DE1302930B

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Publication number: DE1302930B
Application number: DENDAT1302930D
Authority: DE
Priority date: 1960-09-19
Publication date: 1971-01-28
Also published as: AT242284B

Description

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren, Kollagenmaterial aus natürlichen Ausgangsstoffen wieder herzustellen. Gegenstand der Erfindung ist, aus natürlichem Kollagenmaterial, welches s^pltfiZq- einer Weiterverarbeitung nicht oder nur sehr Schwer _veignet, insbesondere aus Abfall von Leder oder ähnlichen Stoffen, die zur Bildung notwendigen Kollagenfasern so zu gewinnen, daß eine Rückvervfandlung aus diesem Material zu wünschenswertem Kollagenmaterial ermöglicht wird.

Aus chemisch modifiziertem Kollagen besteht beispielsweise Leder. Dieses ist im allgemeinen nur in Form von ganzen Tierhäuten erhältlich. Hersteller von Lederwaren pflegen aus der Tierhaut Stücke der benötigten Größe, Qualität und Lage auszuschneiden, während der Abfall eine verhältnismäßig unwirtschaftliche Verwertung findet. Weitere Schwierigkeiten bei der Verwertung ergeben sich durch die Unterschiede in Qualität, Stärke und Größe der jeweiligen Tierhäute. Auch hierdurch wird die Abfallquote erhöht. Seit langem wurde daher nach einem Verfahren gesucht, den Grundstoff des Leders, Kollagen, in einen Zustand zu bringen, der eine Verwertung und Wiederherstellung zu einer Materialform wie beispielsweise Leder od. ä. ermöglicht.

Die üblicherweise anzuwendenden Lösungsverfahren ergeben bei Kollagen regelmäßig Stoffe nach Art der Gelatine. Dieses ist im allgemeinen irreversibel denaturiert; es ist kein praktisch nutzbares Verfahren bekannt, Gelatine oder ähnliche Stoffe wieder in eine Faserstruktur entsprechend dem nativen Kollagen zu verwandeln und die einzelnen Fasern zu Polymeren mit entsprechenden Quervernetzungen der einzelnen Fasern zu verwandeln.

Es ist bekannt, daß natürliches Kollagen kleine Mengen von sogenanntem Tropokollagen oder auch Prokollagen enthält, welches gelöst und wieder in Strukturen zurück verwandelt werden kann, aus denen natürliches Leder besteht. Dieser zur Wiederherstellung geeignete Anteil des natürlichen Kollagens kann nur mit sorgfältig auf niedrigen Temperaturen gehaltenen Auszügen gewonnen werden; insbesondere muß dazu verhältnismäßig seltenes und insbesondere teures Kollagen-Ausgangsmaterial verwendet werden, wie beispielsweise Kalbshäute, Rindshäute, welche aus reifem Kollagen bestehen, enthalten dagegen oft nur Spuren von sogenanntem Tropokollagen.

Versuche, die Ausbeute an Tropokollagen oder Prokollagen durch Erhöhung der Auszugstemperatur zu steigern, haben nur die völlige Zerstörung des Gewebes zur Folge. Während des unter Anwendung von Hitze vorgenommenen Säure- oder Alkaliauszuges des Kollagens wird dieses unter Bildung von wasserlöslichem Kollagen gewöhnlich irreversibel depolymerisiert, so daß daraus keine dem natürlichen Kollagen entsprechenden Fasern wiedergewonnen werden können.

Es bedarf daher eines Verfahrens mit einem gesteigerten Anteil von tropokollagen- und prokollagenähnlichem Material, ohne daß dabei die strukturelle Wiederherstellbarkeit aufgehoben wird.

Es ist bekannt, tierisches Ausgangsgut mechanisch zu zerkleinern und alsdann eine Aufschwemmung mit bestimmten chemischen Stoffen vorzunehmen, um die so gewonnenen Fasern anschließend wieder zu einer Schrumpfung zu bringen. Dieses Verfahren ermöglicht jedoch nur die Herstellung von natürlichem, kollagenähnlichem, aber nicht gleichwertigem Material in Form dünner Fäden, jedoch nicht in Form von beliebigen Zuständen.

Es ist weiter bekannt, wie z. B. in der USA.-Patentschrift 2 935 431 beschrieben, natürliches Kollagen mit der wäßrigen Lösung einer organischen Säure auszuziehen. Mit diesem Verfahren ist es gelungen, gewisse Mengen rekonstituierbares Kollagen zu gewinnen. Diese Mengen waren aber äußerst begrenzt; auch konnte dieses Verfahren nur bei niedrigen Temperaturen von etwa 5 bis 10° C durchgeführt werden, um eine Umsetzung des Kollagens in einen nicht mehr rekonstituierbaren Status zu vermeiden.

Die Erfindung beruht auf der Erkenntnis, daß durch Auswahl entsprechender organischer Säuren die Extraktionstemperaturen wesentlich gesteigert werden können, beispielsweise bis zu einer Größenordnung von 30 bis 70° C, ohne daß ein Abbau des Kollagens zu Gelatine an Stelle von rekonstituierbarem Kollagen entsteht. Hierdurch können sehr viel größere Mengen rekonstituierbaren Kollagens erhalten werden. Dies wurde bisher für unmöglich gehalten, da angenommen wurde, daß höhere Temperaturen unvermeidlich mit einer Bildung von Gelatine verbunden seien.

Zu diesem Zweck wird vorgeschlagen, natürliches Kollagen mit einer wäßrigen Lösung von Zitronen-, Benzoe- oder Glykolsäure auszuziehen, um einen größeren Teil des Kollagens löslich zu machen, ohne daß das Material in einen nicht mehr rekonstituierbaren Zustand versetzt wird. Anschließend kann das auf diese Weise löslich gemachte Kollagen zu einer Form rekonstruiert werden, die im wesentlichen dem natürlichen Kollagen gleichartig ist.

Dies wird dadurch erreicht, daß die aus Einzelpolypeptidketten bestehenden »Kollagenfasern«, auch Kollagennbrillen genannt, die durch eine Bänderung von etwa 640 A gekennzeichnet sind, erfindungsgemäß bis zu einem solchen Zustand abgebaut werden, der noch nicht zu einer Denaturierung der Fibrillen bzw. Peptidketten geht, sondern der einen Wiederaufbau der ursprünglichen Faserstruktur ermöglicht.

Nach dem erfindungsgemäßen Verfahren kann beispielsweise aus der Haut ausgewachsener Tiere, welche aus reifem Kollagen besteht, bis zu lO°/o des Gewichtes lösliches Kollagen gewonnen werden, welches zur Rückbildung zu vernetzender, hochgradig orientierter Faserstruktur fähig ist und welches die Eigenschaften von Tropokollagen aufweist. Das erfindungsgemäß vorgeschlagene Verfahren ermöglicht es, einen erheblichen Anteil des natürlichen Kollagens in Form von polymerisierten Fasern des Tropokollagens auszufällen und alsdann später zu Kollagenmaterial zurückzuverwandeln. Besonders bedeutsam ist, daß hierbei Temperaturen oberhalb Zimmertemperatur angewandt werden können und daß das gewonnene Kollagen die Eigenschaften des Tropokollagens zeigt.

Erfindungsgemäß wird lösbar gemachtes Kollagen, welches die Eigenschaften von Tropokollagen aufweist, aus natürlichem Kollagen in Gegenwart von Zitronen-, Benzoe- oder Glykolsäure bei Temperaturen von etwa 30 bis 70° C gewonnen. Als kollagenhaltiges Material können hierfür Felle, Häute, Sehnen, Ossein u. dgl. benutzt werden. Vorzugsweise wird Bullenhaut von ausgewachsenen Tieren, aus rei-

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fern Kollagen bestehend, oder Hautabfall, als Rohmaterial verwendet. Das Ausgangsmaterial kann dabei verschiedenen Vorbehandlungen unterworfen werden, wie Dehydrieren, Salzen oder ähnlichem. Zweckmäßigerweise ist das Kollagen-Ausgangsmaterial von Häuten, Aas und Kot zu befreien, zu reinigen und zu waschen, bevor es erfindungsgemäß benutzt wird. Anschließend wird das Kollagenmaterial in bekannter Weise zerkleinert, beispielsweise durch Verarbeitung in einer Papiermühle mit genügend Wasser und ausreichender Vermischung. Hierdurch wird ein leichtflüssiger Brei gewonnen. Vorzuziehen ist die Verwendung eines Holländers, bei dem die Länge der Kollagenfasern nicht merklich verkürzt wird.

Nach der mechanischen Zerkleinerung wird der Kollagenbrei mit Hilfe von Zitronen- Benzoe- oder Glykolsäure lösbar gemacht. Vorzuziehen ist, den Fasern zunächst das im Vermahlungsprozeß zugesetzte Wasser zu entziehen, was beispielsweise durch Auspressen zwischen Gummirollen erfolgen kann. Die genannten Säuren reagieren vermutlich während des Erhitzungs- und Lösbarmachungsprozesses mit dem Kollagen und verhindern damit eine Reaktion des Proteins mit dem vorhandenen Wasser. Die Kollagenfaserfragmente können daher nicht kollabieren; sie behalten auf diese Weise die Eigenschaft, sich zu nativen quervernetzten Strukturen ausfällen zu lassen.

Während der Lösbarmachung nach dem vorgeschlagenen Verfahren beträgt die Temperatur der Reaktionsmischung zwischen 30 und 70° C, wobei die besten Ergebnisse mit Temperaturen ungefähr zwischen 30 und 6O⁰C erzielt werden. Liegt die Temperatur erheblich unter Zimmerwärme, so bleibt die Ausbeute an löslichem, ausfällbarem Kollagen sehr gering. Temperaturen über 7O⁰C sollten andererseits vermieden werden, um die dann erfolgende Bildung von Gelatine in großer Menge auszuschalten.

Bei richtiger Erhitzung und Versäuerung tritt die Fasermasse in einen Zustand, der als fasrige Plastizität beschrieben werden kann. Hält man sie darin für die Dauer von 30 bis 60 Minuten, so wird eine hinreichende und angemessene Lösbarkeit erzielt. Niedrigere Säuregrade und Temperaturen erfordern langere Zeiten, z. B. eine Temperatur von 30⁰C bei einem pH-Wert von ungefähr 3,0 erfordert eine Reaktionszeit von etwa 3 bis 4 Stunden. Während dieses Verfahrensabschnittes soll die Fasermasse zweckmäßigerweise umgerührt und vermischt werden, wobei eine Rührschnecke oder ähnliche Apparate Anwendung finden können.

Der so gewonnene lösliche Teil der Fasermasse wird alsdann ausgezogen und zu haut- oder folienähnlichen Strukturen ausgefällt, ohne daß unbehandelte Fasern beigemischt werden.

Eines der bekannten Verfahren zur Ausfällung der löslichen tropokollagenartigen Kollagenfraktion wie Gerinnen durch Hitze, Neutralisieren oder Aussalzen der löslichen Bestandteile mit irgendeinem Reagens kann zur Anwendung gelangen. Gute Ergebnisse lassen sich in einer Verbindung von Neutralisation und Aussalzen erzielen. Dies kann leicht dadurch erreicht werden, daß man die Faserstruktur einer halbgesättigten Ammoniumsulfatlösung aussetzt, die mit Ammoniumhydroxyd basisch gemacht ist. Die so gewonnene hautartige Struktur läßt sich dann weiter wie typisch natürliches Kollagen behandeln.

Die erfindungsgemäß ausgefällten, tropokollageartige Fasern enthaltenden Kollagenprodukte können zu den verschiedensten Erzeugnissen, wie Fäden, Folien oder anderen Formen, weiterbehandelt werden.

Die nach dem beschriebenen Verfahren hergestellten tropokollagenartigen Fasern haben die folgenden Eigenschaften:

Unter dem Elektronenmikroskop zeigen sie die typische Querbänderung des natürlichen Kollagens mit einer Periodizität von ungefähr 600 bis 650 Ä. Das erfindungsgemäß hergestellte, tropokollagenartige Fasern enthaltene Material besteht aus einem ineinanderverflochtenen dreidimensionalen Netzwerk von Fasern, die einen reversiblen Zusammenhalt zeigen und in Wasser mit einem pH-Wert von ungefähr 4 bis 8 löslich sind. Außerdem haben die so hergestellten Materialien eine verhältnismäßig hohe Zugfestigkeit in nassem Zustand.

Für die Anwendung der Erfindung seien die folgenden Beispiele dargestellt:

Beispiel I

Kollagenstücke aus Bullen-Corium in Würfeln von 1 cm Seitenlänge wurden in 0,1 m Zitronensäure bei Zimmertemperatur suspendiert. Nachdem sie von der Zitronensäure durchzogen waren, wurde die Mischung unter Umrühren über 1 Stunde auf 50° C erhitzt. Das Material löste sich zum größten Teil unter Rückstand von wenigen Stücken einzelner Fasern. Die ganze Mischung wurde dann in einem Waring-Mischer vermischt, um einen einheitlichen Dispersionszustand zu erreichen. Der so erhaltene Brei wurde auf Zimmertemperatur abgekühlt und über eine Düse auf ein Transportband ausgepreßt, das die Masse durch eine halbgesättigte Ammoniumsulfatlösung befördert, deren pH-Wert mit Ammoniumhydroxyd auf 8,5 gehalten wurde. Der Transportweg durch das Bad betrug etwa 1 m; danach wurde die Fasermasse auf ein zweites Förderband übertragen, das sie in ein Bad von kaltem Wasser brachte. Sobald das Salz ausgewaschen war, wurde die Fasermasse herausgenommen und in einen Trockenturm gebracht.

Beispiel II

Gereinigtes und in Würfel geschnittenes Bullen-Corium wurde bei Zimmertemperatur in 0,1 m Glykolsäure suspendiert. Das gesäuerte Kollagen wurde unter ständigem Rühren auf 55⁰C erhitzt und für 1 Stunde auf dieser Temperatur gehalten. Die Kollagenmischung wurde abzentrifugiert und der Überlauf in einem flachen Gefäß für 30 Minuten auf 4° C abgekühlt. Auf das dadurch gebildete, gekühlte Kollagengel wurde eine halbgesättigte Ammoniumsulfatlösung aufgegossen, die mit Ammoniumhydroxyd auf pH 8,1 eingestellt war. Die sich nach einer halben Stunde bei Zimmertemperatur ergebende Folie wurde gegen Leitungswasser dialysiert, um das Ammoniumsulfat zu entfernen. Das Ergebnis war eine Folie von hoher Festigkeit in nassem Zustand, die sich gerben ließ.

Beispiel III

Corium von Bullenhaut wurde in 0,15 m Zitronensäure suspendiert und auf 50° C über 1 Stunde erhitzt. Das löslich gemachte Kollagen wurde in einen Dialysebeutel gefüllt und über Nacht gegen Leitungswasser dialysiert. Ein festes Gel, das sich in dem

Dialysebeutel gebildet hatte, wurde an der Luft getrocknet und formte sich zu einem röhrenförmigen Gebilde von faseriger Struktur und hoher Festigkeit, das bei der Untersuchung die Feinstruktur des nativen Kollagens zeigte.

Beispiel VI

Corium aus Bullenhaut, das nach Beispiel II ausgezogen war, wobei 0,025 m Zitronensäure bei 50° C und einer Zeitdauer von einer Stunde Verwendung fand, ergab ungefähr 1% lösbares und wiederherstellbares Kollagen.

Beispiel V

Bullenhaut wurde für die Dauer von 30 Minuten bei 60⁰C mit 0,1 m Zitronensäure ausgezogen. Auf diese Weise erhöhte sich der Anfall an wiederherstellbarem Kollagen auf 10%. Die wiederhergestellten Fasern zeigten die typische 640-A-Bänderung der nativen Kollagenfasern.

Eine Anwendungsform der Erfindung, die vor allem in Verbindung mit der Darstellung zu gerbender wiederhergestellter Kollagenstrukturen zweckmäßig ist, schließt die Verwendung von Benzoesäure ein, die bei Erhitzung und Löslichmachen des Kollagenmaterials anwesend sein muß. Es hat sich herausgestellt, daß die Benzoesäure nicht nur für die Kontrolle des Kollagenauszuges in der Verfahrensstufe des Löslichmachens geeignet ist, sondern daß sie auch den nachfolgenden Gerbprozeß günstig beeinflußt. Kollagenfasern, die erfindungsgemäß mit einer Lösung von 0,1 bis 2 Gewichtsprozent Benzoesäure behandelt wurden, zeigen nämlich eine wesentlieh erhöhte Aufnahmefähigkeit für die Chromgerbung. Unter dem Elektronenmikroskop zeigt sich, daß bei den mit Benzoesäure behandelten Fasern durch die Säure Längssegmente geöffnet werden, wodurch reaktive Oberflächen geschaffen werden, deren Vorhandensein die Reaktion der Chromgerbung fördert.

Die folgenden Beispiele erläutern die Anwendung der Erfindung unter Benutzung von Benzoesäure.

Beispiel VI

Das Ausgangsmaterial waren Kollagenfasern, die aus der Lederhautschicht frischer, ungekalkter Bullenhäute durch mechanisches Zerkleinern des Coriums in einer Papiermühle zu einzelnen Fasern gewonnen waren. Dabei wurde das Corium in Form eines wäßrigen Breies in der Mühle verarbeitet, der anschließend entwässert und getrocknet wurde. Die getrockneten Fasern wurden in O,25°/oiger Benzoesäure bei 50⁰C für die Dauer von 15 Minuten unter kräftigem Umrühren dispergiert, wobei der Anteil an festen Bestandteilen auf ungefähr 20% gehalten wurde. Nach dem Mischen wurden Kollagenfasern von einer Stärke von 6 mm ausgewalzt, während ihre Temperatur auf 50° C gehalten wurde. Die Folien wurden anschließend in den Kühlraum gebracht und blieben dort bei 4° C über 30 Minuten. Danach wurden sie in einem Bad von halbgesättigtem (NHJ₂SO₄, das mit NH₄OH auf pH 8,1 eingestellt war, ausgefällt, und das Kollagen wurde wiederhergestellt. Nachdem dies nach ungefähr einer Stunde abgeschlossen war, wurden die Folien in fließendem Leitungswasser gewaschen. Ein schmaler Streifen wurde davon entnommen und auf Wärmeschrumpfung in einem Theis-Schrumpfungsmesser untersucht, er riß aber bei 62° C.

Untersuchungen der mit Benzoesäure behandelten Kollagenfasern haben das sehr interessante Phänomen erkennen lassen, daß die Säure entlang der Fasern Segmente aufschließt und dadurch Reaktionsoberflächen erzeugt, die die Chromgerbung fördern.

Claims

Patentanspruch:

Verfahren zur Gewinnung von rekonstituiertem Kollagenmaterial durch Extraktion von natürlichem Kollagen mit einer organische Säure, wie Zitronensäure, enthaltenden wäßrigen Lösung mit einem pH-Wert von 2,5 bis 4,0, dadurch gekennzeichnet, daß man das zerkleinerte Ausgangsmaterial mit der wäßrigen Lösung von Zitronensäure, Benzoesäure oder Glykolsäure bei einer Temperatur von etwa 30 bis 70° C extrahiert und das extrahierte Kollagen aus dem Extrakt in an sich bekannter Weise isoliert.