FI72525B - Foerfarande foer framstaellning av terapeutiskt anvaendbara stabila s-adenocylmetioninsalter. - Google Patents

Description

χ 72525

Menetelmä terapeuttisesti käyttökelpoisten stabiilien S-adenosyylimetioniinisuolojen valmistamiseksi.

Tämä keksintö koskee uusien S-adenosyylimetioniini-5 suolojen (SAM-suolojen) valmistusta, jotka suolat ovat erittäin stabiileja korotetuissa lämpötiloissa ja käytännöllisesti katsoen rajattomia aikoja.

Tiedetään, että S-adenosyylimetioniini on luonnollista alkuperää oleva, kaikissa elollisissa eliöissä esiin-10 tyvä tuote, jota ko. eliöissä tietty entsyymi tehokkaasti syntetisoi, ja joka vastaa seuraavaa rakennekaavaa:

NH

I 2

---N

15 |l I

^ CH

i i3

CH -CH-CH-CH-CH -S-CH -CH -CH-COO

Il 2 + 2 2 I

OH OH NH

2 20 _ O — SAM osallistuu suureen määrään ihmiselle olennaisen tärkeistä aineenvaihduntaprosesseista ja siitä johtuen sen puute on monen orgaanisen toimintahäiriön syynä.

25 Vaikka tämän tuotteen biologinen merkitys on tun nettu joitakin vuosikymmeniä, mahdollisuus tutkia sitä ja siten mahdollisuus käyttää lääkkeenä on ollut olemassa ainoastaan viime vuosina johtuen sen äärimmäisestä epästa-biilisuudesta 0°C:n yläpuolisissa lämpötiloissa.

30 Tässä suhteessa vasta vuonna 1975 tämän hakemuksen tekijän onnistui valmistaa SAM-suola, joka oli kyllin stabiili 25QC:ssa (US-patenttijulkaisu 3 893 999), ja jota seurasi muutama suola, jotka olivat varsin stabiileja 45°C:ssa (US-patenttijulkaisu 3 954 726/1976 ja US-pa-35 tenttijulkaisu 4 057 686/1977).

2 72525

Tarkemmin sanoen US-patenttijulkaisu 3 893 999/1975 käsittelee SAM-triparatolueenisulfonaattia, US-patentti-julkaisu 3 954 726/1976 käsittelee SAM-disulfaattidipara-tolueenisulfonaattia ja US-patenttijulkaisu 4 057 686/1977 5 käsittelee SAM-suolojen ryhmää/joka voidaan esittää yleisesti kaavalla SAM^RSO^H tai SAM.SRSO^H, joissa RSO^H tarkoittaa sulfonihappoekvivalenttia, joka voidaan osaksi korvata ekvivalentilla määrällä rikkihappoa.

Mainittu hakija on sanonut, että hän ei pysty selit-10 tämään syytä siihen, miksi vain tietyt patenttivaatimusten mukaiset suolat olivat stabiileja, kun aikaisemmin valmistetut SAM-suolat (nimittäin monokloridi ja disulfaatti) olivat korkeintaan saavuttaneet ajallisesti rajoitetun stabiilisuuden pidettäessä niitä 4°C:ssa, eikä siihen, miksi 15 triparatolueenisulfonaatti oli stabiili vain 25°C:seen saakka, kun taas disulfaattidiparatolueenisulfonaatti oli stabiili 45°C:seen saakka.

Nyt on yllättäen havaittu, että stabiileja SAM-suoloja saadaan aina, kun SAMista muodostetaan suola 4-6 moolin kans-20 sa vahvaa epäorgaanista happoa, jonka pK on alle 2,5 (suolahappo, rikkihappo tai fosforihappo).

Tarkemmin sanoen on yllättäen havaittu, että jos SAMista muodostetaan suola hapon kanssa, jonka pK on alle 2,5, suolan suurin stabiilisuus saavutetaansilloin, kun 25 suola sisältää 5moolia happoa. Suolojen, jotka sisältävät 4 tai 6 moolia happoa, stabiilisuus on vielä hyvä, mutta ratkaisevasti alhaisempi.

Suolat, jotka sisältävät 1-3 moolia happoa, ovat ehdottomasti kelvottomia terapeuttiseen käyttöön, koska 30 niissä tapahtuu erittäin suuria hajoamisilmiöitä.

On korostettava, että koska kaikilla uusilla tämän keksinnön mukaisilla suoloilla on käyttöä ihmisten hoidossa, hajoamistuotteen esiintyminen edes prosentuaalisesti pieninä määrinä ei ole hyväksyttävää, ei vain sik-35 si, että se merkitsee vastaavaa vaikutuksen vähenemistä, vaan myös ja erityisesti siksi, että se on osoituksena 3 72525 aineenvaihduntatuotteiden muodostumisesta, jotka on havaittu lievästi myrkyllisiksi, ja jotka häiritsevät biologisia prosesseja;

On myös havaittu, että uusien SAM-suolojen stabiili-5 suus on suoraan riippuvainen ympäristön polaarisuudesta ja niin ollen erityisesti läsnä olevan kosteuden määrästä, ja siksi on keksitty keino vähentää tämä kosteus lähes nollaan. Tämän keksinnön mukaiset suolat vastaavat yleiskaavaa 10 Γ

A-N

| i|

15 \ N/ CH

I I 3

CH-CH-CH-CH-CH -S-CH —CH -CH-C00 . nX

Il 2+22( OH OH NH2 - 0- 20 jossa x on vahvan mineraalihapon, jonka pk on alle 2,5 (suolahapon, rikkihapon tai fosforihapon) happoekvivatentti ja n 4, 5 tai 6.

Käytännössä on havaittu, että X voi olla vain HC1-, H2SO4- tai H3P04-ekvivalentti, koska HNC>3 ja HCIO^ 25 ovat terapeuttisesti kelvottomia happoja myrkyllisyytensä vuoksi, ja koska HBr:a ja HI:a ei voida käyttää siksi, että ne panevat alkuun SAM:n demetylaation.

Hapoilla, joita voidaan käyttää tämän keksinnön mukaisten uusien suolojen valmistamiseen, on seuraavat 30 pK-arvot: HC1: pK < 0,5 H2S04: pK < 0,5 (1. vaihe); pK = 1,92 (2.vaihe)

HjPO^: pK = 2,12 (1. vaihe).

Tarkemmin sanoen tämän keksinnön mukaiset uudet 35 suolat muodostavat seuraavat tuoteluokat: 4 72525 1) NH +

AL

l wj κ ^N^ N/ CH.

I H I 3 CH-CH-CH-CH-CH.-S-CH -CH -CH-COOH . 4* il 2+2 2 I +

OH OH NH

_0 - 10 2) ΝΉ+

-IT

15 mLjJ ce

I I h I

H CH -CH-CH-CH-CH -S-CH -CH -CK-COOH . 5X~ II 2 + 2 2 I + OH OH NH^ - 0- 20 3) NH + XL? 25 31 -|N+

kjAjy CH

I "h I

s CH-CH-CH-CE-CH-S-CH-CH -CH-COOH . 6x

|| 2 + 2 2 I

OH OH NH

30 3 - 0- joissa X on Cl~, iSO~” tax H2PO~.

5 72525

Uudet suolat ovat osoittautuneet hyvin käyttökelpoisiksi lukuisilla ihmisten hoidon aloilla, esimerkiksi maksaa suojäävinä aineina, kuten käy jäljempänä tarkemmin ilmi.

5 Niitä valmistetaan menetelmällä, joka käsittää seu- raavat olennaiset vaiheet, jotka kaikki ovat ratkaisevia, kun tarkoituksena on saada tuote, jolla on ehdottomasti muuttumaton ja toistettavissa oleva farmaseuttinen puhtaus.

a) väkevän vesiliuoksen valmistus raa'asta SAM-10 suolasta millä tahansa tunnetulla menetelmällä; b) liuoksen puhdistus kromatografisesti johtamalla se heikosti happaman ioninvaihtohartsipylvään läpi; c) SAM:n eluointi vaaditun hapon laimealla vesi-liuoksella; 15 d) eluaatin titraus ja happomäärän säätö täsmälleen stökiömetriseen suhteeseen läsnä olevaan SAM-määrään nähden; e) eluaatin väkevöinti; f) kylmäkuivaus.

Vaiheessa a) valmistettu vesiliuos voi luonnolli-20 sesti käsittää minkä tahansa liukenevan SAM-suolan, koska anioni poistuu seuraavassa vaiheessa kulkiessaan pylvään läpi, eikä näin ollen häiritse menetelmän loppuosaa. Yleensä tavallisilla menetelmillä, jotka sisältävät väkevöinnin ja SAM:n uuttamisen hiivasta, saadaan liuos, jossa on 25 SAM+-ioneja ja SO^ -ioneja.

Kaikissa tapauksissa liuoksen pH säädetään 6:n ja 7:n välille, edullisesti 6,5:een.

Kromatografinen puhdistusvaihe b) suoritetaan edullisesti käyttäen Amberlite IRC50:ä tai Amberlite CG50:ä.

30 (styreeni-divinyylibentseeni-kopolymeereja).

Eluointivaihe c) suoritetaan edullisesti vaaditun hapon 0,1 N vesiliuosta käyttäen.

Jos eluaatin titraus (vaihe d) osoittaa läsnä olevien happoekvivatenttien määrän vaadittua määrää (4, 5 tai 6) 35 pienemmäksi, mikä on tavallinen tilanne, lisätään täsmälleen puuttuvaa määrää vastaava happomäärä väkevän kaupallisen vesiliuoksen muodossa. Jos kuitenkin käy selville, 6 72525 että happoa on läsnä ylimäärin, ylimäärä poistetaan käsittelemällä liuosta vahvasti emäksisellä, OH -muodossa olevalla ioninvaihtohartsilla, esimerkiksi Amberlite IRA-401:llä.

5 Vaiheessa e) eluaatti väkevöidään seuraavana suori tettavan kylmäkuivausprosessin kannalta parhaaseen arvoon, so. pitoisuuteen 50-100 g/1, edullisesti noin 70 g/l:aan.

Viimeisenä oleva kylmäkuivaus suoritetaan tavanomaisin menetelmin, jolloin saadaan täysin kiteinen,100-%:isen 10 puhdas tuote.

Jos kylmäkuivaus suoritetaan soveltuvan inertin aineen ollessa läsnä, saadaan tuote, jonka jäännöskosteus-pitoisuus on alhaisempi, ja joka niin ollen on stabiilimpi.

Tarkemmin sanoen on todettu,että jos valmistetaan 15 ruiskeina annettaviin farmaseuttisiin muotoihin käytettäväksi tarkoitettua suolaa, kylmäkuivaus tulisi suorittaa mannitolin ollessa läsnä. Jos kuitenkin uusi suola on tarkoitettu suun kautta annettavien tablettien valmistukseen, kylmäkuivaus tulisi suorittaa jauhemaisen piihapon 20 ollessa läsnä.

Seuraavat esimerkit kuvaavat keksinnön mukaista menetelmää S-adenosyylimetioniinisuolojen (SAM-suolojen) valmistamiseksi.

Esimerkki 1 25 110 1 etyyliasetaattia ja 110 1 vettä lisätään ympä ristön lämpötilassa 900 kg:aan hiivaa, johon on lisätty SAM:a (6,88 g/kg), Schlenkin mukaisella tavalla (Enzymolo-gia 29 (1965) 283).

30 minuuttia kestäneen voimakkaan sekoituksen jäl-30 keen lisätään 500 1 0,35 N rikkihappoa, ja sekoitusta jatketaan vielä puolitoista tuntia.

Seos suodatetaan ja jäännös pestään vedellä, jolloin saadaan 1400 1 liuosta, joka sisältää 4,40 g/1 SAM:a, joka vastaa 99,5 % siitä määrästä, joka oli läsnä lähtöaineessa. 35 Liuokseen lisätään 23 kg pikrolonihappoa 250 l:ssa metyylietyyliketonia samalla sekoittaen.

7 72525 Yön yli seisottamisen jälkeen sakka erotetaan sentrifugoimalla ja pestään vedellä.

Sakka liuotetaan ympäristön lämpötilassa sekoittaen 62 Iraan 1 N rikkihapon metanoliliuosta.

5 Sen jälkeen kun pienet määrät liukenematonta ainetta on erotettu suodattamalla, liuokseen lisätään 500 1 asetonia.

Sakan laskeuduttua täydellisesti supernatantti de-kantoidaan ja liukenematon jäännös pestään pienellä mää-10 rällä asetonia.

Sakka liuotetaan 800 Iraan tislattua vettä, lisätään 2 kg väriä poistavaa hiiltä, ja seos suodatetaan.

Valmistetaan 200 1 Amberlite IRC 50 -hartsia H+-muodossa sisältävä pylväs, ja pestään se huolellisesti 15 tislatulla vedellä.

Edellä saatuun vesiliuokseen lisätään samalla sekoittaen 4,8 kg jääetikkaa ja sen jälkeen lisätään 2 N NaOHra, kunnes saavutetaan pH-arvo 6,5.

Liuos johdetaan hartsipylvään läpi virtausnopeu-20 den ollessa 400 1/h, joka pidetään muuttumattomana koko prosessin ajan.

200 1 tislattua vettä, 1600 1 0,1 N etikkahappoa ja vielä 200 1 tislattua vettä johdetaan sitten peräkkäin pylvään läpi.

25 SAM eluoidaan 400 lrlla 0,1 N rikkihappoa. Näin saatu 400 1 eluaattia sisältävää noin 4 kg SAMra ja se väkevöidään alipaineessa 60 1 tilavuuteen.

Lisätään 0,5 kg hiiltä, ja seos suodatetaan. Liuos titrataan.

30 Lisätään väkevää rikkihappoa, kunnes H2S04rn ja SAMrm moolisuhde 2,5 rl saavutetaan, ja sen jälkeen liuos kylmäkuivataan.

Saadaan 6,5 kg tuotetta, jolla on seuraava koostumusr SAM+ 61 %; H2S04 37,5 %r H20 1,5 %.

35 Suolalla on kiteinen ulkomuoto, ja sen liukoisuus veteen on yli 20 %, jossa liuotuksessa muodostuu väritön liuos,mutta se ei liukene tavallisiin orgaanisiin liuottimiin.

8 72525

Suolalla on kiteinen ulkomuoto, ja sen liukoisuus veteen on yli 20 %, jossa liuotuksessa muodostuu väritön liuos, mutta se ei liukene tavallisiin orgaanisiin liuottimiin.

5 Ohutkerroskromatografia julkaisun Anal. Biochem.

4 (1971) 16-28 mukaisella tavalla osoittaa, että tuote ei sisällä mitään epäpuhtauksia.

Taulukko 7 esittää analyysitiedot, jotka täsmäävät kaavan 10 C15H22N6°5S * 2'5H2S04 * 0'5H2° mukaiseen yhdisteeseen.

Uusi yhdiste tunnistettiin myös entsymaattisella 15 menetelmällä, joka perustuu nikotiiniamidin ja guanidiini-etikkahapon entsymaattiseen metylointiin SAMilla (G.L.Can-toni, J. Biol. Chem. 189 (1951) 745; G.De La Hoba, B.A. Jameison, S.H. Mudde, H.H. Richards, J. Am. Chem.

Soc. 81 (1959) 3975).

20 Toistettaessa menetelmä samalla tavalla mutta lisää mällä ennen kylmäkuivausta rikkihappoa niin paljon, että sen ja SAM:n moolisuhde kohaa 3:1 reen, saadaan suola SAM.3H2SO4.0,7H20, jonka analyysitiedot on esitetty taulukossa 7.

25 Vastaavasti alentamalla I^SO^rn ja SAM:n moolisuh de 2:l:een ennen kylmäkuivausta saadaan suola SAM.2^50^. 0,41^0, jonka analyysitiedot esitetään taulukossa 7.

Esimerkki 2 11,5 g pikrolonihappoa 100 Iraan isobutyylialkoho- 30 lia liuotettuna lisätään 700 Iraan liuosta, joka on saatu hajoittamalla hiivasoluja samaa raaka-ainetta ja menetelmää käyttäen kuin esimerkissä 1.

Yön yli seisottamisen jälkeen muodostunut sakka erotetaan sentrifugoimalla.

35 Sakka liuotetaan ympäristön lämpötilassa samalla sekoittaen 31 Iraan 1 N rikkihapon etanoliliuosta.

9 72525

Sen jälkeen kun pieni määrä liukenematonta ainetta on erotettu suodattamalla, liuokseen lisätään 250 1 dietyylieetteriä.

Seisottamisen jälkeen seos suodatetaan, ja kiinteä 5 aine pestään pienellä määrällä eetteriä. Se kuivataan alipaineessa.

Kiinteä aine liuotetaan 400 litraan vettä,lisätään 1 kg väriä poistavaa hiiltä, ja seos suodatetaan.

Lisätään jääetikkaa, pH säädetään 6,5reen ja 10 liuos johdetaan Amberlite IRC 50:llä täytetyn pylvään läpi, kuten esimerkissä 1 on kuvattu.

SAM eluoidaan pylväästä 200 1:11a 0,1 N suolahappoa.

Se väkevöidään alipaineessa 30 litran tilavuuteen. Lisätään 0,25 kg aktiivihiiltä ja seos suodatetaan. Liuos 15 titrataan, ja siihen lisätään riittävä määrä väkevää suolahappoa, jotta HClrn ja SAMrn moolisuhteeksi saadaan 5:1. Liuos kylmäkuivataan.

Saadaan 2,8 kg tuotetta, jolla on seuraava koostumus: SAM+ 67,6 %; HC1 30,9 %; H20 1,5 %.

20 Suolalla on kiteinen ulkomuoto, ja sen liukoisuus veteen on yli 20 %. Tässä liuotuksessa muodostuu väritön liuos. Se liukenee huonosti tavallisiin orgaanisiin liuottimiin.

Esimerkin 1 mukainen ohutkerroskromatografia 25 osoittaa, että yhdiste ei sisällä mitään epäpuhtauksia.

Analyysitiedot esitetään taulukossa 7, ja ne täsmäävät kaavan C. ,-Η-,,Ν,Ο^.δΗΟΙ 15 22 6 5 30 mukaiseen tuotteeseen.

Uusi yhdiste tunnistettiin myös esimerkissä 1 kuvatulla entsymaattisella menetelmällä.

Toimimalla esimerkissä 1 yksityiskohtaisesti kuva-35 tulla tavalla on mahdollista valmistaa suoloja, joissa suolan muodostus on eriasteista, ja erityisesti suolat 10 72525 SAM.4HC1.0/4H20 ja SAM.6HC1.0/7H20/ joiden analyysitiedot esitetään taulukossa 7.

Esimerkki 3 5 Esimerkissä 1 kuvattu valmistus toistettiin samalla tavalla, mutta ennen kylmäkuivausta liuokseen lisättiin 4,75 kg ei-pyrogeenista mannitolia. Sen jälkeen liuos kylmä-kuivattiin tavanomaisella tavalla.

Mannitolin lisäys kulmäkuivauksen apuaineeksi te-10 kee mahdolliseksi valmistaa tuotteen, jonka jäännöskosteus-pitoisuus on 0,1 %.

Tällä tavalla saatu tuote soveltuu muutettavaksi ruiskeina annettaviksi farmaseuttisiksi muodoiksi.

Esimerkki 4 15 Noudatetaan esimerkin 1 mukaista menettelytapaa.

Liuokseen lisätään 4 kg Aerosiliä (jauhemainen piihappo) ennen kylmäkuivausta, ja saatu kolloidinen suspensio kylmäkuivataan.

Aerosilin lisäys kulmäkuivauksen apuaineeksi tekee 20 mahdolliseksi valmistaa tuotetta, jonka jäännöskosteuspi- toisuus on 0,2 %.

Tällä tavalla saatu tuote soveltuu muutettavaksi suun kautta annettaviksi tableteiksi.

Esimerkki 5 25 Noudatetaan esimerkin 2 mukaista menettelytapaa, mutta SAM eluoidaan 0,1 M fosforihappoliuoksella 0,1 N suolahapon asemesta.

Ennen kylmäkuivausta lisätään riittävä määrä väkevää fosforihappoa, jotta H3P04:n ja SAM:n moolisuhteeksi 30 saadaan 5:1.

Saadaan 4,26 kg tuotetta,jolla on seuraava koostumus: SAM+ 44,4 %; H3PC>4 54,6 %: H20 1 %.

Analyyysitiedot esitetään taulukossa 7 ja ne täsmäävät kaavan 35 C15H22N605S.5H3P04.0,5H20 11 72525 mukaiseen tuotteeseen.

Esimerkin 1 mukainen ohutkerroskromatogafia osoittaa, että tuote ei sisällä mitään epäpuhtauksia.

Uusi tuote tunnistettiin myös esimerkissä 1 kuva-5 tulla entsymaattisella menetelmällä.

Työskentelemällä esimerkissä 1 kuvatulla tavalla on mahdollista valmistaa suoloja, joissa suolan muodostus on eriasteista, ja erityisesti suolat SAM.4H3P04.0,4H20 ja 10 SAM.6H3P04.0,7H20, joiden analyysitiedot esitetään taulukossa 7.

. „ 12 72525 c -d" o

VO CO

Ä s; ^^CvaCMCNJCSji-TrH^ rH VO W v_r d

-P

JO ^ VO rH Ov J- Ov tn o ^ n tv~ ca oT 3" ctn~ vovo Ά a- \o vo 3- γα a d

< -P

CO-P ^C^^CVJ^sOCVJonfrOv <*> x,

m νΟνΟνΑΑ-νΟνΟΆ3 CA

(Ö

I—I

d t? cj ^A VA CA ^+- CA CA Ά j® ^ ^ o^ Ov^ 3- Ο O u~\ CV) w )3 3: 3 ^ >λ >λ j” <α γα

» f rH rH

d t! £-covorHCAoOrHvo co V ^ H- H. “ °_ «1 ^

CP yj M r-l H

(0 rH

d

Γ" -P

/-1 5 Ονοσννο,νο,υΛ^- γα αο ° :2 °_ ® μ >Λ (xj_ h ^ to ® x _

d d rH rH rH H rH rH rH

Ή S +» 5 iri S? CO rH VA \β CA ΓΑ y\

(0 dPQJ Ovco Ov cv) A) CA VA CA .A

h x ----------

03 ^'CVtrHvA.d-CAoOvcO

CÖ rHrHrHrHMrHrH

r—I

o _ CV) „ 0 0 0 0 0 0

_, °N ^ °N X™ x™ ϊΝ aT1 KN

S 5 ο g 3. o 3 r ε 2 o *000000 y ^ ······ • · · -^- 'ΛνΟ-^ 'Λνο r* rH rH rH P* fL CL· 2 2 ^ ^ “ S S ”h “>A MOv 5 <£ O^ 0M 010 O^ O^ o" O™ O^ .¾ X° X° X° ώ° ^ s>° ^>

•H VP £- CP VO A- CO -j- 3v- Q

n ►J'1 cv) cv) cv) - cm γα ca 3 E JA ΧΙΛ» VTN XIA Ä1A KIA ^ Kva Xia « cT· cT cT cT1 o"1 cT* cT cT cT*

O

cv) o x o o o o N ^ w CV) CV) CV) 3'Koooxxx o tv- CV) CV) CV) ^)- VA N-

• · X tc X

Π3 ° *. Ο nt ά a- o o o rH HT ...

o %. O * o o o 5 r-3 m ^J- ^J- ^3- rrt OCV)0..*000 03 COXCOrHrHrHXXp:

CV) va CV) O O O CA CA (A

X *XXXXXXX

<MC\)CA^-uS53^^ ·········

WWCOCOCOCOCOCOCO

13 72525

Kuvatulla tavalla valmistettujen suolojen stabiili-suuskokeet suoritettiin pitämällä tuotetta uunissa, jonka lämpötila oli säädetty 45°C:seen ja määrittämällä jäljellä olevan suolan osuus prosentteina tiettyjen ajanjakso-5 jen kuluttua. Kokeet suoritettiin käyttäen vertailukohteina tunnetulla menetelmällä (US-patenttijulkaisu 2 969 353) valmistettuja SAM.nHCl-suoloja, joissa n on 1, 2 ja 3, sekä myös tunnetulla tavalla (DE-hakemusjulkaisu 1 803 978) valmistettuja SAM.nf^SO^-suoloja, joissa n on 10 0,5, 1 ja 1,5.

Seuraavat taulukot osoittavat hajoneen suolan osuuden prosentteina ilmoitettujen ajanjaksojen kuluttua:

Taulukko 1 15 SAM.nHCl

Hajoaminen 45°C:ssa n jäännös- 60 päivän 120 päivän 180 päivän 240 päivän 360 päivän kosteus kuluttua uluttua kuluttua kuluttua kuluttua 20 1 0,2 % 100 % 100 % 100 % 100 % 100% 2 0,5 % 80 % 100 % 100 % 100 % 100 % 3 0,8 % 30 % 60 % 80 % 100 % 100 % 4 1 % 5 % 10 % 14 % 17 % 20 % 51,5% - 1,5 % 3% 4,5% 5% 25 6 2 % 5 % 10 % 14 % 17 % 20 %

Taulukko 2 SAM.nH2S04 hajoaminen 45°C:ssa 30 0,5 0,2 % 100 % 100 % 100 % 100 % 100 % 1 0,5 % 80 % 100 % 100 % 100 % 100 % 1.5 0,8 % 30 % 60 % 80 % 100 % 100 % 2 1 % 5 % 10 % 14 % 17 % 20 % 3.5 1,5 % - 1,5 % 3 % 4,5 % 5 % 35 3 2 % 5 % 10 % 14 % 17 % 20 % 14 72525

Taulukko 3 SAM.1,5 H2S04.n HC1

Hajoaminen 45°C:ssa 5 n jäännös- 60 päivän 120 päivän 180 päivän 240 päivän 360 päivän kosteus kuluttua kuluttua kuluttua kuluttua kuluttua 1 1 % 5 % 10 % 14 % 17 % 20 % 2 1,5 % - 1,5 % 3 % 4,5 % 5 % 3 2 % 5 % 10 % 14 % 17 % 20 % 10

Taulukko 4 SAM 2HC1. nH2SO.

hajoaminen 45°C:ssa 0,5 0,8 % 30 % 60 % 80 % 100 % 100 % 15 1 1 % 5 % 10 % 14 % 17 % 20 % 1,5 1,5 % - 1,5 % 3 % 4,5 % 5 % 2 % 5 % 10 % 14 % 17 % 20 %

Hajoamattoman SAM:n prosentuaalinen osuus ilmoi- 20 tettujen ajanjaksojen kuluttua määritettiin uudella jäljempänä kuvatulla menetelmällä, joka takaa mittausten parhaan mahdollisen tarkkuuden, koska se tekee mahdolliseksi erottaa SAM:n täydellisesti kaikista mahdollisista hajoamistuotteista.

25 Tässä suhteessa on todettu,että tähän asti käyte tyllä, analyyttisen Dowex 50-ioninvaihtohartsipylvääseen perustuvalla menetelmällä (Schlenk ja De Palma, J. Biol. Chem. 229 (1957)) SAM:n erottuminen tietyistä hajoamistuotteista, erityisesti metyylitioadenosiinista, ei ollut 30 täydellistä, ja se johti sen vuoksi virheeseen SAM:n stabiilisuuden arvioinnissa stabiilisuuden näyttäessä todellista paremmalta.

Tämä menetelmä SAM:n määrittämiseksi perustuu HPLC:n käyttöön.

35 Käytetyt analyysiolosuhteet: is 72525 - pylväs PARTISIL 10 SCK - 2,5 x 250 mm - eluentti 0,1 M ammoniumformaatti, jonka pH on 4, ja joka sisältää 20 % metanolia HPLC:ä varten - virtaus ml/minuutti 5 - SAM retentioaika noin 400 sekuntia.

Taulukkojen 1, 2, 3 ja 4 tiedoista käy selville, että SAM-suolat saavuttavat suurimman stabiilisuutensa sisältäessään 5 happoekvivalenttia. Suolat, jotka sisältävät 4 tai 6 ekvivalenttia ovat vielä varsin stabiileja, 10 kun sen sijaan vähemmän happoekvivalentteja sisältävät suolat eivät ole käyttökelpoisia epästabiilisuutensa vuoksi.

On myös ilmeistä, että stabiilisuus noudattaa samaa kaavaa käytetystä haposta riippumatta, edellyttäen,että 15 hapon kP on alle 2,5.

Ei ollut mahdollista valmistaa 4-6 happoekvivalenttia sisältäviä suoloja sellaisten happojen kanssa, joiden pK on yli 2,5.

Stabiilisuuskokeet suoritettiin samaa menetelmää 20 käyttäen myös suoloilla, jotka valmistettiin kulmäkuivauk-sen apuaineen ollessa läsnä esimerkkien 3 ja 4 mukaisesti.

Näiden määritysten tulokset esitetään seuraavissa taulukoissa 5 ja 6. Kosteuspitoisuuden ratkaiseva väheneminen suoritettaessa kylmäkuivaus apuaineen ollessa läsnä 25 on ilmeistä, samoin kuin sen seurauksena oleva suolojen kokonaisstabiilisuus, joka tällä tavalla saavutetaan.

is 72525

Taulukko 5 SAM 5 HCl jäännöskosteus hajoaminen 45°C:ssa __360 päivän kuluttua 5 kylmäkuivattu ilman apuainetta 1,5 % 5 % kylmäkuivattu mannito-lin kanssa 10 (100 g SAM+ + 120 g mannitolia 0,1 % kylmäkuivattu Aerosilin kanssa 15 (100 g SAM+ + 100 g

Aerosilia) 0,2 %

Taulukko 6 2o SAM. 2,5 H2S04 kylmäkuivattu ilman apuainetta 1,5 % 5 % kylmäkuivattu 25 mannitolin kanssa (100 g SAM+ + 120 g mannitolia 0,1 % kylmäkuivattu 30 Aerosilin kanssa (100 g SAM+ +100 g Aerosilia) 0,2 17 72525

Suoloilla SAM.5HC1 ja SAM.2,suoritettiin laaja farmakologinen tutkimus ja kaikissa tapauksissa niillä osoittautui olevan erittäin mielenkiintoiset vaikutukset-ja myrkyllisyysominaisuudet, jotka olivat riippumattomia 5 SAM:iin sitoutuneesta anionista. Osoitettiin, että uusien suolojen vaikutus riippuu olennaisesti eliössä vapautuneen SAM+-ionin kyvystä toimia metyyliryhmien luovuttajana samalla tavalla, kuin monien rasva-, valkuaisaine- ja sokeri-aineenvaihdunnan perusreaktioita katalysoivien transmety-10 laasientsyymien luonnollinen substraatti.

Uusien suolojen vaikutus aiheutuu siis suureksi osaksi siitä, että ne tekevät S-adenosyylimetyylitioniinin ehdottoman stabiiliksi alle 45°C:n lämpötiloissa mahdollistaen siten sen transmetylointivaikutuksen 100-%:sen hyväksikäytön 15 ihmisessä ilman sitä vaaraa, että muodostuu myrkyllisiä hajoamistuotteita jotka häiritsevät SAM+:n aktivoimia biologisia prosesseja.

Myrkyllisyys Määritettiin akuutti myrkyllisyys hiirillä, jolloin 20 saatiin kummallakin suolalla seuraavat arvot: LD^q suun kautta annettuna yli 3 g/kg LD^q laskimonsisäisesti annettuna 1,1 g/kg

Siedettävyyttä ja kroonista myrkyllisyyttä koskevat kokeet suoritettiin Wistar- ja SPrague-Dowley-kannan ro-25 tiliä antamalla niille päivittäin tuotetta 20 mg/kg 12 kuukauden ajan. Käsittelyn päättyessä eri elimissä ja elin-ryhmissä ei esiintynyt patologisia muutoksia.

Epämuodostumien syntykokeet suoritettiin kaneilla. Annettaessa kymmenen kertaa suurempia suola-annoksia kuin 30 suurinnat terapeuttiset annokset ei todettu mitään teratogeenistä tai epämuodostumia aiheuttavaa vaikutusta alkioon tai loppuvaiheessa olevaan sikiöön.

Laskimonsisäisesti jopa 200 mg/kg:n annoksien antaminen ei aiheuttanut kanilla kuumeoireita.

35 Laskimoon antaminen annoksen ollessa 40 mg/kg ei aiheuttanut kanilla ja rotalla muutosta kaulavaltimos ta mitatussa verenpaineessa, sydämen lyöntitiheydessä, hengitystiheydessä eikä EKG-käyrässä.

ie 725 2 5 »

Lihaksensisäisen ruiskeen paikallinen sietokyky, 5 jopa sen jälkeen kun antamista oli toistettu 30-60 päivän ajan, ja kanin ulkokorvan pintalaskimoon annetun laskimo-ruiskeen paikallinen sietokyky olivat erinomaisia.

Farmakologia

Kokonainen sarja rotilla suoritettuja kokeita on 10 osoittanut, että uudet suolat synnyttävät hyvin huomattavan suojavaikutuksen rasvamaksaa vastaan sekä rasvamaksaa vähentävän vaikutuksen joka rasvamaksa on saatu aikaan runsaasti rasvaa ja valkuaisaineita sisältävällä ruokavaliolla Handlerin mukaisesti, tai joka aiheutuu akuutista 15 alkoholin aiheuttamasta myrkytyksestä tai muista myrkyllisistä aineista, jopa 10 mg/kg SAM+:a sisältäviä annoksia annettaessa.

Rotalla kokeellisessa veren runsasrasvaisuudessa, joka on aiheutettu esimerkiksi Triton S:llä, uudet suolat 20 ovat osoittaneet hyvin selvää rasvapitoisuutta alentavaa vaikutusta, joka käytetty annos, so. 10 mg/kg (jälleen SAM+:na ilmaistuna), huomioon ottaen oli paljon voimakkaampi kuin muita rasvapitoisuutta alentavia lääkkeitä käytettäessä.

25 Kanoilla, joille oli aiheutettu ateroskleroosi run saasti kolesterolia ja fruktoosia sisältävällä ruokavaliolla, uuden tuotteen parenteraalinen antaminen 10 mg/kg:n annoksina laski veren runsasta kolesterolipitoisuutta ja muutti edullisesti rinta- ja vatsa-aortan sekä arvopohjan 30 pienten verisuonien tarkkailussa todettuja vaurioita.

Mitä tulee fosfolipidiaineenvaihduntaan, kokeellisesti todettiin fosfatidyylikoliinimäärän nousu sellaisten rottien maksakudoksessa, joilla oli hoitamaton rasvamaksa. Selvä fosfatidyylikoliinin lisäys veren α-lipcpro teiinien 35 kustannuksella määritettiin myös kokeellisin muutoksin, jotka saatiin aikaan β- ja α-lipoproteiinien suhteilla.

19 72525

Kaikki nämä kokeet ovat selvästi osoittaneet uusien suolojen lipidiaineenvaihdunnan muutoksia parantavan vaikutuksen .

Toinen rotalla suoritettu koesarja on osoittanut, 5 että 1 mg/kg:n annosten antaminen saa aikaan glykogeeni- varastojen kerääntymisen maksa- ja lihastasolle, mikä osoitetaan sekä histokemiallisin menetelmin että kvantitatiivisin määrityksin. Kokeellisessa alloksaanilla aiheutetussa diabeteksessa välttämätön insuliinimäärä kohonnei-10 den verensokeriarvojen palauttamiseksi normaaliksi laski huomattavasti annettaessa SAM+-määrää 0,5 mg/kg vastaava annos tuotetta.

Tämä koesarja on osoittanut keksinnön mukaisten uusien yhdisteiden selvän positiivisen vaikutuksen sokeriaineen-15 vaihduntaan.

Lopuksi käsiteltiin rottia, joille oli kokeellisesti saatu aikaan veren valkuaisainepitoisuuden aleneminen, SAM:11a määrien ollessa 10 mg/kg. Todettiin, että mainittu tuote palauttaa kokonaisvalkuaisainearvot normaaleiksi 20 nostamalla merkittävästi albumiinipitoisuutta ja osoitta en siten merkittävää proteiinianabolista vaikutusta.

Tämä ja muut samanlaiset kokeet ovat osoittaneet uusien tuotteiden valkuaisaineaineenvaihdunnan toimintahäiriöitä parantavan vaikutuksen.

25 Yhteenvetona edellä mainittujen farmakologisten ja monien muiden kokeiden perusteella, jotka ovat mahdollistaneet uusien suolojen tutkimisen kaikilla ihmiselimistön tasoilla, uusien tuotteiden vaikutus on kliinisesti todistettu maksasairauksissa akuutin ja kroonisen maksan 30 vajaatoiminnan ollessa kyseessä, neurologiassa masennusta lievittävinä aineina ja luuston sairauksissa reuman tapaisten niveltulehdusten ollessa kyseessä.

Vaikutusta lukuisilla muilla ihmisten hoidon alueilla tutkitaan.

35 Uudet suolat voidaan antaa suun kautta tai lihaksen- tai laskimonsisäisinä ruiskeina.

Muita mahdollisia antomuotoja ovat peräpuikot,silmiin laitettavat nesteet, aerosolit tai paikallisesti käytettävät muodot.

Claims (7)

20 72525

1. Menetelmä terapeuttisesti käyttökelpoisten S-adenosyy-limetioniinisuolojen (SAM-suolojen) valmistamiseksi, joilla 5 on kaava NH? N *

10 CH3 CH -CH-CH-CH-CH„-S-CH_-CH_-CH-COO~ . nX~ f I 2 . 2 2 | OH OH NH2 -O — 15 jossa X on suolahapon, rikkihapon tai fosforihapon happoekvi-valentti ja n on 4, 5 tai 6, tunnettu siitä, että epäpuhtaan SAM-suolan väkevä vesiliuos puhdistetaan johtamalla se heikosti happaman ioninvaihtohartsipylvään läpi, SAM elu-oidaan halutun hapon HX laimealla vesiliuoksella, eluaattiin 20 lisätään tarvittava määrä happoa, joka tarvitaan haluttua suolaa vastaavan täsmällisen stökiometrisen määrän saavuttamiseksi, minkä jälkeen liuos väkevöidään ja erittäin puhdas suola erotetaan kylmäkuivausta käyttäen, edullisesti inertin aineen, kuten mannitolin tai jauhemaisen piihapon läsnäollessa.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnet- t u siitä, että SAM:n vesiliuoksen pH säädetään 6:n ja 7:n välille, edullisesti 6,5:een.

3. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnet-t u siitä, että heikosti happamana ioninvaihtohartsina käyte- 30 tään styreeni-divinyylibentseeni-kopolymeereja.

4. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnet-t u siitä, että eluenttina käytettävän hapon HX liuoksen kon-sentraatio on 0,1 N.

5. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnet- 35. u siitä, että stökiometrisestä määrästä puuttuva happo HX lisätään eluaattiin väkevän kaupallisen vesiliuoksen muodossa. 21 72525

6. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, t u n n e t tu siitä, että eluaatin sisältäessä ylimäärin happoa HX stökiömetriseen määrään nähden tämä ylimäärä poistetaan vahvasti emäksistä ioninvaihtohartsia 5 käyttäen.

7. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, t u n n e t tu siitä, että eluaatti väkevöidään pitoisuuteen 50-100 g/1 SAM:a. 72525