DE1617568A1

DE1617568A1 - Verfahren zur Abschwaechung von Schweinecholeravirus

Info

Publication number: DE1617568A1
Application number: DE19671617568
Authority: DE
Inventors: Hisao Izawa; Masao Soekawa
Original assignee: Kitasato Institute
Current assignee: Kitasato Institute
Priority date: 1967-03-13
Filing date: 1967-03-13
Publication date: 1972-02-17
Also published as: ES351893A1

Description

Verfahren zur Abschwächung von Schweinecholeravirus

Die Erfindung betrifft die Abschwächung von Schweinecholeravirus (HCV) durch Anwendung von Reihenzellpassagen von virustragenden Einschichtkulturen, die sich von Nieren oder anderen Organen oder Geweben von Schweinen ableiten, die künstlich mit einem virulenten Stamm des Virus infiziert wurden. Die Abschwächung der Virulenz des verbleibenden HCV schreitet markant voran, wenn die Anzahl der Reihenzellpassagen erhöht wird. Durch die Reihenzellpassagen ergibt sich ein HCV tragender Zellstamm, der eine stabile Quelle für den abgeschwächten HCV ist. Ent-

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sprechend dem erfindungsgemäßen Verfahren wird es auf einfache Weise möglich, eine abgeschwächte Schweinecholeravirusvakzine zu entwickeln.

Die Schweinecholera stellt eine gut bekannte Krankheit der Schweine dar und ist äußerst schädlich, da sie große wirtschaftliche Schäden auf dem Gebiet der Schweineverarbeitung in einer Vielzahl von Ländern verursacht. Als eine praktische Maßnahme zur Verhinderung dieser Krankheit wurde Schweinecholeravakzine, die entweder aus abgetöteten oder lebenden Virus bestand, in weitem Umfang verwendet.

Kristallviolettvakzine, eine typische Vakzine mit abgetöteten Virus wurde hinsichtlich ihrer Sicherheit und Wirksamkeit untersucht. Als Fehler dieser Vakzine sind jedoch große Dosierungen, um eine starke Immunität zu erreichen, und eine langsame Entwicklung und kurze Dauer der Immunität bekannt. Weiterhin kommen die Gestehungskosten der Vakzine ziemlich hoch auf Grund des Ausgangsmaterials, des defibrinierten Gesamtblutes von infizierten Schweinen. Die Nachteile dieser Vakzine könnten durch Verwendung von Vakzinen mit Lebendvirus reduziert werden. Bestimmte Lebendvirusvakzinen, beispielsweise ein lapinisierter Virus, müssen jedoch hinsichtlich ihrer Virulenz mit Vorsicht betrachtet werden.

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Die idealste Virusvakzine sollte ein abgeschwächter Virus sein, da eine perfekte Vakzine in jeder. Weise sicher sein muß und geeignet sein muß, eine starke und lang dauernde Immunität unter rascher Entwicklung bei kleiner Dosierung des Inokulums zu ergeben. Dies läßt sich zufriedenstellend jedoch nur durch einen sicheren abgeschwächten Virusvakzinestamm erreichen. Außerdem können die Gestehungskosten wesentlich vermindert werden, da Gewebskulturverfahren zur Herstellung der Vakzine eingesetzt werden können.

Das erfindungsgemäße Verfahren zur Abschwächung von Schweine Choleravirus besteht darin, daß Nieren oder andere Organe oder Gewebe von Schweinen, die künstlich mit einem Virulenten Stamm eines Schweinecholeravirus infiziert wurden, zerkleinert werden, während etwa 12 Stunden die zerkleinerten Fragmente mit einer NaC1-Pufferlösung, die Trypsin enthält, behandelt und in Einschichtkultur bei 36° bis 37°C kultiviert und anschließend einer mehr als 50fachen Reihenzellpassage unterworfen werden.

Es gab eine Reihe von Versuchen, um abgeschwächten HCV unter Anwendung von Gewebskulturverfahren zu erhalten. Eine Vielzahl dieser Versuche ging von der Inokulierung von HCV auf Kulturen aus, die von gesunden Tieren herge-

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stellt worden waren. Im Gegensatz hierzu geht man beim erfindungsgemäßen Verfahren von der Kultivierung von Einschichtkulturen aus, die von Nieren, Milzen und anderen Organen oder Geweben von Schweinen herstammen, die mit experimenteller Schweinecholera infiziert sind. Dann werden die infizierten Einschichtkulturen einer Reihenpassage unterworfen, um HCV-haltige Zellstämme zu erhalten. Von dem erhaltenen Virus zeigte es sich, daß er zunehmend abgeschwächt wurde, je weiter die Reihenzellpassage fortschritt. Die vorliegende Erfindung stellt ein solches Verfahren zur Abschwächung von SchweineCholeravirus dar. Diese das Wesen der Erfindung darstellende Feststellung ist durch den überraschenden Erfolg des vorliegenden Verfahrens zur Virusabschwächung gekennzeichnet. Im folgenden wird ein Beispiel für das erfindungsgemäße Verfahren gegeben.

Beispiel

Gesunde Yorkshire Schweine, die hochempfindlich für HCV sind und in einer isolierten und geschlossenen Anstalt unter Beachtung gesundheitlicher Regelungen gehalten wurden, wurden mit einem virulenten Stamm von HCV inokuliert. Der Stamm bestand aus einem Standardimmunitätstest-Virus und war strikt unter Ausschluß von bakteriellen und viruellen Verunreinigungen gehalten worden. Beim Höhepunkt der

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Infektion wurden die Schweine ausgeblutet und die Nieren aseptisch entnommen. Die Nieren wurden in kleine Fragmente zerkleinert und bei 4⁰C über Nacht gerührt, wobei die Zellen in einer Phosphatpuffersalzlösung (PBS) dispergiert wurden, die 0,25 % Trypsin und 0,25 % Pankreatin (auf das Gewicht bezogen) enthielt. Die dispergierten Zellen wurden gesammelt, gespült und erneut in einem Nährmedium mit einer Konzentration von 5 x 10 Zellen je Milliliter suspendiert. Die Zellsuspension wurde in Glasgefäße gebracht und stationär bei 36° bis 37⁰C inkubiert. Die an der Glaswand anhaf- * tenden Zellen bildeten einen zusammenhängenden Einschichtzellbogen.

Nach vollständiger Ausbildung des Zellbogens wurde die Schicht erneut mit PBS, welches 0,1 Gewichtsprozent Trypsin und 0,1 Gewichtsprozent EDTA enthielt, dispergiert. Die dispergierten Zellen wurden erneut gesammelt, gespült und in einem Nährmedium mit einer Konzentration von etwa 1 χ 10^ Zellen je Milliliter suspendiert. Die suspendierten Zellen wurden in Kulturgefäße gegeben und stationär bei 36° bis 37°C inkubiert, wobei sich wiederum ein zusammenhängender Einschichtzeilbogen ergab.

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Dieses Verfahren wird als Zellpassage bezeichnet. Zellen, die in der Reihe mehr als 50 mal passiert hatten, werden hier Zellstämme genannt» Das Ausgangsmaterial für das vorliegende Verfahren, nämlich der in den Nieren infizierte HCV, zeigte sich zur Überpflanzung von einer Generation auf eine jüngere Generation der Zellkulturen und zur Beständigkeit in Zellstämmen geeignet. Außerdem wurde die Änderung des beständigen Virus zu einem nichtpathogenen Charakter klar dadurch gezeigt, daß Schweine mit der Kulturflüssigkeit, die bei verschiedenen Stufen der Zelldurchgänge der Zellstämme abgenommen worden waren, inokuliert wurden. Die mit dem Zellstamm 1-1 und dem Zellstamm 3-2 erhaltenen Ergebnisse, die jeweils von zwei infizierten Schweinen herstammen, sind in Tabelle I zusammengefaßt.

Der Zellstamm 1-1 zeigte, falls der HCV bei der vierzigsten Passage oder vorher abgenommen worden war, was einem Kultivierungstag von 375 oder früher entspricht, keine Änderungen hinsichtlich seiner Virulenz. Bei der 66. Passage, was einem Kultivierungstag von 500 entspricht, war der Virus nicht mehr lethal für Schweine. Die Reaktion eines Schweines, das den Virus erhielt, war stark, jedoch erholte es sich wieder und überlebte als im Wachstum zurückgeblieben.

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Die mit einem bei der 80. Passage abgenommenen Virus inokulierten Schweine, Kultivierungstag 300, blieben gesund ohne klinische Symptome. Sämtliche überlebenden Schweine waren beständig gegenüber einem Immunitätstest mit einem virulenten HCV bei 10 MLD. Die Beständigkeit war 10 Tage nach der Inokulierung mit dem abgeschwächten Virus vorhanden .

Das im Zellstamm 3-2 enthaltene HCV war nicht schädlich für Schweine beim 63. Durchgang, Kultivierungstag 500. Die Reaktion des Schweines auf den Virus war schwach. Beim 80. Durchgang (Kultivierungstag 600) war der Virus offensichtlich unschädlich für Schweine. Die überlebenden Tiere Wall

ren beständig gegenüber 10 MLD eines virulenten HCV, und zwar bereits 10 Tage nach der Impfung mit dem abgeschwächten Virus.

Im Gegensatz hierzu war ein HCV, der in nichtpassierten Einschichtzellen verblieb , welche während mindestens 600 Tagen unter Anwendung periodischer Änderungen des Mediums gehalten worden waren, noch lethal für Schweine. Das waren Kulturen, aus denen die Trägerzellstämme gewonnen werden konnten.

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Reaktion von Schweinen auf Schweinecholeravirus, der bei verschiedenen Stufen von Reihenzellpassagen von virustragenden Schweineniereneinschichtzellstämmen abgenommen worden war

Inoculum für Versuchsschweine

Zellstamm- Anzahl der Kultivie- Virus- Anzahl++) bezeichnung Passagen rungstag titer Schweine Reaktion der Schweine
auf das Inoculum

C£> OO O CO

1-1

10 Reaktion der Schweine auf Immunitätstestversuch

151

2,75

x)

24	300	2,50	9
40	375	4,25	13
66	500	3,75	17
80	600	3,75	24
80	600	3,75	25

Tod aufgrund«. Schweinecholera (9) ^;

¹¹ (22)
(16)

Krank,jedoch Erholung
als im Wuchs zurückgeblieben

Verblieb gesund

5 Wochen ,keine Reaktion

co

2 Wenn. ,Keine Reaktion 10 Tage jkeine Reaktion

3-2

20

200

5,00

35	300	1,50	11
44	350	2,83	15
63	500	5,00	19
80	600	5,25	26
80	600	5,25	27

Tod aufgrund Schweine-

cholera (11) ...

überleben mit schwacher 3 Wochen,keine Reakt.

Reaktion

Verblieb gesund 2 Wenn.,keine Reaktion·

" " 10 Tage,keine Reaktion

χ) LOg₁₀TCID,-Q-Virustiter je Inoculum "(1 ml), erhalten nach END-Test

+) Tage bis zum Tod

++) Yorkshire-Schwein, frei von HCV-Antikörper,50 bis 60 Tage alt

+++) Zeitraum zwischen Virusinokulierung u. Ansprechen

auf Immunitätsversuch

Es ergibt sich, daß das in Zellkulturen überlebende HCV hinsichtlich seiner Immunigenität durch Reihenpassagen der Zellen abgeschwächt wird.

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Claims

Patentansprüche

1. Verfahren zur Abschwächung von Schweinecholeravirus in Zellen, die in einer phosphatisch gepufferten, salzhaltigen, 0,1 % Trypsin und 0,1 % EDTA enthaltenden Lösung suspendiert sind, gekennzeichnet durch folgende Schritte:

(1) Beschaffung der zu suspendierenden Zellen aus Nieren oder anderen Schweinecholeravirus tragenden Organen eines sonst gesunden, Schweinecholeravirus hoch-verdächtigen, virusinfizierten Schweines, das frei von einem Schweinecholeravirus-Antikörper ist, welches mit einem virustragenden Stamm eines Standardimmunitätsvirus geimpft wurde, wobei diese Nieren oder andere Organe aseptisch beim Höhepunkt der Infektion entfernt wurden durch Zerstückelung der Niere oder anderer Organe und dispergierter Suspendieruhg in dieser Pufferlösung bei 4°C;

(2)Züchtung, durch stationäre Inkubation bei 36 bis 37°C, von infizierten, in Trypsin dispergierten Zellen in einem

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Nährmedium zur Erlangung eines primären Einschichtzellbogens von in der ersten Passage infizierten Zellen;

(3) Dispergierung des primären Einsehichtzellbogens in dieser phosphatisch gepufferten, salzhaltigen, 0,1 % Trypsin und 0,1 % EDTA enthaltenden Lösung;

(4) Stationäre Inkubat ions Züchtung bei 36 bis 37°C von der ersten Passage dispergierten, infizierten Zellen der Stufe 3 in einem frischen Nährmedium, die darin eine neue Generation von infizierten Zellen erzeugen₃ zu denen der Virus selbst gelangt und in der der Virus weiterbesteht, und Gewinnung hierdurch eines Einschichtzellbogens der zweiten Passage;

(5) Wiederholung sowohl dieser Dispergierstufen in dieser Dispergierlösung als auch dieser frischen Nährmedium-Züchtungsstufen für 50 oder mehr Reihenpassagen, um den Sehweinecholeravirus abzuschwächen, bis der Virus entweder scheinbar für Sehweine unschädlich ist und die mit dem abgeschwächten Virus geimpften Schweine einem Virustragenden Immunitätsvirus widerstehen können*

2. Verfahren nach Anspruch I₃ dadurch gekennzeichnet, daß

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die Dispergierstufe und die Züchtungsstufe jeweils einzeln für ca. 80 Reihenpassagen wiederholt werden,

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