PL137816B1 - Method of obtaining stable delta-adenozilomethionine salts - Google Patents

Description

Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarza¬ nia nowej grupy soli S-adenozylometioniny (SAM), które sa bardzo trwale w podwyzszonych tempe¬ raturach i w ciagu praktycznie nieokreslonych o- kresów czasu.Wiadomo, ze S-adenozylometionina jest produk¬ tem pochodzenia naturalnego, obecnym we wszy¬ stkich zywych organizmach, w których jest ak¬ tywnie syntetyzowana przez specjalny enzym. S- -adenozylometionina, okreslana skrótem SAM ma budowe okreslona wzorem 2.SAM uczestniczy w wielu procesach metabolicz¬ nych o podstawowym znaczeniu dla organizmu Juldrikiego i w zwiazku z tym jej niledobór lezy u podstaw wielu nieprawidlowych czynnosci or¬ ganizmu. iMiimo, ze donioslosc biologiczna tego zwiazku jest znana od kilku dziesiecioleci, to mozliwosci badania go i stosowania jako leku istnieje zale¬ dwie od kilku lat, z powodu jego wyjatkowej nde- trwalosci w temperaturach przekraczajacych 0°C.W zwiazku z tym, dopiero w 1975 roku udalo sie otrzymac sol SAM, która miala nalezyta trwa¬ losc w temperaturze 25°C (opis patentowy St.Zjedn, Ameryki nr 3 8931999), a nastepnie w 1976 roku niektóre sole o dobrej trwalosci w tempera¬ turze 45°C (opisy patentowe St. Zjedn. Ameryki nr 396^726 i 40157686).Scislej, opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 3 890 9919 dotyczy trójparatoluenosul- 10 U fonianu SAM, opis patentowy St. Zjedn. Ame¬ ryki nr 3 95J4 72I6 dotyczy dwusiarczanu dwuparai- toluenosulfoniianu SAM a opis patentowy St. Zjedn.Ameryki nr 4 057 606 dotyczy grupy soli SAM, które mozna okreslic ogólnie wzorami SAM. 4RS03H lub SAM.3RIS03H, w których RSO»H o- znacza równowaznik kwasu sulfonowego, który czesciowo moze byc zastapiony równowaznikiem kwasu siarkowego.W opisach tych stwierdzono, ze nie mozna wy¬ jasnic dlaczego tylko szczególne, zastrzezone sole sa trwale, podczas gdy sole SAM wytwarzane we¬ dlug wczesniiej znanych metod, a mianowicie jed- nochlorek lufo diwusiarczan, mialy przy najwiek¬ szych wysilkach ograniczona trwalosc w czasie, o ile .przechowywano je w temperaturze 4°C, ani tez dlaczego trójparatoluenosulfonian byl trwaly tylko do 25°C natomiast dwusiarczan dwupara- toluenosulfonianu byl trwaly do 45°C.(Nieoczekiwanie stwlierdzono, ze trwale sole SAM mozna wytwarzac podczas zobojetnienia SAM 4^-6 molami mocnego kwasoi nieorganicznego o warto¬ sci pK nizszej niz 2,5.Scislej biorac, nieoczekiwanie stwierdzono, ze jezeli wytwarza sie sól SAM z kwasem o warto¬ sci pK nizsizej niz 2,5, to otrzymuje sie sól o naj¬ wyzszej trwalosci, jezeli zawiera ona 5 moli kwa¬ su. Sole zawierajace 4 lub 6 moDi kwasu maja trwalosc nadal dobra ale zdecydowanie nizsza. lSole zawierajace 1—3 moli kwasu sa absolut- 137 816S 137 816 4 nie nieodpowiednie do celów terapeutycznych, gdyz ulegaja powaznej degradacji.JNalezy podkreslic, ze poniewaz wszystkie nowe sole wytwarzane siposobem wedlug wynalazku ma¬ ja zastosowanie w leczeniu ludzi, obecnosc nawet malej procentowo ilosci produktu rozkladu jest niedopuszczalna nie tylko ze wzgledu na wyni¬ kajacy z tego spadek aktywnosci, ale równiez, a nawet szczególnie, ze wzgledu na to, ze wystepo¬ wanie tego produktu wskazuje na tworzenie sie metabolitów, które jak stwierdzono, sa lekko tok¬ syczne d zaklócaja procesy biologiczne. iStwierdzono ponadto, ze trwalosc nowych soli SAM ksztaltuje sie pod bezposrednim wplywem polarnosci srodowiska, a zatem szczególnie zalezy od ilosci obecnej wilgoci, dlatego tez wazne jest zastosowanie srodków umozliwiajacych obnizenie poiziomu wilgoci do wartosci zblizonych do ze¬ ra.Sole SAM wytwarzane sposobem wedlug wyna¬ lazku okreslone sa wzorem 1, w którym X ozna¬ cza kwasowy równowaznik mocnego kwasu mine¬ ralnego o wartosci pK nizszej niz 2,5 a n oznacza liczbe 4, 5 lub 6.(W rzeczywistosci stwierdzono, ze X moze byc tylko równowaznikiem HO, H2S04 lub H3PO4, gdyz HNG3 i HOO4 sa. kwasami niedopuszczalny¬ mi do stosowania terapeutycznego z powodu ich toksycznosci a HBr i HJ nie moga byc stosowane, poniewaz powoduja potrójne demetylowanie SAM.Te kwasy, które moka byc uzywane do wytwa¬ rzania nowych soli sposobem wedlug wynalazku, maja nastejpujace wartosci pK: HO: pK<0,5 H^SO4:pK<0,5' KI stadium dysocjacji); HtfPC^flpK =®jL2 (1 stadium dysocjacji) pK=il,a2 (2 stadium dysocjacji) Seisilej biorac, nowe so&e wytwarzane sposobem wedlug wynalazku tworza grupy produktów okre¬ slone wzorami 3, 4 i 5, w których to Wzorach X oznacza O", l/a/SC^--/ l\*b HfiOe-* {Potwierdzono, ze aowe sole sa bardzo uzyteczne w wifcfoi dfciedzanach terapii ia ludzi, na przyklad jako hepatoptotetetory, czyli substancje chroniace watroba, co bedzie wyjasnione w dalszej czesci 0$tel.Sposób wytwarzania nowych soli SAM wedlug wjtaalazku polega na przeprowadzeniu procesu o- be^mujaceigo nastepujace zasadnicze 'etapy, wszy¬ stkie majace 6ecydaja)ce znaczenie dla otrzymania produktu o sbsoliataiej trwalosci i posiadajacego powtarzalna czyistosc wymagana w fanmacji: a) wytwarzanie stezonego, wodnego roztworu su¬ rowej soli SAM dowolna znana metoda, Ib) oczyszczanie tego roztworu metoda chroma- tograificzna przez praejMi&zczanie go sprzee kolumnie wypelniona slabo kwasna zywica jonowymiemria, (e) eluowanie SA!M rozcienczonym, wodnym roz¬ tworem odpowiedniego frwasu, d) miarecafeowaaiie otrzymanego eluatu i dtfpro- w&daeinie ilosci kwasu do atesunku scisle stechio- metrycznego w odniesieniu do ilosci SAM obecnej w roztworze, e) zatezanie eluatu, f) liofilizacja. 5 Roztwór wodny otrzymany w etapie a) moze 0- czywisoie zawierac dowolna rozpuszczalna sól SAjM, poniewaz anion tej soli jest eliminowany podczas nastepujacego po tym etajpie przepuszcza^ nia tego roztworu przez kolumne i dlatego anion ten nie zaklóca pozostalej czesci procesu. Na ogól, przy normalnym przebiegu procesów obej¬ mujacych zatezanie i ekstrakcje SAM z drozdzy, otrzymuje sie roztwór zawierajacy jon SAM+ i jon SO4--. We wszystkich przypadkach pH roz¬ tworu doprowadza sie do wartosci zawartej w za¬ kresie 61—7, korzystnie do 6,15.Etap oczyszczania chromatograficznego b) pro¬ wadzi sie korzystnie przy uzyciu Amberlite IRCI50 lub Amberlite CG 50.Etap eluowaniia c) prowadzi sie korzystnie 0,1'N wodnym roztworem odpowiedniego kwasu.Jezeli miareczkowanie eluatu (etap d wskazuje na to, ze ilosc równowazników kwasu obecnych w roztworze jest mniejsza od ilosci wymaganej (4, 5 lub 6), co zdarza sie zwykle, wtedy dodaje sie taka ilosc kwasu, która odpowiada scisle nie¬ doborowi, ^w postaci stezonego, technicznego roz¬ tworu wodnego. Jednak, jezeli okaze sie, ze w roztworze znajduje sie nadmiar kwasu, to nadmiar ten usuwa sie przez traktowanie roztworu siliniie zasadowa zywica jonowymienna w postaci OH", na przyklad zywica Amberlite IRA-4(X1.IW etapie e) eluat zateza sie do wartosci opty¬ malnej z punktu widzenia nastepujacego po nim procesu liofilizacji, czyli do wartosci zawartej w zakresie 5K)—-100 g/l, a korzystanie okolo 7G g/l.Koncowy etap liofilizacji prowadzi sie znanymi metodami w celu otrzymania doskonale wykrysta¬ lizowanej soli o 10'Op/o czystosci.Jezeli liofilizacje prowadzi sie w obecnosci od¬ powiedniej substancji obojetnej, to otrzymuje sie produkt o nizszej zawartosci resztkowej wilgoci, a wiec bardziej trwaly.(Bardziej szczególowo, stwierdzono, ze jezeli wy¬ twarzana sól zamierza sie stosowac w postaciach farmaceutycznych nadajacych sie do wstrzykiwa¬ nia, to liofilizacje nalezy prowadzic w obecnosci mannitu. Jezeli jednak nowa sól ma byc preparo¬ wana w postaci tabletek do podawania doustnego, to liofilizacja powinna byc prowadzona w obec¬ nosci sproszkowanego kwasu krzemowego.Ponizej podano kilka praktycznych przykladów preparatywnych, które sluza ilustracji sposobu we¬ dlug wnalazku i umozliwiaja otrzymanie nowych iproduktów z latwiejsza odtwarzalnoscia.Przyklad I. Do £00 kg drozdzy wzbogaco¬ nych ^w SAiM modogia, 2®, 283 /1S6&/] dodano w temperaturze 0- toczenia 116 1 octanu etylu i 11)0 1 wody.Po trwajacysn 30 minult energicznym mieszanki doda**© 500 1 0,35 N kwasu- -siarkowego i miesza¬ nie kontynuowano dalsze póltorej godziny.Mieszanitoe. przesaczano a ^pozostalosc przemyto woda i otrzymano 14"0O 1 roztworu zawierajacego 15 20 25 30 35 4* 45 50 555 137 81* t 4,40 g/1 SAM, co odpowiada 80,5»/§ tej *ksei, któ¬ ra byla obecna w materiale wyjsciowym.Podczas mieszania do roztworu dodano 23 kg kwacu pifcrotonowego w 250 l metyloetyloketonu.Po odstawieniu na noc oddzielono przez wirowa¬ nie' i przemyto woda wytracony osad. Osad ten rozpuszczono mieszajac go w temperaturze oto¬ czenia z 6® 1 HN roztworu kwasu siarkowego w metanolu. Po odsaczeniu sladów nierospuszczone- go materialu do roztworu dodano 500 1 aceto¬ nu.Po calkowitej sedymentacji wytraconego osadu zdekantowano przezroczysta ciecz a nierozpuszczal¬ na pozostalosc przemyto mala iloscia acetonu. O- sad rozpuszczono w 800 1 wody destylowanej, do¬ dano 2 kg odbarwiajacego wegla drzewnego i mieszanine przesaczono.Przygotowano kolumnie z 2O0 1 zywicy Amber- liite IRC 50 w postaci H+ i starannie przemyto ja woda destylowana. Do otrzymanego wczesniej roztworu wodnego dodano mieszajac 4$ kg lodo¬ watego kwasu octowego a nastepnie dodawano 2N roztwór NaOH do czas-u, az roztwór uzyska wartosc pH. = 6,5, Roztwór ten przepuszczano przez kolumne wy¬ pelniona zywica z szybkoscia 400 Vh, która utrzy¬ mywano na stalym poziomie w ciagu calego pro¬ cesu. Nastepnie przez kolumne przepuszczano ko¬ lejno 200 1 wody destylowanej, 1600 1 0,1 M kwa¬ su octowego i 200 1 wody destylowanej.SAM eluowano 400 1 0,1 N roztworu kwasu siarkowego. Otrzymane w ten sposób 400 1 ehiatu zawiera okolo 4 kg SAM. Eluat zatezano pod ob¬ nizonym cisnieniem do objetosci 60 1. iDo zatezomego roztworu dodano 0,5 kg wegla drzewnego i mieszanine przesaczono. Roztwór mia¬ reczkowano. Dodawano stezony kwas siarkowy do czasu, az uzyskano stosunek molowy H2SO4/ /SAM 2,5:il, a nastepnie roztwór liofilizowano. O- trzymano 6/5 kg produktu o nastepujacym skla¬ dzie: SAM+ W* H2SO4 3f7^/f, H20 -1&I: Otrzymana sól miala postac krystaliczna i by¬ la rozpuszczalna w ,ponad zWo w wodzie tworzac bezbarwny roztwór, natomiast byla nierozpusz¬ czalna w zwyklych rozpuszczalnikach organicz¬ nych. Chromatografia- cienkowarstwowa przepro¬ wadzona wedlug AnaJ. Blochem. 4, 10—38/1071/ wykazuje, ze produkt jest wolny od wszelkich zanieczyszczen.W tablicy 1 podane sa dane analityczne, wy¬ kazujace zgodnosc z budowa zwiazku o wzorze sumarycznym Ci5H22iN^$S.2^5H2iSO4.0,i5iH2O.Nowy zwiazek zidentyfikowano równiez metoda enzymatyczna oparta na enzymatycznym metko¬ waniu amidu kwasoi nikotynowego i gunanidyny — kwasu octowego za pomoca SAiM [G. L. Cantoni, J. Biol. Chem. 180, 74& /195H7, G. De La Holba, B.A. Jameison, S. H. Mudde, H. H. Richarda, J. Am.Chem. Soc. 81, 3075 A«WJ.Powtarzajac opteany proces w identyczny spo¬ sób, ale przed liofilizacja dodajac taka ilosc kwa¬ su siarkowego, zeby stosuttefc molowy podwyzszyc do 3:1 w odndesieniai do SAiM, otrzymuje sie sól SAMaaH2SO<4j0,7iH2O, której dane analityczne po¬ dane sa w tablicy 1. Podobnie, obnizajac stosunek •molowy H*$ trzymuie sie sól SAMaH^SO^O^^O, której dane analityczne podane *a w tablicy 1.Przyklad II. Do 700 1 roztworu otrzymanego przez lize komórek drozdzowych prowadzona z zastosowaniem takiego samego materialu wyjscio¬ wego i sposobu postepowania jak w przykladzie I dodano 11,5 kg kwasu pitoroflonówege rozpuszczo¬ nego w 100 1 alkoholu izebutylowego.Po pozostawieniu na noc, utworzony osad od¬ dzielono przez wirowanie. Osad rozpuszczono mie¬ szajac w temperaturze otoczenia w 31 1 IN roz¬ tworu kwasu siarkowego w etanolu. Po odsacze¬ niu malej ilosci nierozpuszczonej substancji, do roztworu dodano 250 1 eteru etylowego. Po od¬ staniu mieszanine przesaczono i oddzielone cialo stale przemyto mlala iloscia eteru. Osad suszono pod obnizonym cisnieniem. Cialo stale rozpusz¬ czono w 400 1 wody, do roztworu dodano ! kg odbarwiajacego wegla drzewnego i mieszanine przesaczono.Do roztworu dodano lodowaty kwas octowy, wartosc pH doprowadzono do 6,5 i roztwór prze¬ puszczono przez kolumne wypelniona Amberlite IRC 50 w sposób opisany w przyfcalcMe I. SAM eluowano z koflumny 200 1 IN roztworu kwaau solnego.Eluat zatezono pod obnizonym cisnieniem do objetosci 30 1. Dodano 0,25 kg aktywnego wegla drzewnego i mieszanine przesaczono. Rozfcwór mia¬ reczkowano i dodano do niego stezony kwas soi- ny w ilosci odpowiedniej do uzyskania stosunku molowego HiCl/SiAIM 3:1 ? Roztwór liofilizowano, Otrzymano %A kg produktu o nastepujacym skla¬ dzie: SAM+ OT^f/f, HC1 30#V* H«0 lyP/s, Otrzymana sól ma postac krystaliczna i jest rozpuszczalna w ponad 30*/* w wodzte, tworzac bezbarwny roztwór. Sól jest slabo rozpuszczalna w zwyklych rozpuszczalnikach organicznych. Chro¬ matografia cienkowarstwowa prowadzona jalc w przykladzie I wykazuje, ze otrzymany zwiazek jest wolny od wszelkich zanieczyszczen. Dane anali¬ tyczne podanie' w tablicy 1 wyikazuja zgodnosc z budowa zwiazku o wzorze sumarycznym Ci5H23jN*OfS.5Ha.Nowy zwiazek zidentyfikowano równiez metoda enzymatyczna opisana w przykladzie I.Postepujac w sposób opisany w przykladzie I mozna otrzymac sole o róznych stopniach sali- fikacji, a scislej sole: SAM.4JHO1.0,4H2O SAMj6iHC1.0,7H2O, których dane analityczne sa podane w tablicy 1.Przyklad III. Sposób opisapy w przykla¬ dzie I powtórzono identycznie, z tym, ze do roz¬ tworu przed liofilizacja dodano 4,75 kg apyroge- nicznego mannitu. Roztwór liofilizowano^ nastep¬ nie w wykly sposób, Dodanie mannitu jako sub¬ stancji wspomagajacej Mobilizacje pozwala na o- trzyntanle produkitu posiadajacego resztkowa za¬ wartosc wilgoci Ojl*/o. Produkt otrzymany w ten sposób nadaje sie do przeróbki ngt preparaty far¬ maceutyczne do wstrzykiwania.P r *j k l a d IV. Powtarzano postepowanie z 10 11 U 25 tt 35 41 45 56 ff «4137 816 przykaldu I. Do roztworu przed liofilizacja do¬ dano 4 kg Aerosil, czyli pylistego kwasu krzemo¬ wego, i otrzymana koloidalna zawiesine poddano liofilizacji. Dodanie Aerosilu jako substancji wspomagajacej liofilizacje pozwala na otrzymanie produktu o zawartosci wilgoci resztkowej 0,2%.Produkt otrzymany w ten siposób nadaje sie do przeróbki na tabletki do podawania doustnego.Przyklad V. Powtarzano postepowanie z przykladu II, przy czym SAM eluowano 0,1 M roztworem kwasu fosforowego zamiast 0,1 N roz¬ tworem kwasu solnego. Przed liofilizacja dodano odpowiednia ilosc stezonego kwasu fosforowego, zeby otrzymac stosunek molowy HgP04/SAM 5:1.Otrzymano 4,26 kg produktu o nastepujacym 10 19 kowano równiez metoda enzymatyczna opisana w przykladzie I.Postepujac w sposób opisany w przykladzie I mozna otrzymac sole o róznych stopniach saHifi- kacjiy a scislej sole: 6AM.4H3PO4.0,4H2O SAM.tiHiPO4.0,7H2O, kltórych dane analityczne sa podane w tablicy 1.Sole wytwarzane sposobem wedlug wynalazku poddiano badaniom trwalosci, przetrzymujac je w suszarce, w której temperature nastawiono na 45°C i okreslajac procentowa zawartosc pozosta¬ lej soli po uplywie oznaczonych okresów czasu.Badania przeprowadzono w 'porównaniu z solami o wzorze SAMjiHiCil, w którym n oznacza 1, 2 Tablica ! % N % S % SAM Sól Wzór empiryczny Obli- Znale- Obli- Znale- Obli- Znale- czono ziono czono ziono czono ziono El % 266 ran 76iN HjjSO*/ SAM.2HzSO4.0y4H^O ClsH2(iN6O1^Ssj04H2O SAM.2,aH2S04. C15H27N^Oi5S8f5. .0,5H2O X),5H20 SAM.3HzSO4.0,7H2O C1^H2gN6OirS4X),TH20 SAM.4Hai.0,4JH2O C15H2(rN6C%S04^4HzO SAM.5HCL0£H2O ClffH|TN60ffS016/),5lH20 SAM.6HO1.0,7H2O C15H2^NgO5SCle.0,7H2O SAM.4JH3P04/,4H20 C15H84N^021SP4X),4H20 SA'Mj5H3fPO4.0,5H2(O CitfH3TN6O2gSP5.0,!5e2O SAM.6HaP04X).7H20 C1^H4^tfO29SP6.0y7H5O 13,96 12,38- 11,90. 115,26 [14,26 13,33 10,58 9,85 8,4 14,00 12,86 11,819 115,55 14,26 13,16 10,64 9,33 8,38 115,97 17J18 18,16 51,8(1 5,43 5,08 4,01 3,56 3,2 16,01 17,15 118,05 5,^3 6,44 5,03 4,03 3,55 3,2 66,2 GM 56,0 72,2 67,6 63,2 j50,0 44,4 39,9 66,3 60,9 56„4 72,4 67,6 63,1 49,9. 44,4 39,9 242 223 207 264 247 231 176 156 140 skladzie: SAM+ 4!4,4%, HsP04 54^6%,- H^ 1%. Da¬ ne analityczne zestawiono w tablicy 1 wykazuja zgodnosc z budowa zwiazku o sumarycznym wzo¬ rze C1^H22NeO^S.6H3PO4.0,5iH2O. Chromatografia cienkowarstwowa prwadzona jak w przykladzie I wykazuje, ze otrzymany zwiazek jest wolny od wszelkich zanieczyszczen. Nowy zwiazek identyfi- 40 45 i 3 otrzymanymi znana metada (opis patentowy St.Zjedn. Ameryki nr 2969 363) i w porównaniu z solami o wzorze SAM.nH2S04 ,w którym n ozna¬ cza 0,5, 1 i 1/5., równiez otrzymanymi znana me¬ toda (opis patentowy RN nr 1 803 978).W tablicach 2, 3 i 4 podano procent rozkladu soli we wskazanych okresach czasu.Tablica 2 SAMjnHCl li Resztkowa wilgotnosc Degradacja w temiperaturze 45°C po uplywie 60 dni 120 dni AM dni 240 dni 360 dni 1 2 a 4 5 0,2% 0,5% 0,8% l% 1,5% WN4: ad% 30% 6% — 100% 100% 60% 10% 1,5% 100% 100% 80% 14% 3% 100% 100% 100% irfih 4,51% 100% 100% 100% 20% 6% 2% 6% 10% 14% 17% 20%n Resztkowa wilgotnosc 137816 Tablica 3 SAMJ1H2SO4 10 Degradacja w temperaturze 45°C ;po uiplywie 60 dni 1120 dni 180 dni 240 dni 360 dni 0,5 1 1,5 2 3,5 3 02% 0,5% 0,8% 1% 1,5% 2% 100% 60% 30»/o 5% — 6% 1000/0 100% 60% 10% l,5tyo ao% 100% U00% 80% 114% 3% 14% 100% lOO^/o H00% 17% 4,5% 17% 100% 100% 100% ...Ol 20% 6% 20% Tablica 4 SAMjl,5jftiS04jnHCl n 1 2 3 Resztkowa wilgotnosc 1% 1,5% 20/o Degradacja w 60 .dni 5% — 5% 120' idini 10% 1,5% a o^/o temperaturze 180 dni , 14% 3% 14% 45°C po uplywie 240 dni 17% 4,f50/o 17% 360 dni E0% 6% _ ao% Tablica 5 SAM,2HCl.nH2S04 n 0,6 1 *fi 2 Resztkowa wilgotnosc 0,8% 1% 1,5% 2% Degradacja w 60 dni V 80% 5% — 5% 120 dni 00% 10% 1,5% 10% temperaturze 180' dni 00% (14% 3% 14% 45°C po uplywie 240- dni 100% 17% 4,5% 17% 360 dni 100% 20% 5% 20% Udzial procentowy pozostalego SAM we wska¬ zanych okresach czasu okreslano nowa metoda, która zostanie nizej opisana, zapewniajaca ma¬ ksymalna dokaldnosc pomiarów, gdyz pozwala ona na calkowite oddzielenie SAM od wszystkich mo¬ zliwych produktów degradacji.W zwiazku z tym stwirdteono, ze metoda uzy¬ wana dotychczas, oparta na zastosowaniu kolum¬ ny analitycznej z zywica jonowymienna Dowex 50 [Schlenk.i De Palma, J. Biol. Ohem. 229 /l967/], oddzielanie SAM od pewnych produktów degrada¬ cji, zwlaszcza do metylotioadenozyny, nie bylo calkowite, a wiec, metoda ta prowadzila do bled¬ nych oznaczen trwalosci SAM, która okreslano ja¬ ko lepsza niz byla rzeczywiscie.Metoda oznaczania SAM uzywana obecnie opie¬ ra sie na zastosowaniu wysokocisnieniowej chro¬ matografii cieczowej (HPLC).Stosowane warunki analizy: — Kolumna PARTISIiL 10 SCX — 2,15X260 mm 50 — Eluent 0,1M roztwór mrówczanu amono¬ wego o wartosci pH=4, zawierajacy 20% metanolu do HPLC — Przeplyw 1 mUninute — Czas prze- 55 bywania SAM okolo 400i sekund.Z danych zawartych w tablicach 2, 3, 4 i 5 wynika w sposób oczywisty, ze sole SAM wyka¬ zuja maksymalna trwalosc, gdy zawieraja 5 rów- 60 nowazników kwasu. Sole z 4 i 6 równowaznikami nadal posiadaja dobra trwalosc, natomiast sole z miejiszna liczba równowaznikowa kwasu nie ma¬ ja praktycznie znaczenia ze wzgledu na swa nie- trwalosc. 65 Oczywistym jest równiez, ze trwalosc soli11 137 816 12 ksztaltowana jest wedlug modelu niezaleznego od uzytego kwasu, o ile ten kwas ma wartosc pK< pKa,5, zawierajacych 4—6 równowazników kwa¬ sowych jest niemozliwe.Badania trwalosci przeprowadzono równiez ta sama metoda na solach wytwarzanych w obec¬ nosci nosnika, etyli substancji wsipomagajacej lio¬ filizacje, metoda wedlug przykladów III i IV.Wyniki tych pomiarów podlano w tablicach 6 i 7. Drastyczne obnizenie zawartosci wilgoci pod* czas prowadzeni liofilizacji w obecnosci nosnika jest wyraznie widoczne, jak równiez wynikajaca z tego calkowita trwalosc soli otrzymanych w ten sposób.Tablica 6 SAM.5HC1 Degradacja w tempe¬ raturze 45°C |o uplywie 360 dni' Resztkowa -wilgot¬ nosc Sól liofilizowana bez nosnika 1,50/0 filW Sól liofilizowana z mannitem /100 g SAM++120 g mannitu/ 0,lV» Sól liofilizowana z Aerosilem /100 g SAjM+'+1O0 g Aerasilu/ 0^»/e Tablica 7 iSAMASH^SC^ wilgot¬ nosc Degradacja fW tempe¬ raturze 45°C po uplywie 360 dni Sól liofilizowana bez nosnika M°/o 5«/< &ól ftofiiizowana L mannitem fMO g SAiM+-hl20 g mannitui/ Oyl°/o Sól liofilizowana z AerosiUem /100 g SAM++1W g Aerosilu/ OJfh fi^e SAM. 5HC1 i SAM. 2 5H^S04 badano w (prowadzonych w szerokim zakresie próbach far- imakóilogicznych i we wszystkich przypadkach wy¬ kazaly ona wysoce interesujace cechy charakte¬ rystyczne^ w zakresie aktywnosci i toksycznosci, które byly niezalezne od anionu zwiazanego z SAM. Ustalono, ze aktywnosc nowych soli za¬ lezy sasaoMczo od zdolnosci jonu SAM+ uwal- 10 15 20 25 niajacego sie w organizmie do dzialania jako donor grup metylowych, czyli jako naturalnego suJhstratu wielu enzymów typu transmetylazy, któ¬ re katalizuja podstawowe reakcje metabolizmu li- piTdowego, protieidowego i gilucydowego.¦Znaczenie nowych so!i» pochodzi wiec w isto¬ cie z faktu, ze czynia one S-adenozyftometionine absolutnie trwala w temjperaturach do 40°Q cp •umozliwia utrzymywanie ich aktywnosci tranf- metylowania w organizmie czlowieka na pozio¬ mie 100*/o, bez ryzyka tworzenia sie toksycznych produktów rozkladu, które mialyby niekorzystny wplyw na procesy biologiczne aktywowane pjzez SAM+.Toksycznosc Ostra toksycznosc na myszach okreslono uzy¬ skujac nastepujace wartosci dla obu badanych soli: LD50 podawanie doustne 3 g/kig L^so podawanie dlonaczyniiowe = lyl gykg. ©adalnia tolerancji i przewleklej toksycznosci prowadzono na szczurach szczepu Wistar i Spra- gue-Dowley podajac zwierzetom 20 mgi/kg pro¬ duktu dziennie w ciagu 12 milesiecy. fo uplywie okresu podawania badano rózne organy i syste¬ my zwierzat, które nie wykazywaly zadnych zmian chorobowych.Badania wald wrodzonych plodu prowadzono na królikach. Przy podawaniu zwierzetom* 10' krot¬ nie wyzszych dawek od maksymalnych dawek terapeutycznych nde zaobserwowano zadnego wply¬ wu teratogennego ani dzialania powodujacego znie¬ ksztalcenia zarodków lub dojrzalych plodów.•Podawanie donaczyniowe w dawkach do 200 mg^cg nie powodowalo u królików zadnych za¬ burzen temperatury.Podawanie dozylne 40 mg/kg królikom i szczu¬ rom nie wywolywalo zadnych zmian cisnienia w tetnicy szyjnej, czejstoscl ujrzen serca i czesto¬ tliwosci oddechu, jak równiez zadnych zmian w obrafcie elektrokardiograficznym zwierzat.Tolerancja miejscowa priy podawaniu domies¬ niowym, nawet po podawaniu' powtarzanym w okresie 30—GO dni, i przy wstrzykiwaniu dona- czyniowym w brzegowa zyle zewnetrznej czesci ucha królika byla doskonala.^Farmakologia ^Szeroki wachlarz serii badan prowadzonych na szczurach wykaeal, ze nowe sole wytwarzane spo¬ sobem wedlug wynaiazku wywieraja sikie dzia¬ lanie ochronne i rozpuszczajace w watrobowym zwyrodnieniu tluszczowym, wywolanym dlieta nad- lipidowoniadprotemowa, wedlug Handlera, i w zwyrodnieniu tluszczowym wywolanym ostrym za¬ truciem alkoholowym i innymi srodkami toksycz¬ nymi, nawet jezeH podaje sie dawke. 10 mg&g Przy doswiadczanej hiperlijpemu u szczurów, na przyklad wywolanej przez Triiton 3, nowe sole wykasuja bardzo wyrazna aktywnosc hiipodipe- miczna, która w stosunku do stosowanej dawki, np. 1* mgWkg jako SA/M+, byla znacznie bar¬ dziej nasilona niz w przypadku innych leków wykazujacych aktywnosc hipou^emiezna.13 13T816 14 Aktywnosc nawych zwiazków w wielu innych dziedzinach terapfii ludzi pozostaje przedmiotem badan. Nowe sole mozna podawac dolistnie, do¬ miesniowo lub dozylnie.Innymi mozliwymi postaciami preparatów lecz¬ niczych sa supazytoria, ciecze, preiparaty do oczu, aerozole lub kompozycje odpowiednie do stoso¬ wania izewnetrznego.U drobiu z miazdzyca* wywolana dietami wzbo¬ gaconymi w cholesterol i fruktoze, pozajelitowe podawanie nowego produktu w dawkach 10 mg/kg, obniza cholesterolemie i korzystnie modyfikuje zmiany chorobowe wystepujace u zwierzat kon¬ trolnych w olbrejbie tetnicy piersiowej i brzusz¬ nej i malych naczyn w podstawowych zwojach mózgu.(W odniesieniu do metabol&mu fosfoliipidowego,, to stwierdzono doswiadczalnie, ze nastepuje wzrost ilosci fosfaltydylocholiny w komórkach watrobo¬ wych szczurów z nieskompensowanym zwyrod¬ nieniem tluszczowym. Wyrazny wzrost fosfatydy- locholdny stwierdzono równiez kosztem a-dipopro- tein krwi w doswiadczalnych zmianach wywola¬ nych stosunkami jff/a-li|po|protein. v (Wszystkie te badania wyraznie wykazaly lecz¬ nicze dzialanie nowych soli przy zmianach me¬ tabolizmu lipidowego.Dalsze serie badan prowadzonych na szczurach wykazaly, ze podawanie dawek 1 mg/kg wywo¬ luje nagromadzenie zapasów glikogenowych na poziomie watroby i miesni, co potwierdzaja za¬ równo metody hiistochemiczne jak i oznaczenia ilosciowe. W doswiadczalnej cukrzycy, wywolanej alloxanem, ilosc insuliny niezbedna do powrotu wartosci cukru we %krwi do normalnego poziomu zostala znacznie obnizona przez podawanie rów¬ nowaznika 0,5 mg/kg SAM+.Te serie badan potwierdzaja wyraznie korzy¬ stny wplyw nowych zwiazków wytwarzanych spo¬ sobem wedlug wynalazku na metabolizm glucy- dowy.W koncu szczurom z doswiadczalnie wywolana hipodisproteiinemia podawano 10 mg/kg SAM.Stwierdzono, ze stosowany lek powoduje powrót wartosci calkowitego nadmiaru bialka we krwi do poziomów normalnych, przez zasadniczy wzrost poziomu albuminy i w ten sposób wykazuje zna¬ czaca aktywnosc w zakresie anaboliiamu, czyli przyswajania protein. Te i inne podobne badania wykazaly wartosc lecznicza nowych produktów w zaburzeniach metabolizmu proteidowego.Podsumowujac, na podstawie podanych wyzej badan farmakologicznych i wielu innych badan, które umozliwily poznanie aktywnosci nowych so¬ li na wszystkich poziomach organizmu ludzkie¬ go, aktywnosc nowych zwiazków zostala ustalo¬ na w dzdedzfrnie hematologii, w przypadkach o- strych i przewleklych zatruc watrobowych,, w ne¬ urologii jako srosdka antydepresyjnego i w osteo¬ logii, w przypadkach pierwotnie postepujacego go- sca (stawowego.^Zastrzezenia (patentowe <1. Sposób wytwarzania soli S-adenozylometio- niny, SAM, o wzorze 1, w którym X oznacza kwasowy równowaznik mocnego kwasu nrneral- nego o wartosci pK nizszej niz 2,5 a n oznacza liczbe 4, 5 lub 6, znamienny tym, ze stezony wodny roztwór surowej soli SAM oczyszcza slie przepuszczajac go przez kolumne wypelniona sla¬ bo kwasna zywica jonowymienna, SAM eluuje sie rozcienczonym, wodnym roztworem odpowied¬ niego kwasu o wzorze HX, przy czym do eluatu dodaje sie taka ilosc kwasu, która jest potrzebna do osiagniecia idoscd scisle stechiometrycznie od¬ powiadajacej wytwarzanej soli, nastepnie roztwór zateia ide i przez liofilizacje wyodrebnia sie sól o wysoMej czystosci. 12. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze wartosc pH wodnego roztworu SAjM^ dopro¬ wadza sie do zakresu ©—7, fcorzyistnie 6,5. 3. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze jako slabo kwasna zywice jonowymienna sto¬ suje sie Amfberlite IRC 50 lub Amfoerlite CG 50. 4. Sposób wedlug zastrz. U znamienny tym, ze do eluowania stosuje sie roztwór kwasu o wzorze HX o stezeniu 04 N. 5. Sposób wedfctg zastrz. 1, znamienny tym, ze brakujaca w stosunku do ilosci stechiometrycz- nej ilosc kwasu o wzorze HX wprowadza sie do eluatu w postaci technicznego, stezonego roz¬ tworu wodnego. 6. fifcosob wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze w przypadku, gdy eluat zawiera nadmiar kwa¬ su o wzorze HX, w stosunku do ilosci fetechio- metrycznej, nadmiar ten usuwa sie przy uzyciu silntie zasadowej zywicy jonowymiennej. ff. Sposóib wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze eluat zateza sie do stezenia zawartego w za¬ kresie 90—100 g/1 SAIM. 6. Sposób wedlug zastrz. 5, znamienny tym, ze liofilizacje prowadzi sie w obecnosci substan¬ cji obojetnej, korzytfcEAe mannitu lub sproszko¬ wanego kwasu krzemowego. 15 20 29 35 m 45 k137 816 NH2 1 CH3 CH-CH-CH-CH-CH2-S-CH2-CH2-CH-C00~.nX" OH OH — O — NHr WZÓR 1 NH2 N"S—N CH3 CH-CH-CH-CH-CH2- S-CH2-CH2- CH-COO" I I OH OH NH2 WZÓR 2 CH-CH-CH-CH-CHo-S-CHo-CHo-CH-COOH . LX i 1 l l z + c *¦ I CH3 I OH OH — o — NH3 WZCiR 3 NH3 n\-n I ^H CH3 H CH-CH-CH-CH-CH2-S-CH2- CH2-CH-C00H. 5X I I OH OH —0 I , NH3 WZCfR 4137 816 CH3 ¦ H CH-CH-CH-CH-CH2-S-CH2-CH2-CH-COOH . 6X~ OH OH — o — NH3 WZÓR 5 PL PL PL

Claims (1)

1. Zastrzezenia (patentowe <1. Sposób wytwarzania soli S-adenozylometio- niny, SAM, o wzorze 1, w którym X oznacza kwasowy równowaznik mocnego kwasu nrneral- nego o wartosci pK nizszej niz 2,5 a n oznacza liczbe 4, 5 lub 6, znamienny tym, ze stezony wodny roztwór surowej soli SAM oczyszcza slie przepuszczajac go przez kolumne wypelniona sla¬ bo kwasna zywica jonowymienna, SAM eluuje sie rozcienczonym, wodnym roztworem odpowied¬ niego kwasu o wzorze HX, przy czym do eluatu dodaje sie taka ilosc kwasu, która jest potrzebna do osiagniecia idoscd scisle stechiometrycznie od¬ powiadajacej wytwarzanej soli, nastepnie roztwór zateia ide i przez liofilizacje wyodrebnia sie sól o wysoMej czystosci. 12. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze wartosc pH wodnego roztworu SAjM^ dopro¬ wadza sie do zakresu ©—7, fcorzyistnie 6,5. 3. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze jako slabo kwasna zywice jonowymienna sto¬ suje sie Amfberlite IRC 50 lub Amfoerlite CG 50. 4. Sposób wedlug zastrz. U znamienny tym, ze do eluowania stosuje sie roztwór kwasu o wzorze HX o stezeniu 04 N. 5. Sposób wedfctg zastrz. 1, znamienny tym, ze brakujaca w stosunku do ilosci stechiometrycz- nej ilosc kwasu o wzorze HX wprowadza sie do eluatu w postaci technicznego, stezonego roz¬ tworu wodnego. 6. fifcosob wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze w przypadku, gdy eluat zawiera nadmiar kwa¬ su o wzorze HX, w stosunku do ilosci fetechio- metrycznej, nadmiar ten usuwa sie przy uzyciu silntie zasadowej zywicy jonowymiennej. ff. Sposóib wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze eluat zateza sie do stezenia zawartego w za¬ kresie 90—100 g/1 SAIM. 6. Sposób wedlug zastrz. 5, znamienny tym, ze liofilizacje prowadzi sie w obecnosci substan¬ cji obojetnej, korzytfcEAe mannitu lub sproszko¬ wanego kwasu krzemowego. 15 20 29 35 m 45 k137 816 NH2 1 CH3 CH-CH-CH-CH-CH2-S-CH2-CH2-CH-C00~.nX" OH OH — O — NHr WZÓR 1 NH2 N"S—N CH3 CH-CH-CH-CH-CH2- S-CH2-CH2- CH-COO" I I OH OH NH2 WZÓR 2 CH-CH-CH-CH-CHo-S-CHo-CHo-CH-COOH . LX i 1 l l z + c *¦ I CH3 I OH OH — o — NH3 WZCiR 3 NH3 n\-n I ^H CH3 H CH-CH-CH-CH-CH2-S-CH2- CH2-CH-C00H. 5X I I OH OH —0 I , NH3 WZCfR 4137 816 CH3 ¦ H CH-CH-CH-CH-CH2-S-CH2-CH2-CH-COOH . 6X~ OH OH — o — NH3 WZÓR 5 PL PL PL