DE1648806B2

DE1648806B2 - Kulturmedium zum nachweis von bier-milchsaeurebakterien

Info

Publication number: DE1648806B2
Application number: DE19671648806
Authority: DE
Inventors: Atsushi Tokio Nakagawa
Original assignee: Asahi Breweries Ltd
Current assignee: Asahi Breweries Ltd
Priority date: 1966-09-21
Filing date: 1967-09-21
Publication date: 1973-03-22
Also published as: US3616255A; DE1648806A1; GB1193975A; DE1648806C3

Description

1 648 80S ^J

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die Erfindung näher erläutert werden. Dl? Zusammen- wachsen könnten, völlig gehemmt werden, so daß

setzung ergibt sich aus der Tabelle 1. . man ,dis Nachweisreaktion in gewünschter Weise

-- ■ ■: ■ - ■. · durchführen kann.

Tabelle 1 . ., , D₉₈ Ergebnis der Entwicklung von verschiedenen

Hefeextrakt 5g " ⁵ Mikroorganismen in einem mit dem erfindungs-

Pepton ü 5 g "v gemäßen Kulturmedium (mit einem Gehalt von etwa

-"' Glucose 162g " 4Gewichtsprozent Trockenpräparat gemäß Tabellel

Natriuiracetot(wasVerfreij ".'.'.'.'.'.'.['. 8g' ™^d. *°Gewichtsprozent Bier neben Wasser) nach

Primäres Kaliumphosphat 02 g ' 4 bis 6 Tagen Bebrütung bei 25°C ist in der Tabelle 2

Kaliumchlorid Υ.'.'.'.'.'.'.', 0^g «aufgeführt.

Natriumthioglycolat Ig τ**.»ιι» ο

1-Cystein Ig Tabeüe 2

Agar-Agar-Pulver wenig Wachstum

Zitronensäure 2,2 g Hefen: Saccharomyces carlsbergensis —

Calciumchlorid 0,1 g *⁵ Saccharomyces cerevisiae —

Magnesiumsulfat 0,1 g Pilze: Peniciffium notatum —

Mangansulfat 1 mg Aspergillus oryzae —

Ferrichlorid 1 mg Bakterien: Acetobacter —

7-Hydroxy-phenoxazon-(2)-10-oxid Aerobacter aerogenes —

(Natriumsalz) 3 mg ²⁰ Escherichia coh" —

Mevalonsäure 5 mg Micrococcus ~

Actidion 5 mg Sarcina —

τι ™ ,. „, Bacillus subtilis —

Um unter Benutzung dieses Trockenpräparates Milchsäurevorstehender Zusammensetzung Biermilchsäurebak- _{aS bakterien}. Streptococcus faecalis
tenen auffinden zu können ist es nur erforderlich, Lactobacillus plantarum
etwa 3 bis 5 Gewichtsprozent dieses Trockenpräparates Hopfenresistente
in Wasser zu geben und zu erwärmen, um es in dem Milchsäure

heißen Wasser aufzulösen. Die dabei entstehende _bakterien: " Pediococcus cerevisiae +

Losung wird unmittelbar m ein Reagenzglas abge- 30 Pediococcus mevalovorus +

gössen und abgekühlt. Die Probe, die man prüfen will, Lactobacillus brevis + wird dann in das Reagenzglas eingegeben und bei

einer Temperatur von etwa 25⁰C hebrütet. Wenn man Aus vorstehendem ergibt sich klar, daß bei Bebrüdie Bebrütung auf diese Weise durchführt, erscheinen tung von Bakterien unter Benutzung des erfindungsin den Fällen, bei denen sich in der Probe Bier-Milch- 35 gemäßen Kulturmediums das Wachstum von Mikrosäurebakterien befanden, Bakterienkolonien, die sich Organismen, die in Bier vorkommen können, mit in suspendierter Form in dem halbfesten Kultur- Ausnahme der hopfenresistenten Stämme der Milchmedium ausbilden. Auf diese Weise wird das Vorhan- säurebakterien völlig unterdrückt wird; dies beruht densein dieser Organismen leicht nachgewiesen. Es ist auf den im folgenden erläuterten Ursachen,
hierzu jedoch zu bemerken, daß für den Fall, daß man 40 Wie bereits erwähnt, kommen im Bier während der das Kulturmedium durch Auflösen des Trocken- Gärung verschiedene Bakterien, beispielsweise Thermopräparates in Wasser, so wie es beschrieben ist, her- bakterien, Flavobakterien, Essigsäurebakterien, Microstellt, neben den hopfenresistenten Bakterienstämmen kokken, Sarzina und Lactobacilli vor. Es ist festzuauch die anderen Milchsäurebakterienstämme sich stellen, daß das Wachstum von Bakterien wie Thermoentwickeln können. Wenn es erwünscht ist, nur die 45 bakteria und Flavobakteria durch die Benutzung von hopfenresistenten Stämme zu bestimmen, ist es nur Essigsäure als Bestandteil des benutzten Mediums nötig, das Trockenpräparat in einer geeigneten Menge unterdrückt werden kann. Weiterhin ist das Wachstum von Bier zu lösen. Für den Fall, daß man eine Keim- von allen vorstehend aufgezählten Bakterien mit Auszahlbestimmung durchführen will, ist es nur erforder- nähme der Milchsäurebakterien zu unterdrücken, lieh, den Agar-Agar-Gehalt im Kulturmedium derart 50 wenn der pH-Wert durch Benutzung von Zitronenzu erhöhen, daß man es zu Platten gießen kann. säure herabgesetzt und die Kultur unter anaeroben Während der für den vorstehend beschriebenen Zweck Bedingungen mit Hilfe eines Zusatzes von Natriumdurchgeführten Inkubation (Ausbrütung) der Mikro- thioglycolat und 1-Cystein durchgeführt wird. Außerorganismen während der Beorütung verändert der in dem ist der Zusatz von Natriumacetat als Puffersubdem Kulturmedium enthaltene Oxydations-Reduk- 55 stanz wesentlich und dient dazu, ein übermäßiges tions-Indikator seine Farbe je nach dem Verhältnis Absinken des pH-Wertes im Kulturmedium, das sich des bestehenden Redoxpotentials; hierdurch wird an- als Folge der von den schnell wachsenden Milchsäuregezeigt, ob durch die in dem Kulturmedium befind- bakterien hergestellten Milchsäure ergeben könnte, zu liehen Reduktionsmittel eine anaerobe Kultur wirk- verhindern. Ferner wesentlich ist der Zusatz der Reduksam aufrechterhalten wird. 60 tionsmittel, nämlich Natriumthioglykolat und 1-Cy-

Wenn bei der Bebrütung angenommen werden kann, stein; diese Mittel dienen zur Unterdrückung des

daß in der Probe Essigsäurebakterien vorhanden sind, Wachstums von aerophilen Bakterien. Neben diesen

überschichtet man die Oberfläche des Kulturmediums Reduktionsmitteln ist auch 1-Ascorbinsäure und Ery-

mit einer Schicht von Agar-Agar, die man bereits sorbinsäure brauchbar.

in einer solchen Weise hergestellt hat, daß sie eine 65 Darüber hinaus kann das Wachstum von Milchwirkungsvolle Bebrütung in dem Reagenzglas zuläßt. säurebakterien mit Ausnahme der hopfenresistenten Durch diese Maßnahme erreicht man, daß aerophile Stämme durch die Zugabe von Bier oder Hopfen-Organismen, die an der Oberfläche des Mediums extrakt zum Kulturmedium verhindert werden. Das

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Wachstum der Essigsäurebaktenen, der Bazillen und Obwohl Mevalonsäuren im Bier anwesend ist, muß

Pilze wird durch Zusatz von Reduktionsmitteln man in vorliegendem Pail darauf achten, daß ein

unterdrückt Mevalonsäurezusatz in der Größenordnung von 2 ppm

Die Unterdrückung der Entwicklung der in den oder darüber erfolgt

Bäkteriehkultüren befindlichen Bierhefe erfolgt durch 5 Wie bereits beschrieben ermöglicht die vorliegende

die Zugabe Von Ä-ctidiön W -dem "Kulturmedium. Erfindung die leichte Herstellung eines Kulturmediums

Pediocöccus AeVaIpVaTUs, 'bei dem es sich um eine zum Nachweis von Bier-Milchsäurebakterien und ge-

Ärt von Bier-Sarcinäe ^handelt, erfordert unbedingt stattet eine verbesserte selektive Kultur von Bier-

die Zufuhr von Mevalonsaure für seine Entwicklung. Milchsäurebakterien.

Claims

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gische Kontrolle solcher Betriebsanlagen, und zwar

Patentanspruch: nicht nur bei Brauereien, die bereits von bierschäd

lichen Milchsäurebakterien tatsächlich befallen sind,

Kulturmedium zum Nachweis von Bier-Milch- sondern auch für solche Brauereien, bei denen ein säurebakterien in Form einer wie üblich eine 5 solcher Befall nicht als unmöglich anzusehen ist, eine Stickstoff- und eine Kohlenstoff quelle, anorganische Nachweismethode zu schaffen, mit der die Gegenwart Salze, Wachstumsfaktoren für Bier-Milchsäure- dieser Bakterien leicht und eindeutig entdeckt wird, bakterien, eine kleine Menge Agar-Agar und an- Die Entdeckung dieser schädlichen Müchsäurebakdere geeignete bekannte Hilfssubstanzen enthal- terien wird jedoch dadurch erschwert, daß sie «,Orzugstenden wäßrigen Lösung zum Ansatz von Bak- io weise unter anaeroben Bedingungen sich vermehren tsrienkulturen bzw. eines zu deren Herstellung und darüber hinaus ihre Vermehrungsgeschwindigkeit dienenden Trockenpräparates, gekennzeich- verhältnismäßig gering ist

net durch einen Gehalt an einem ein über- Außerdem sind gerade diese Bakterien in ihren mäßiges Absinken des pH-Wertes im Medium Nahrungsanforderungen sehr ungenügsam. Dies hat verhindernden Azetat und an 2 ppm oder darüber 15 dazu geführt, daß bis heute trotz der Kenntnis ihres Mevalonsäure. schädlichen Einflusses auf Bier ihre Auffindung als

äußerst schwierig angesehen wird. Tatsächlich sind in den Vereinigten Staaten von Amerika und in Europa

bisher nur die im nachfolgenden für die Anwendung in

20 Bierbrauereien beschriebenen Verfahren zur Anzeige von Biermilchsäurebakterien vorgeschlagen worden. So benutzt man Williamsons und auch Difcos W. L.

Die Erfindung betrifft ein Kulturmedium zum Nach- Spezialnährboden, aber auch beispielsweise ammoniaweis von Bier-Milchsäurebakterien in Form einer wie kaiisches Bier, kleistertrübes Bier und Hefeautolysat üblich eine Stickstoff- und eine Kohlenstoffquelle, 35 und Tomatensaft als Zusatz zu verschiedenen Kulturanorganische Salze, Wachstumsfaktoren für Bier- medien. Diese bisher zur Auffindung von bierschäd-Milchsäurebakterien, eine kleine Menge Agar-Agar liehen Milchsäurebakterien benutzten Nachweismittel und andere geeignete bekannte Hilfssubstanzen ent- sind jedoch insofern nachteilig, als die teils eine ziemhaltenden wäßrigen Lösung zum Ansatz von Bak- lieh komplizierte Verfahrensweise für die Herstellung terienkulturen bzw. eines zu deren Herstellung dienen- 30 erfordern, oder daß sie andererseits das gleichzeitige den Trockenpräparates. Wachstum von anderen Arten bierschädlicher Bak-

Man kennt verschiedene Bakterien, die in der Bier- terien zulassen und sie den hopfenunempfindlichen würze oder auch im Bier während des Brauprozesses Milchsäurebakterien nur eine niedrige Wachstumsvorkommen. Unter diesen Bakterien befinden sich geschwindigkeit ermöglichen. Außerdem beschränkten nur einige, die sich in Bier vermehren können, nämlich 35 sich diese bisherigen Methoden auf die Verfahrensgewisse hopfenresistente Milchsäurebakterienstämme. weisen der anaeroben Kultur. Die früheren Ver-Tm einzelnen kann man sagen, daß zu den Bakterien, fahrensweisen wiesen also auch die Unbequemlichkeit die dazu fähig sind, in Bier während des Brauprozesses auf, daß sie besondere Mittel zur Schaffung der anvorzukommen, neben den Milchsäurebakterien bei- aeroben Bedingungen benötigten und daß sie es nicht spielsweise auch Thermobakterien, Flavobakterien 40 ermöglichten, während des gesamten Zeitverlaufs die und Essigsäurebakterien gehören. Die ersten beiden Entwicklung zu beobachten.

Arten dieser Bakterien sind säureempfindlich und Ausgehend von diesem Stand der Technik wurden

können sich bei einem pH-Wert von 5 oder darunter ausgedehnte Untersuchungen an verschiedenen Baknicht vermehren. Essigsäurebakterien dagegen ge- terien, die dazu fähig waren, Bier während der Bierhören ihrer Art nach zu den Aerobiern, und sie kön- 45 herstellung zu befallen, durchgeführt; insbesondere nen sich deshalb nicht unter anaeroben Bedingungen wurden die taxonomischen Positionen, die Eigenvermehren, wie sie bei der Vergärung von Bier oder schäften und die Ernährungserfordernisse von Milchbierartigen Produkten unter Anwesenheit von Kohlen- säurebakterien, die in Bier vorkommen, untersucht, dioxid herrschen. Als Ergebnis konnte ein Kulturmedium gefunden

Auch der größte Anteil von Arten der Milchsäure- 50 werden, das ausschließlich ein Wachstum von Bierbakterien werden in ihrem Wachstum auf Grund der milchsäurebakterien zuläßt.

antibiotischen Eigenschaften der Hopfenbittersub- Dieses Kulturmedium der anfangs genannten Art

stanzen unterdrückt. Nur solche Milchsäurebakterien, ist gekennzeichnet durch einen Gehalt an einem ein die gegenüber der antiseptischen Wirkung von Hopfen übermäßiges Absinken des pH-Wertes im Medium widerstandsfähig sind, können überleben und sich 55 verhindernden Azetat und an 2 ppm oder darüber während des gesamten Brauereiprozesses vermehren. Mevalonsäure.

Gemäß Bergeys Manual of Determinative Bacterio- Zu den geeigneten Hilfssubstanzen gehören Inhibi-

logy, 7. Ausgabe, 1957, werden diese überlebenden toren gegen das Wachstum von anderen Mikroorga-Milchsäurebakterien derart eingegliedert, daß unter nismen, beispielsweise die Hopfenbitterstoffe, ferner den Lactobazillen die Stäbchen als Lactobacillus 60 Reduktionsmittel zur Auf rechterhaltung der anaeroben pastorianus und die Kokken als Pedicoccus cerevisiae Bedingungen und Actidion zur Unterdrückung des eingestuft werden. Wenn sich diese Bakterien im Hefewachstums.

Bier vermehren, wird dieses Bier unvermeidlicherweise Man benutzt das Kulturmedium in üblicher Weise,

nicht nur trübe, sonde¹"· es nimmt auch infolge der Vorteilhaft setzt man der wäßrigen Lösung des Milchsäuregärung einen sauren Geschmack an, und 65 Kulturmediums Bier zu.

darüber hinaus riecht auch ein solches Bier infolge des Im folgenden soll am Beispiel einer bevorzugten

durch Pedicoccus cervisiae erzeugten Diacetyls un- Zusammensetzung des Kulturmediums in Trockenangenehm. Es ist deshalb notwendig, für die biolo- form für die Auffindung von Bier-Milchsäurebakterien