch eine stark verbesserte Wirkung insbesondere auf die nicht enzündlichen Phänome (offene und geschlossene Komedonen).

Claims

Verwendung einer Lactoferrin enthaltenden Molkenproteinfraktion für die Herstellung einer oralen Zusammensetzung zur Behandlung von Akne.
Verwendung nach Anspruch 1, worin die Molkenproteinfraktion zwischen 50 und 98 Gew.-% Lactoferrin enthält.
Verwendung nach Anspruch 1 oder 2, worin die Molkenproteinfraktion zusätzlich basische Proteine oder Peptide mit einem Molekulargewicht zwischen 10 kD und 60 kD enthält.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, worin die Molkenproteinfraktion in einer Dosis zwischen 40 mg und 2 g Lactoferrin pro Patient pro Tag verabreicht wird.
Verwendung nach Anspruch 4, worin die Molkenproteinfraktion in einer Dosis zwischen 60 und 800 mg pro Patient und Tag verabreicht wird.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 5, worin die Molkenproteinfraktion als Tablette verabreicht wird.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 5, worin die Molkenproteinfraktion als mindestens ein Kohlenhydrat und/oder ein Nicht-Molkenprotein enthaltendes Nahrungsmittel oder Getränk verabreicht wird.
Orale Dosierungseinheit enthaltend mindestens 10 mg Lactoferrin.
Orale Dosierungseinheit nach Anspruch 8 enthaltend mindestens 20 mg Lactoferrin.
Orale Dosierungseinheit nach Anspruch 8 oder 9, die in Form einer Tablette vorliegt.
Orale Dosierungseinheit nach Anspruch 10, die mindestens 50 Gew.-% nicht reduzierender Zucker, Polysaccharide und/oder Zuckeralkohole enthält.
Orale Dosierungseinheit nach Anspruch 8 oder 9, die eine Nahrungsmittelzusammensetzung darstellt, die mindestens ein Kohlenhydrat und/oder Nicht-Molkenprotein enthält und eine Molkenproteinfraktion umfaßt, die zwischen 50 und 98 Gew.-% Lactoferrin enthält, wobei das Gewichtsverhältnis zwischen der Lactoferrin enthaltenden Molkenproteinfraktion und dem Kohlenhydrat und/oder Nicht-Molkenprotein zwischen 1:4 und 1:100 liegt.