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Verfahren zur Extraktion von nativem Kollagen
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Extraktion von nativem Kollagen aus tierischem Hautmaterial mit Säuren.
Leder, das aus chemisch modifiziertem Kollagen besteht, steht im allgemeinen nur in Form von Stücken aus unversehrter tierischer Haut zur Verfügung. Die Hersteller von Lederartikeln schneiden Stücke gewünschter Form, Grösse und Qualität aus den Hautstücken aus und verwerfen den Rest. Der dabei entstehende Abfall wird in verhältnismässig unwirtschaftlicher Weise verwertet. Durch Unterschiede in Qualität, Dicke und Form der Stücke natürlichen Leders ergeben sich weitere Schwierigkeiten und eine Erhöhung der Menge des Abfalles bei den Herstellern. Es ist schon vor langer Zeit erkannt worden, dass es vorteilhaft wäre, wenn man Kollagen so auflösen könnte, dass das löslich gemachte Kollagen für die Rückverwandlung in ein einheitliches Lederstück geeignet ist. So wird beispielsweise in der österr.
Patentschrift Nr. 105790 zur Herstellung von Kunstleder vorgeschlagen, die bei der Lederbereitung abfallenden Teile, das sogenannte Leimfleisch, einer Behandlung mit Erdalkalilösung, namentlich Barythydrat, bei bestimmten Temperaturen zu unterwerfen, bei denen eine Lösung dieser Substanzen eintritt. Aus diesen Lösungen sollen dann durch schwache Säuren, wie Gerbsäure, Milchsäure, Ameisensäure, Kohlensäure u. dgl., die Eiweissstoffe wieder abgeschieden werden. Das hiebei erhaltene Eiweiss soll auf ein Gewebe aufgetragen, mittels der bei der Lederbereitung üblichen Gerbstoffe gegerbt und so in lederartige Substanz umgewandelt werden.
Die Behandlung des Kollagens zwecks Auflösung desselben liefert im allgemeinen Stoffe wie Gelatine.
Gelatine ist stets irreversibel denaturiert, und es ist keine praktisch anwendbare Methode bekannt, mitwelcher eine Repolymerisation oder Rückwandlung von Gelatine od. ähnl. Materialien in naturähnliche Fasergebilde, wie sie im Leder vorliegen, erreicht werden könnte.
Seit einiger Zeit ist es wissenschaftlich erwiesen, dass üblicherweise vorkommendes Kollagen sehr geringe Mengen eines Stoffes enthält, der als Tropokollagen oder Prokollagen bezeichnet wird und der löslich gemacht und in naturähnliche Fasergebilde, wie sie im Leder vorliegen, rückgewandelt werden kann. Die regenerierbare Fraktion des nativen Kollagens kann jedoch nur durch ein sorgfältig geregeltes Niedrigtemperaturextraktionsverfahren erhalten werden. So wird beispielsweise gemäss der USA-Patentschrift Nr. 2, 934, 446 die Extraktion bei einer Temperatur durchgeführt, die nicht über 5 C liegt. Die gleiche Temperatur wird beim Verfahren gemäss der USA-Patentschrift Nr. 2, 934, 447 bevorzugt.
Da die zuletzt genannte Patentschrift die Behandlung von geleimten Häuten betrifft, ist ein vorhergehender Behandlungsschritt unter Einweichen in Säure vorgesehen, wobei als Säure vorzugsweise Essigsäure, aber auch Ameisensäure, Propionsäure, Citronensäure, Phosphorsäure, Salzsäure, Schwefelsäure u. a. übliche organische Säuren und Mineralsäuren verwendet werden können. Dabei sollen, wie angegeben ist, die Hautmaterialien eine Temperatur unter 25 C aufweisen und vorzugsweise eine solche in der Nähe von 0 C. Zur Extraktion wird weitere Säure zugesetzt, und die Masse wird auf eine Temperatur unter 5 C gebracht, worauf der Extrakt bei einer Temperatur von 0 bis 5 C neutralisiert wird. Dabei müssen relativ seltene und teure Kollagenausgangsmaterialien, wie Kalbshäute, verwendet werden.
Bei Verwendung der Haut von ausgewachsenen Rindern erhält man bei der Extraktion oft lediglich Spuren des Tropokollagens.
Beim Niedrigtemperaturverfahren kann nur eine kleine Menge rückwandelbares Kollagen gebildet werden. So kann z. B. unter Verwendung von Essigsäure bei einer Temperatur von 5 C etwa 1% des Kollagens in löslich gemachtes, rückwandelbares Kollagen übergeführt werden. Eine Ausbeute von 1% ist jedoch zu gering, um von irgendwelchem praktischen Wert zu sein.
Versuche zur Erhöhung der Ausbeuten des Tropokollagens oder Prokollagens durch Erhöhung der bei Extraktionsverfahren angewendeten Temperatur haben nur zu einer vollständigen Zerstörung des Materials geführt.
Die vorliegende Erfindung zielt auf die Erhöhung der Ausbeute an tropokollagen ähnlichen oder prokollagen ähnlichen Materialien aus tierischem Hautmaterial ohne Zerstörung der Regenerierbarkeit dieser Substanzen ab und ermöglicht es, aus Häuten erwachsener Ochsen bis zu 10 Gew.-% löslich gemachtes Kollagen zu extrahieren, das zur Rückwandlung in vernetzte, hochorientierte Kollagenfasern geeignet ist und das die Eigenschaften des Tropokollagens aufweist.
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Gemäss der Erfindung wird zur Extraktion von nativem Kollagen aus tierischem Hautmaterial mit Säuren die Kombination der folgenden Massnahmen angewendet : 1. Extraktion des nativen Kollagens mit einer wässerigen Lösung von Citronen-, Glykol- oder Benzoesäure, 2. Durchführung der Extraktion bei einer Temperatur von mehr als 300 C, aber nicht wesentlich über 60 C, vorzugsweise bei etwa 50 bis 55 C, wobei man erhöhte Ausbeuten von löslich gemachtem, in natives Kollagen rückwandelbarem Kollagen erhält.
Als Ausgangsmaterialien für das Verfahren gemäss der Erfindung sind kollagenhaltige Stoffe verschiedener Herkunft geeignet. Beispiele solcher Materialien umfassen Häute, Bindegewebe, Sehnen, Knochen usw. Vorzugsweise werden Ochsenhäute oder Abfälle der Ochsenhaut als Ausgangsmaterial eingesetzt.
Es kann auch Kollagen verwendet werden, das verschiedenen Vorbehandlungen, wie Entwässerung, Salzbehandlung u. dgl., unterworfen worden ist. Am besten wird das kollagenhaltige Material vor der Behandlung enthaart, vom Fleisch befreit sowie sorgfältig gereinigt und gewaschen.
Zur Vorbereitung des tierischen Hautmaterials für das Extraktionsverfahren gemäss der Erfindung empfiehlt es sich, das Hautmaterial durch verschiedene an sich bekannte Verfahren zu zerkleinern, wie z. B. durch Schlagen, Mahlen usw. Eine befriedigende Methode zur Erreichung dieser Zerkleinerung besteht im Einbringen des Hautmaterials in eine Papierherstellungsmaschine unter Zusatz von genügend Wasser und Durchführung eines ausreichenden Mischens und Schlagen, damit eine frei fliessende Aufschlämmung erhalten wird. Ein bevorzugter Typus der Apparatur ist ein bei der Papierherstellung benützter Holländer, in welchem ein zufriedenstellender Schlamm ohne nennenswerte Verringerung der Länge der nativen Fasern erhalten wird.
Vorzugsweise wird vor der Durchführung der Extraktion des nativen Kollagens aus den Fasern zuerst ein Teil jenes Wassers entfernt, welches während des Schlagprozesses zugesetzt worden ist. Das Ausdrücken der Fasern unter Verwendung von Gummiwalzen ist eine der geeigneten Methoden.
Es wird angenommen, dass die Citronen-, Glykol- und Benzoesäure bei der Durchführung des Extraktionsverfahrens gemäss der Erfindung mit den Kollagenfasern reagieren und dabei eine Reaktion des Proteins mit dem vorhandenen Wasser verhindern ; als Folge davon können die Kollagenfaserfragmente nicht weiter abgebaut werden. Die gelösten Fasern behalten dabei ihre Eignung zur erneuten Fällung in einer nativen, vernetzten, polymeren Form bei.
Die Extraktion des nativen Kollagens mit einer wässerigen Lösung von Benzoesäure ist insbesondere im Hinblick auf die Herstellung von regenerierten, zum Gerben bestimmten Kollagenprodukten vorteilhaft. Es wurde gefunden, dass Benzoesäure nicht nur bei der Extraktion des Kollagens wirksam ist, sondern auch bei der späteren Gerbbehandlung vorteilhaft mitwirkt.
Die Konzentration der Säure soll ausreichend sein, um in der Extraktionsmischung aus Kollagen und Säurelösung einen pH-Wert von etwa 2, 5 bis 4, 0 einzustellen. Anders ausgedrückt wird dieser pH-Wert im allgemeinen dann erhalten werden, wenn in Abhängigkeit von der einzelnen jeweils verwendeten Säure oder des benutzten Säuregemisches eine etwa 0, 01- bis 1-molare Säurelösung angewendet wird. Vorzugsweise werden Säurekonzentrationen angewendet, die der Extraktionsmischung einen pH-Wert von etwa 3, 0-3, 5 verleihen.
Wenn Aufschlämmungen extrahiert werden, die unter Bildung nasser Fasern aus etwa 25% Protein und 75% Wasser entwässert worden sind, wird aus 1 Teil Kollagenfasern je etwa 1 Gew.-Teile 0, 1-molarer Citronensäure eine Extraktionsmischung mit zufriedenstellender Acidität erhalten.
Bei der Extraktion des nativen Kollagens nach dem Verfahren gemäss der Erfindung wird die Fasermasse aus Hautmaterial einen physikalischen Zustand annehmen, der als "zähe Plastizität" bezeichnet werden kann. Für eine entsprechende Solubilisierung des nativen Kollagens ist es meist ausreichend, wenn das warme angesäuerte Kollagen 30-60 min mit den wässerigen Lösungen von Citronen-, Glykol- oder Benzoesäure behandelt wird. Geringere Säuregrade und Temperaturen an der unteren Grenze des erfindunggemäss vorgesehenen Temperaturbereiches können jedoch längere Behandlungszeiten erforderlich machen ; z. B. kann die Anwendung einer Temperatur von etwa 30 C bei einem pH-Wert von 3, 0 eine 3-bis 4stündige Extraktionszeit notwendig machen.
Der Faserteig wird während der Solubilisierung vorzugsweise gerührt und gemischt, wobei ein Schraubenmischer gute Ergebnisse liefert.
Das extrahierte in natives Kollagen rückwandelbare Kollagen kann als solches als haut- oder folien- ähnliches Gebilde wiedergefällt werden. Vorzugsweise wird aber der das extrahierte, in natives Kollagen rückwandelbare Kollagen enthaltende Faserteig mit nassen Fasern gemischt, die lediglich mechanisch zerteilt worden sind. Vorzugsweise werden die feuchten Fasern schwach gegerbt, indem sie mit einer Lösung von Formaldehyd mit einer Konzentration von etwa 0, 3 bis 3 Gew.-% in Berührung gebracht werden. Durch Vermischen von etwa 15 Gew.-% Faserteig, der löslich gemachtes, in natives Kollagen rückwandelbares Kollagen enthält, mit etwa 85 Gew.-% schwach gegerbten, feuchten Fasern und Zusatz einer entsprechenden Menge Wasser erhält man eine ausgezeichnete Mischung für die Herstellung regenerierter Gebilde, wie Folien, Fäden und verschiedene andere Produkte.
Die feuchte Mischung kann dann in gewünschter Weise verformt und an einem kühlen Ort kurze Zeit, z. B. 30 min bei 4 C, stehengelassen werden. Die Formkörper, wie Folien, können dann durch irgendwelche der bekannten Methoden, die eine Wiederfällung der löslichen, dem Tropokollagen ähnlichen Kollagenfraktionen ermöglichen, zu stabilen, vernetzten Strukturen wiedervereinigt werden. Diese Methoden umfassen die Hitzekoagulation, Neutralisation und das Aussalzen der aus dem tierischen Hautmaterial gelösten Bestandteile mit irgendeinem der verschiedenen
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erhalten worden sind, zeigen im Elektronenmikroskop die typische Kreuzriefung des nativen Kollagens mit einer Axialperiodizität von etwa 600 bis 650 A.
Beispiel 1 : 1200 g frisches Ochsencorium werden in einer Papierschlagmühle unter Zusatz von Wasser geschlagen. Der geschlagene Kollagenschlamm wird entwässert, indem die Fasern zwischen Gummiwalzen ausgequetscht werden, wobei nasse Fasern mit einem Gehalt von 25% Protein und 75% Wasser erhalten werden. 1200 g der nassen Fasern werden zu 1800 cm3 0, 1-molarer Citronensäurelösung gegeben. Die Extraktionsmischung, die einen pH-Wert von 3, 5 aufweist, wird 30 min bei einer Temperatur von 50 C kontinuierlich in einem Schraubenmischer abgemischt. 450 g des säurebehandelten Faserteiges gibt man zu
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Wasser. Das Faser-Wasser-Gemisch wird 30 min abgemischt und zu Folien ausgewalzt, die eine Dicke von etwa 0, 4 mm aufweisen.
Die Folien werden in einem kühlen Raum bei etwa 4 C 30 min gelagert, worauf man sie in eine halbgesättigte Ammonsulfatlösung gibt, die unter Zusatz von Ammoniumhydroxyd auf einen pH-Wert von 8, 1 eingestellt worden war. Die Ammoniumsulfätlösung wird durch Zugabe von 1100cm* Wasser zu 0, 45 kg Ammoniumsulfat erhalten. Nach 4 h dauerndem Eintauchen der Folien werden diese mit Wasser gewaschen und mit Chrom gegerbt, wobei ein hochfestes, lederähnliches Produkt erhalten wird.
Beispiel 2 : Rindercorium-Kollagenstücke mit etwa 1 cm Seitenlänge werden in 0, 1-molarer Citronensäure bei Zimmertemperatur verteilt. Nachdem die Kollagenstücke mit der Citronensäurelösung durchnässt worden sind, wird die Mischung unter Rühren 1 h auf 50 C erhitzt. Es löst sich der überwiegende Teil des Materials auf, wobei nur einige wenige Stücke einzelner Fasern zurückbleiben. Der gesamte Schlamm wird in einem Waringmischer abgemischt, um eine gleichmässige Dispersion herzustellen. Dieser Schlamm wird dann auf Zimmertemperatur abgekühlt und auf ein laufendes Förderband ausgepresst, welches den Schlamm durch eine halbgesättigte Ammonsulfatlösung führt. Mit Ammoniumhydroxyd wird im Bad ein pH-Wert von 8, 5 aufrechterhalten.
Die ausgepressten Fasern werden über eine Strecke von mehreren dm oder m durch das Bad geführt und dann von einem zweiten Förderband aufgenommen und in ein Kaltwasserbad gebracht, das auf niedriger Ionenstärke gehalten wird. Sobald das Salz entfernt ist, werden die Fasern aus dem Wasser genommen und in einen Trockenturm gebracht.
Beispiel 3 : Rindercorium, das gereinigt und würflig geschnitten worden war, wird in 0, 1-molarer Glykolsäure bei Zimmertemperatur verteilt. Das angesäuerte Kollagen wird unter gleichmässigem Rühren auf 55 C erhitzt und dann 1 h bei dieser Temperatur belassen. Das kollagenartige Gemisch wird zentrifugiert und die überstehende Flüssigkeit abgetrennt. Die überstehende Flüssigkeit wird in eine Pfanne gebracht und 30 min auf 40 C abgekühlt, worauf eine halbgesättigte Ammonsulfatlösung, die mit Ammoniumhydroxyd auf einen pH-Wert von 8, 1 eingestellt worden war, auf das entstehende gekühlte Kollagengel geschichtet wird. Nach einstündigem Stehen bei Zimmertemperatur werden die gebildeten Folien zur Entfernung des Ammoniumsulfat gegen Leitungswasser dialysiert.
Man erhält eine hochnassfeste Folie, die zum Gerben geeignet ist.
Beispiel 4 : Ochsenlederhaut wird in 0, 15-molarer Citronensäure suspendiert und 1 h auf 50 C erhitzt. Das solubilisierte Kollagen wird in einen Dialysebeutel gebracht und über Nacht gegen kaltes Leitungswasser dialysiert. Im Behälter bildet sich ein steifes Gel, das an der Luft unter Bildung eines faserartigen röhrenförmigen Gebildes mit hoher Nassfestigkeit getrocknet wurde ; es zeigt bei Prüfung die Feinstruktur des nativen Kollagens.
Beispiel 5 : Ochsenhaut wird mit 0, 1-molarer Citronensäurelösung bei 600 C 30 min extrahiert. Aus dem solubilisierten Kollagen erhält man eine 10%ige Ausbeute an regenerierbarem Kollagen. Die regenerierten Fasern zeigen die typischen 640A-Banden der nativen Kollagenfasern.
Beispiel 6 : Es wird das Corium frischer, ungekalkter Viehhäute verwendet. Das Corium wird nach mechanischer Zerteilung in Wasser aufgeschlämmt und in einer Schlagmühle behandelt. Die entstehenden Fasern werden anschliessend zur Schaffung des Ausgangsmaterials entwässert und getrocknet. Die getrockneten Fasern werden 15 min bei 50 C mit 25%iger Benzoesäure extrahiert, worauf man kräftig rührt und den Feststoffgehalt auf etwa 20% einstellt. Nach dem Durchmischen wird das Produkt auf eine Dicke von etwa 6 mm ausgewalzt, wobei eine Temperatur von etwa 50 C aufrechterhalten wird. Die ausgewalzten Streifen werden in einen Kühlraum (4 C) gebracht und dort 30 min belassen, worauf man sie in einem halbgesättigten Ammonsulfatbad, das mit Ammoniumhydroxyd auf einen pH-Wert von 8, 1 eingestellt ist, fällt.
Nachdem die Fällung und Regenerierung beendet ist (etwa nach 1 h), werden die Streifen in fliessendem Leitungswasser gewaschen. Es wird ein Streifen herausgenommen und auf Wärmeschrumpfung in einem Theis-Schrumpfungsmesser geprüft ; er bricht jedoch bei 62 C. Nach 2stündigem Waschen werden die Streifen einer wässerigen Chromgerbelösung (1% Cr203 + 2% COONa) ausgesetzt. Nach regelmässigen Abständen werden Kollagenstreifen dem Gerbbad entnommen, und es werden Schrumpfungsmessungen durchgeführt. Die Ergebnisse sind nachstehend angegeben.
Wirkung der Schrumpftemperatur auf die Chromaufnahme :
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<tb>
<tb> Behandlung <SEP> Ts <SEP> in <SEP> oC <SEP> : <SEP>
<tb> in <SEP> Stunden <SEP> : <SEP>
<tb> 1 <SEP> 72,5
<tb> 2 <SEP> 78, <SEP> 5 <SEP>
<tb> 3 <SEP> 80, <SEP> 0 <SEP>
<tb>
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Ausgiebiges Waschen der Streifen vor dem Gerben beeinflusst die Chromaufnahme oder die Schrumpftemperatur nicht wesentlich. Das während der Neutralisation in den Streifen gebildete Salz wirkt offenbar während des Gerbens als entschwellendes Mittel. Die Schrumpftemperatur kann erhöht werden, wenn das Kollagen aus dem Gerbbad entfernt und zur Verhinderung einer Oberflächenaustrocknung abgedeckt wird.
Dies erhöht die Fixierung des Chroms und dementsprechend die Schrumpftemperatur.
Die elektronenmikroskopische Prüfung des mit Benzoesäure behandelten Kollagens zeigt, dass durch die Säure Segmente längs der Faser geöffnet und so reaktive Stellen geschaffen werden, die auf die Chromgerbungsreaktion beschleunigend wirken.