DE19949579C1 - Verfahren zur fermentativen Herstellung von L-Cystein oder L-Cystein-Derivaten - Google Patents
Verfahren zur fermentativen Herstellung von L-Cystein oder L-Cystein-DerivatenInfo
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Abstract
Die Erfindung betrifft Verfahren zur Herstellung von L-Cystein oder L-Cystein-Derivaten mittels Fermentation von Mikroorganismen sowie für das Verfahren geeignete Mikroorganismen. DOLLAR A Der Mikroorganismenstamm, der zur fermentativen Herstellung von L-Cystein oder L-Cystein-Derivaten geeignet ist, besitzt einen deregulierten Cysteinstoffwechsel, wobei diese Deregulation des Cysteinstoffwechsels nicht auf einer veränderten CycB-Aktivität beruht. Er ist dadurch gekennzeichnet, daß er zusätzlich eine erhöhte CycB-Aktivität besitzt, wobei die CycB-Aktivität ein für ein Wildtyp-CysB typisches Regulationsmuster besitzt.
Description
Die Erfindung betrifft Verfahren zur Herstellung von L-Cystein
oder L-Cystein-Derivaten mittels Fermentation von Mikroorga
nismen sowie für das Verfahren geeignete Mikroorganismen.
Die Aminosäure L-Cystein ist von wirtschaftlicher Bedeutung.
Sie wird beispielsweise als Lebensmittelzusatzstoff (insbeson
dere in der Backmittelindustrie), als Einsatzstoff in der Kos
metik, sowie als Ausgangsprodukt für die Herstellung von Phar
mawirkstoffen (insbesondere N-Acetyl-Cystein und S-Carboxy-
Methyl-Cystein) verwendet.
L-Cystein-Derivate sind alle S-haltigen Metaboliten, die sich
in ihrer Synthese vom Cystein ableiten, also z. B. Cystin, Me
thionin, Glutathion, Biotin, Thiazolidine, Thiamin, Liponsäure
und Coenzym A.
Die Regulation der Cysteinbiosynthese in Bakterien erfolgt auf
zwei Ebenen (Fig. 1):
- 1. Auf der Ebene der Enzymaktivität unterliegt die Serin- Acetyl-Transferase (cysE-Genprodukt) einer Endprodukt- Hemmung durch L-Cystein. Dies bedeutet, daß eine Akkumula tion von L-Cystein direkt zur Hemmung der ersten spezifi schen Reaktion der Cystein-Biosynthese führt und die weite re Synthese unterbunden wird.
- 2. Auf der Ebene der Transkription fungiert das Regulatorpro tein CysB (kodiert durch das cysB-Gen) als Transkriptions aktivator und sorgt für eine regulierte Bereitstellung von reduziertem Schwefel. Als Induktor benötigt CysB N-Acetyl- Serin, das in der Zelle aus O-Acetyl-Serin entsteht, wenn nicht ausreichend reduzierter Schwefel für die O-Acetyl- Serin-Sulfhydrylase-Reaktion zur Verfügung steht. Folglich stehen alle Gene, die mit Aufnahme, Reduktion und Einbau von Schwefel in Verbindung stehen, unter der Kontrolle von CysB. Dies sind die Operone: cysPTWAM, cysDNC, cysJIH und das cysK-Gen. Während Acetyl-Serin als Induktor für CysB wirkt, zeigen Sulfid und Thiosulfat einen negativen Effekt als sogenannte "Antiinducer", da ihr Vorhandensein die Ver fügbarkeit von SH-Gruppen anzeigt.
Der Stand der Technik bezüglich der Gewinnung von L-Cystein
und L-Cystein-Derivaten wird ausführlich in WO 97/15673 (ent
spricht der US Anmeldung SN 09/065104) diskutiert. WO 97/15673
selbst beschreibt ein fermentatives Herstellungsverfahren, bei
dem feedbackresistente Serin-Acetyl-Transferasen zum Einsatz
kommen. Die Anmeldung offenbart ferner, daß eine weitere Stei
gerung der Cysteinausbeute durch eine zusätzliche Deregulie
rung des Regulatorproteins CysB auf Genebene im Sinne einer
konstitutiven Expression möglich ist.
Die Patentanmeldung EP 885962 A1 (entspricht der US Anmeldung
mit der Serial number SN 09/097759) offenbart Mikroorganismen,
die zur fermentativen Herstellung von L-Cystein, L-Cystin, N-
Acetyl-Serin und Thiazolidinderivaten geeignet sind, die da
durch gekennzeichnet sind, daß sie mindestens ein Gen überex
primieren, das für ein Protein kodiert, welches direkt zur
Ausschleusung von Antibiotika oder anderen für die Mikroorga
nismen toxischen Stoffen aus der Zelle geeignet ist.
CysB gehört zur Familie der LysR-Typ-Transkriptionsregulatoren
(LTTR) von der bereits über 100 Vertreter bekannt sind (Schell
M. A., 1993, Annu. Rev. Microbiol. 47: 597-626). Sie zeichnen
sich durch eine N-terminale DNS-Bindedomäne mit einem Helix-
Turn-Helix-Motiv und eine C-terminale Induktor-Bindungsdomäne
aus. Von CysB liegen detaillierte DNS-Bindungsstudien vor. Zu
dem ist CysB das erste LTTR-Protein, von dem auch eine Kri
stallstruktur zur Verfügung steht (Tyrell et al., 1997, Struc
ture 5: 1017-1032). LTTR-Proteine wirken in der Regel als posi
tive Genregulatoren, die vom Vorhandensein eines Induktormole
küls abhängig sind. Es wurde bisher angenommen, daß nur hoch
aktive CysB-Varianten, die unabhängig von Effektormolekülen
sind (sogenannte konstitutiv aktive Varianten), eine Steige
rung der Cystein-Produktion zulassen, da solche Formen gleich
bleibend hohe Genaktivierung entfalten (Nakamori S. et al.,
1998, Appl. Env. Microbiol. 64: 1607-1611).
Beispiele für konstitutiv aktive Formen von CysB wurden für
Salmonella typhimurium beschrieben. Diese Varianten zeigen ho
he Aktivität, wobei die Aktivität völlig unabhängig vom Induk
tor N-Acetyl-Serin und der negativen Wirkung von Thiosulfat
und Sulfid ist (Colyer T. E., Kredich N. M., 1994, Mol. Miro
biol. 13: 797-805).
Die vorliegende Erfindung betrifft einen Mikroorganismenstamm,
der zur fermentativen Herstellung von L-Cystein oder L-
Cystein-Derivaten geeignet ist und einen deregulierten Cy
steinstoffwechsel besitzt, wobei diese Deregulation des Cy
steinstoffwechsels nicht auf einer geänderten CysB-Aktivität
beruht, dadurch gekennzeichnet, daß er zusätzlich eine erhöhte
CysB-Aktivität besitzt, wobei die CysB-Aktivität ein für ein
Wildtyp-CysB typisches Regulationsmuster besitzt.
Mikroorganismenstämme mit dereguliertem Cysteinstoffwechsel,
bei denen diese Deregulation nicht auf einer veränderten CysB-
Aktivität beruht, sind bekannt. Es handelt sich um Stämme mit
modifizierten cysE-Allelen, wie beispielsweise in WO 97/15673
(hereby incorporated by reference) oder Nakamori S. et al.,
1998, Appl. Env. Microbiol. 64: 1607-1611 (hereby incorporated
by reference) beschrieben, oder um Stämme, bei denen Efflux-
Gene eingesetzt werden, wie beispielsweise in EP 0885962 A1
(entspricht der US Anmeldung mit der Serial Number SN
09/097759 (hereby incorporated by reference)) beschreiben,
oder um Stämme, die unter Einsatz unspezifischer Mutagenese-
Methoden kombiniert mit Screening-Methoden für Cystein-
Überproduktion oder verminderten Cystein-Abbau gewonnen wer
den, wie beispielsweise in WO 97/15673 oder in Nakamori S. et
al., 1998, Appl. Env. Microbiol. 64: 1607-1611 beschrieben.
Im Sinne der Erfindung ist eine erhöhte CysB-Aktivität gege
ben, wenn die Aktivität von CysB um mindestens 10% im Ver
gleich zur CysB-Aktivität im Wildtypstamm erhöht ist.
Bevorzugt ist die CysB-Aktivität um mindestens 25% erhöht.
Besonders bevorzugt ist die CysB-Aktivität um mindestens 50%
erhöht.
Ein Escherichia coli Stamm (MC4100::λKZL300), der zur Bestim
mung der CysB-Aktivität geeignet ist, wird in Beispiel 2 be
schrieben. Er wurde bei der DSMZ (Deutsche Sammlung für Mikro
organismen und Zellkulturen GmbH, D-38142 Braunschweig) gemäß
Budapester Vertrag am 23.6.99 unter der Nummer DSM 12886 hin
terlegt. Das jeweilige cysB-haltige Konstrukt wird dazu in den
Stamm MC4100::λKZL300 in an sich bekannter Art und Weise ein
gebracht.
Ein für ein Wildtyp-CysB typisches Regulationsmuster der CysB-
Aktivität ist in Abhängigkeit von der S-Quelle gegeben, wenn
die CysB-Aktivität von Zellen, gewachsen mit Thiosulfat, ge
genüber Zellen, gewachsen mit Sulfat, weniger als 75% beträgt
und die CysB-Aktivität von Zellen, gewachsen mit Cystin, ge
genüber Zellen gewachsen mit Sulfat, weniger als 20% beträgt
(siehe Beispiel 2).
Erfindungsgemäße Mikroorganismenstämme sezernieren L-Cystein
oder ein L-Cystein Derivat im Vergleich zu einem Mikroorganis
menstamm mit dereguliertem Cysteinstoffwechsel ohne erhöhte
CysB-Aktivität in erhöhtem Ausmaß.
Ein erfindungsgemäßer Mikroorganismenstamm ist demnach ein Mi
kroorganismenstamm mit dereguliertem Cysteinstoffwechsel, wo
bei diese Deregulation des Cysteinstoffwechsels nicht auf ei
ner veränderten CysB-Aktivität beruht, in dem homologe oder
heterologe cysB-Gene verstärkt exprimiert werden, die für CysB
mit einem Wildtyp-CysB typischen Regulationsmuster kodieren.
Bevorzugt handelt es sich um Escherichia coli Stämme mit dere
guliertem Cysteinstoffwechsel, wobei diese Deregulation des
Cysteinstoffwechsels nicht auf einer veränderten CysB-
Aktivität beruht, in denen ein Wildtyp-cysB-Gen überexprimiert
wird.
Besonders bevorzugt handelt es sich um Escherichia coli Stämme
mit dereguliertem Cysteinstoffwechsel, wobei diese Deregulati
on des Cysteinstoffwechsels nicht auf einer veränderten CysB-
Aktivität beruht, in denen die Kopienzahl des Wildtyp-cysB-
Gens von Escherichia coli erhöht ist und dieses Gen überexpri
miert wird.
Es zeigte sich überraschend, daß nicht wie in den genannten
Offenbarungen des Stands der Technik postuliert, ein Einsatz
von cysB-Allelen, die für konstitutiv aktive CysB-Regulator
proteine kodieren, die Cystein-Produktion steigert, sondern
daß, ganz im Gegenteil, eine verstärkte Expression eines Wild
typ-cysB-Gens die Cystein-Produktion steigert.
Dieser Befund ist auch deshalb überraschend und unerwartet, da
bisher kein Beispiel bekannt ist, in dem eine vermehrte Ex
pression eines Regulatorproteins aus der Familie der LysR-Typ-
Trans-krip-tions-regulatoren eine Überproduktion eines Metabo
liten ermöglicht.
Die Erfindung betrifft somit auch die Verwendung eines Regula
torproteins aus der Familie der LysR-Typ-Trans-krip-tions-
regulatoren zur Überproduktion eines Metaboliten sowie ein
Verfahren zur Überproduktion eines Metaboliten, das dadurch
gekennzeichnet ist, daß ein Regulatorgen aus der Familie der
LysR-Typ-Trans-krip-tions-regulatoren in einem Mikroorganismus
überexprimiert wird und eine verstärkte Produktion des Metabo
liten im Mikroorganismus bewirkt.
Eine Erhöhung der CysB-Aktivität in einem Mikroorganismus bei
gleichzeitigem Erhalt des typischen Regulationsmusters kann
zum Beispiel erreicht werden durch:
- 1. eine Erhöhung der Kopienzahl eines cysB-Gens, kodierend für CysB mit einem Wildtyp-CysB typischen Regulationsmuster, im Mikroorganismus unter Kontrolle eines Promotors oder
- 2. eine verstärkte Expression eines cysB-Gens kodierend für CysB mit einem Wildtyp-CysB typischen Regulationsmuster durch Austausch des die Expression des Wildtyp-cysB-Gens regulierenden Promotors gegen einen stärkeren Promotor.
cysB-Gene sind bekannt aus Escherichia coli, Salmonella typhi
murium, Klebsiella aerogenes, Haemophilus influenzae, Pseudo
monas aeruginosa und Thiocapsa roseopersicina. Als cysB-Gene
werden vorzugsweise Gene verstanden, deren Genprodukte mit dem
CysB-Protein von Escherichia coli eine Identität von minde
stens 40% aufweisen. Die Homologiewerte beziehen sich auf Er
gebnisse, die mit dem Computerprogramm "Wisconsin Package Ver
sion 9.0, Genetics Computer Group (GCG), Madison, Wisconsin"
erhalten werden. Dabei erfolgt die Suche in der Datenbank mit
dem Unterprogramm "blast" unter Verwendung der Standardparame
ter.
cysB-Gene sind ferner solche Allele von Wildtyp-cysB-Genen,
deren Genprodukte in ihrer Sequenz verändert sind, ohne daß
dadurch das typische Wildtyp-CysB Regulationsmuster verloren
geht. Ein Beispiel hierfür sind CysB-Varianten mit konservati
ven Aminosäure-Austauschen.
Ein erfindungsgemäßer Mikroorganismus läßt sich beispielsweise
dadurch herstellen, daß in einem Mikroorganismenstamm mit de
reguliertem Cysteinstoffwechsel, wobei diese Deregulation des
Cysteinstoffwechsels nicht auf einer veränderten CysB-
Aktivität beruht, mittels an sich bekannter Methoden die Ko
pienzahl des Wildtyp-cysB-Gens oder eines cysB-Gens kodierend
für CysB mit einem Wildtyp-CysB typischen Regulationsmuster
erhöht wird, oder daß mittels an sich bekannter Methoden eine
verstärkte Expression des Wildtyp-cysB-Gens oder eines cysB-
Gens kodierend für ein CysB mit einem Wildtyp-CysB typischen
Regulationsmuster bewirkt wird.
Im folgenden bedeutet der Begriff "CysB" sowohl "Wildtyp-CysB"
als auch "CysB-Variante mit einem für einen Wildtyp-CysB typi
schem Regulationsmuster". Der Begriff "cysB-Gen" bedeutet im
folgenden "Wildtyp-cysB-Gen" sowie "cysB-Gen kodierend für
CysB mit einem für Wildtyp-CysB typischen Regulationsmuster".
Die Erhöhung der Kopienzahl des cysB-Gens in einem Mikroorga
nismus kann mit dem Fachmann bekannten Methoden vorgenommen
werden. So kann zum Beispiel das cysB-Gen in Plasmid-Vektoren
mit mehrfacher Kopienzahl pro Zelle (z. B. pUC19, pBR322,
pACYC184) kloniert und in einen Mikroorganismus mit deregu
liertem Cysteinstoffwechsel eingebracht werden. Alternativ
kann das cysB-Gen mehrfach ins Chromosom eines Mikroorganismus
mit dereguliertem Cysteinstoffwechsel integriert werden. Als
Integrationsverfahren können die bekannten Systeme mit tempe
renten Bakteriophagen, integrative Plasmide oder die Integra
tion über homologe Rekombination genutzt werden (z. B. Hamilton
et al., 1989, J. Bacteriol. 171: 4617-4622).
Bevorzugt ist die Erhöhung der Kopienzahl durch Klonierung ei
nes cysB-Gens in Plasmid-Vektoren unter der Kontrolle eines
Promotors. Besonders bevorzugt ist die Erhöhung der Kopienzahl
durch Klonierung eines cysB-Gens in pACYC-Derivate, wie z. B.
pACYC184-LH (hinterlegt gemäß Budapester Vertrag bei der Deut
schen Sammlung für Mikroorganismen und Zellkulturen, Braun
schweig am 18.8.95 unter der Nummer DSM 10172).
Als Kontrollregion für die Expression eines plasmid-kodierten
cysB-Gens kann die natürliche Promotor- und Operatorregion des
Gens dienen.
Die verstärkte Expression eines cysB-Gens kann jedoch auch
mittels anderer Promotoren erfolgen. Entsprechende Promotorsy
steme sind dem Fachmann bekannt (Makrides S. C., 1996, Micro
biol. Rev. 60: 512-538). Solche Konstrukte können in an sich
bekannter Weise auf Plasmiden oder chromosomal verwendet wer
den.
Die Klonierung eines cysB-Gens in Plasmid-Vektoren erfolgt
beispielsweise durch spezifische Amplifikation mittels der Po
lymerase-Ketten-Reaktion unter Einsatz von spezifischen Pri
mern, die das komplette cysB-Gen mit Promoter- und Operatorse
quenz erfassen und anschließende Ligation mit Vektor-DNS-
Fragmenten.
Als bevorzugte Vektoren für die Klonierung eines cysB-Gens
werden Plasmide verwendet, die bereits genetische Elemente zur
Deregulierung des Cysteinstoffwechsels enthalten, beispiels
weise ein cysEX-Gen (WO 97/15673) und ein Effluxgen (EP 0885962
A1). Solche Vektoren ermöglichen die Herstellung eines erfin
dungsgemäßen Mikroorganismenstammes aus einem beliebigen Mi
kroorganismenstamm, da ein solcher Vektor auch eine Deregulie
rung des Cysteinstoffwechsels in einem Mikroorganismus be
wirkt.
Die Erfindung betrifft somit auch ein Plasmid, das dadurch ge
kennzeichnet ist, daß es genetische Elemente zur Deregulierung
des Cysteinstoffwechsels besitzt, wobei diese genetischen Ele
mente keine Veränderung der CysB-Aktivität bewirken, sowie ein
cysB-Gen unter Kontrolle eines Promotors enthält.
Durch eine gängige Transformationsmethode (z. B. Elektroporati
on) werden die cysB-haltigen Plasmide in Bakterien eingebracht
und beispielsweise mittels Antibiotika-Resistenz auf plasmid
tragende Klone selektiert.
Die Erfindung betrifft somit auch Verfahren zur Herstellung
eines erfindungsgemäßen Mikroorganismenstammes, dadurch ge
kennzeichnet, daß in einen Mikroorganismenstamm ein erfin
dungsgemäßes Plasmid eingebracht wird.
Die Produktion von Cystein oder Cystein-Derivaten mit Hilfe
eines erfindungsgemäßen Mikroorganismenstammes erfolgt in ei
nem Fermenter nach an und für sich bekannten Verfahren. Als C-
Quellen können z. B. Glukose, Laktose oder andere Zucker, als
N-Quelle Ammonium oder Proteinhydrolysate verwendet werden.
Als S-Quelle können z. B. Sulfid, Sulfit, Sulfat oder Thiosul
fat verwendet werden. Während der Fermentation gebildetes L-
Cystein kann durch Oxidation zu schwerlöslichem Cystin oder
durch Kondensation mit Aldehyden oder Ketonen zu Thiazolidinen
(z. B. mit Brenztraubensäure zu 2-Methyl-thiazolidin-2,4-
dicarbonsäure) abreagieren.
Die Erfindung betrifft somit auch ein Verfahren zur Herstel
lung von L-Cystein, oder L-Cystein-Derivaten, welche dadurch
gekennzeichnet sind, daß ein erfindungsgemäßer Mikroorganis
menstamm in an sich bekannter Art und Weise in der Fermentati
on eingesetzt und das L-Cystein oder L-Cystein-Derivat aus dem
Fermentationsansatz abgetrennt wird.
Die folgenden Beispiele dienen der weiteren Erläuterung der
Erfindung.
Das Wildtyp-cysB-Gen von Escherichia coli wurde unter Anwen
dung der Polymerase-Ketten-Reaktion (PCR) kloniert. Mit den
spezifischen Oligonukleotid-Primern (20 pmol pro Ansatz)
cysBP1 (SEQ. ID. NO: 1) und cysBP2 (SEQ. ID. NO: 2) wurde ein
genomisches 3107 basenpaare langes DNS-Fragment amplifiziert,
das das Wildtyp-cysB-Gen mit flankierenden Regionen umfaßt und
terminale EcoRI- bzw. SalI-Restriktionsschnittstellen besitzt.
5'-GTT ACG AGA TCG AAG AGG-3' (Phosphorothioat-Bindung am 3'-
Ende) (SEQ. ID. NO: 1)
5'-GTC ACC GAG TGG TCA ATG-3' (Phosphorothioat-Bindung am 3'- Ende) (SEQ. ID. NO: 2)
5'-GTC ACC GAG TGG TCA ATG-3' (Phosphorothioat-Bindung am 3'- Ende) (SEQ. ID. NO: 2)
Die PCR-Reaktion wurde mit der Pwo-DNS-Polymerase der Firma
Boehringer (Mannheim, D) mit 10 ng genomischer DNS als Matrize
durchgeführt. Das Programm umfaßte 29 Zyklen mit einer Annea
lingtemperatur von 56°C (30 Sekunden pro Zyklus), einer Ex
tensionstemperatur von 72°C (60 Sekunden pro Zyklus) und ei
ner Denaturierungstemperatur von 94°C (30 Sekunden pro Zy
klus). Das DNS-Fragment wurde mit den Restriktionsenzymen Eco-
RI und SalI nachbehandelt und über eine präparative Gelelek
trophorese und die Geneclean-Methode (Geneclean Kit BIO101 P.
O. Box 2284, La Jolla, California, USA, 92038-2284) gereinigt.
Dieses Fragment wurde in den EcoRI-SalI-geschnittenen und
phosphatase-behandelten Phagemid-Vektor pTZ19U der Firma Bio-
Rad Laboratories (Hercules, California, USA) ligiert und so
das Plasmid pTZ19U-cysB erhalten (Fig. 2). Nach der Transfor
mation wurden positive Klone über Restriktionsanalyse identi
fiziert.
Zur Konstruktion eines konstitutiv aktiven cysB-Allels wurde
(in Analogie zu der bei Colyer T. E., Kredich N. M., 1994,
Mol. Mirobiol. 13: 797-805 beschriebenen Mutation im Wildtyp
cysB-Gen von Salmonella typhimurium) die Mutation des Codons
147 des Wildtyp-cysB-Gens zu einem Methionin-Codon mit dem
"Mutagene In Vitro Mutagenesis"-Kit der Firma Bio-Rad Labora
tories (Hercules, California, USA) durchgeführt. Dabei wurde
das Oligonukleotid CysBMut4 (SEQ. ID. NO. 3) verwendet. Die
unterstrichenen Basen zeigen die Abweichung von der Wildtyp-
Sequenz an.
5'-TTC GCT ATC GCC ATG GAA GCG CTG CAT-3'(SEQ. ID. NO. 3)
Für Aktivitätstests (siehe Beispiel 2) wurden die beiden cysB-
Allele als EcoRI-SalI-Fragmente nach Klenow-Behandlung in den
Ecl136II-geschnittenen, phosphatase-behandelten Vektor
pACYC184-LH kloniert.
Zur Messung der CysB-Aktivität wurde ein Reportergen-Ansatz
gewählt. Hierfür wurde die Kontroll-Region des cysK-Gens mit
dem lacZ-Gen, das für das Enzym β-Galaktosidase kodiert, fu
sioniert. Durch Integration dieser Fusion in Stämme ohne endo
gene β-Galaktosidase wird dieses Enzym in Abhängigkeit von der
CysB-Aktivität gebildet und liefert somit in Form von β-
Galaktosidase-Aktivität ein indirektes Maß der CysB-Aktivität.
Für die Konstruktion der Fusion wurde das von Simons et al.
beschriebene System verwendet (Simons R. W. et al., 1987, Gene
53: 85-96). Zunächst wurde der Promotorbereich des cysK-Gens
einschließlich der ersten fünfzehn Codons unter Verwendung der
Oligonukleotidprimer cysKP1 (SEQ. ID. NO: 4) und cysKP3 (SEQ.
ID. NO: 5) und 10 ng chromosomaler DNS von Escherichia coli
und Pwo-Polymerase mittels der Polymerase-Ketten-Reaktion am
plifiziert.
5'-CCG GAA TTC CCG TTG CCG TTT GTG GCG-3'(SEQ. ID. NO: 4)
5'-CGC GGA TCC GTG TGA CCG ATA GTC AGC-3'(SEQ. ID. NO: 5)
Die Bedingungen entsprachen denjenigen, die in Beispiel 1 be
schrieben wurden. Das resultierende 317 Basenpaar-Produkt wur
de mit den Restriktionsenzymen EcoRI und BamHI nach Herstel
lerangaben verdaut und mittels präparativer Gelelektrophorese
und der Geneclean-Methode gereinigt. Anschließend wurde das
Produkt mit dem ebenfalls EcoRI-BamHI-verdauten und phosphata
se-behandelten Vektor pRS552 (hinterlegt gemäß Budapester Ver
trag bei der Deutschen Sammlung für Mikroorganismen und Zell
kulturen, Braunschweig am 14.9.99 unter der Nummer DSM 13034)
ligiert. Mittels Elektroporation wurde der Stamm MC4100 (ATCC
35695) mit dem Ligationsansatz transformiert und positive Klo
ne anhand von Restriktionsanalysen identifiziert. Diese ent
halten eine translationale cysK-lacZ-Fusion. Das erhaltene
Plasmid wurde der Anleitung von Simons et al. folgend mit dem
Bakteriophagen λRS45 (hinterlegt gemäß Budapester Vertrag bei
der Deutschen Sammlung für Mikroorganismen und Zellkulturen,
Braunschweig am 14.9.99 unter der Nummer DSM 13035) rekombi
niert und ein homogenes Lysat des rekombinanten Phagen mit der
Bezeichnung λKZL300 hergestellt. Mit diesem Phagen wurde der
Δlac-Stamm MC4100 infiziert und durch Kanamycin-Selektion ly
sogene Klone identifiziert (MC4100::λKZL300), die nun für die
Messung der CysB-Aktivität verwendet werden konnten.
Zum Vergleich der Wirkung eines multicopy cysB-Gens kloniert
in pACYC184-LH und eines cysB(T149M)-Gens wurde
MC4100::λKZL300 mit den entsprechenden Plasmiden pACYC-cysB
und pACYC-cysB(T149M) transformiert.
Die Stämme wurden in VB-Minimalmedium (3,5 g/l Na(NH4)HPO4; 10
g/l KH2PO4; 2 g/l Citrat × H2O; 0,078 g/l MgCl2; pH mit NaOH
auf 6,5 einstellen, 5 g/l Glukose 5 mg/l Vitamin B1) mit ver
schiedenen Schwefelquellen (je 1 mM Schwefel) kultiviert, wo
bei 15 mg/l Tetracyclin zugesetzt wurde. Die Bestimmung der β-
Galaktosidase-Aktivität erfolgte nach der von Miller beschrie
benen Methode (Miller J. H., 1972, Experiments in Molecular
Genetics, Cold Spring Harbour, New York, 352-355).
Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 dargestellt. Es zeigt sich
bei der Kontrolle (MC4100::λKZL300/pACYC184-LH) ein für ein
CysB-Wildtyp typisches Regulationsmuster der CysB-Aktivität in
Abhängigkeit von der S-Quelle: Die CysB-Aktivität von Zellen,
gewachsen mit Thiosulfat, gegenüber Sulfat beträgt weniger als
75% und die CysB-Aktivität von Zellen, gewachsen mit Cystin,
gegenüber Sulfat beträgt weniger als 20%. Dieses Muster wird
bei Vorhandensein eines Wildtyp-cysB-Gens in multicopy auf ei
nem insgesamt gehobenen Aktivitätsniveau erhalten (erfindungs
gemäßes Beispiel MC4100::λKZL300/pACYC-cysB). Das
cysB(T149M)-Allel führt dagegen zu einer konstitutiv hohen Ak
tiviät unter Verlust des typischen Regulationsmusters.
Erfindungsgemäße Organismen zeichnen sich durch einen deregu
lierten Cysteinstoffwechsel und beispielsweise durch ein cysB-
Gen in mehrfacher Kopienzahl aus. Um solche Organismen herzu
stellen, wurde das Plasmid (pACYC184-cysEX-GAPDH-ORF306) als
Grundkonstrukt gewählt. Dieses Plasmid enthält die Elemente
feedback-resistentes cysE-Allel und Efflux-Gen zur Deregulie
rung des Cysteinstoffwechsels. Es ist in der Patentanmeldung
EP 0885962 A1 (Beispiel 2D) eingehend beschrieben. In dieses
Konstrukt, verdaut mit dem Restriktionsenzym SnaBI sowie phos
phatase-behandelt, wurde zwischen das cysEX-Allel und das Ef
flux-Gen ein cysB-Fragment inseriert. Letzteres wurde durch
Restriktion mit den Enzymen EcoRI und BstXI und durch an
schließendes Glätten der DNS-Enden mit Klenow-Enzym aus dem
Plasmid pTZ19U-cysB gewonnen (Fig. 2). Das Plasmid trägt die
Bezeichnung pHC34.
Durch Transformation des Escherichia coli Stammes W3110 (ATCC
27325; Bachmann B. J., 1996, In: Neidhardt F. C. (ed.) Esche
richia coli und Salmonella: cellular and molecular biology,
American Society for Microbiology, Washington D. C., Chapter
133) entsteht ein erfindungsgemäßer Organismus. Die Transfor
mation wurde mit Hilfe der Elektroporation durchgeführt. Hier
bei wurde eine dichte Zellsuspension in eiskalter 10%-iger
Glycerinlösung mit 0,1 µg Plasmid-DNA versetzt und bei 2500 V,
200 Ohm und 12,5 µF einem elektrischen Puls ausgesetzt. Nach
dem Transfer des Ansatzes in steriles LB-Medium (1% Trypton,
0,5% Hefeextrakt, 1% NaCl) und Inkubation bei 30°C für eine
Stunde wurden plasmidtragende Klone auf LB-Agarplatten mit 15
µg/ml Tetracyclin selektiert.
Für einen Vergleich der Wirkung des Wildtyp-cysB-Gens gegen
über dem konstitutiven cysB(T149M)-Allel wurde ein analoges
Konstrukt (pHC30) erstellt und ebenfalls in den Stamm W3100
eingebracht. Des weiteren diente der in EP 885962 A1 beschrie
bene Organismus W3110, transformiert mit dem Plasmid
pACYC184/cysEX-GAPDH-orf306, als Grundkonstrukt zum Vergleich
und gleichzeitig zur Abgrenzung gegen den Stand der Technik.
Da es sich bei W3110 um einen Wildtypstamm handelt, sind alle
Cystein-Produktionseffekte auf plasmid-kodierte Gene zurückzu
führen.
Zum Nachweis der Cystein-Produktion wurden die in Beispiel 3
beschriebenen Mikroorganismen in Fermentern im Fed-Batch-Modus
mit kontinuierlicher Glukose- und Thiosulfat-Fütterung kulti
viert. Als Vorrichtung diente ein Biostat M-Gerät der Firma
Braun Biotech (Melsungen, D) mit einem maximalen Kulturvolumen
von 2 l.
Als Vorkultur wurden 20 ml LB-Medium (10 g/l Trypton, 5 g/l
Hefeextrakt, 10 g/l NaCl), das zusätzlich 15 mg/l Tetracyclin
enthielt, beimpft und bei 30°C und 150 rpm in einem Schüttler
inkubiert. Nach sieben Stunden wurde der gesamte Ansatz in 100
ml SM1-Medium (12 g/l K2HPO4; 3 g/l KH2PO4; 5 g/l (NH4)2SO4; 0,3
g/l MgSO4 × 7 H2O; 0,015 g/l CaCl2 × 2 H2O; 0,002 g/l FeSO4 × 7
H2O; 1 g/l Na3Citrat × 2 H2O; 0,1 g/l NaCl; 1 ml/l Spurenele
mentlösung bestehend aus 0,15 g/l Na2MoO4 × 2 H2O; 2,5 g/l Na-
BO3; 0,7 g/l CoCl2 × 6 H2O; 0,25 g/l CuSO4 × 5 H2O; 1,6 g/l
MnCl2 × 4 H2O; 0,3 g/l ZnSO4 × 7 H2O), das mit 5 g/l Glukose;
0,5 mg/l Vitamin B1 und 15 mg/l Tetracyclin supplementiert
wurde, überführt. Die weitere Inkubation erfolgte bei 30°C
für 17 Stunden bei 150 rpm.
Mit dieser Vorkultur (optische Dichte bei 600 nm von ca. 3)
wurde der Fermenter mit 900 ml Fermentationsmedium (15 g/l
Glukose; 10 g/l Trypton; 5 g/l Hefeextrakt; 5 g/l (NH4)2SO4;
1,5 g/l KH2PO4; 0,5 g/l NaCl; 0,3 g/l MgSO4 × 7 H2O; 0,015 g/l
CaCl2 × 2 H2O; 0,075 g/l FeSO4 × 7 H2O; 1 g/l Na3Citrat × 2 H2O
und 1 ml/l Spurenelementlösung s. o., 5 mg/l Vitamin B1 und 15
mg/l Tetracyclin, eingestellt auf pH 7,0 mit 25% Ammoniak)
beimpft. Während der Fermentation wurde eine Temperatur von
30°C eingestellt und der pH-Wert durch Zudosierung von 25%
Ammonik bei einem Wert von 7,0 konstant gehalten. Die Kultur
wurde mit entkeimter Druckluft bei 1,5 vol/vol/min begast und
mit einer Rührerdrehzahl von 200 rpm gerührt. Nach Absinken
der Sauerstoffsättigung auf einen Wert von 50% wurde die
Drehzahl über ein Kontrollgerät bis zu einem Wert von 1200 rpm
erhöht, um 50% Sauerstoffsättigung zu erhalten.
Nach zwei Stunden erfolgte eine Zudosierung einer 30% Na-
Thiosulfat-Lösung mit einer Rate von 3 ml/h. Glukose wurde aus
einer 56% Stammlösung zugefüttert, sobald der Gehalt im Fer
menter von anfänglich 15 g/l auf ca. 5-10 g/l abgesunken war.
Die Glukose-Fütterung erfolgte mit einer Flußrate von 8-14
ml/h, wobei versucht wurde, eine Glukosekonzentration von ca.
5-10 g/l konstant zu halten. Die Glukose-Bestimmung wurde mit
dem Glukoseanalysator der Firma YSI (Yellow Springs, Ohio,
USA) durchgeführt.
Die Produktion von L-Cystein wurde colorimetrisch mit dem Test
von Gaitonde (Gaitonde, M. K. (1967), Biochem. J. 104, 627-633)
verfolgt. Dabei ist zu berücksichtigen, daß der Test
nicht zwischen L-Cystein und dem in EP 0885962 A1 beschriebe
nen Kondensationsprodukt von L-Cystein und Pyruvat (2-Methyl-
thiazolidin-2,4-dicarbonsäure) diskriminiert. Schwerlösliches
Cystin, das durch Oxidation aus L-Cystein entsteht, wurde nach
Lösen in 8% Salzsäure und anschließende Reduktion mit Dithio
threitol (DTT) in verdünnter Lösung bei pH 8,0 ebenfalls als
L-Cystein nachgewiesen.
Tabelle 2 zeigt den Produktionsverlauf einer Fermentation von
Organismen mit dem in EP 0885962 A1 beschriebenen Grundkon
strukt pACYC184/cysEX-GAPDH-ORF306 im Vergleich mit einem er
findungsgemäßen Plasmid pHC34 und einem entsprechenden Kon
strukt mit dem cysB(T149M)-Allel, das für ein konstitutiv ak
tives CysB-Genprodukt kodiert. Es wird deutlich, daß die er
findungsgemäße Einsatz des Wildtyp-cysB-Gens einen positiven
Effekt auf die Produktionsleistung ausübt, während das konsti
tutive Allel cysB(T149M) negative Auswirkung zeigt.
Claims (10)
1. Mikroorganismenstamm der zur fermentativen Herstellung von
L-Cystein oder L-Cystein-Derivaten geeignet ist und einen
deregulierten Cysteinstoffwechsel besitzt, wobei diese De
regulation des Cysteinstoffwechsels nicht auf einer geän
derten CysB-Aktivität beruht, dadurch gekennzeichnet, daß
er zusätzlich eine erhöhte CysB-Aktivität besitzt, wobei
die CysB-Aktivität ein für ein Wildtyp-CysB typisches Regu
lationsmuster besitzt.
2. Mikroorganismenstamm, der zur fermentativen Herstellung von
L-Cystein oder L-Cystein-Derivaten geeignet ist und einen
dereguliertem Cysteinstoffwechsel besitzt, wobei diese De
regulation des Cysteinstoffwechsels nicht auf einer verän
derten CysB-Aktivität beruht, in dem homologe oder hetero
loge cysB-Gene verstärkt exprimiert werden, die für CysB
mit einem für Wildtyp-CysB typischen Regulationsmuster ko
dieren.
3. Mikroorganismenstamm nach Anspruch 2, dadurch gekennzeich
net, daß es sich um einen Escherichia coli Stamm mit dere
guliertem Cysteinstoffwechsel handelt, in dem ein Wildtyp-
cysB-Gen überexprimiert wird.
4. Mikroorganismenstamm nach Anspruch 3, dadurch gekennzeich
net, daß es sich um Escherichia coli Stämme mit deregulier
tem Cysteinstoffwechsel handelt, in dem die Kopienzahl des
Wildtyp-cysB-Gens von Escherichia coli erhöht ist und die
ses Gen überexprimiert wird.
5. Verfahren zur Herstellung eines Mikroorganismus gemäß einem
der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß in einem
Mikroorganismenstamm mit dereguliertem Cysteinstoffwechsel
mittels an sich bekannter Methoden die Kopienzahl eines
Wildtyp-cysB-Gens oder eines cysB-Gens kodierend für CysB
mit einem für Wildtyp-CysB typischen Regulationsmuster er
höht wird, oder daß mittels an sich bekannter Methoden eine
verstärkte Expression des Wildtyp-cysB-Gens oder eines
cysB-Gens kodierend für ein CysB mit einem Wildtyp-CysB ty
pischen Regulationsmuster bewirkt wird.
6. Verfahren zur Herstellung von L-Cystein, oder L-Cystein-
Derivaten dadurch gekennzeichnet, daß ein Mikroorganismen
stamm gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4 in an sich bekann
ter Art und Weise in der Fermentation eingesetzt wird und
das L-Cystein oder L-Cystein-Derivat aus dem Fermentations
ansatz abgetrennt wird.
7. Plasmid, dadurch gekennzeichnet, daß es genetische Elemente
zur Deregulierung des Cysteinstoffwechsels besitzt, wobei
diese genetischen Elemente keine Veränderung der CysB-
Aktivität bewirken, sowie ein cysB-Gen unter Kontrolle ei
nes Promotors enthält.
8. Verfahren zur Herstellung eines Mikroorganismenstammes ge
mäß einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet,
daß in einen Mikroorganismenstamm ein Plasmid gemäß An
spruch 7 eingebracht wird.
9. Verfahren zur Überproduktion eines Metaboliten, das dadurch
gekennzeichnet ist, daß ein Regulatorgen aus der Familie
der LysR-Typ-Trans-krip-tions-regulatoren in einem Mikroor
ganismus überexprimiert wird und eine verstärkte Produktion
des Metaboliten im Mikroorganismus bewirkt.
10. Verwendung eines Regulatorgens aus der Familie der LysR-
Typ-Trans-krip-tions-regulatoren zur Überproduktion eines
Metaboliten.
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