DE60218063T2 - Milchsäurebakterien der gattung lactococcus lactis und deren verwendung zur konservierung von nahrungsmitteln - Google Patents
Milchsäurebakterien der gattung lactococcus lactis und deren verwendung zur konservierung von nahrungsmitteln Download PDFInfo
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Description
- Die vorliegende Erfindung betrifft eine neue Schicht Milchsäurebakterien der Gattung Lactococcus lactis.
- Die Erfindung betrifft zudem Kulturen, Biomassen, die von der Schicht abgeleitet sind, und ihre Verwendung zur Konservierung von Nahrungsmitteln.
- Die Erfindung betrifft auch Zusammensetzungen, die eine solche Schicht enthalten, Nahrungsmittel, die mit einer solchen Schicht behandelt werden, und Verfahren zur Konservierung solcher Nahrungsmittel.
- Die vorliegende Erfindung ist das Ergebnis von Untersuchungen, die auf dem Gebiet der Konservierung von Nahrungsmitteln, insbesondere von Meereserzeugnissen, die unter Vakuum oder in einer geregelten Atmosphäre verpackt wurden, durchgeführt wurden.
- Frischer Fisch ist ein besonders leicht verderbliches Nahrungsmittel, was seine Konservierung erschwert und seinen Vertrieb begrenzt. Das Verderben von gekühltem Frischfisch wird durch die Entwicklung von nicht-pathogenen Mikroorganismen hervorgerufen, die Ammoniak, Amine, Schwefelwasserstoff usw. erzeugen. Die Verpackung unter Vakuum oder in einer modifizierten Atmosphäre hemmt die Verderbnisflora, von der sich ein Teil an die Bedingungen der Anerobiose anpassen kann, nicht vollständig. Daraus folgt die Entwicklung unangenehmer Gerüche, die sich schnell konzentrieren, noch bevor sich der Geschmack des Fisches verändert. Das „Vakuum" und die modifizierte Atmosphäre sind jedoch zunehmend geschätzte Verpackungsverfahren, da sie die organoleptischen und ernährungsphysiologische Qualität frischer Nahrungsmittel und eine längere Haltbarkeit verbinden.
- Die Verwendung von Milchsäurebakterien zur Konservierung gekühlter Nahrungsmittel ist Gegenstand verschiedener Patente oder Publikationen.
- So verwenden Bourdreaux et al. 1989 lebende Lactobacillus-Zellen, die die Besonderheit aufweisen, dass sie nicht fermentieren und Wasserstoffperoxid produzieren können, um die Verderbnisflora und die pathogene Flora von verpackten gekühlten Nahrungsmitteln zu hemmen (U.S. Nr. 4.874.704). Wasserstoffperoxid erweist sich jedoch als wenig wirksam für Fisch und wirft Probleme in Bezug auf die Rechtsvorschriften auf.
- Matrozza et al. (1989) fügen eine Mischung aus Streptococcus lactis und Pediococcus auf der Basis nicht lebensfähiger Zellen hinzu, um die psychotrophe Flora gekühlter Milch zu hemmen, ohne eine Fermentation oder ein Wachstum der Milchsäureflora zu erhalten (U.S. Nr. 4.880.743). Der Hemmungsprozess beruht folglich auf der Produktion aktiver Moleküle.
- Im Rahmen eines Forschungsprogramms im Bereich Fischerei und Aquakultur im Jahr 2000 testete das Team von Dr. Hall von der Universität Loughborough verschiedene Schichten isolierter Milchsäurebakterien auf Meereserzeugnissen, um gehacktes Fleisch vom Wittling zu konservieren. Die Zugabe von Ferment (Lactococcus- oder Canobacterium-Schichten) wirkten sich weder auf die organoleptische Qualität der Erzeugnisse noch auf die Hemmung der Verderbnisflora aus.
- Hutkins et al. (1993) führen in gekühlte Nahrungsmittel, die unter Anaerobiose konserviert wurden, lebende Pediococcus-Zellen ein, die Bakteriocine produzieren. Die hinzugegebenen Milchsäurebakterien entwickeln sich nicht im Nahrungsmittel, fermentieren es nicht und verändern seine organoleptischen Eigenschaften nicht (U. S. Nr. 5.186.962). Die Bakteriocine produzierenden Bakterien erweisen sich als langfristig nicht lebensfähig. Zudem gelten Bakteriocine als Zusätze vom Typ Antibiotikum, die das Auftreten resistenter Keime verursachen und somit ihre Wirksamkeit verlieren können.
- Versuche zur Konservierung von Räucherlachs mit einer Nisin produzierenden Lactococcus-lactis-Schicht wurden 1996 von Wessels und Huss durchgeführt. Es hat sich herausgestellt, dass die Population von Lactococcus lactis an dem bei 10°C konservierten Räucherlachs zurückgeht, da die Schicht weder psychotroph noch für diese Art von Substrat geeignet ist. Die kombinierte Wirkung des Salzes und des CO2-Gehalts ermöglicht die Verstärkung der bakteriziden Wirkung des Nisins gegen die Schichten von Listeria monocytogenes (Nilsson et al. 1997).
- Derselbe Schichttyp wurde gleichzeitig von Chen Mei-Hui et al. untersucht. Makrelenfilets wurden durch Eintauchen in eine saure und salzhaltige Lösung mit einer starken Konzentration von Nisin produzierenden Lactococcus-lactis-Zellen beimpft. Nach dem Trocknen wurden die Filets bei 4°C in Beuteln konserviert. Die Verfasser konnten die Entwicklung der Verderbnisflora bei den beimpften Filets und den nicht beimpften Filets nicht vergleichen, da die herkömmlichen Auszählungsmethoden die Separation der Verderbnisflora von dem in sehr großer Menge hinzugefügten Ferment nicht ermöglichen (Chen Mei-Hui et al.: „Processing of low-slated mackerel fillets using biopreservative". Journal of the Fisheries Society of Taiwan, vol. 24, no. 4, 1997 (1997–12), S. 327–336.
- Isolierte Milchsäurebakterien bei Fisch, die die Entwicklung der Verderbnisflora am Fisch oder von Schichten von Listeria monocytogenes hemmen, waren Gegenstand verschiedener Untersuchungen (Stoffels et al., 1992; Pilet et al., 1995; Leroi et al., 1996). Alle untersuchten Schichten sind mit der Gattung Carnobacterium verwandt. Auch eine isolierte Leuconostoc-Schicht am Fisch zeigte die Fähigkeit zur Hemmung der Entwicklung von Listeria-monocytogenes-Schichten (Jeppensen und Huss, 1993). Diese Schichten wachsen allerdings bei 30°C. Es ist folglich unmöglich, die Verderbnisflora der Schicht bei den mikrobiologischen Routineanalysen zu separieren.
- Die internationale Anmeldung WO 00/60947 beschreibt neue Schichten von Milchsäure produzierenden Bakterien. Diese Milchsäurebakterien sind aus Milcherzeugnissen isoliert und wachsen bei 30°C. Keine der beteiligten Bakterien verdirbt die Nahrungsmittel bei Temperaturen von unter 7°C, weil sie sich bei diesen Temperaturen nicht entwickeln. Die Bakterienpopulation wird nach einer bis zwei Wochen der Konservierung durch 100 geteilt. Das Wachstum pathogener Keime wird nur bei Temperaturen von über 8°C gehemmt. Das ist auf das Vorhandensein von Säuren, Kohlendioxid und Bakteriocinen oder sonstigen Stoffen zurückzuführen. Diese Milchsäurebakterien weisen folglich verschiedene Nachteile auf, da sie nicht in der Lage sind, die Entwicklung unerwünschter Keime bei Temperaturen von unter 8°C zu hemmen, ohne Bakteriocine zu produzieren, und da sie sich bei 30°C entwickeln.
- Eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, eine neue Schicht von Milchsäurebakterien vorzuschlagen, die in der Lage ist, die Entwicklung schlechter Gerüche bei gekühlten Nahrungsmitteln, die vorzugsweise in geregelter Atmosphäre oder unter Vakuum verpackt werden, zu verzögern und die Entwicklung von Nachbarkeimen und pathogenen Keimen zu hemmen, um die Haltbarkeit von Nahrungsmitteln, insbesondere von verpackten Meereserzeugnissen, zu verlängern.
- Eine weitere Aufgabe der Erfindung ist es, eine neue Schicht von Milchsäurebakterien vorzuschlagen, die sich bei 30°C nicht entwickeln kann, so dass die Auszählung der Verderbnisflora von Nahrungsmitteln bei mikrobiologischen Routineanalysen möglich ist.
- Zu diesem Zweck liefert die vorliegende Erfindung eine neue Schicht von Milchsäurebakterien, das heißt Lactococcus lactis, die für eine Nutzung zur Konservierung von Nahrungsmitteln, insbesondere von Meereserzeugnissen, geeignet ist.
- Ein Muster der erfindungsgemäßen Mikroorganismuskultur, LLO-Lactococcus-lactis-Schicht genannt, wurde am 11. September 2001 nach dem Budapester Vertrag bei der Collection Nationale de Cultures de Micro-organismes (CNCM), Institut Pasteur, 28 rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15, hinterlegt. Dem Muster wurde die Hinterlegungsnummer CNCM I-2716 zugewiesen.
- Gemäß dieser Erfindung sind auch die Kulturen, Biomassen ausgehend von der vorgenannten Schicht vorgesehen. Natür lich umfasst diese Erfindung auch die Lactococcus-lactis-Schichten, die ausgehend von Mutation, Variation, Rekombination der LLO-Lactococcus-lactis-Schicht erhalten werden und die eine Wachstumstemperatur von 2°C bis 25°C mit einer optimalen Wachstumstemperatur um 20°C und eine Fähigkeit zur Verzögerung der Entwicklung der Verderbnisflora bei gekühlten Nahrungsmitteln aufweist.
- Ein weiterer Gegenstand der Erfindung betrifft die Verwendung von Schichten, Kulturen, Biomassen von LLO Lactococcus lactis zur Konservierung von Nahrungsmitteln als Wirkstoff, der das Auftreten schlechter Gerüche verzögert oder die Entwicklung der Verderbnisflora bei gekühlten Nahrungsmitteln, die vorzugsweise in sauerstoffarmer Atmosphäre verpackt werden, verlangsamen.
- Ein weiterer Gegenstand der Erfindung betrifft eine Zusammensetzung, dadurch gekennzeichnet, dass sie mindestens die LLO-Lactococcus-lactis-Schicht oder eine Variante oder eine Mutante davon umfasst.
- Ein weiterer Gegenstand der Erfindung betrifft eine Nahrungsmittelzusammensetzung zur Konservierung von Nahrungsmitteln im gekühlten Zustand, insbesondere von Meereserzeugnissen, die vorzugsweise in sauerstoffarmer Atmosphäre verpackt werden, dadurch gekennzeichnet, dass sie die LLO-Lactococcus-lactis-Schicht oder eine Variante oder eine Mutante davon umfasst.
- Ein weiterer Gegenstand der Erfindung betrifft ein Nahrungsmittel, das im gekühlten Zustand konserviert und vorzugsweise in sauerstoffarmer Atmosphäre verpackt wird, dadurch gekennzeichnet, dass dieses Nahrungsmittel an seiner Oberfläche eine biologische Barriere aufweist, die mindestens aus LLO Lactococcus lactis oder einer Variante oder einer Mutante davon besteht.
- Ein weiterer Gegenstand der Erfindung betrifft ein Verfahren zur Konservierung von Nahrungsmitteln im gekühlten Zustand, insbesondere von Meereserzeugnissen, die vor dem Ver zehr vorzugsweise in sauerstoffarmer Atmosphäre verpackt werden, dadurch gekennzeichnet, dass das zu konservierende Nahrungsmittel und Lactococcus lactis vor der Verpackung des Nahrungsmittels in Kontakt gebracht werden, so dass sich auf der Oberfläche des Nahrungsmittels mindestens eine biologische Barriere bildet, die das Auftreten schlechter Gerüche und das Wachstum der Verderbnisflora bei dem Nahrungsmittel verzögert.
- Beim Lesen der folgenden Beschreibung der Ausführungsbeispiele unter Bezugnahme auf die einzige Figur, die in Form von drei Spalten die Wanderung der verschiedenen Restriktionsfragmente der chromosomalen DNS der LLO-Schicht zeigt, lässt sich die Erfindung verstehen.
- Die LLO-Lactococcus-lactis-Schicht wurde aus gekühlten Wittlingsfilets isoliert, die in sauerstoffarmer Atmosphäre verpackt wurden.
- Die LLO-Lactococcus-lactis-Schicht entspricht der Definition einer Milchsäurebakterie. Sie ist mit der Art Lactis der Gattung Lactococcus verwandt. Ihr Stoffwechsel verursacht in Milch oder in Fischbrühe keine Verderbnis. Sie hemmt die Entwicklung der Verderbnisflora beim Wittling, beim Lachs oder bei Krustentieren.
- Morphologisch gesehen sind die Zellen der LLO-Lactococcus-lactis-Schicht ovoid und unbeweglich. Sie treten paarweise oder in Ketten auf.
- In Bezug auf ihre Kulturmerkmale sind diese Zellen Gram-positiv, Katalase-negativ, Oxidase-negativ. Sie bilden keine Sporen. Sie sind fakultative Anaerobier und haben einen fermentativen Stoffwechsel. Die Glucosefermentation wird von einer leichten Gasproduktion begleitet. Die Schicht ist jedoch homofermentativ. Sie gehört zur Gattung Lactococcus.
- Die Schicht hydrolysiert kein Arginin, Harnstoff oder Stärke, produziert weder Indol noch Schwefelwasserstoff und macht die Milch nicht sauer. Sie reduziert nicht den Nitratgehalt, sie ist alpha-hämolytisch. Sie produziert Acetoin.
- Die Schicht ist psychotroph und entwickelt sich zwischen 2 und 25°C mit einem optimalen Wachstum um 20°C. Sie wird auf Nährböden folgender Kulturen gezüchtet: MRS pH 6,5, Elliker, M17, Trypticase-Soja-Blut-Agar. Sie wächst nicht auf Rogosa-Agar, auch nicht bei 30°C. Sie entwickelt sich auf dem Fleisch gekühlter Fische oder Krustentiere, ohne Gerüche oder eine Geschmacksveränderung hervorzurufen.
- Mit der LLO-Lactococcus-lactis-Schicht wurde ein Antibiogramm durchgeführt, um ihre Resistenz gegen bestimmte Antibiotika zu untersuchen.
- Der Test wurde auf einem Müller-Hinton-Nährboden mit 1,7% Agar und 5% Pferdeblut durchgeführt, der pH-Wert beträgt 7,3. Die Dicke der Agarose-Schicht in den Petrischalen ist konstant und beträgt 4 mm. Es handelt sich um einen nach den WHO-Normen standardisierten Nährboden.
- Die LLO-Schicht wird in einer MRS-Bouillon, pH 6,5, 48 bis 36 Stunden bei 15°C bis zum Erreichen der stationären Phase gezüchtet. Die Kultur wird in einer Müller-Hinton-Bouillon auf ein Zehntel verdünnt. Die Konzentration der Suspension beträgt ungefähr 106 Bakterien/ml.
- Die Agarose-Nährböden werden mit 2 ml der Suspension vollkommen benetzt. Die überschüssige Flüssigkeit wird entfernt und die Schalen trocknen dann 10 Minuten bei Umgebungstemperatur. Die Platten mit den Antibiotika werden mit einer Zange hineingelegt (höchstens 4). Die Schalen werden 48 Stunden bei Umgebungstemperatur inkubiert.
- Es wurden folgende Ergebnisse aufgezeichnet:
- Nach dem Digerieren des Genoms mit einem selten schneidenden Restriktionsenzym wurde eine genetische Identifizierung durch Pulsfeld-Elektrophorese durchgeführt.
- Dabei wurde folgendes Verfahren angewandt:
Die Bakterienbiomasse aus 10 ml Kultur (48 Stunden auf MRS-Nährboden, 18°C) wird durch Zentrifugierung (10 min mit 4000 g) herausgelöst. Das Zellpellet wird in 10 ml TE-Puffer (Tris 10 mM, EDTA 1 mM, pH 7,5) gegeben und mit einem Vortex-Gerät homogenisiert. DO600 wird anschließend entnommen. Es wird zentrifugiert (10 min mit 4000 g) und das Zellpellet wird in DO600/0,7 ml T100E-Pufferlösung (Tris 10 mM, EDTR 100 mM, pH 7,5) gegeben. Die Zellsuspension wird mit einer LMP-Agarose (mit niedrigem Schmelzpunkt) in der Schmelze (2% im TE-Puffer) v/v gemischt. Sie wird auf 4°C abgekühlt, dann werden die 1 mm dicken Blöckchen geschnitten. Sie werden 4 Stunden bei 37°C in 3 ml T100E-Puffer, der 2 mg/ml Lysozym enthält, inkubiert. Dann wird das Reaktionsgemisch entnommen. Dann wird 16 Stunden bei 37°C in 3 ml TESP-Puffer (Tris 10 mM, EDTA 0,5 M, Sarkosyl 10 %, pH 7,5), der 3 mg Pronase enthält, inkubiert. Nach der Inkubation werden die Blöckchen mit 10 ml TE-Puffer 6 Mal gespült (30 min je Spülgang), dann werden sie von dem Restriktionsenzym unter folgenden Bedingungen 4 Stunden digeriert: Gesamtmenge 120 μl, 30 U Enzym, 1,2 μl BSA und 1/10 vom Hersteller OZYME empfohlener Puffer. - Nach dem Digerieren wird das Blöckchen in 10 ml TE-Puffer (20 min) gespült, dann wird das Wanderungsgel aufgebracht.
- Das verwendete Gerät ist ein GeneLine (Beckman).
- Das verwendete Enzym ist Apa I.
- Es werden drei Wanderungsbedingungen angewandt, um die verschiedenen erhaltenen Restriktionsfragmente unter den günstigsten Bedingungen zu separieren. Die Ergebnisse sind in der einzigen Figur dargestellt.
- Die erste Spalte entspricht 10 s Puls während 16 Stunden zur Identifizierung der großen Fragmente.
- Die zweite Spalte entspricht 7 s Puls während 16 Stunden zur Identifizierung der mittleren Fragmente.
- Die dritte Spalte entspricht 2 s Puls während 7 Stunden, anschließend 4 s Puls während 4 Stunden zur Identifizierung der kleinen Fragmente.
- Der Wanderungspuffer ist TBE 0,25 X, die Temperatur beträgt 12°C.
- Die Ergebnisse sind in der einzigen Figur dargestellt.
- Die hemmenden Wirkungen der LLO-Schicht wurden im Doppelschichtverfahren in der Petrischale untersucht.
- Die Indikatorschichten wurden 24 bis 48 Stunden bei 30°C in M17- oder MRS-Bouillon bei Milchsäurebakterien und in Nährbouillon bei Nichtmilchsäurebakterien gezüchtet, bevor sie auf demselben Nährboden, der 1% Agar enthält, beimpft werden. Die Endkonzentration in der Indikatorschicht beträgt 107 KbE/ml. Die bei 46°C unterkühlt gehaltene Agarose wird auf eine vorher abgekühlte identische Agarose mit 1,2% Agar in eine Petrischale gegeben. Nach dem Gelieren der zweiten Schicht wird auf jede Agarose ein Pellettropfen der 3 Tage bei 20°C in M17-Bouiilon gezüchteten und in physiologischer Lösung gespülten „O"-Schicht geträufelt. Die Schalen werden bei 30°C inkubiert.
- Die Skala der Empfindlichkeit der Indikatorschichten gegenüber der LLO-Schicht ist wie folgt festgelegt:
- Kein Hof: –
- 1 mm Hof um die Ablagerung: +
- 2 bis 3 mm Hof um die Ablagerung: ++
- Die erhaltenen Ergebnisse sind in nachstehender Tabelle aufgeführt:
- Die LLO-Schicht wird von der Nisin produzierenden Schicht Lactococcus lactis ATCC 11454 gehemmt.
- Die Versuche mit Beimpfung von Wittlingsfilets, die in sauerstofffreier Atmosphäre konserviert wurden, wurden mit der LLO-Lactococcus-lactis-Schicht durchgeführt. Die Versuche sind nachfolgend beschrieben:
Die Wittlingsfilets wurden bei einem Fischhändler gekauft. Die Kontrollfilets werden in einen Beutel gegeben und bei 5°C im Kühlschrank konserviert. Die Versuchsfilets werden durch Aufsprühen der in physiologischer Lösung suspendierten LLO-Schicht mit der LLO-Schicht beimpft, bevor sie in einen zweiten Beutel gegeben und bei 5°C konserviert werden. An beiden Filettypen werden sensorische und mikrobiologische Analysen durchgeführt. Die sensorischen Analysen werden an einer Kontrollprobe und einer Versuchsprobe durchgeführt. - Der Geruch und der Geschmack nach dem Kochen jeder Probe werden nach folgender Notenskala bewertet:
0 faulig 1–2 sehr schlecht 3–4 schlecht 5–6 annehmbar 7–8 zufrieden stellend 9–10 sehr zufrieden stellend - Die mikrobiologischen Analysen werden insbesondere durch Auszählung der aeroben mesophilen Keime durchgeführt.
- Die Auszählungen werden nach einer Entnahme von 10 g Fleisch vorgenommen, das in 90 ml steriler physiologischer Lösung suspendiert und 3 Minuten homogenisiert wird. Diese Suspension ist die Stammsuspension.
- Die Auszählungen der aeroben mesophilen Keime, die in 3 Tagen bei 30°C gezüchtet werden, werden nach Verdünnung der Stammsuspension auf ein Zehntel nach der Methode der Auszählung in der Tiefe vorgenommen. Der Kulturnährboden ist PCA- Agar, die übliche Agarose für Auszählungen in der Lebensmittelmikrobiologie.
- Die LLO-Schicht wird auf MRS-Agar, pH 6,5, nach der Methode der Auszählung in der Tiefe ausgezählt, die Schalen werden 5 Tage bei 15°C inkubiert.
- Folgende Ergebnisse wurden erhalten:
Die Ergebnisse der organoleptischen Tests sind in nachstehender Tabelle aufgeführt:
- Die Ergebnisse der Auszählungen sind in nachstehender Tabelle aufgeführt:
- Durch die durchgeführten Versuche lässt sich feststellen, dass Nahrungsmittel, die mit der LLO-Lactococcus-lactis-Schicht beimpft wurden, immer eine bessere organoleptische Qualität aufweisen als die Kontrollproben. Insbesondere wird ein starker Rückgang des Ammoniak- oder H2S-Geruchs festgestellt, was eine Verlängerung der Haltbarkeit behandelter Nahrungsmittel ermöglicht. Der regelmäßige Verzehr beimpfter Nahrungsmittel verursacht weder Verdauungsstörungen noch Allergien. Zudem wird festgestellt, dass die Entwicklung der banalen Flora verzögert wird.
- Aufgrund der erhaltenen Ergebnisse lässt sich folglich auf die Möglichkeit schließen, eine Zusammensetzung mit der LLO-Lactococcus-lactis-Schicht oder einer Variante oder einer Mutante davon als Nahrungsmittelzusammensetzung zur Konservierung von Nahrungsmitteln im gekühlten Zustand zu verwenden. Gekühlte Nahrungsmittel sind Nahrungsmittel, die bei einer Temperatur zwischen 0°C und 12°C konserviert werden. Andererseits wird festgestellt, dass sich die Schicht nicht bei einer Temperatur von 30°C entwickelt. Das ermöglicht eine Auszählung der Flora von Nahrungsmitteln bei mikrobiologischen Routineanalysen.
- Zudem wird festgestellt, dass sich die Wirkung dieser Schicht erhöht, wenn sie auf Nahrungsmittel aufgebracht wird, die in einer sauerstoffarmen Atmosphäre verpackt wurden.
- Versuche wurden auf diese Weise an frischem schottischen Lachs (Salmo salar) aus einer Zuchtfarm von den Shetland-Inseln durchgeführt, der vor der Behandlung ausgenommen und 4 Tage auf Eis gelegt wurde. Der Lachs wird mit der Haut filetiert. Ein Filet dient als Kontrollprobe, das andere als Versuchsprobe.
- Zur Vorbereitung einer Kontrollprobe wird ein Kontrollfilet vom frischen Lachs in acht Portionen von 100 bis 200 g geschnitten, einzeln in Beuteln verpackt und vor der Lagerung in einem Kühlraum bei 2 bis 4°C unter Vakuum gesetzt.
- Die Versuchsprobe wird auf die gleiche Weise vorbereitet, mit der Ausnahme, dass sie zwischen dem Schneiden und dem Verpackten durch Aufsprühen der in physiologischer Lösung suspendierten LLO-Schicht beimpft wird.
- An den beiden Proben werden zum einen sensorische Analysen, zum anderen mikrobiologische Untersuchungen durchgeführt. Die sensorischen Analysen werden an einer Kontrollprobe und an einer Versuchsprobe durchgeführt. Die Farbe des Fleisches wird visuell geprüft. Nach dem Öffnen der Beutel wird der Geruch anhand einer Notenskala bewertet. Bei Bedarf wird die Probe einige Minuten lang in siedendem Wasser gekocht, bevor sie erneut bewertet wird.
- Die Notenskala wird wie folgt festgelegt:
0 faulig 1–2 sehr schlecht 3–4 schlecht 5–6 annehmbar 7–8 zufrieden stellend 9–10 sehr zufrieden stellend - Bei den mikrobiologischen Untersuchungen wird der pH-Wert an verschiedenen Stellen der Proben gemessen. Der endgültige Wert ist ein Mittelwert aus 3 Messungen. Die Auszählungen werden nach Entnahme von 10 g Fleisch vorgenommen, das in 90 ml steriler physiologischer Lösung suspendiert und 3 Minuten homogenisiert wird. Diese Suspension ist die Stammsuspension.
- Die Auszählungen der aeroben mesophilen Keime, die in 3 Tagen bei 30°C gezüchtet werden, werden nach Verdünnung der Stammsuspension auf ein Zehntel nach der Methode der Auszählung in der Tiefe vorgenommen. Der Kulturnährboden ist PCA-Agar, die übliche Agarose für Auszählungen in der Lebensmittelmikrobiologie.
- Die LLO-Schicht wird auf MRS-Agar, pH 6,5, nach der Methode der Auszählung in der Tiefe ausgezählt, die Schalen werden 5 Tage bei 15°C inkubiert.
- Folgende Ergebnisse wurden erhalten:
Die Ergebnisse der organoleptischen Tests sind in nachstehender Tabelle aufgeführt:
- Die Ergebnisse der pH-Schwankungen sind in nachstehender Tabelle aufgeführt:
- Die Ergebnisse der Auszählungen sind in nachstehender Tabelle aufgeführt:
- Die Ergebnisse zeigen deutlich, dass kein bedeutender Unterschied zwischen dem pH-Wert der Kontrollproben und dem der behandelten Erzeugnisse besteht. Andererseits weisen die organoleptischen Qualität der Erzeugnisse sowie die Entwicklung der banalen Flora im Vergleich zu den Kontrollproben positive Ergebnisse auf.
- Weitere Versuche wurden an tiefgefrorenen Zuchtgarnelen ohne Kopf durchgeführt. Die Garnelen werden 5 Minuten in lauwarmem Wasser aufgetaut, bevor sie 1 Minute in kochendem Salzwasser mit einem Salzgehalt von 20 g/l gekocht werden. Nach einem schnellen Abkühlen unter laufendem Wasser werden die Garnelen in eiskaltes Wasser mit einem Salzgehalt von 20 g/l gegeben.
- Die „Kontrollgarnelen" werden zu jeweils zehn Stück in modifizierter Atmosphäre in Behältern verpackt. Die „Versuchsgarnelen" werden vorher durch Aufsprühen der in physiologischer Lösung suspendierten LLO-Schicht mit der LLO-Schicht beimpft. Anschließend werden sie zu jeweils zehn Stück in modi fizierter Atmosphäre in Behältern verpackt und bei 4°C konserviert.
- Die sensorischen Analysen werden an einer „Kontrollprobe" und an einer „Versuchsprobe" durchgeführt. Die Farbe des Fleisches wird visuell geprüft. Nach dem Öffnen der Beutel wird der Geschmack anhand derselben Notenskala bewertet, die für das oben beschriebene Beispiel mit dem Lachs verwendet wurde.
- Die Auszählungen werden nach Entnahme von 10 g Garnelen vorgenommen, die in 90 ml steriler physiologischer Lösung suspendiert und 3 Minuten homogenisiert werden. Diese Suspension ist die Stammsuspension.
- Die Auszählungen der aeroben mesophilen Keime, die in 3 Tagen bei 30°C gezüchtet werden, werden nach Verdünnung der Stammsuspension auf ein Zehntel nach der Methode der Auszählung in der Tiefe vorgenommen. Der Kulturnährboden ist PCA-Agar, die übliche Agarose für Auszählungen in der Lebensmittelmikrobiologie.
- Die LLO-Schicht wird auf MRS-Agar, pH 6,5, nach der Methode der Auszählung in der Tiefe ausgezählt, die Schalen werden 5 Tage bei 15°C inkubiert.
- Die Ergebnisse der organoleptischen Tests sind in nachstehender Tabelle aufgeführt:
- Die Ergebnisse der Auszählungen sind in nachstehender Tabelle aufgeführt:
- Folglich ist es möglich, eine industrielle Anwendung dieser Schicht im Rahmen des Verfahrens zur Konservierung von gekühlten Nahrungsmitteln in Betracht zu ziehen. Das Verfahren besteht dann darin, das zu konservierende Nahrungsmittel und die LLO-Lactococcus-lactis-Schicht vor der Verpackung des Nahrungsmittels in Kontakt zu bringen, so dass sich auf der Oberfläche des Nahrungsmittels eine biologische Barriere bildet, die die Entwicklung schlechter Gerüche und das Wachstum der Verderbnisflora bei dem Nahrungsmittel verzögert. Selbstverständlich darf der Kontakt erst nach der Behandlung des Nahrungsmittels hergestellt werden, insbesondere, wenn das Nahrungsmittel einer Wärmebehandlung unterzogen werden muss. Der Kontakt kann durch Inokulation des zu konservierende Nahrungsmittels mit etwa 105 bis 107 lebensfähig gebliebenen Zellen von LLO Lactococcus lactis je Gramm des zu konservierenden Nahrungsmittels hergestellt werden. Je nachdem, in welcher Form die Schicht vorliegt, kommen verschiedene Inokulationsmethoden in Betracht. So kann die LLO-Lactococcus-lactis-Schicht in gefriergetrockneter Form vorliegen. Die LLO-Lactococcus-lactis-Schicht kann auch in Form einer Suspension vorliegen. Die Beimpfung des Nahrungsmittels kann auch durch Aufsprühen eines Pulvers, das die LLO-Lactococcus-lactis-Schicht enthält, oder durch Aufsprühen einer Zellsuspension, die Schicht enthält, oder durch Eintauchen des Nahrungsmittels in ein Bad, das die Schicht enthält, erfolgen. Die Schicht kann allein oder mit einem Träger vermischt verwendet werden.
- Die Schicht weist folglich die Eigenschaften auf,
- – dass sie sich bei Kühltemperaturen auf Meereserzeugnissen wie Fisch, Krustentieren oder anderen entwickelt,
- – dass sie das Nahrungsmittel nicht verdirbt,
- – dass sie es unter bestimmten Bedingungen ermöglicht, die Entwicklung der banalen Verderbnisflora des Nahrungsmittels zu verzögern und die Entwicklung bestimmter Pathogene zu hemmen,
- – dass sie das Auftreten unerwünschter Gerüche wie Ammoniak- oder H2S-Geruch zu verzögern.
- Ihre Wirksamkeit erhöht sich, wenn das Lebensmittel unter Vakuum, in modifizierter Atmosphäre oder auf eine andere Weise, bei der der Sauerstoffgehalt verringert wird, verpackt wird.
- Sie entwickelt sich nicht bei 30°C und kann bei einer üblichen mikrobiologischen Nahrungsmittelanalyse ausgezählt werden.
Claims (12)
- Schicht von Lactococcus lactis, LLO-Lactococcus-lactis-Schicht genannt und bei der Collection nationale de cultures de micro-organismes (CNCM) unter der Hinterlegungsnummer CNCM I-2716 hinterlegt.
- Eine Schicht von Lactococcus lactis nach Anspruch 1 oder erzeugt durch Mutation, Variation, Rekombination der Schicht nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass sie eine Wachstumstemperatur von 2°C bis 25°C mit einer optimalen Wachstumstemperatur um 20°C und eine Fähigkeit zur Verzögerung der Entwicklung der Verderbnisflora bei gekühlten Nahrungsmitteln aufweist.
- Kulturen, Biomassen, die ausgehend von Schichten nach einem der Ansprüche 1 und 2 erzeugt werden.
- Zusammensetzung, dadurch gekennzeichnet, dass sie mindestens die LLO-Lactococcus-lactis-Schicht oder eine Variante oder eine Mutante davon nach den Ansprüchen 1 und 2 umfasst.
- Zusammensetzung nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass die LLO-Lactococcus-lactis-Schicht in gefriergetrockneter Form vorliegt.
- Zusammensetzung nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass die LLO-Lactococcus-lactis-Schicht in Form einer Suspension vorliegt.
- Zusammensetzung für die Konservierung von Nahrungsmitteln im gekühlten Zustand, insbesondere von Meereserzeugnissen, die vorzugsweise in sauerstoffarmer Atmosphäre verpackt werden, dadurch gekennzeichnet, dass sie die LLO-Lactococcus-lactis- Schicht oder eine Variante oder eine Mutante davon nach einem der Ansprüche 1 und 2 umfasst, insbesondere als Wirkstoff, der das Auftreten schlechter Gerüche und/oder die Entwicklung pathogener oder nicht pathogener Bakterien verzögert.
- Nahrungsmittel, das im gekühlten Zustand konserviert und vorzugsweise in sauerstoffarmer Atmosphäre verpackt wird, dadurch gekennzeichnet, dass dieses Nahrungsmittel an seiner Oberfläche eine biologische Barriere aufweist, die mindestens aus LLO Lactococcus lactis oder einer Variante oder einer Mutante davon nach einem der Ansprüche 1 und 2 besteht.
- Verwendung von Schichten, Kulturen, Biomassen von LLO Lactococcus lactis nach einem der Ansprüche 1 bis 3 als Wirkstoff, der das Auftreten schlechter Gerüche an Nahrungsmitteln verzögert, die im gekühlten Zustand konserviert und vorzugsweise in sauerstoffarmer Atmosphäre verpackt werden.
- Verwendung von Schichten, Kulturen, Biomassen von LLO Lactococcus lactis nach einem der Ansprüche 1 bis 3 als Wirkstoff, der die Entwicklung der Verderbnisflora bei gekühlten Nahrungsmitteln verzögert, die vorzugsweise in sauerstoffarmer Atmosphäre verpackt werden.
- Verfahren zur Konservierung von Nahrungsmitteln im gekühlten Zustand, insbesondere von Meereserzeugnissen, die vorzugsweise in sauerstoffarmer Atmosphäre verpackt werden, dadurch gekennzeichnet, dass das zu konservierende Nahrungsmittel und LLO Lactococcus lactis nach einem der Ansprüche 1 und 2 vor der Verpackung des Nahrungsmittels in Kontakt gebracht werden, so dass sich auf der Oberfläche des Nahrungsmittels mindestens eine biologische Barriere bildet, die das Auftreten schlechter Gerüche und das Wachstum der Verderbnisflora bei dem Nahrungsmittel verzögert.
- Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass das zu konservierende Nahrungsmittel und LLO Lactococcus lactis durch Inokulation des zu konservierenden Nahrungsmittels mit etwa 105 bis 107 lebensfähig gebliebenen Zellen von LLO Lactococcus lactis je Gramm des zu konservierenden Nahrungsmittels in Kontakt gebracht werden.
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