DD210455A1

DD210455A1 - Verfahren zur herstellung der salze von s-adenosilmehtionin

Info

Publication number: DD210455A1
Application number: DD82242759A
Authority: DD
Inventors: Federico Gennari
Original assignee: Bioresearch Spa
Priority date: 1981-08-24
Filing date: 1982-08-24
Publication date: 1984-06-13
Also published as: YU42793B; DK149861B; FI72525C; FI822944L; EP0073376B1; EP0073376A1; YU190882A; CZ279834B6; US4543408A; AU552466B2; CA1201434A; EP0073376B2; ATE16394T1; GR76862B; CZ614282A3; IT8123603A0; NZ201679A; IL66584A0; JPH0149274B2; HU186108B

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Salzen des S-Adenosil-methionins fuer die Anwendung als Arzneimittel auf zahlreichen Gebieten der Humanmedizin. Ziel der Erfindung ist die Bereitstellung von solchen Salzen, d. auch bei hoeheren Temperaturen u. waehrend praktisch unbegrenzter Zeitraeume stabil sind. Erfindungsgemaess werden Salze von S-Adenosil-methionin hergestellt, die der Formel entsprechen, wobei X ein Saeureaequivalent einer starken Mineralsaeure mit einem pK-Wert von weniger als 2,5 und n 4, 5 oder 6 sind.

Description

Verfahren zur Herstellung der Salze von S-Adenosilmethionln

Anwendungsgebiet der Erfindung;

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung einer neuen Klasse von Salzen d?a S-Adeno3_;ilaethionins (SAMe), die bei hohen Temperaturen und während praktisch unbegrenzter Zeiträume stabil sind.

Die erfindungsgemäS hergestellten- Verbindungen werden ange wandt als Arzneimittel in der Humanmedizin«

Charakteristik der bekannten technischen Lö'&ag/

Es ist bekannt, daß das S-Adenosil-methionin ein Produkt natürlichen Ursprungs ..ist-i, das in allen, lebenden Organismen vorhanden 1st, in denen es mit Hilfe eines spezifischen Enayms aktiv synthetisiert wirdj es besitzt die folgende Pormel

?^H3

CH-GH-GH-CH-GH₂-S-CH₀-CH₀-CH-COo"

OH OH ^{! +} 0

Das SAMe nimmt an zahlreichen metabolischen Prozessen von

D 3 U ~²~ 31.3.1983

WP O 07 D/242 759/0

61. 339/11

grundlegender Wichtigkeit für den menschlichen Organismas teil, deshalb iat sein fehlen die Ursache von vielen organischen Pehlfunktionen*

Obwohl- die biologische Bedeutung dieses Produktes bereits seit Jahrzehnten bekannt iat, besteht die Möglichkeit,- Versuche· durchzuführen und es dann als Pharmazeutika zu verwenden, erst in den letzten Jahren, da es bei Iemperat aren über O ⁰G äußerst instabil ist«

Tatsächlich gelang es erst 1975» ein Salz von SAMe, das bei 25 ⁰G ausreichend stabil ist (US-PS 3 393 999), und schließlich einige Salsa mit guter Stabilität bei 45 ⁰G (US-?Sen 3-954-726 und 4 057 686) herzustellen*

Insbesondere die_:US-PS 3 893 999 beschreibt das Tri-p-· toiuol-sulfonat von SiMe, die US-PS 3 954 726. das Disulfatdi-p-!*^:oluolsalÄoa.at-von SJtMa₅₁ die US-PS 4" 057 68Ä eine Gruppe von Salzen von SAMe, die allgemein als SAHe.«4RSO.,H₀ SAMeο3SSO-H angegeben werden können, worin RSO^H ein Äquivalent einer ^ulfonsäurs i3t, die partiell mit dem SchwefelsäureäquiTalent substituiert sein kann* Man kann weder erklären,, warum nur die spezifischen beanspruchten Salsa stabil sind, wenn die gamäB dem Stand der-'Technik hergestellten Salze des SAMe (und zwar das Honochlorid und das Diaulfat) höchstens Stabilität während eines begrenzten Zeitraumes erreichten, wenn, sie bei 4 ⁰G gehalten wurden, noch warum das "Sri-p-toluolsulfonat nur bis 25 ⁰G stabil war, wohingegen das Disulfat~di-p-toluolauifonat bis 45 ⁰G stabil blieb«

242753 O "³" 31.3.1983

WP G 07 D/242 759/0 61 339/11

Ziel der Srfindana;

Ziel der Erfindung ist die Bereitstellung von Salzen des S-Adenosil-aethionins, die auch bei höheren Temperaturen unbegrenzte Zeit stabil sind»

Darlegung des Wesena der Erfindung

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, derart stabile Salze des S-Adenosil-methionins sowie Verfahren au ihrer Herstellung aufzufinden«

Es wurde nun völlig überraschenderweise gefunden» und dies ist Gegenstand der vorliegenden Erfindung, daß man stabile Salae des SAMe dannerhält, wenn man das SAMe- mit 4 bis 6 Mol einer starken anorganischen Säure mit einem p£-Wert von weniger als 2,5 in ein SaIs überführt»

Dies wurde ganz überraschenderweise festgestellt and bildet den Gegenstand der vorliegenden Erfindung: Sin Verfahren zur Herstellung von stabilen SAMs-Saisen, worin SAMe mit 4 bis 6 Mol einer starken anorganischen Saure mit einem pS-Wert kleiner als 2,5 in ein SaIa überführt wird»

Insbesondere wurde überraschenderweise gefunden, daJ3 man, wenn man das 3AMa mit einer Säure mit einem ρΚ-Wert unter 2,5 in ein SaIs überführt, ein SaIs von maximaler Stabilitä erhält, wenn das SaIa 5 Mol Säure enthält j die Salze, die 4 üol Säure oder 6 Mol Säure enthalten, habss. noch immer eine gute, jedoch entschieden geringere Stabilität. Dia Salze, dia 1 bis 3 Mol Säure enthalten, sind für therapeutische Verwendungszwecke absolut unannehmbar, da sie Abbau-

31.3.1983

WP G 07 P/242 759/0

61 339/11

erseheinangen unterliegen..

Hervorzuheben-ist, daßj da die neuen Salze gemäß vorliegender Erfindung alle in der HiamantherapB Anwendung finden, das Vorhandensein aush nur eines beschränkten Prozentsatzes eines Abbauproduktea nicht akzeptiert werden kann_s nicht nur, weil diea einen entsprechenden Aktivitätsverlust mit sich bringt, sondern auch und Tor allem, weil dies die Bildung von Metaboliten anzeigt, bei denen eine gewisse Tosizität und die Fähigkeit j biologische Prozesse sa beeinträchtigen* festgestellt wurde.

Ss wurde auch gefunden, und dies ist ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung, daß die Stabilität der neuen Salze von SAMs/- direkt von der Polarität der Umgebung und insbesondere von der vorhandenen ^Feuchtigkeit beeinflußt wird; es wurde non gefunden, wie man diese Feuchtigkeit auf Werte',nahe' lull bringen kann«

Die Salze₉ weiche Segenstand der vorliegenden Erfindung sind, besitzen die allgemeine Pormel HEU

i ?^H3

CH-CH-CH-CH-CH_p-3-CH₂-CH_p* OH OH

GH-C00".nl" IH₀

24 27 5

31.3.1983 WP C 07 D/212 759/0 61 339/11

wobei Σ das Säureäauivalent einer starken Mineralsäure miteinem pK-Wert von weniger als 2,5 and η = 4» 5 oder 6 ist.

Tatsächlich wurde gefunden, daß 2 nur das Äquivalent von HGl, H₂SO₄, H-PO. sein kann, da HHO. und HClO₄ auf Grund ihrer Toxizität therapeutisch nicht annehmbare Säuren sind» wohingegen HBr und. HJ nicht verwendet werden können, da sie die Demethylie rung von SAMe einleiten.

Die Säuren, welche zur Herstellung der neuen Salze gemäß vorliegender Erfindung verwendet werden können, haben die folgenden pK-Werte:

HGl - pK 4. °>5

ρΚ < 0,5 (U Stufe); = 1,92 (2. Stufe) pK = 2,12(1* Stufe),

H₂SO₄ H₃PO₄

Genauer gesagt, bilden die.„.neuen Salze, die Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind, die folgenden Klassen von Produkten:

CH-CH-CH-CH-CH^-S-Ch₀-CH₀-CH-COOH^Z" ι - 4- <- <- ι

OH OH

BH-

UH,

-β-

31.3.1983

W? G 07 D/242 759/0

61 339/11

IzXJ)

GH₃

GH-CH-CH-GH-CH₀-S-GH₀-CH₀-CH-COOh♦:

OH OH

HH,

+ 3 H

CH-CH-CH-GH-CH

) » J ¹

OH OH

HiIi

worin X Gl", 1/2 (SO₄""") oder H₂PO₄" ist,

Die neuen Sal2s haben sich auf zahlreichen Gebieten der Huinantharapie als höchst nut such erwiesen, S₃ B, als· Leberschutzsiitijel, wie nachfolgend genauer erläutert werden wird«

Sie werden- gemäß einem Verfahren hergestellt₉ das die folgenden wesentlichen Schritte umfaStj die alle entscheidend dafür sind, ein reines pharmazeutisches Produkt 2a erhalten₅

h L· I 0 Ό U -7- 31.3.1983

WP G 07 D/242 759/0 61 339/11

das absolut konstant and reproduzierbar ist:

a) Herstellen einer konzentrierten wäßrigen Lösung eines Salzes von rohem SAMe in an sich bekannter Weise j

b) Reinigen der Lösung auf chromatographischem Weg durch Durchleiten durch eine schwach saure Ionenaustauscherharz-Säule ;

c) Sluieren von SiMe mit einer verdünnten wäßrigen Lösung der gewünschten Säure ;

d) Titrieren des Sluats und Regulieren des Säureanteils in streng stöchiometrischem Verhältnis zum vorhandenen SAMe j

e) Konzentration des 31uat3; f") Gefriertrocknen*

Die wässerige Lösung, die in Stufe (a) bereitet wird, kann jedes beliebige lösliche Salz von SiMs enthalten, da das Anion beim nachfolgenden Durchgang durch die Säule entfernt wird und somit auf den Verlauf des Verfahrens keinen SinflaS hat, Im allgemeinen·erhält-sian mit den üblichen Schritten des Sonaantrierens und Sxtrahierens des SAMe ausEefe eina Lösung, welche das Ion SiMe⁺ und das Tön enthält«

In jedem. Pail liegt der pH-Wert der Lösung zwischen 6 αηά 7, vorzugsweise bei 6,5©

Die Stufe (b),. d* h· die chromatographische Reinigung, wird vorzugsweise mit Amsserlite IRC50 oder mit Aaberlite GG 50

-8- 31.3..1983

W? G 07 D/242 75.9/0 61 339/11

durchgeführt»

Das Eluieren gemäB Stufe (c) wird vorzugsweise mit einer Q,1n wässerigen Lösung der gewünschten Säure durchgeführt*

Wenn sich, wie dies meistens der Pail ist, aus der titration des Sluata (Stufe d) die Anwesenheit einer Menge an Säareäquivalenten unterhalb· des gewünschten Anteils (4«, 5 oder 6) abzeichnet, wird genau der fehlende Säureanteil'in ?orm einer handelsüblichen konzentrierten wässerigen Lösung zugefügt» Wenn jedoch ein Säureüberschuß vorgefunden wird, wird dieser durch'Behandlung der Lösung mit- stark basischem lonsnaustauscherhara in 0H""Porm.j s* B, mit JjnberiitB . IP.A-4Q1»-. entfernt» In Stufe (e) wird das Sluat konzentriert^ bis ein· optimaler Wert für das nachfolgende Gefriertrocknen erzielt ist j d· h# ein Wer+ Tön 50 bis 100 g/l, vorzugsweise etwa. 70 g/l:.

Das Gefriertrocknen schließlich wird mit den gewöhnlichen Methoden durchgeführt und ergibt ein vollkommen kristallines Salz mit einer Reinheit τοη 100 %*

'ffenn das Gefriertrocknen in Anwesenheit einer geeigneten inerten Substanz durchgeführt wird, erhält man ein Produkt mit geringer Hest'feuchtigksit und daher höherer Stabilität« Genauer gesagt* wurde gefunden, daS es, wenn das hergestellte SaIs al3 in.jiiierbars phar^:irias3Utische ?orm ?er7/endet werden soll j günstig ist, das Gefriertrocknen in Anwesenheit von Mannit durehäufuhren; wenn hingegen das neue SaIs

2427

-SK 31.3.1983

WP C 07 P/242..759/0 61 339/11

zur Herstellung von Tabletten für orale Verwendung bestimmt ist, ist es günstig, das Gefriertrocknen in Anwesenheit von pulverförmiger Kieselsäure durchzuführen«

Ausführungskeispiel

Um die neuen Produkte leichter reproduzieren zu können, werden nachstehend zu Illustrationszweoken einige Herste11ungsbeispiele angegeben:

Beispiel 1; 900 kg eines sauren. Hefe-Mediums₉ gemäß der Methode Ton Schlenk (Enzymologie, 2£_} 283 (1965)) mit 6,,88 g/kg SAMe angereichert j werden mit 110 1 Äthylenacetat und 11.0 1 Wasser bei Umgebungstemperatur versetzt« lach kräftigem Rühren während 30 min werden 500 1 O_s35n Schwefelsäure zugeführt, worauf 1/2 h weitergerührt wird«

Man filtriert und wäscht mit Wasser und erhält 1400 1 einer Losung, die 4,40 g/l SAMe enthält, was 99,5 % des Gehaltes im -^usgangsmaterial entspricht» Die Lösung wird unter Rühren mit einer Lösung von 23 kg Picrolonsäure in 250 1 Methylethylketon versetzte

Nach Stehenlassen über Sacht wird der liederschlag abzentrifugiert und mit Wasser gewaschen* Der Niederschlag wird unter Rühren bei umgebungstemperatur in 62 1 einer in Lösung von Schwefelsäure in Methanol gelöst.

lach Abfiltrieren der Spuren von unlöslichem Material wird die Lösung mit 500 1 Aceton versetzt*

^W ' WP C 07 D/242 759/0

61 339/11

lach Tollständiger Sedimentierung des Hiederschlages wird die überstehende Lösung dekantiert und der unlösliche Rückstand mit ein wenig Aceton gewaschen,

Der liederschlag wird in 800-1 destilliertem Wasser gelöst, es werden 2 kg entfärbende Kohle zugegeben.und filtriert» Man stellt eine Säule aus 200 1 Amteerlite-Hara IRC 50 in H⁺Porm her und .wäscht sorgfältig mit destilliertem Wasser, Zu der Yorher erhaltenen wäßrigen Lösung· fügt man 4,3 kg Eisessig unter Rühren und 2n NaOH bis zu einem pH-Wert von 6,5 zu« ·

Diese Losung führt man mit einer Geschwindigkeit von 400 l/h, die über den ganzen Prozeß hindurch konstant bleibt, durch .

die Harssäule« .

Danach werden nacheinander 200 1 destilliertes Wasser IcOO 1 Oj1M Essigsäure und weitere 200 1 destilliertes Wasser durchgeleitet»

Man eluiert das SiMe mit 400 1 0,1η Schwefelsäure» Die 400 1 Eluat, die auf diese Weise erhalten werden, enthalten ca« 4 kg SAMe5 es wird im Vakuum auf SO 1 konzentriert, Man fügt 0_s5 kg Kohlenstoff zu und filtriert;» Dis Lösung wird titriert.

Man fügt kons» Schwefelsäure bis zu eines Moirerhäitnis HpSO,/SiMe 2j5 : 1 zu._? worauf man gefriertrocknen* Man erhält 6,5 kg eines Produktes mit folgender Zusammensetzung;

= Sr %r H₉SO₄ » 37,5 %\ H₂O »1,5 %. Das Salz besitzt ein kristallines Aussehen, es ist au mehr

24 27 5 9 O "¹¹" 31*3.1983

W? G 07 D/242 759/0

61 339/11

als 20 % in Wasser löslich and bildet eine farblose Lösung; in den üblichen organischen Lösungsmitteln ist es unlöslich« Bei Dünnschichtchroinatographie gemäß Anal« Bioohem* 4? 16-28 (1971) scheint das Produkt frei von Verunreinigungen zu sein*

In Tabelle 7 sind die analytischen Daten angeführt, die für eine Verbindung der Formel

C₁₅H₂₂^₆O₅S,2,5/H₂SO₄,0,5/H₂O

stehen« ·

Die neue Verbindung wurde außerdem gemäS einer enaymatisehen Methode auf Basis der enaymatiachen Methylierung von Nicotinamid und Guanidinessigsäure als SAMe identifiziert (G* L₉ Cantoni., J. 3iol« Chesu JSJ, 745 (1951)); (G* De La Hoba, B* Α« Jameisonj S. H* Mudde, H, H, Richards, J· im_e Chem« Soc, 8I₉ 3975 (1959)).

Wenn man das Verfahren auf identische Weiss wiederholt, jedoch vor dem Gefriertrocknen soviel Schwefelsäure hinzufügt, da-3 das Mol verhältnis in bezog auf SAMe auf 3 : 1 gebracht wird, erhält man da.3 SaIs; -

SAMe * 3H₂SO,,0,7H₃O,

dessen analytische Daten in 'Tabelle 7 aufscheinen.. Analog dazu erhält man bei Ändern des Molverhältnisses H₉30₄/SAle vor dem Gefriertrocknen auf 2 : 1 das 3al2

SiMe *2H₂SO.*0,

D S U ~¹²~ 31.3.1.983

WP G 07 D/242 759/0 61 339/11

dessen analytische' Daten in Tabelle 7 angegeben sind»

Beispiel 2; 700 1 einer Lösung, welche vom Zerlegen von Hefeaeilen stammen» erhalten unter Verwendung des gleichen Aasgangsmaterials und des gleichen Verfahrens wie in Beispiel 1, werden mit 1i',5 kg Piorolonsäure, gelöst in 100 1 Isobutylalkohol, versetzt«

Bach Stehenlassen über Sacht wird der gebildete niederschlag abaentrifugiert. Der niederschlag wird bei Umgebungstemperatur und unter Rühren in 31 1 einer in Lösung γon Schwefelsäure in Äthanol gelöst«, lach .!^.filtrieren eines kleinen ^Αητ3ϋ3 ah unlöslichem Material setst man der Lösung 250 1 Diäthyiäther su_o

lach Stehenlassen wird filtriert und der feststoff mit ein wenig Äther gewaschen* Unter Vakuum wird getrocknet,

Der-'Feststoff wird in 400 1 Wasser gelöst, mit 1 kg entfärbender Kohle versetzt und filtriert» Man fügt Bisessig ZUj stellt auf einen pH-Wert von S,5 ein und leitet das Ganze gemäß dea Verfahren von Beispiel 1 durch eine iaaberlita-

Das SiMe wird von der Säule mit 200 1 Q,In Salzsäure eluiert

Unter Vakuum wird bis au einem Volumen von 30 1 eingeengt.» Dann versetzt man mit-.0,25 kg Aktivkohle 'ΐΏ,ύ filtriert» Dia Lösung wird titriert und kona, Salzsäure augefügt, bis man ein Molverhältnis HCl/SiMe von 5 : 1 erhält. Dann wird gefriergetrocknet»*So erhält man 2,3 kg eines Produktes mit folgender Zusammensetzung: " .

242759 8 -^- 31*3.1983

WP C 07 D/242 759/0 61 339/11

SiMe⁺ = 67,6 %\ HCl = 30,9 %; H₂O * 1,5 %·

Das Sals besitst ein kristallines Aussehen und ist zu mehr als 20 % in Wasser unter 3iidung einer farblosen Lösung löslich; in den übliohen organischen Lösungsmitteln ist es wenig löslich,

3ei %nnschichtohromatographie wie in Beispiel 1 scheint die Verbindung frei von jeder Verunreinigung zn. sein. Die analytischen Daten sind in tabelle 7 angeführt und stimmen mit einen Produkt der Formel

überein·

Die neue Verbindung wurde außerdem gemäß der in Beispiel 1 angeführten enayaatisahan Methode identifiziert»

Wenn man wie in Beispiel 1 beschrieben verfährt, kann man Salze mit verschiedenen Graden der 3&isbildung erhalten, inabesondere die Salse

SAMe ♦ 4HGl ₀ 0,4H₅O SAMe , 6HCl . 0,7H~0,

deren analytische Daten in Tabelle 7 angeführt sind,

Beispiel 3: Die in Beispiel 1 beschriebene Heratellangswerte wurde in identischer ^eiae wiederholt, jedoch wurden der Lösung vor dem Gefriertrocknen 4,75 kg Mannit zagesetat.

£4 Z / DO y -14- 31.3.1983

WP C 07 D/242 759/0 61 339/11

Dana wurde auf übliche Weise gefriergetrocknete,

Der Zuaata von Mannit sum Unterstützen des Gefriertrocknens ermöglicht es, ein Produkt mit einer B.e st feuchtigkeit von 0,1 % zu erhalten«

Das so erhaltene Produkt ist für die Hersteilung von in.jisier» baren pharmaaeutischen formen geeignet*

Beispiel 4? Man geht _s wie in Beispiel 1 beschrieben. Tor, V.or dem Gefriertrocknen .fügt man der Lösung 4 kg Aerosil (pulverförmig©'Kieselsäure) zu_?.und die so erhaltene kolloidale Suspension wir^ gefriergetrocknet₀

Der Zusata τοη Aerosil sum Unterstützen des Gefrier« trpcknens ermöglicht es,'ein Produkt mit einer Eestfeuchtigkeit ύοώ. 0j2 % au -erhalten,«

Das auf diese Weiss erhaltene Produkt ist für die Herstellung von tabletten zur oralen Verwendung geeignet«

Beispiel 5; Man geht wie in Beispiel 2 "or_? vrobei jedoch daa SiMs anstatt mit Q,In Salzsäure mit einer Lösung von 0_s1M Phosphorsäure eluiert wird* .

Yo? dem Gefriertrocknen wird soviel kona„ Phosphorsäure sugeführt j daß man ein Molverhäitnis E-PO ,/3,AMe von 5 ? 1 sr»

J τ

hält ο

Man erhält 4,26 kg eines Produktes mit folgender Zusammensetsungi

4 2 7 5 3 O -15- 31.3.1983

WP C 07 D/242 759/0

61 339/11

⁺ = 44,4 #; H₃PO₄ = 54,6 %j H₃O = 1 %_o

Die analytischeη Daten sind in Tabelle 7 angeführt und entsprechen einem Produkt der Formel:

C₁₅H₂₂H₆O₅S.SH₃PO₄.0,5H₂O,

Bei Dünnschichtchromatographie, wie Ln Beispiel 1 beschrieben., scheint die erhaltene Verbindung frei von ^eder Verunreinigung zu sein*

Dia neue Verbindung wurde außerdem gemäß der in Beispiel 1 beschriebenen 3nzymati3chen Methode identifiziert»

Wenn man_t wie in Beispiel 1 beschrieben, arbeitet, 1st es möglich, Salze mit verschiedenen Graden an Salzbild zu erhalten, insbesondere die Salzet

S^Me . 4H₃PO₄ · 0,4H₂O SAMe , 6H₃PO₄ ♦ 0,7H₂O,

deren analytische Daten in Tabelle 7 angeführt ainc

«κ?

cn	C) T	CM	cn	c—	vO
in	O		CM	O	CM
C-	VD CO	CM	CM	OJ
	in cm
CM	cvia
T

Q- T-

t— \

o cn

cn

ο cn

Ph t-

P=I

r-VO

(D

KS 54 %S. Φ

Φ to

cn

23

bo

co

ta

CO

cn

VO

CM

VO

4«.

VO

τ—

C-

cn

in

CO

O CM

co m

τ-Ο

S3 vO CM

O CM

CO CM

CM

co

O VO

O vO

τ—

C—

CO

t—

vO

GO CM

co

in O in

co' in

vO

c—

OJ

m ο O

CM

in

o*

co

CM

in

4h

CM OJ

CO

vO

in

tn

VO

in O

VO

co

cn co

cn

CM

C-

co

VO

CO CM

in

ΤΟ

O OJ

co

CM

CO

CM

CM C-

in

co

in in

in

r—

CM

tn

CM

H O CO

VO

vO

CM

O CM

co

CM

VO

c—

VO

vO

C-VO

in

CM

VO CM

O CM

m a

in H ο co

in ο

vO

CO

in ο

O CM

co

co CM

VO

CM

as

VO

cn ο

in

co ο

in

CM

a ί—

VD .H O

_vO

''"co

CV

in

.—i

VO

ε—

cn

ο in

cn

in ο

cn in

CM

co

r— CM

O VD

-er

in

T"

O CM

o a

Cj "^r

Pm cn

co

vO in

in in

cn

VO

in. cn

cn cn

cn

in

CS

cn

O CM

tn

in

Cm co in

CJ O vO

^fH ^w *tH

>n

O CM

a ο

.CM

cn in

OQ

cn cn

cn

cn cn

CM

cn

CM

cn

co cn

co

vO CO

CM O

O CM

VO

co

7 5 8 O "¹⁷~ 31.3..1983

WP C 07 D/242 759/0

61 339/11

Mit den gemäß dem oben beschriebenen Verfahren erhaltenen Salzen wurden Untersuchungen auf Stabilität durchgeführt, wobei das Produkt in einem ihermostatofen bei 45 ⁰C gehalten und zu bestimmten Zeiten der Prozentsatz an Restsais beatiuMt wurde« ^iβ Untersuchungen wurden im Vergleich mit den Salzen von SÄMe.n HCl, wobei n'1, 2 oder 3 ist, naoh bekannten Methoden hergestellt (US-PS 2 969 353)».wad mit den Salzen von SAMe,n HgSO,,, wobei η 0,5» 1 oder 1,5, ist, ebenfalls nach, bekannten Methoden hergestellt (DI-PS 1 803 973), durchgeführt.

In den folgenden Tabellen sind die Prozentsätze der Zersetzung des Salzes za den angegebenen Zeiten angeführt;

	e.n HCl	TABELLS	1	bei 45	⁰G. nach	360
SAM	Restfeuchtig			128	240	Tagen
H=	keit		Abbau	Tagen	Tagen	100 '%
		60	120	100 SS	100 %	100 #
	0,2 %	Tagen	Tagen	100 %	100 %	100 %
1	0,5 %	100 %	100 %	80 %	100 %	20 %
2	0,8 %	80 %	100 %	14 %	17 %
3	j /ν	30 %	60 #		4_S5 %	20 %
4	1,5 %	c ei	10 %	14 %	17 %
5		-	1,5 %
6		1Ö %;

31.-3.1983

WP G 07 B/242 759/0 61 339/11

TABSLLS 2 SAMe.nH_oS0,

η=	Eestfeuchtig-	Ta	60	120	Abbau bei	UI CZ, > /O	100	% 100 %	180	14 %	45 G	nach	1	360
	keit	1 % 5		180	TABELLE	100	% 100 %	Tagen	240 -	360	Tagen
		1,5 %	Tagen Tagen Tagen		60		14 %	Tagen	Tagen	20 %
0,1.	0,2 %	2 % 5	100 %		10	% 14 %	1,5 % 3 %	100 %	100 %	C C/ J /C
1	0,5 %		80 %	60	1,5		10 %	100 %	100 %	20 %
1₅5	0,8 %	30 %	gen T.	10 f	δ 14 %	1CO %	TOO % .
2	1 %		%	3		17 %	20 %
3,5,	1,5 %	-				4,5 %	5 %
3			Abbau bei. 45 ^C	17 #	20 #
		120
5AMa	· 1,5" H₂SO₄^nHCl	ag«n
η=	Rastfeuchtig	10 %	³C na si
	keit	240
	Tagen
1	17 %
2	4,5 %
3	.17 %

2759

31.3.1983

W? C 07 D/242 759/0

61 339/11

TABELLE

SAMe,2HCl.^

Restfeuchtig-

keit

	Abbau	bei 45	⁰C nach	360
60	120	180	240	Tagen
Tagen	Tagen	Tagen	Tagen	100 %
30 %	60 %	80 %	100 %	20 %
c of	10 %	14 %	17 %	5 %
-	1,5 %	^ /«	4,5 %	20 %
5 %	10 %	14 %	17 %

0	,5	0	,5
1		1
1	,5	1
2		2

Der Prozentsatz an SAMe-Rest zu den angegebenen Zeiten wurde mit einem neuen, im nachfolgenden beschriebenen Verfahren bestimmt j das die größtmögliche Genauigkeit an Bestimmungen garantiert, da es ermöglicht, das SAKe von allen anderen eventuellen Abbauprocukten vollständig zu trennen.

Man hat festgestellt, daß mit dem bis heute angewendeten Verfahren, das auf der Verwendung einer Analysesäule des lonenaustauscherharzea Bowex 50 (Schlank und De Palma.: J« Bio. Chem« 229 (1957)) beruh j, die Trennung von SAMs von einigen anderen Abbauprodukten, insbesondere von Methylthioadenosin, nicht vollständig erfolgt und daher au einer falschen Bewertung der Stabilität des SAMe führ^H al 3 in W ir.k 1 i chk e i t war,

ie noher

Das derzeitige Verfahren zur'Bestinnnung von SAMe beruht auf der Anwendung von HZLC,

Verwendete Anaiysebedingungen;

/4 L / D a U -20- 31.3 ο 1983

WP C 07 D/242 759/0 61 339/11

- Säule = PARSISIL 10 SCZ, 2,5 x 250 mm

- Sluierungsmittel = 0,1 M Ammoniumformiat, pH 4? enthaltend

20 % Methanol für HPCL; .- Strömung = 1 ml/min; -Retentionszeit .

von SAMe = etwa 400 s_o ,

Aus den Daten der Tabellen 1, 2, 3, 4 geht klar hervor, daß die S-alss von SAMe ein Höchstmaß an Stabilität dann erreichen, wenn sie 5 Säureäquivalente enthalten; die Salze mit 4 and 6 Äquivalenten haben noch immer eine gute Stabilität, wohingegen die Sala®. mit weniger Säureäquivalenten keinerlei praktische Bedeutung haben, da sie instabil sind»

Außerdem ist es offensichtlich, daß die Stabilität _s unabhängig von der verwendeten Säure, den gleichen Yeriauf hatj, wenn es sich um eine Säure mit einem pZ-We-rt < 2-,5 handelt,

Salze ait Säuren mit pK-Warten / 2,5? die zwischen 4 bis 6 Säureäquivalente enthalten, konnten nicht hergestellt werden« StabilitätsunterBuchungen wurden mit dem gleichen Verfahren ·' auch mit Salsen durchgeführt ₃ welche im Beisein eines Gefriertrocknungszusatses, entsprechend den .Beispielen 3 und 4₅ hergestellt wurden* "

Die Ergebnisse der durchgeführten Bestimmungen sind in den nachfolgenden Tabellen 5 und S aufgezeigt, Die' deutliche Reduktion der Feuchtigkeit, wenn die Gefriertrocknung mit einem Zusatz erfolgt, und die daraus resultierende Ge-sasrfcstabilität der Salsa, die durch dieses Verfahren gewonnen werden, ist ersichtlich«

24 2 7

31.3.1983

WP G 07 D/242 759/0

61 339/11

TABSLLS

SAM · 5HCl

Restfeuchtigkeit

Abbau bei 45 C nach 360 Tagen

gefriergetrocknet ohne Zusatz

1,5 %

gefriergetrocknet mit Mannit

.100 g SAMa^ + 120 g Mannit) 0,1 %

gefriergetrocknet mit Aerosil .10Og SAMc⁺ +10Og Aerosil) 0,2 %

TABELLE'

SAMe.2,

Restfeuchtig- Abbau bei 45 0 keit nach 3öO Tagen

gefriergetrocknet ohne Zusatz

5 %

gefriergetrocknet mit Mannit

(100 g SAMe* + 120 g Mannit) 0,1

gefriergetrocknet mit Aerosil 100 g SAMe⁺ +10Og Aerosil)

0,2

-22- 31.3.1983

W? C 07 D/242 759/0' 61 339/11

Die Salze SiMs₀SHCl and SAMe«2,5H₂SO, wurden in einem ausgedehnten Screeningtest pharmakologiseh. erprobt and zeigten in jedem Pall höchst interessante Wirkaamkeits- and Toxizitätscharakteristiks, unabhängig von dem an SiMs gebundenen Anion* Ea wurde gefunden, daß die Wirksamkeit ; dei&euen Salze im wesentlichen von. der Fähigkeit des freien Ions SAMe⁺ abhängt, im Organismus als Donator von Methylgrup pen zu wirken, einem natürlichen Substrat von zahlreichen Trajasmethylase-Siiaymen, welche grundlegende Reaktionen des Jett-, Protein- und Zucker-Metabolismus katalysieren» Die Bedeutung der neuen Salsa liegt daher im wesentlichen darin, das S-Adenösil-fflethionin bei Temperaturen bis zu 45 absolut stabil zu halten, und so ssine transmethyliarende Wirkung im menschlishen Organismus mit 100%iger Wirksamkeit auszuüben, ohne daS die Gefahr besteht, daß sich toxische 2ersetzungsprodukte bilden oder selche, die mit den you SAMe⁺-aktivierten biologischen Prozessen negativ interferieren*

Die akute.To^izität wurde bei der Maus bestimmt, wobei mit beiden S&lzan. die folgenden Werte erhalten wurden:

DL₅₀ per. os > 3-g/kg DI₅₀ Uv₄ = 1,1 .g/kg«

Die Untersuchungen auf Tolerierbarkeit und chronische Toxizität wurden mit Ratten des Stammes Wistar und Spragus· Dowley durchgeführt j denen für die Dauer von 12 Monaten 20 mg/kg pro Tag des Produktes verabreicht wurden: Am Ende

2427

-23- . 31.3*1983

W? G 07 D/242 759/0 61 339/11

der Behandlung zeigten die verschiedenen Organe and Systeme keinerlei pathologische Veränderung, .

Die Untersuchungen auf Teratogenese wurden mit Kaninchen durchgeführt: Bei Verabreichung von Dosen des Salzes, die 10mal höher waren als die therapeutischen Höchstdosen, zeigten sich keine teratogenen Auswirkungen oder irgendwelche mißgebildeten Embryos oder !'Sti am Snde der Vera'ereichungszeit.

Die endovenöse Verabreichung von Dosen bis zu 200 mg/kg rief beim Kaninchen keinerlei pyrogene Manifestationen hervor. Die venöse Verabreichung in Kaninchen and Ratten- von 40 mg/kg rief keinerlei Veränderung des Karotis—Drucke3₉ der Herzfrequenz,, der Atemfrequen.2 und des elektrokardiographischen Kurvenbildes hervor* ,

Die lokale 'Tolerierbarkeit von intramuskulären Injektionen, auch nach wiederholten- Verabreichungen, während 30 bis 60 Tagen, und von endovenösen Injektionen in die Eandvens der Ohrmuschel von Kaninchen ist ausgezeichnet,

Pharmakologie

Eine gsruze Serie von Untersuchungen an Hatten hat bewiesen, daß die neuen Salze eine beträchtliche Sahutzwirkung und auflösende Wirkung bei lebersteatöse^:durch Hyperlipid- und Hyperproteindiät gemäß Handler und bei der Staatοse durch akute Alkoholvergiftung und Vergiftung durch andere giftige Substanzen bereits bei Verabreichung you Dosen von 10 mg/kg SAMe⁺ besitzen-.

3 S y _24- 31.3*1983

WP C 07 D/242 759/0 61 339/11

Bei experimenteller Hyperlipämie bei Hatten, z« B, durch Triton S, zeigten die neuen Salze eine beträchtliche Hypelipämiewirkung, welche, im Verhältnis au den angewendeten Dosen von 10 mg/kg (stets aasgedrückt als SAMe⁺) deutlich intensiver als bei anderen Mitteln mit dieser Wirkung war«

3ei Hühnern, welche mit cholesterin- and fructosereichsr Nahrung'arteriosklerotisch gemacht worden war, reduzierte die Verabreichung des neuen Produktes auf parenteral ein Weg in Dosen von 10 mg/kg die Cholasterinämie und beeinflußte günstig die Verletzungen, welche bei Kontrollen im Bereich der Shoraxaorta und der 3auchaorta sowie der kleinen Gefäße der Sncephalonbasis festgestellt worden waren*

Was den Metabolismus der Phospholipide betrifft, konnte im Versuch ein Ansteigen des Phosphatidylcholin-Satzes im. Lebergawsse b-si. Eatt-en -mit d'ek-ampensisriie-r Steatos^ fest-gestellt werden, lin deutlichen Ansteigen des Phosphatidylcholina wurde auch im Bereich der Ot» -Lipoproteine im Blut bei experimentellen Veränderungen beobachtet, die durch die Verhältnisse 3|«C der Lipoproteine-hervorgerufen wurden*

Alle diese Proben haben klar eine Heilwirkung dar neuen Salze bei Veränderungen des S'ettmetabolismus gezeigt_o

3ine weitere Reihe von Untersuchungen mit Ratten hat bewiesen,, daß die Verabreichung von Dosen von 1 mg/kg su -einer Akkumulation der Qlvcogenreaervan im Leber- und Muskelbereich führt, die mit hvsto-cheaisehen Verfahren, aber auch mit quantitativen Bestimmungen festgestellt werden kann» Bei

24 27 59 O -25-' 31.3.1983

WP C 07 D/242 759/0

61 339/11

experimenteller Diabetes durch Alloxan ist die zur Wieder- herstellung der normalen Blutzuckerwerte erforderliche Insulinmenge beträchtlich niedriger bei einer Verabreichung entsprechend 0,5 mg/kg SAMe⁺*

Diese Reihe von Untersuchungen hat eine deutlich positive Wirkung der neuen Verbindungen gemäß vorliegender Irfindung auf den Zucker-Metabolismus gezeigt.

Schließlich wurden Ratten mit experimentell hervorgerufener Hypodisproteinämie mit Anteilen von 10 mg/kg SAMe behandelti Man hat festgestellt, daß das genannte Produkt die lormalwerte der Gesamtproteinämie wiederherstellt^ indem ea die . Albuminquote deutlich erhöht und damit eine spürbare proteinabbauende Wirkung ausübte ,

Diese und andere Untersuchungen haben die Heilwirkung der neuen Produkte bei ffehlf unkt ionen de^v3 Proteinmetaboliamua gezeigt.

Ia wesentlichen wurde auf Basis der phanaakologiachen Versuche, wie 3ie soeben angegeben wurden., sowie vieler weiteren Versuche, die es ermöglicht haben., die Wirkung dar neuen Salze auf allen übenen des menschlichen Organismus zn erforschen, im klinischen Bereich die Wirkung der neuen Produkte bewiesen; im Bereich dar Hepatologie bei akuten und chronischen Lebervergiftungen, im Bereich der Ueurologia ala Aafi&epressivum und im Bereich der Osteologie bei rheu-

4 27

-26- 31.3.1983

WP O 07 D/242 759/0 61 339/11

matischer Arthritis. Die Wirkung in vielen weiteren Bereichen der Humantherapie ist im Srprobungsstadiunu

Die neuen Salas können auf oralem Wege oder durch intramuskuläre oder endovenoae Injektion verabreicht werden*

Weitere JOrmen der'"Verabreichung können sein: Tabletten, flüssigkeiten zum Einträufeln in die Augen, Aerosol, topische Anwendung*

Claims

CH-GH-CH-GH-GH^-S-GH.-.-CH^-GH-GÖO". nT

worin 2 ein Säureäquivalent einer starken Minealsäure . mit einem pK-Wer~fc von weniger als 2,5 und η = 4? 5 oder . 6 ist, gekennzeichnet dadaroh, daß eine konzentrierte wässerige Lösung, eines ³alaes von rohem SAMe durch Leiten durch eins Säule eines schwach sauren Ionenaustauacharharzes gereinigt wird, wobei SAMe mit verdünnter wässeriger Lösung der gewünschten Säure HZ eluiert wird» das Sluat mit der notwendigen Säuremenge versetzt wird, um genau die dsm gewünschten SaIa entsprechende Stöchiometris au erreichen, und schließlich konaentriert und das Sals von hoher Reinheit durch Gefriertrocknen abgetrennt wird«
2* "Verfahren nach Punkt 1, gekennzeichnet dadurch, da.3 der pH-Wert der wässerigen SAMs-Lösung zwischen .6 und.7» vorzugsweise auf 6,5> eingestellt wird*

4// 3 3 y -28- 31.3.1983

WP C 07 D/242 759/0 61 339/11

3. Verfahren nach Punkt 1, gekennzeichnet dadurch, daß das schwach saure Ionenaustauscherharz imerlite IRC 50 oder imerlite CG 50 ist«,

4» Verfahren nach Punkt 1, gekennzeichnet dadurch, daß dis Lösung der Säure HX, die als Eluierungsmittel eingesetzt wird, eine Konzentration von 0,1n aufweist«,

5· Verfahren nach Punkt 1, gekennzeichnet dadurch, daß die in bezug auf dia Stöchiometrie fehlende Säure H2 dem Sluat in ^orm einer handelsüblichen konzentrierten wässerigen Lösung zugesetzt wird»

6* Verfahren nach Punkt 1, gekennzeichnet dadurch* daß, wenn das Bluat einen Überschuß an Säure Hl in bezug auf die StSehioiaetrie aufweist, dieser Überschuß mit einem stark basischen Ionenaustauscherhars entfernt wird*

7» Verfahren nach Punkt 1., gekennzeichnet dadurch* daß das Slaat bis zu einem Wert von 50 bi3 100 g/l SiHe konzentriert wird»
3. Verfahren.nach Punkt 1, gekennzeichnet dadurch, daß die Gefriertrocknung in Anwesenheit einer inerten Subs vorzugsweise Mannit-oder pulverförmiger Kieselsäure durchgeführt wird*