DE1618819B1

DE1618819B1 - Inokosteron und Verfahren zu seiner Gewinnung

Info

Publication number: DE1618819B1
Application number: DE1967R0045861
Authority: DE
Inventors: Nobushige Nishimoto; Shuntaro Ogawa; Tsunematsu Takemoto
Original assignee: Rohto Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Rohto Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 1966-10-19
Filing date: 1967-04-25
Publication date: 1972-03-23
Also published as: DE1793642A1; US3433814A; GB1190960A; DE1793642C3; DE1793642B2; CH485692A

Description

Bombyx mori pupae
Bombyx mori pupae

Bombyx mori pupae
Panzerkrebs

Ausbeute (%)

7,36 x 10~⁶ 9 χ 10~⁷

1,79 x 10~⁶ 2 χ ΙΟ"⁷

So können z. B. nur etwa 250 mg Ecdyson aus

1 Tonne Bombyx-mori-Puppen und nur etwa 9 mg Ecdysteron aus einer Tonne Bombyx-mori-Puppen erhalten werden.

Es wurde vorgeschlagen, Ecdyson aus Ergosterin

rs zu synthetisieren. Diese Methode bedingt jedoch eine sehr komplizierte, 14stufige chemische Reaktion, und trotzdem ist die Ausbeute sehr niedrig.

Diese Hormone sind daher sehr teuer und wurden trotz ihrer Brauchbarkeit nicht in weitem Umfang verwendet.

Es wurde nun gefunden, daß Pflanzen der Gattungen, Achyranthes und Cyathula eine verhältnismäßig große Menge an gewissen Insektenhäutungs- oder Metamorphosenhormonen enthalten, d. h. Inokosteron neben dem ebenfalls vorliegenden, bereits bekannten Isoinokosteron oder Ecdysteron.

Es wurde auch gefunden, daß dieses Hormon leicht aus den obenerwähnten Pflanzen isoliert werden kann. Inokosteron ist ein neues, bisher nicht bekanntes Hormon.

Die vorliegende Erfindung betrifft Inokosteron und ein Verfahren zur Gewinnung von Inokosteron durch Extraktion in an sich bekannter Weise dieser Verbindung mit einem Lösungsmittel aus einer Pflanze der Gattungen Achyrantes und Cyathula.

Beispiele von Pflanzen sind Achyranthes fauriei, Achyranthes longifolia, Achyranthes japonica, Achyranthes bidentata, Achyranthes aspera, Achyranthes obutusifolia, Achyranthes rubrofusca, Cyathula capitata, Cyathula tomentosa. Jeder Teil (der aphyllische Teil, der Stengel, die Wurzel u. dgl.) dieser Pflanzen kann verwendet werden. Jedoch sind Wurzeln wegen ihrer kommerziellen Zugänglichkeit und ihres höheren Gehaltes an gewünschtem Hormon am meisten bevorzugt.

Diese Pflanzen können der Extraktion in jeder

" geeigneten Form unterworfen werden. Gewöhnlich wird die gesammelte Pflanze mit Wasser gesäubert, getrocknet und zu kleinen Stücken geschnitzelt oder in feine Teilchen oder in Pulver zerteilt, bevor sie . der Extraktion unterworfen wird. Gewünschtenfalls kann die Pflanze roh oder verarbeitet sein, also einer physikalischen, chemischen oder biologischen Behandlung unterworfen sein, bevor sie der Extraktion unterworfen wird.

Diese Pflanzen sind einjährige Pflanzen, die in ganz Japan, China, und vielen anderen Teilen der Welt wachsen, und daher leicht in großer Menge und billig erhältlich sind. Gemäß der Erfindung wird Inokosteron sowie das ebenfalls vorliegende Isoinokosteron aus diesen Materialien mit einem geeigneten Lösungsmittel extrahiert. Für diesen Zweck können verschiedene Lösungsmittel verwendet werden. Die Verwendung von anorganischen Lösungsmitteln, (Wasser, Salzlösung, gepufferte Lösung) oder organischen Lösungsmitteln (Methanol, Äthanol, Butanol Äthylacetat, Butylacetat) oder eines Gemisches von

2 oder mehr davon ist jedoch bevorzugt.

Die Menge an Extraktionslösungsmittel bezüglich des Pflanzenmaterials kann über einen weiten Bereich schwanken. Im allgemeinen wird eine Menge von 1 bis 40 Gewichtsteilen' (vorzugsweise 2 bis 10 Gewichtsteilen) des Extraktionslösungsmittels je Teil 5 Pflanzenmaterial verwendet.

Die Extraktion kann in jeder geeigneten Weise durchgeführt werden. Im typischsten Fall wird das Pflanzenmaterial in das Extraktionslösungsmittel eingetaucht. Die Temperatur der Extraktion kann über einen weiten Bereich variiert werden, beispielsweise von Zimmertemperatur oder gewöhnlicher Temperatur (etwa 20 bis 25⁰C) bis zum Siedepunkt des besonderen verwendeten Lösungsmittels. Die Extraktion wird eine ausreichende Zeitspanne durchgeführt, um die gewünschte Extraktion zu bewirken, wobei die Zeit variiert werden kann (1 Stunde—20 Stunden) je nach der besonderen Temperatur und der Art des beteiligten Lösungsmittels.

In der obigen Weise wird Inokosteron im Pflanzenmaterial in das Lösungsmittel extrahiert.

Aus dem Extrakt können Inokosteron und das ebenfalls extrahierte Isoinokosteron mittels Ionenaustauscherbehandlung und/oder wiederholter Extraktion mit Lösungsmittel und Nichtlösungsmittel für die gewünschten Verbindungen gereinigt und isoliert werden.

Da Inokosteron und das ebenfalls vorliegende Isoinokosteron leicht löslich in Methylalkohol, Äthylalkohol, Pyridin kaum löslich in Wasser, Äthylacetat, Butylacetat, Äther und in Petroläther, Benzol, Hexan unlöslich sind, können durch geeignete kombinierte und wiederholte Verwendung dieser Medienais Extraktions- oder Waschmedium die gewünschten Verbindungen gereinigt und kristallisiert werden. Arbeitsweisen dieser Art sind zur Isolierung einer Verbindung aus ihrer Lösung bekannt.

Bei Verwendung eines wäßrigen Extraktionsmediums soll der erhaltene wäßrige Extrakt vorzugsweise mit stark saurem Kationenaustauscherharz und/oder stark basischem Anionenaustauscherharz behandelt werden, um basische und/oder saure Verunreinigungen zu entfernen und eine neutrale wäßrige Lösung zu erhalten, welche die gewünschte Verbindung enthält. ' . Bei Verwendung eines organischen Extraktionsmediums soll die extrahierte Verbindung vorzugsweise vom organischen Extrakt in ein wäßriges Medium übergeführt werden.

Die in der obigen Weise erhaltene wäßrige Lösung kann der Extraktion mit einem Lösungsmittel, wie Estern (Äthylacetat, Butylacetat) oder höheren Alkoholen (Butylalkohol, Amylalkohol), die mit Wasser verhältnismäßig nicht mischbar sind, unterworfen werden.

Durch Abdestillieren des Lösungsmittels können rohe Kristalle erhalten werden.

Die rohen Kristalle können weiter durch wiederholtes Umkristallisieren aus Wasser oder einem Gemisch eines unpolaren Lösungsmittels, Hexan, Benzol, Äther, Petroläther, und eines polaren Lösungsmittels (Äthylalkohol, Methylalkohol) gereinigt werden. Auf diese Weise können reine Kristalle von Inokosteron und dem.ebenfalls extrahierten Isoinokosteron hergestellt werden. Die Trennung von Inokosteron und Isoinokosteron kann durch Ausnutzen der Löslichkeitsunterschiede bewirkt werden. Inokosteron ist unlöslicher als Isoinokosteron.

Alternativ können die rohen Kristalle acetyliert werden. Da Inokosteron ein Tetraacetat bildet, während Isoinokosteron das Triacetat bildet, können sie durch chromatographische Behandlung isoliert werden. Die getrennten Acetate können getrennt hydrolysiert werden, um freies Inokosteron zu erhalten.

Beispiel 1

Wurzeln von Achyranthes fauriei wurden mit Wasser gesäubert und an der Luft getrocknet. Getrocknete Achyranthes-Wurzel wurde zu kleinen Stücken geschnitten. 15 kg dieses Materials wurden dreimal mit Methanol extrahiert. Bei jeder Extraktion wurde das Material in 201 Methanol getaucht und 4 Stunden zum Rückfluß erhitzt. Der Extrakt wurde im Vakuum auf 21 konzentriert, und gebildete Ausfällungen (die hauptsächlich aus KNO₃ bestanden) wurden abfiltriert. Das Filtrat wurde mit 21 Wasser gemischt und dreimal mit Äther (insgesamt 500 ml) extrahiert. Die wäßrige Schicht wurde abgetrennt und wiederholt mit Äthylacetat (insgesamt 401) extrahiert. Der Extrakt wurde zur Entfernung von Äthylacetat destilliert, so daß rohe Kristalle im Rückstand ausfielen, die abfiltriert wurden. Das Filtrat wurde an einer Säule von Aluminiumoxid (200 g) adsorbiert und mit einem Gemisch von Äthylacetat und Äthylalkohol (8:2) eluiert. Das Eluat wurde im Vakuum konzentriert, um rohe Kristalle auszufüllen.

Die rohen Kristalle wurden vereinigt und mit 20 ml Äthylacetat gewaschen und dann in 130 ml Äthylalkohol gelöst. Nach Zugabe von 300 ml Petroläther wurden 4,7 g rohe Kristalle von Inokosteron und Isoinokosteron ausgefällt. Die rohen-Kristalle wurden wiederholt aus einem Gemisch von Äthylalkohol zu Petroläther (2:8) umkristallisiert, bis reine, farblose Nadeln von Inokosteron vom F. = 255° C (Zersetzung) erhalten wurden. Ausbeute = 0,75 g. ■ Löslich in Methylalkohol, Äthylalkohol und Pyridin, kaum löslich in Wasser, Äthylacetat und Äther, unlöslich in Benzol und Petroläther. Analyse: C₂₇H₄₄O₇ · ^ H₂O.

Berechnet ... C 66,23, H 9,26%; gefunden ... C 66,09, H 9,29%.

So erhaltenes Inokosteron war sowohl bei der Lieberman - Burchard - Reaktion als auch der Salcowski-Reaktion und der Tschugajeff-Reaktion

P°^sitiv- Beispiel 2

Dieses Beispiel zeigt eine weitere Arbeitsweise zur Reinigung und Trennung von Inokosteron und Isoinokosteron.

4 g rohe Kristalle eines Gemisches von Inokosteron und Isoinokosteron, die in der gleichen Weise wie im Beispiel 1 erhalten waren, wurden in 20 ml Pyridin gelöst. Zur erhaltenen Lösung wurden 40 ml Essigsäureanhydrid gegeben, und das Gemisch wurde über Nacht bei gewöhnlicher Temperatur (20 bis 25° C) stehengelassen. Dann wurde das Gemisch in 200 ml Eiswasser gegossen, um acylierte Produkte auszufällen (3,8 g), die abfiltriert wurden. Das gewonnene Produkt wurde in 50 ml eines Gemisches von Äthylacetat und Petroläther (1:1) gelöst und die Lösung am oberen Teil einer Säule von Aluminiumoxid (250 g) adsorbiert. Dann wurde die Säule mit 1,5 1 eines 1:1-Gemisches von Petroläther und Äthylacetat eluiert. Das Eluat wurde destilliert, um das

Lösungsmittel zu entfernen und der Rückstand wiederholt aus verdünntem Äthylalkohol umkristallisiert, um farblose Nadeln von Inokosterontetraacetat zu erhalten. Ausbeute = 1,3 g, F. = 165 bis 168°C. ' 1 g so erhaltenes Inokosterontetraacetat wurde in 100 ml Äthylalkohol gelöst, und 10 ml 10%ige KOH wurden zugefügt. Das Gemisch wurde auf einem heißen Wasserbad 1 Stunde erhitzt. Nach Abkühlen auf Zimmertemperatur wurde die Lösung durch eine Schicht von 30 mg eines Kationenaustauscherharzes, nämlich Amberlite IR-120 (Η-Form) gegeben, und die Harzschicht wurde mit 100 ml 50%igem Äthylalkohol gewaschen. Die durchgelaufene Lösung und die Waschflüssigkeit wurden vereinigt und im Vakuum konzentriert. Der gebildete Niederschlag wurde wiederholt aus einem 2:8-Gemisch von Äthylalkohol und Hexan umkristallisiert, was farblose Nadeln von Inokosteron in einer Ausbeute von 0,6 g und vom F. = 255° C (Zersetzung) ergab.

20

Beispiel 3

Eine getrocknete Achyranthes-Wurzel wurde zu kleinen Stücken geschnitten. 2 kg dieses Materials wurden in 31 Wasser getaucht und über Nacht bei Zimmertemperatur (20 bis 25° C) stehengelassen. Dann wurde die Suspension filtriert und der Rückstand wieder in der gleichen Weise mit 21 Wasser extrahiert und. dann filtriert. Die Filtrate wurden vereinigt und durch eine Säule von 300 ml eines stark sauren Kationenaustauscherharzes, nämlich Amberlite IR-120 (Η-Form) gegeben. Die Säule wurde mit 11 Wasser gewaschen. Das Waschwasser und die durch die -Harzsäule gelaufene Lösung wurden vereinigt, und das Gemisch wurde durch eine Säule von 300 ml eines stark basischen Anionenaustauscherharzes (Amberlite IRA-410, OH-Form) gegeben. Die Säule wurde mit 11 Wasser gewaschen. Das Waschwasser und die durch die Harzsäule gelaufene Lösung wurden vereinigt. Das Gemisch wurde durch Eindampfen im Vakuum konzentriert, was 200 g eines neutralen Konzentrats ergab, das dann wiederholt mit Äthylacetat, (insgesamt 11) extrahiert wurde. Der Extrakt wurde destilliert, um das Lösungsmittel zu entfernen, und im Rückstand fielen rohe Kristalle aus. Die rohen Kristalle wurden abfiltriert. Das Filtrat wurde an einer Aluminiumoxidsäule adsorbiert, mit einem Äthylacetat-Äthylalkohol-Gemisch eluiert und konzentriert, was weitere rohe Kristalle in der gleichen Weise wie im Beispiel 1 ergab. Auf diese Weise wurden insgesamt 0,4 g rohe Kristalle von Inokosteron und dem Nebenprodukt Isoinokosteron erhalten. Diese rohen Kristalle wurden in der gleichen Weise wie im Beispiel 2 behandelt, um 0,1 g kristallines Inokosteron (F. = 255° C, Zersetzung) zu erhalten, wobei 0,1 g kristallines Isoinokosteron (F. = 242° C, Zersetzung) als Nebenprodukt anfielen.

Beispiel 4

Achyranthes fauriei-Pflanzen wurden an der Luft getrocknet und zu kleinen Stücken geschnitzelt.

28 kg dieses Materials wurden in 2001 Methylalkohol getaucht und 6 Stunden zum Rückfluß erhitzt. Nach Abkühlen wurde die Suspension filtriert, und der Rückstand wurde zweimal 6 Stunden lang mit jeweils 1501 Methylalkohol extrahiert. Nach jeder Extraktion wurde die abgekühlte Suspension nitriert. Die Filtrate wurden vereinigt und durch Eindampfen im Vakuum konzentriert, was 3,8 kg Konzentrat ergab. Zu diesem Konzentrat wurden 41 Wasser zugegeben und feste Verunreinigungen abfiltriert. Das Filtrat wurde dreimal mit insgesamt 3 1 Äther extrahiert. Die wäßrige Schicht des Extraktes wurde gewonnen und wiederholt mit insgesamt 35 1 Äthylacetat extrahiert. Der Extrakt wurde destilliert, um das Lösungsmittel zu entfernen und der Rückstand in 50 ml Äthylalkohol gelöst. Die Lösung wurde am oberen Teil einer Säule von 500 g Aluminiumoxid adsorbiert. Die Säule wurde mit 2,51 eines 8:2-Gemisches von Äthylacetat und Äthylalkohol eluiert. Das Eluat wurde destilliert, um das Lösungsmittel zu entfernen, und es wurden 9 g rohe Kristalle erhalten. Die rohen Kristalle wurden in der gleichen Weise wie im Beispiel 1 behandelt, um 2,8 g kristallines Inokosteron vom F. = 255° C (Zersetzung) und 2,0 kg kristallines Isoinokosteron als Nebenprodukt vom F. = 242° C (Zersetzung) zu erhalten.

Das nach dem erfindungsgemäßen Verfahren erhaltene Inokosteron zeigt eine sehr starke Aktivität in Häutungsprüfungen, die bei Verwendung von isolierten Abdomen von Fliegenlarven, wie Sarcophaga crassipalpis, Sarcophage peregrina, Phormia regina und Chrysomyia megacephala durchgeführt wurden.

In »Journal of Pharmacological Association of Japan«, 66, 1970, S. 1 bis 13, wurde berichtet, daß der LD₅₀-Wert bei intraperitonealer Applikation von Isoinokosteron bzw. Ecdysteron 6,4 g/kg beträgt (Versuchstiere: Mäuse) während der LD₅₀-Wert von Inokosteron bei 7,8 g/kg liegt.

Die chemischen und physikalischen Merkmale von Inokosteron sind wie folgt:

Inokosteron

Chemische Formel

OH

CH₂OH

Farblose Nadeln vom F. = 255⁰C (Zersetzung).

[a] F = +59,4° (c = 0,78, MeOH); IR (KBr) cm"¹ 3400, 1645; UV λ *°^H = 243 πΐμ.

Die· NMR-Werte (in Pyridin, p.p.m, TMS) von Inokosteron und zum Vergleich von Isoinokosteron und Ecdysteron (das, wie gefunden wurde, identisch mit Isoinokosteron ist) und anderen verwandten, bekannten Verbindungen sind wie folgt:

Substanz	C-18	C-19	' C-21	C-26	C-27
Ecdyson Ecdysteron [nokosteron .... [soinokosteron	0,69 1,19 1,19 1,20	1,04 1,06 1,07 1,07	1,24 1,55 1,52 1,57	1,35 1,34 0,991 1,O7J 1,37	D C-27

Claims

Patentansprüche:
1. Inokosteron der allgemeinen Formel

OH

CH, OH

Hormon

HO

ho—iw ;
2. Verfahren zur Gewinnung von Inokosteron der im Anspruch 1 wiedergegebenen Formel, dadurch gekennzeichnet, daß man diese Verbindung aus Pflanzen der Gattungen Achyranthes und Cyathula in an sich bekannter Weise mit einem Lösungsmittel extrahiert und isoliert. ._. „

Die Erfindung betrifft Inokosteron und ein Verfahren zu seiner Gewinnung.

Ecdyson, das aus Puppen von Seidenraupen (Bombyx mori) von Butenandt und Mitarbeitern (A. Butenandt und P. K ar Is on, Zeitschrift für Naturforschung, 9 b, 389 [1954]) isoliert wurde, ist das erste der Insektenmetamorphosenhormone (Häutungshormon). Dann wurden 1966 20-Hydroxyecdyson und Ecdysteron, deren metamorphotische "Wirksamkeit beim Insekt wirksamer sein soll als Ecdyson, ebenfalls aus Puppen von Bombyx mori von H ο c.k s und Mitarbeitern (P. H ο c k s und R. Wiechert, Tetrahedron Letters, Nr. 26, S. 2989 bis 2993, 1966) bzw. Hoffmeister und Mitarbeitern (H. Hoffmeister und H. F. Grützmacher, Tetrahedron Letters, Nr. 33, S. 4017 bis 4023, 1966) isoliert. Weiter wurde die Isolierung von Crustecdyson aus dem Panzerkrebs (Jasus lalandii) -aus der Augenspillereichenseidenmotte (Antherea Pernyi) mitgeteilt (F.Hampshire und D. H. S. Horn, Chem. Comm., 37 [1966] und D. H. S. Horn, E. J. Middlet ο η und J. A. Wunderlich, Chem. Comm., 339 [1966]).

Diese Verbindungen sind als Häutungshormone oder Metamorphosenhormone von Insekten aktiv und demgemäß wertvolle Substanzen. Nach herkömmlichen Methoden können diese Insektenhäutungshormone jedoch nur in extrem kleiner Menge aus einer großen Menge der teueren Ausgangsmaterialien erhalten werden. Zum Beispiel sind die Ausbeuten dieser Hormone aus den jeweiligen Materialien nach den herkömmlichen Methoden wie folgt:

Ecdyson

Ecdysteron ...
20-Hydroxyecdyson ...
Crustecdyson

Material