DE1648806A1

DE1648806A1 - Nachweismittel fuer Biermilchsaeurebakterien

Info

Publication number: DE1648806A1
Application number: DE19671648806
Authority: DE
Inventors: Atsushi Nakagawa
Original assignee: Asahi Breweries Ltd
Current assignee: Asahi Breweries Ltd
Priority date: 1966-09-21
Filing date: 1967-09-21
Publication date: 1971-11-25
Also published as: US3616255A; GB1193975A; DE1648806C3; DE1648806B2

Description

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PATENTANWALT PULLACH/MÖNCHEN

Zeichen: TsA-41-P 1648806

Datum s 21. September 1967

Beschreibung

zur

Patentanmeldung "Naehweismittel für Biermilchsäurebakterien"

Anmelderini Asahi Breweries Iitd., Tokyo, Japan

Die Priorität der folgenden Patentanmeldung wird beansprucht» Japanische Patentanmeldung 61 956/1966, eingereicht am 21₀ September 1966

Die Erfindung betrifft Trockenpräparate als ein Mittel zum Nachweis von Milchsäurebakterien, die sich während des Brauvorganges in Bier oder Bierwürze ansiedeln, der sogenannten Biermilchsäurebakterien und sie bezieht sich auch auf das Machweisverfahren unter Benutzung der erfindungsgemäßen Trokkenpräparate.

Man kennt verschiedene Bakterien, die in der Bierwürze oder auch im Bier während des Brauprozesses vorkommen. Unter diesen Bakterien befinden sich nur einige, die sich in Bier vermehren können, nämlich gewisse hopfenrestistente Milchsäurebakterienstämme. Im einzelnen kann man sagen, daß zu den Bak-

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terien, die dazu fähig sind, in Bier während des Brauprozesses . vorzukommen, neben den Milchsäurebakterien beispielsweise auch TSermobakterien, Flavobakterien und Essigsäurebakterien gehören. Die ersten beiden Arten dieser anderen Bakterien sind säureempfindlich und können sich bei einem pH-Vert von 5 oder darunter nicht vermehren. Essigsäurebakterien dagegen gehören ihrer Art nach zu den Aiteierobiern und sie können sich deshalb nicht unter anaerobischen Bedingungen vermehren, wie sie bei der Vergärung von Bier oder bierartigen Produkten unter Anwesenheit von Kohlenstoffdioxyd herrschen.

Auch der größte Anteil von Arten der Kilchsäurebakterien werden in ihrem Wachstum aufgrund der antibiotischen Eigenschaften der Hopfenbittersubstanzen unterdrückt. Nur solche Milchsäurebakterien, die gegenüber der antiseptischen Wirkung von Hopfen widerstandsfähig sind,können überleben und sich während des gesamten Brauereiprozesses vermehren. G-emäß Bergey's Manual of Determinative Bacteriology, 7. Ausgabe, 1957, werden diese überlebenden Milchsäurebakterien derart eingegliedert, daß unter den Lactobazillen die Stäbchen als Lactobacillus pastorianus und die Kokken als Pedicoccus cerevisiae eingestuft werden. Wenn sich diese Bakterien im Bier vermehren ,wird dieses Bier unvermeidlicherweise nicht nur trübe, sondern es nimmt auch infolge der Milchsäuregärung

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einen sauren Geschmack an und darüber hinaus riecht auch ein solches Bier infolge des durch J?edicoccus cerevisiae erzeugten Diacetyls unangenehm. Es ist deshalb notwendig, für die biologische Kontrolle solcher Betriebsanlagen, und zwar nicht nur bei Brauereien, die bereits von bierschädlichen Milchsäurebakterien tatsächlich befallen sind, sondern auch für solche 3rauereien, bei denen ein solcher Befall nicht als ganz unmöglich anzusehen ist, eine liiachweismethode zu schaffen, mit der die Gegenwart dieser Bakterien leicht und genau entdeckt wird. Die Entdeckung dieser schädlichen iuilchsäurebakterien wird jedoch in ihrer Mehrzahl dadurch erschwert, daß sie vorzugsweise unter anaerobischen Bedingungen sich vermehren und darüber hinaus ihre Vermehrungsgeschwindigkeit verxiältnismäßig gering ist.

Außerdem sind gerade diese Bakterien in ihren Nahrungsanforderungen sehr ungenügsam. Dies hat dazu geführt, daß es bis heute trotz der Kenntnis ihres schädlichen -Einflusses auf die Brauerei von Bier nicht nur nicht gelungen ist irgendeine einfache und wirkungsvolle kethode zu ihrer Entdeckung zu entwickeln, sondern daß ganz allgemein ihre Auffindung als äußerst schwierig angesehen wird. Tatsächlich sind in den Vereinigten Staaten von Amerika und in Europa bisher nur die im nachfolgenden für die Anwendung in Bierbrauereien beschriebenen Ver-

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fahren, zur Anzeige von Biermxlchsäurebakterien vorgeschlagen worden. Bei diesen Verfahren benutzt man in zwei Fällen, nämlich bei Gebrauch von Williamson's Medium und von Difco's V/.L₀ Nährmedium, Anzeigemittel in form eines Trockenpräparates, im übrigen aber auch natürlich vorkommende Medien wie beispielsweise mit Alkali versetzte Bierwürze, durch Stärke getrübtes Bier, üefeautolysat (Hefeextrakt) und Tomatensaft. Diese bisher zur Auffindung von bierschädlichen Milchsäurebakterien benutzten Hachweismittel sind jedoch insofern nachteilig, daß sie eine ziemlich komplizierte Verfahrensweise für die Herstellung erfordern, oder daß sie das gleichzeitige Wachstum von anderen Arten bierschädlicher Bakterien zulassen, daß sie ein Wachstum der Hopfenunempfindlichen schädlichen Bakterien nicht ermöglichen, oder daß sie für die hopfenunempfindlichen Milchsäurebakterien nur eine sehr niedrige Wachstumsgeschwindigkeit ermöglichen. Außerdem beschränkten sich diese bisherigen Methoden auf Verfahrensweisen für die Ausführung der anaerobischen Kultur, bei denen das Medium zunächst in Petrischalen einer Plattenkultur unterworfen wurde und dann erst unter Benutzung eines Vakuumexsiccators mit Kohlenstoffdioxyd überschichtet wurden. Die früheren Verfahrensweisen wiesen also die Unbequemlichkeit auf, daß sie besondere Mittel zur Schaffung der anaerobischen Bedingungen benötigten und daß sie es nicht gestatteten,während des ge-

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samten Zeitverlaufs die Entwicklung zu beobachten.

Diese bisherigen Schwierigkeiten veranlassten den Erfinder zu einer ausgedehnten Untersuchung von verschiedenen Bakterien, die dazu fähig waren, Bier während des Brauereiprozesses zu befallen; insbesondere wurden die taxonomischen Positionen, die Eigenschaften und die Ernährungserfordernisse von Milchsäurebakterien, die in Bier vorkommen, untersucht. Als Ergebnis konnte ein Medium gefunden werden, das ausschließlieh ein Wachstum von Biermilchsäurebakterien zuläßt. Auf der Grundlage dieses allgemeinen lösungsprinzips wurde die erfindungsgemäße Problemlösung ausgearbeitet.

Der Erfindungsgegenstand besteht dementsprechend in der Schaffung eines Nachweismittels für Biermilchsäurebakterien in Form eines wie üblich eine Quelle für Stickstoff, eine Quelle für Kohlenstoff, anorganische Salze, Wuchsfaktoren für Biermilchsäurebakterien, eine kleine Menge Agar-Agar und andere geeignete bekannte HiIfssubstanzen enthaltenden Trockennährpräparates zum Ansatz von Bakterienkulturen, das durch einen Gehalt an einem Acetat und an Mevalonsäure gekennzeichnet ist.

Zu den geeigneten weiteren Hilfssubstanzen gehören Inhibitoren gegen das Wachstum von anderen Mikroorganismen,

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beispielsweise die Hopfenbitterstoffe, ferner Reduktionsmittel zur Aufrechterhaltung der anaerobischen Bedingungen und Actidion zur Unterdrückung des PiIz- und Hefewachstums.

Man benutzt das Trockennährmedium in üblicher Weise zum Ansatz von Bakterienkulturen, die man mit den zu prüfenden Substanzen geimpft hat. üa ist vorteilhaft, der wässrigen 'lösung des Trockennährmediums Bier zuzusetzen, um nur die hopfenresistenten Milchsäurebakterien zu entwickeln.

Im folgenden soll am Beispiel einer bevorzugten Zusammensetzung des Trockennährpräparates für die Auffindung von Biermilchsäurebakterien die Erfindung näher erläutert werden. Die Zusammensetzung des Präparates ergibt sich aus der Tabelle 1.

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Tabelle

Hefeextrakt Pepton

Glucose

Natriumacetat (wasserfrei) Primäres Kaliumphosphat Ka 1 iumc hl ο r id.

Natriumthioglycolat

.^-Cystine

Agar-Agar Pulver Zitronensäure " Calciumchlorid Magnesiumsulfat Mangansulfat Perrichlorid 7-Hydroxy-phenoxezon (2)-10-oxid (Natriumsalz) kevalonsäure •«.ctidion

5 g	g	g
5 g		g
16.2	g	g
8 g	g	mg
0.2	g	mg
0.5	g	mg
1	wenig	mg
1	2.2	mg
	0.1
	0.1
1
1
3
VJI
VJI

Um unter Benutzung dieses Trockenpräparates vorstehender Zusammensetzung Biermichsäurebakterien auffinden zu können, ist.es nur erforderlich, etwa 3-5 Gew.-$ dieses
Trockennährpräparates in Wasser zu geben und zu erwärmen.

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um die Zusammensetzung in dem heißen Wasser aufzulösen« Die dabei entstehende lösung wird unmittelbar in ein Reagenzglas abgegossen und abgekühlt. Die Probe, die man prüfen will, wird dann in das Reagenzglas eingegeben und bei einer Temperatur von etwa 25⁰C entwickelt. Wenn man die Inkubation auf diese Weise durchführt, erscheinen in den Fällen, bei denen sich in der Probe Milchsäurebakterien befanden, Bakterienkolonien, die sich in suspendierter Form in dem halbfesten Medium ausbilden. Auf diese Weise wird das Vorhandensein dieser Organismen leicht nachgewiesen. Es ist hierzu jedoch zu bemerken, daß für den Fall, daß man die Kulturflüssigkeit durch Auflösen des Trockennährpräparates in Wasser, so wie es beschrieben ist, herstellt, neben den hopfenresistenten Bakterienstämmen auch die anderen Milchsäurebakterienstämme sich entwickeln können. Wenn es erwünscht ist, nur die Hopfenresistenten Stämme zu bestimmen, ist es nur nötig, dem Trockennährpräparat eine geeignete ^iuenge von Bier zuzugeben. Auch für den Fall, daß es erwünscht ist, eine genaue Anzahl von Organismen zu erhalten, ist es nur erforderlich, den im Nährmedium befindlichen Gehalt· an Agar-Agar zu erhöhen, derart, daß sich aus dem Trockennährpräparat eine Hochschichtkultur herstellen läßt. Während der für den vorstehend beschriebenen Zweck durchgeführten Inkubation (Ausbrütung) der Mikroorganismen

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verändert der in dem Trockennährpräparat enthaltene Oxydations-Reduktions-Indikator seine Farbe je nach dem Verhältnis des bestehenden Redoxpotentials$ hierdurch wird angezeigt, ob durch die in den»Medium befindlichen Reduktionsmittel eine anaerobische Kultur wirksam aufrechterhalten wird.

Wenn bei der Durchführung der Kultur angenommen werden kann, daß in der ^rrobe eine Anzahl von Essigsäurebakterien vorhanden ist, überschichtet man die Oberfläche des Mediums mit einer Schicht von .Agar-Agar, die man bereits in einer solchen Weise hergestellt hat, daß sie eine wirkungsvolle Durchführung der Kultur in dem Reagenzrohr zuläßt. Durch diese Maßnahme erreicht man, daß aerophile Organismen, die an der Oberfläche des Mediums wachsen könnten, völlig gehemmt werden, so daß man die ITachweisreaktion in gewünschter Weise durchführen kann.

Das Ergebnis der Beobachtung der Entwicklung von verschiedenen Mikroorganismen in einem mit dem erfindungsgemäßen Trockennährpräparat einer Zusammensetzung gemäß Tabelle 1 hergestellten Kulturmedium (mit einem Gehalt von etwa 4 .-# Trockennährpräparat und 50 Gew.-# Bier neben Wasser)

nach 4-6 Tagen Inkubationszeit bei 25⁰G ist in Tabelle aufgeführt.

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Tabelle

Arten der Organismen

Sorten Wachstum

Hefen

Pilze

Bakterien

Milchsäurebakterien

Saccharomyces carlsbergensis Saccharomyces cerevisiae

Penicillium notatum Aspergillus oryzae

Acetobacter

Aerobacter aerogenes

Äscherichia coli

Micrococcus

Sarcina

Bacillus subtilis

Streptococcus faecalis lactobacillus plantarum

Hopfenresistente Pediococcus cerevisiae Milchsäurebakterien Pediococcus mevalovorus

Lactobacillus brevis -11-

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Aus dem vorstehenden Text ergibt es sich klar, daß die Inkubation von Bakterien unter benutzung des erfindungsgemäßen Trockennährpräparats das Wachstum von Mikroorganismen, die in Bier vorkommen können,mit Ausnahme der hopfenresistenten Stämme der ^ilchsäurebakterien völlig unterdrückt; dies beruht auf den im folgenden erläuterten Ursachen.

Wie bereits erwähnt kommen im Bier während der Gärung verschiedene Bakterien, beispielsweise T_.ermobakterien, Flavobakterien, Essigsäurebakterien, Microkokken, Sarzina und Lactobacilli. Es ist festzustellen, daß das Wachstum von Bakterien wie Thermobakteria und ilavobakteria durch die Benutzung von Essigsäure als Bestandteil des benutzten Mediums unterdrückt werden kann. Weiterhin ist das Wachstum von allen vorstehend aufgezählten Bakterien mit Ausnahme der J^ilchsäurebakterien zu unterdrücken, wenn der pH-Wert durch Benutzung von Zitronensäure herabgesetzt und die Kultur unter anaerobischen Bedingungen mit Hilfe eines Zusatzes von Natriumthioglycolat und X*-Cystin durchgeführt wird. Außerdem ist der Zusatz von iiatriumacetat als Puffersubstqnz wesentlich und dient dazu, ein· übermäßiges Absinken des pH-V/ertes im Medium, das sich als Folge der von den schnellwachsenden Milchsäurebakterien hergestellten Milchsäure ergeben könnte, zu verhindern, ferner wesentlich

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ist der Zusatz der Reduktionsmittel, nämlich Natriumthioglykolat und L-Cystin; diese Mittel dienen zur Unterdrückung des Wachstums von aerophilen Bakterien, jtfeben diesen Reduktionsmitteln ist auch 2r-Ascorbinsäure und Erysorbinsäure brauchbar.

Darüber hinaus kann das Wachstum von Milchsäurebakterien mit Ausnahme der hopfenresistenten Stämme durch die Zugabe von Bier oder Hopfenextrakt zu dem Trockennährpräparat verhindert werden. Das Wachstum der -^ssigsäurebakterien, der Bazillen und Pilze wird durch Zusatz von Reduktionsmitteln unterdrückt.

Die Unterdrückung der Entwicklung der in den Bakterienkulturen befindlichen Bierhefe erfolgt durch die Zugabe von Actidion zu dem Medium» Pediococcus mevalovarus, bei dem es sich um einen Stamm von Bier-Sarcinae handelt, erfordert unbedingt die Zufuhr" von ^evalonsäure für seine Entwicklung. Obwohl ^evalonsäure im Bier anwesend ist, muß man darauf achten, daß dann, wenn nur ein synthetisch hergestelltes lahrmedium benutzt wird, auch iievalonsäurS>/iri der Größenordnung von 2 p.p.m. oder darüber erfolgt.

Wie bereits beschrieben ermöglicht die vorliegende Erfindung die leichte Herstellung eines Bakterienkulturmediums und gestattet eine selective Kultur von Bier-

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milchsäurebakterien mit dem -Ergebnis, daß mit Hilfe des erfindungsgemäß durchführbaren Kulturverfahrens der Jüachweis von derartigen Mikroorganismen wesentlich erleichtert und verbessert ist. Deshalb bedeutet die vorliegende Erfindung eine erhebliche Bereicherung der industriellen Technik als Uachweismittel für die Auffindung und Kontrolle der "Bierschädlichen Milchsäurebakterien.

Patentansprüche t

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Claims

-H- Zeichen» TsA-41-P Datum : 21. September I967 Pat ent ans prüche

1. Hachweismittel für Biermilclisäurebakterien in ü'orm eines wie üblich eine Quelle für Stickstoff, eine welle für Kohlenstoff, anorganische Salze, Ymchsfaktoren für Biermilchsäurebakterien, eine kleine iaenge Agar-Agar und andere geeignete bekannte üilfssubstanzen enthaltenden Trockennährpräparates zum Ansatz von Bakterienkulturen, gekennzeichnet durch einen Gehalt an einem Acetat und an Kevalonsäure.

•2. Verfahren zum Nachweis von Biermilchsäurebakterien, dadurch gekennzeichnet , daß man eine Bakterienkultur durch Beimpfen einer wässrigen Lösung des Trockennährpräparates gem. Anspruch 1 mit der zu prüfenden Probesubstanz anlegt und die Entwicklung des Bakterienbefalls beobachtet.

3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch g e k e η η ζ e i c h η e t , daß man der wässrigen Lösung des Nährmediums Bier zusetzt.

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