NO330917B1

NO330917B1 - Nye melkesyrebakterier av slekten Lactococcus lactis og anvendelse derav, samt kulturer, materiale, matvareprodukt og fremgangsmate for konservering

Info

Publication number: NO330917B1
Application number: NO20041169A
Authority: NO
Inventors: Sylvie Lorre; Daniel Patrice
Original assignee: Sylvie Lorre
Priority date: 2001-09-21
Filing date: 2004-03-19
Publication date: 2011-08-15
Also published as: FR2830018B1; FR2830018A1; DE60218063T2; ES2280616T3; EP1456350B1; DE60218063D1; WO2003027268A2; ATE353358T1; AU2002362549A1; US20040249129A1; NO20041169L; CA2459481A1; WO2003027268A3; NO20041169D0; EP1456350A2

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører nye melkesyrebakterier av slekten Lactococcus lactis og anvendelse derav, samt kulturer, materiale, matvareprodukt og fremgangsmåte for konservering.

Oppfinnelsen beskriver for øvrig kulturer, biomasser, ekstrakter avledet av denne stamme, samt deres anvendelse ved konservering av næringsmiddelprodukter.

Oppfinnelsen vedrører også materialer som inkorporerer en slik stamme, næringsmiddelprodukter behandlet ved hjelp av en slik stamme, samt fremgangs-måter for konservering av slike næringsmiddelprodukter.

Oppfinnelsen er resultatet av studier utført på området konservering av næringsmiddelprodukter, spesielt marine produkter kondisjonert under vakuum eller under en kontrollert atmosfære.

Fersk fisk er et spesielt lite holdbart matprodukt som gjør konservering vanskelig og begrenser distribusjonen. Endring av fersk fisk som er frosset, blir fremkalt ved utvikling av mikroorganismer som ikke er patogene, som produserer ammoniakk, aminer, hydrogensulfid osv. Emballering under vakuum eller modifisert atmosfære inhiberer ikke fullstendig denne endringsflora hvor en del har evne til å tilpasse seg anaerobe betingelser. Resultatet av dette er utvikling av ubehagelig lukt som hurtig konsentreres, selv som smaken på fisken ikke endres. "Under vakuum" og modifisert atmosfære er imidlertid metoder for kondisjonering som stadig mer blir anvendt, da de forener organoleptiske og ernæringsmessige kvaliteter av friskhet og forlenget konserveringsvarighet.

Anvendelse av melkesyrebakterier for konservering av frosne matvarer er gjenstand for diverse patenter eller publikasjoner.

Således benytter Boudreaux et al. i 1989 levende celler av Lactobacillus som har den spesielle egenskap at de ikke gjærer og er i stand til å produsere hydrogenperoksid for å inhibere endringsfloraen og den patogene flora i forpakkede frosne matprodukter (US-patent nr. 4.874.704). For øvrig viser hydrogenperoksid seg mindre effektivt for fisken og fører til problemer hva angår lovbestemmelser.

Maguin er al. Journal of Applied Bacteriology (1994) beskriver isolering og karakterisering av et større antall melkesyrebakterier fra sjømat.

Matrozza et al. (1989) tilsetter en blanding av Streptococcus lactis og Pediococcus på basis av ikke-levedyktige celler for å inhibere den psykrotrofiske flora fra melk som er frosset, uten å oppnå fenomenet med fermentering eller vekst av melkesyreflora (US-patent nr. 4.880.743). Denne inhiberingsprosess beror følgelig på produksjon av aktive molekyler.

I rammen av et program FAR i 2000 har doktor Hall på universitetet i Loughborough testet forskjellige stammer av melkesyrebakterier isolert fra marine produkter for å konservere opphakket kjøtt fra hvitting. Andelen av gjæringsstoff (stammer av Lactococcus eller Carnobacterium) har ikke innvirkning på de organoleptiske kvaliteter til produktene og heller ikke på inhibering av endringsfloraen.

Hutkins et al. (1993) innfører i frosne, konserverte matvarer under anaerobe forhold levende celler av Pediococcus, produsenter av bakteriosiner. Melkesyrebakteriene som er tilsatt, utvikler seg ikke i matvaren, gjærer ikke og modifiserer ikke de organoleptiske egenskaper (US-patent nr. 5.186.962). Disse bakterier som frembringer bakteriosiner, fremstår ikke levedyktige i det lange løp. For øvrig anses bakteriosinene som additiver av antibiotisk type som fremkaller nærvær av resistente kim og som således kan tape sin effektivitet.

Konserveringsforsøk med røkelaks ved hjelp av en stamme av Lactococcus lactis som produserer nisin, er utført av Wessels et Huss i 1996. Det viser seg at populasjonen av Lactococcus lactis avtar på den konserverte røkelaks ved 10°C, idet stammen ikke er psykrotrof, og heller ikke tilpasset denne type substrat. Den kombinerte virkning av salt og graden av C02gjør det mulig å forhøye de bakteriside effekter i nisin mot stammer av Listeria monocytogene (Nilsson et al. 1997).

Parallelt er den samme type stamme studert av Chen Mei-Hui et al. Makrellfileter er blitt kimsatt ved dypping i en sur og saltet løsning som inneholder en sterk konsentrasjon av celler av Lactococcus lactis som produserer nisin. Etter tørking blir filetene konservert ved 4°C i poser. Vi har ikke kunnet sammenligne utviklingen av endringsfloraen mellom fileter som er kimsatt og som ikke er kimsatt, da teknikkene med klassiske opptellinger ikke gjør det mulig å separere endringsfloraen av gjæringsstoffet som er tilsatt i svært stor mengde (Chen Mei-Hui et al.: "Processing of low-slated mackerel fillets using biopreservative". Journal of the Fisheries Society of Taiwan, vol. 24, nr. 4, 1997 (1997-12), s. 327-336.

Melkesyrebakterier som er isolert fra fisk, som viser de inhiberende aktiviteter i forhold til endringsfloraen for fisken eller stammene av Listeria monocytogener er ikke gjenstand for de forskjellige studier (Stoffels et al., 1992; Pilet et al., 1995; Leroi et al., 1996). De studerte stammer er innordnet i slekten Carnobacterium. Én stamme Leuconostoc isolert fra fisk har likeledes vist naturlige anlegg for å inhibere stammer av monocytogene Listeria (Jeppensen et Huss, 1993). For øvrig vokser disse stammer ved 30°C. Det er altså umulig å separere endringsfloraen til stammen i løpet av vanlige mikrobiologiske analyser.

Den internasjonale søknad WO 00/60947 beskriver nye stammer av bakterier som produserer melkesyre. Disse melkesyrebakterier blir alle isolert fra melkeprodukter og vokser ved 30°C. Hver av de impliserte bakterier endrer ikke matvarene ved temperaturer lavere enn 7°C fordi de ikke utvikles ved disse temperaturer. Bakteriepopulasjonen blir delt i 100 etter én til to ukers konservering. Inhiberingene av de patogene kim finner bare sted ved temperaturer over 8°C. De skyldes nærvær av syrer, av karbondioksid og bakteriosiner eller annet. Følgelig oppviser disse melkesyrebakterier forskjellige ulemper da de er ute av stand til å inhibere uønskede kim ved temperaturer under 8°C uten å produsere bakteriosiner og at de utvikles ved 30°C.

Et mål med foreliggende oppfinnelse er å foreslå en ny stamme av melkesyrebakterier tilpasset å forsinke utvikling av dårlig lukt hos matvareprodukter som er nedkjølt, fortrinnsvis kondisjonert i en kontrollert atmosfære eller under vakuum, og å inhibere kim i nærheten så vel som patogene kim for å forlenge varigheten av konserveringen (DLC) av matvareprodukter, spesielt kondisjonerte marine produkter.

Et annet mål med oppfinnelsen er å foreslå en ny stamme av melkesyrebakterier som ikke er i stand til å utvikle seg ved 30°C, for å tillate opptelling av endringsfloraen hos matvareprodukter innen rammen av mikrobiologiske rutine-analyser.

For dette formål tilveiebringer oppfinnelsen en ny stamme av melkesyrebakterier, dvs Lactococcus lactis tilpasset for utnyttelse på området som gjelder konservering av matvareprodukter, spesielt marine produkter.

En prøve av kulturen av mikroorganismer, i henhold til oppfinnelsen, stammen kalt Lactococcus lactis LLO, er deponert 11. september 2001 under Budapest-traktaten i den nasjonale kultursamling av franske mikroorganismer

(CNCM), Institut Pasteur-28 rue de Docteur Roux- 75724 PARIS CEDEX 15. Prøven har fått registreringsnummer CNCM 1-2716.

Foreliggende oppfinnelse vedrører således en ny stamme av Lactococcus lactis, kjennetegnet ved at den har betegnelsen Lactococcus lactis LLO og deponert hos CNCM under adgangsnummer CNCM 1-2716. Den oppviser en veksttemperatur på mellom 2 og 25°C med en optimal veksttemperatur i nærhet av 20°C.

Foreliggende oppfinnelse vedrører videre materiale, kjennetegnet ved at det omfatter minst stammen Lactococcus lactis LLO eller en variant eller mutant av denne i henhold til kravene 1 til 2. Stammen Lactococcus lactis LLO er i lyofilisert form eller i form av en suspensjon.

Foreliggende oppfinnelse vedrører videre næringsmiddelmateriale for konservering i nedkjølt tilstand av matvareprodukter, spesielt produkter fra havet, kondisjonert fortrinnsvis under atmosfære med nedsatt oksygeninnhold, kjennetegnet ved at det omfatter stammen Lactococcus lactis LLO som angitt i ett av kravene 1 til 2, eller en variant eller mutant av denne, særlig som forsinker opptreden av dårlig lukt og/eller utvikling av patogene bakterier eller ikke.

Foreliggende oppfinnelse vedrører videre matvareprodukt, konservert i nedkjølt tilstand og kondisjonert fortrinnsvis under en atmosfære med nedsatt oksygen, kjennetegnet ved at produktet på sin overflate oppviser en biologisk barriere sammensatt av minst Lactococcus lactis LLO eller en variant eller en mutant av denne, i henhold til ett av kravene 1 til 2.

Det er videre beskrevet anvendelse av stammer, kulturer, biomasser, ekstrakter av Lactococcus lactis LLO i henhold til ett av kravene 1 til 3, som middel som forsinker opptreden av dårlig lukt i matvareprodukter konservert i nedkjølt tilstand og kondisjonert fortrinnsvis under en atmosfære med nedsatt oksygen.

Foreliggende oppfinnelse vedrører også anvendelse av stammer, kulturer, biomasser, ekstrakter av Lactococcus lactis LLO i henhold til ett av kravene 1 til 3, som middel som demper utvikling av endringsflora til matvareprodukter nedkjølt og kondisjonert fortrinnsvis under en atmosfære med nedsatt oksygen.

Det er videre beskrevet fremgangsmåte for konservering i nedkjølt tilstand av matvareprodukter, spesielt produkter fra havet, kondisjonert i en atmosfære med nedsatt oksygen før fortæring, kjennetegnet ved at den består i å bringe i kontakt matvareproduktet som skal konserveres, og Lactococcus lactis LLO i henhold til ett av kravene 1 til 2, før kondisjonering av det nevnte produkt slik at det dannes minst én biologisk barriere på overflaten av det nevnte produkt som demper utvikling av dårlig lukt og vekst av endringsflora på produktet.

Fremgangsmåten er videre kjennetegnet ved at matvareproduktet som skal konserveres bringes i kontakt med Lactococcus lactis LLO ved inokulering av produktet som skal konserveres med ca 10<5>- 10<7>celler som forblir levedyktige av Lactococcus lactis LLO pr gram produkt som skal konserveres.

Et annet formål med oppfinnelsen vedrører følgelig anvendelse av stammer, kulturer, biomasser, ekstrakter av Lactococcus lactis LLO for konservering av matvareprodukter og også som middel til å hemme opptreden av dårlig lukt eller dempe utviklingen av endringsflora hos matvareprodukter som er nedkjølt og fortrinnsvis kondisjonert i en atmosfære med nedsatt oksygen.

Et annet formål med oppfinnelsen vedrører følgelig tilveiebringelse av et spiselig materiale for konservering i nedkjølt tilstand av matvareprodukter, spesielt produkter fra havet, kondisjonert fortrinnsvis under atmosfærer med nedsatt oksygen,karakterisert vedat den omfatter minst Lactococcus lactis LLO eller en variant eller mutant av den.

En annen gjenstand for oppfinnelsen vedrører følgelig et matvareprodukt som er konservert i nedkjølt tilstand og fortrinnsvis kondisjonert under en atmosfære med nedsatt oksygen,karakterisert vedat produktet på sin overflate oppviser en biologisk barriere som utgjøres av minst Lactococcus lactis LLO eller en variant eller en mutant derav.

En annen gjenstand for oppfinnelsen vedrører følgelig en fremgangsmåte for konservering i nedkjølt tilstand av matvareprodukter, spesielt produkter fra havet, fortrinnsvis kondisjonert i en atmosfære med nedsatt oksygen før fortæring,karakterisert vedat den består i å bringe matvareproduktet som skal konserveres,

i kontakt med Lactococcus lactis før kondisjoneringen av produktet slik at det dannes en biologisk barriere på overflaten av produktet som forsinker utviklingen av vond lukt og vekst av endringsfloraen til produktet.

Oppfinnelsen vil i det følgende bli beskrevet ved utførelseseksempler, under henvisning til den eneste figur som er vedlagt, som, i form av tre kolonner, representerer vandringene av forskjellige restriksjonsfragmenter av den kromosomiske DNA for stammen LLO.

Stammen Lactococcus lactis LLO er isolert fra fileter av hvitting, nedkjølt og konservert i nærvær av redusert innhold av oksygen.

Stammen Lactococcus lactis LLO tilsvarer definisjonen av melkesyre-bakterie. Den tilhører slekten Lactococcus, arten Lactis. Dens metabolisme i melk eller aroma fra fisk produserer ikke noe endringsfenomen. Den inhiberer endringsfloraen til hvitting, laks og skalldyr.

På det morfologiske plan er cellene til stammen Lactococcus lactis LLO eggformet, ubevegelige. De opptrer i par eller i kjeder.

Hva angår deres dyrkningskarakteristikker, er disse celler Gram-positive, katalase-negative, oksydase-negative. De danner ikke sporer. De er fakultativt anaerobe og har en fermentativ metabolisme. Fermenteringen av glukose ledsages av en lett produksjon av gass. Stammen er imidlertid homofermentativ. Den tilhører slekten Lactococcus.

Stammen hydrolyserer ikke arginin, urinstoff eller stivelse og produserer ikke indol, heller ikke hydrogensulfid og surgjør ikke melken. Den reduserer ikke nitrater, og den er a-hemolytisk. Den produserer acetoin.

Stammen er psykrotrof og utvikles mellom 2 og 25°C med et optimum av vekst nær 20°C. Den dyrkes i følgende dyrkningsmiljøer: MRS pH 6,5, Elliker, M17, Trypticase-Soja-gel (agar) i blod. Den gror ikke på det gelatinerte miljø av ROGOSA-gel heller ikke ved 30°C. Den utvikles på fiskekjøtt eller skalldyr som er nedkjølt uten å medføre lukt, eller noen endret smak.

Et antibiogram er utført med stammen LLO for å studere dens resistens i forhold til noen antibiotika.

Testen er utført på Meuller Hinton miljø som inneholder 1,7% agar et 5% hesteblod, pH-verdien er 7,3. Tykkelsen på gelen i Petri-kolbene er konstant, nemlig 4 mm. Det dreier seg som et miljø som er standardisert i henhold til normene O.M.S.

Stammen LLO blir dyrket i en MRS-buljong med pH 6,5 i 48-36 timer ved 15°C til oppnåelse av stasjonær fase. Kulturen blir fortynnet til 1/10 i en Mueller Hinton-buljong. Den tilnærmede konsentrasjon i suspensjonen er 10<6>bakterier/ml.

Gelmiljøene blir oversvømt fullstendig med 2 ml av suspensjonen. Overskuddet av væske tappes ut, og kolbene settes til tørking i 10 minutter ved omgivelsestemperatur. De antibiotiske skiver blir deponert ved hjelp av en pinsett (høyst 4). Kolbene blir inkubert ved omgivelsestemperatur i 48 timer.

Resultatene er som følger:

En genetisk identifikasjon er blitt utført ved elektroforese i pulserende løp etter fordøying av genomet med et restriksjonsenzym på sjeldne steder.

Fremgangsmåten er som følger:

Bakteriebiomassen fra 10 ml kultur (48 timer i MRS-miljø, 18°C) blir gjenvunnet ved sentrifugering (10 min ved 4000 G). Cellebunnfallet blir tatt opp i 10 ml TE-buffer (Tris 10 mM, EDTA 1 mM, pH 7,5) og deretter homogenisert ved slynging. DO600 blir så oppnådd. Det sentrifugeres (10 min ved 4000 G) og bunnfallet tas opp i DO600/0J ml av buffer T100E (Tris 10 mM, EDTA 100 mM, pH 7,5). Cellesuspensjonen blandes V/V med en LMP-gel (med lavt smeltepunkt) til sammensmelting (2% i TE). Dette avkjøles til 4°C, og det skjæres plugger med tykkelse 1 mm. Det inkuberes 4 timer ved 37°C i 3 ml buffer T100E som inneholder 2 mg/ml lysozym. Reaksjonsblandingen tas så ut. Det inkuberes 16 timer ved 37°C i 3 ml av buffer TESP (Tris 10 mM, EDTA 0,5 M; Sarkosyl 10% pH 7,5) som inneholder 3 mg pronase. Etter inkubering vaskes pluggene 6 ganger med 10 ml av buffer TE (30 min, hver vasking) og så blir det digerert i 4 timer med restriksjonsenzymet under følgende betingelser: totalt volum 120 ul, 30U av enzym, 1,2 ul av BSA og 1/10 av den buffer som er anbefalt av fabrikanten

OZYME.

Etter digerering vaskes pluggen i 10 ml av buffer TE (20 min) og så lades migreringsgelen.

Det anvendte instrument er et GeneLine (Beckman).

Det anvendte enzym er Apa I.

Tre migreringsbetingelser anvendes for å separere, under de beste betingelser, de forskjellige restriksjonsfragmenter som er oppnådd. Resultatene vises på den eneste medfølgende figur.

Første kolonne tilsvarer 10 s puls i 16 timer for identifisering av de store fragmenter.

Andre kolonne tilsvarer 7 s puls i 16 timer for identifisering av de intermediære fragmenter.

Tredje kolonne tilsvarer 2 s puls i 7 timer og deretter 4 s puls i timer for identifisering av de små fragmenter.

Migreringsbufferen er TBE 0,25 X og temperaturen er 12°C.

Resultatene er vist på den eneste figur.

De inhiberende effekter av stamme LLO er undersøkt i Petri-skål ved teknikken med dobbelte lag.

De indikerende stammer blir dyrket i 24-48 timer ved 30°C i en M17- eller MRS-buljong for melkesyrebakteriene og i næringsbuljong for ikke-melkesyrebakteriene, før de blir kimsatt i det samme miljø som inneholder en 1 % agar. Sluttkonsentrasjonen i indikerende stamme er av størrelsesorden 10<7>CFU/ml. Denne gel holdes i underkjølt, smeltet tilstand ved 46°C og blir overført til en Petri-skål på en gel som er identisk og inneholder 1,2% agar, på forhånd avkjølt. Etter gelering av den andre stamme blir en dråpe bunnfall fra stammen "O" dyrket i buljong M17 ved 20°C i 3 dager og vasket i fysiologisk vann deponert på hver gel. Kolbene blir inkubert ved 30°C.

Sensibilitetsskalaen for de indikerende stammer i forhold til stammen LLO blir etablert som følger:

Fravær av halo: -

Halo på 1 mm rundt deponeringen: +

Halo på 2-3 mm rundt deponeringen: ++

de oppnådde resultater er anført i følgende tabell som følger:

Stammen LLO blir inhibert av stammen Lactococcus lactis ATCC 11454 som produserer nisin.

Forsøk med kimsetting av fileter av hvitting konservert i aerobt miljø blir utført med stammen Lactococcus lactis LLO. Disse forsøk er beskrevet nedenunder.

Fileter av hvitting blir innkjøpt hos en fiskehandler. Filetprøvene blir plassert i en pose og konservert i kjøleskap ved 5°C. Filetprøvene blir kimsatt med stammen LLO ved pulverisering av stammen LLO i suspensjon i fysiologisk vann før de blir anbrakt i en annen pose og konservert ved 5°C. På disse to typer fileter blir det utført sensoriske analyser og mikrobiologiske analyser. De sensoriske analyser blir utført ved hjelp av en blindprøve og forsøk.

Lukten og smaken etter koking av hver prøve blir notert i henhold til en skala med verdier som følger:

De mikrobiologiske analyser blir utført særlig ved opptellinger av aerobe mesofile kim. Opptellingene blir utført med en prøve på 10 g kjøtt i suspensjon i 90 ml fysiologisk vann som er sterilt og homogenisert i 3 minutter. Denne suspensjon betraktes som morsuspensjon.

Opptellingene av aerobe mesofile kim som dyrkes ved 30°C i 3 dager blir utført på fortynninger til 1/10 av morsuspensjonen ved anvendelse av teknikken med opptelling til uendelig. Dyrkningsmiljøet er PCA-gel, vanlig gel for opptelling i næringsmiddel-mikrobiologi.

Stammen LLO blir opptelt på MRS-gel pH 6,5 ved anvendelse av opptellingsteknikken til uendelig, mens kolbene blir inkubert 5 dager ved 15°C.

De oppnådde resultater er som følger:

Hva angår de organoleptiske tester så gir nedenstående tabell resultatene:

Hva angår opptellingene, så angir nedenstående tabell resultatene:

De utførte forsøk gjør det mulig å konstatere at matvareproduktene som er kimsatt med stammen Lactococcus lactis LLO alltid er av bedre organoleptisk kvalitet enn blindprøvene. Det konstateres spesielt en sterk nedsettelse av ammoniakklukt eller av H2S som gjør det mulig å øke konserveringsvarigheten for de behandlede matvareprodukter. Den regulære fortæring av de kimsatte matvareprodukter fremkaller intet fordøyelsesbesvær, og heller ikke noe allergi-fenomen. Det konstateres likeledes at utviklingen av den banale flora er hemmet.

De oppnådde resultater gjør det altså mulig å konkludere med at muligheten for å benytte et materiale som omfatter stammen Lactococcus lactis LLO eller en variant eller mutant av denne som næringsmaterialet for konservering i nedkjølt tilstand av matvareprodukter er tilstede. Ved nedkjøling forstår man matvareprodukter som er konservert i et temperaturområde som omfatter mellom ca 0°C og 12°C. Derimot konstateres det at denne stamme ikke utvikles ved en temperatur på 30°C. Dette gjør det mulig med en opptelling av floraen på matvareprodukter innen rammen av mikrobiologisk rutineanalyse.

Det konstateres likeledes at effekten av denne stamme blir større når den anvendes på matvareprodukter som er konservert i en atmosfære med nedsatt oksygen.

Forsøk er likeledes utført på fersk, skotsk laks (salmo salar), som stammer fra oppdrettsfarm på Shetlandsøyene, sløyet og lagt på is i 4 dager før behandling. Laksen er filetert med skinn. En av disse fileter tjener som blindprøve, den andre som forsøk.

Hva angår tillaging av en blindprøve, så tilskjæres en filet av fersk laks som blindprøve i åtte deler av 100 til 200 g, emballeres i enkeltposer og anbringes under vakuum før de lagres i et kaldt kammer mellom 2 og 4°C.

Forsøkseksemplaret blir tillaget på samme måte med unntagelse av at det mellom tilskjæringstrinnet og emballeringstrinnet kommer et kimsettingstrinn ved pulverisering med stammen LLO i suspensjon i fysiologisk vann.

På basis av disse to prøveeksemplarer blir det på den ene side utført sensorisk analyse, på den annen side mikrobiologisk undersøkelse. De sensoriske analyser blir utført på et blindprøveeksemplar og et forsøkseksemplar. Fargen på kjøttet blir kontrollert visuelt. Etter åpning av posene angis lukten i henhold til en skala. Om nødvendig kokes prøven i boblende vann i noen minutter før registrering på nytt.

Registreringsskalaen blir etablert som følger:

Hva angår de mikrobiologiske undersøkelser, så blir pH-verdien målt ved forskjellige punkter på eksemplarene. Den verdi som angis, er et middel av tre målinger. Opptellingene blir utført ved en prøve på 10 g kjøtt brakt i suspensjon i 90 ml fysiologisk vann som er sterilt og homogenisert i 3 minutter. Denne suspensjon benyttes som morsuspensjon.

Opptellingene av aerobe mesofile kim som dyrkes ved 30°C i 3 dager, blir utført med fortynninger til 1/10 av morsuspensjonen ved å anvende teknikken med opptelling til uendelig. Dyrkningsmiljøet er PCA-gel, vanlig gel for opptelling i næringsmiddel mikrobiologi.

Stammen LLO blir opptelt på MRS-gel pH 6,5 ved anvendelse av opptellingsteknikken til uendelig, og kolbene blir inkubert 5 dager ved 15°C.

De oppnådde resultater er som følger:

Hva angår de organoleptiske tester, viser nedenstående tabell resultatene:

Hva angår variasjonene i pH-verdi, viser nedenstående tabell de oppnådde resultater:

Hva angår opptellingene, viser nedenstående tabell de oppnådde resultater:

Resultatene viser tydelig at det ikke eksisterer noen betydelig forskjell mellom pH-verdien til blindprøvene og til de behandlede produkter. Derimot viser de organoleptiske egenskaper til produktene så vel som utviklingen av den banale flora positive resultater sammenlignet med blindprøveeksemplarer.

Andre forsøk er utført på reker fra oppdrett hvor hodet var fjernet og rekene frosset. Disse reker blir tint i lunkent vann i 5 minutter, før de blir kokt i kokende vann saltet med 20 g/l, i 1 minutt. Etter hurtig avkjøling under rennende vann blir rekene dykket ned i et isbad saltet med 20 g/l.

Rekene som tjener som blindprøve blir emballert i grupper på ti i små båtformede beholdere under modifisert atmosfære. Rekene fra "forsøket" blir forutgående kimsatt med stammen LLO ved pulverisering av stammen LLO i suspensjon i fysiologisk vann. De blir så emballert i grupper på ti i små båtformede beholdere under modifisert atmosfære og konservert ved 4°C.

Sensoriske analyser blir utført med et blindprøveeksemplar og et forsøks-eksemplar. Fargen på kjøttet blir kontrollert visuelt. Etter åpning av posene blir smaken notert i henhold til en skala med verdier identiske med dem som ble brukt for eksempelet med laks ovenfor.

Opptellinger blir utført med en mengde på 10 g av reker i suspensjon i 90 ml fysiologisk sterilt vann og homogenisert i 3 minutter. Denne suspensjon anses som morsuspensjonen.

Opptellinger av aerobe mesofile kim som dyrkes ved 30°C i 3 dager, blir utført med fortynninger til 1/10 av morsuspensjonen ved anvendelse av teknikken med opptelling til uendelig. Dyrkningsmiljøet er PCA-gel, vanlig gel for opptelling i næringsmiddel mikrobiologi.

Stammen LLO blir opptelt på MRS-gel pH 6,5 ved anvendelse av teknikken med opptelling til uendelig, idet kolbene blir inkubert 5 dager ved 15°C.

Hva angår de organoleptiske tester, viser nedenstående tabell resultatene:

Hva angår opptellingene, gir nedenstående tabell de oppnådde resultater:

Det er altså mulig å se for seg en industriell anvendelse av denne stamme innen rammen av fremgangsmåten for konservering av nedkjølte matvareprodukter. Fremgangsmåten består følgelig i å bringe i kontakt det matvareprodukt som skal konserveres, med stammen Lactococcus lactis LLO før kondisjonering av produktet slik at det dannes en biologisk barriere på overflaten av produktet som demper utviklingen av dårlig lukt og vekst av endringsflora på produktet. Selvsagt bør denne kontaktbringing foregå etter enhver behandling av produktet, spesielt hvis sistnevnte skal underkastes en varmebehandling. Kontaktbringingen kan utføres ved inokulering av matvareproduktet som skal konserveres, med ca 10<5>- 10<7>celler som er levedyktige av Lactococcus lactis LLO pr gram produkt som skal konserveres. Diverse inokuleringsmetoder kan tas i betraktning i henhold til typen presentasjon av stammen. Således kan stammen Lactococcus lactis LLO være i lyofilisert form. Denne stamme Lactococcus lactis LLO kan også presenteres i form av en suspensjon. Kimsettingen av næringsmiddelet kan også utføres ved pulverisering av et pulver som inkorporerer stammen Lactococcus lactis LLO eller ved pulverisering av en cellesuspensjon som inkorporerer den før nevnte stammen, eller ved dypping av næringsmiddelet i et bad som inneholder stammen. Stammen kan benyttes alene eller blandet med en bærer.

Denne stamme er altså i besittelse av følgende egenskaper:

å utvikle seg på marine produkter, så som fisk, skalldyr eller annet, ved

nedkjølingstemperaturer,

å ikke endre matvaren,

å tillate, under visse betingelser, å nedsette utviklingen av den banale

flora for endring av matvaren og å inhibere visse patogener,

å retardere fremtreden av uønsket lukt, så som lukt av ammoniakk eller H2S.

Dens effektivitet øker når matvaren blir emballert i vakuum, under modifisert atmosfære eller hvilken som helst annen reduserende betingelse i nærvær av oksygen.

Den utvikles ikke ved 30°C og kan opptelles i en vanlig brukt matvare mikrobiologisk analyse.

Claims

1. Ny stamme av Lactococcus lactis,karakterisert vedat den har betegnelsen Lactococcus lactis LLO og deponert hos CNCM under adgangsnummer CNCM 1-2716.

2. Ny stamme av Lactococcus lactis LLO i henhold til krav 1,karakterisert vedat den oppviser en veksttemperatur på mellom 2 og 25°C med en optimal veksttemperatur i nærhet av 20°C.

3. Kulturer, biomasser og ekstrakter,karakterisert vedat de er oppnådd av stammer i henhold til krav 1.

4. Materiale,karakterisert vedat det omfatter minst stammen Lactococcus lactis LLO eller en variant eller mutant av denne i henhold til kravene 1 til 2.

5. Materiale som angitt i krav 4,karakterisert vedat stammen Lactococcus lactis LLO er i lyofilisert form.

6. Materiale som angitt i krav 4,karakterisert vedat stammen Lactococcus lactis LLO er i form av en suspensjon.

7. Næringsmiddelmateriale for konservering i nedkjølt tilstand av matvareprodukter, spesielt produkter fra havet, kondisjonert fortrinnsvis under atmosfære med nedsatt oksygeninnhold,karakterisert vedat det omfatter stammen Lactococcus lactis LLO som angitt i ett av kravene 1 til 2, eller en variant eller mutant av denne, særlig som forsinker opptreden av dårlig lukt og/eller utvikling av patogene bakterier eller ikke.

8. Matvareprodukt, konservert i nedkjølt tilstand og kondisjonert fortrinnsvis under en atmosfære med nedsatt oksygen,karakterisert vedat produktet på sin overflate oppviser en biologisk barriere sammensatt av minst Lactococcus lactis LLO eller en variant eller en mutant av denne, i henhold til ett av kravene 1 til 2.

9. Anvendelse av stammer, kulturer, biomasser, ekstrakter av Lactococcus lactis LLO i henhold til ett av kravene 1 til 3, som middel som forsinker opptreden av dårlig lukt i matvareprodukter konservert i nedkjølt tilstand og kondisjonert fortrinnsvis under en atmosfære med nedsatt oksygen.

10. Anvendelse av stammer, kulturer, biomasser, ekstrakter av Lactococcus lactis LLO i henhold til ett av kravene 1 til 3, som middel som demper utvikling av endringsflora til matvareprodukter nedkjølt og kondisjonert fortrinnsvis under en atmosfære med nedsatt oksygen.

11. Fremgangsmåte for konservering i nedkjølt tilstand av matvareprodukter, spesielt produkter fra havet, kondisjonert i en atmosfære med nedsatt oksygen før fortæring,karakterisert vedat den består i å bringe i kontakt matvareproduktet som skal konserveres, og Lactococcus lactis LLO i henhold til ett av kravene 1 til 2, før kondisjonering av det nevnte produkt slik at det dannes minst én biologisk barriere på overflaten av det nevnte produkt som demper utvikling av dårlig lukt og vekst av endringsflora på produktet.

12. Fremgangsmåte som angitt i krav 11,karakterisert vedat matvareproduktet som skal konserveres bringes i kontakt med Lactococcus lactis LLO ved inokulering av produktet som skal konserveres med ca 10<5>- 10<7>celler som forblir levedyktige av Lactococcus lactis LLO pr gram produkt som skal konserveres.