CZ48998A3

CZ48998A3 - Cyklické peptidové analogy somatostatinu

Info

Publication number: CZ48998A3
Application number: CZ98489A
Authority: CZ
Inventors: David H. Coy; John E. Taylor
Original assignee: Biomeasure, Incorporated; The Administrators Of The Tulane Educational Fund
Priority date: 1995-09-29
Filing date: 1996-09-04
Publication date: 1998-07-15
Also published as: SK29298A3; ES2158340T3; EP0859785B1; NO981395L; KR100430716B1; IL155693A0; AU6914596A; TW514642B; WO1997011962A1; ATE201696T1; DE69613137T2; EP0859785A1; HUP9802372A3; NZ316822A; AU711423B2; US6001801A; BR9610725A; EP0859785A4; IL123357A0; DE69613137D1

Description

Oblast techniky.

Prótože přírodní sómatostátin používaný pro léčení různých cHbrob ... t^? Yi (např. . akromegalie) je dosti nestabilní, byly vyvinuty .umělé'. , ' ' analogy somatostatinú. Somatostatin vyvolává rozmanité účinky .

včetně modulace .uvolňování .různých hormonů či néúrotransmiterů; .,^ j., b.

Některé tyto účinky, jsou vázány 'na přítomnost', specifických ·.:

receptorů somatostatinú. Snahou je vždy získat analog s co největší selektivitou pro specifický subti-p receptorů odpovědný ' za požadovanou biologickou odpověď, aby se snížily interakce vedoucí k vedlejším účinkům.

Dosavadní stav techniky.

Přírodní somatostatin se skládá z obou izomerních forem aminokyselin 14 - isomer (somatostatin - 14) a 18 - isomer (somatostatin - 18).' Heimán, et al., Neuróendocrinologý. Y ': j 45:429-436 (1987). Ξ důvodu krátkého poločasu rozpadu přírodního somatostatinú, např. proléčení akromegalie. Saynor, et al··. , Molecular Pharmacol. 43 :838- (1993) .

Byl o identifikováno a charakterizováno pět význačných receptorů somfatostatinu. Hoyer, et al. , Naunyn - Schmieděberg s Asch. Pharmacol., 350:441 (1994), Somatostatin vyvolává rozmanité účinky včetně modulace uvolňováni hormonů, např. růstového hormonu, glukagonu,· insulinu, anylinu a též' uvolňováni neurotransmitérů.

Některé tyto efekty jsou.spojeny s jeho vazbou na specifické receptový somatostatinú. Například inhibice růstového hormonu je přisuzována receptorů somatostatinú typu -2 ( 3STP.-2 ) “ (Raynor, et al.,. Molecular Pharmacol. 43:838 (1993); Lloyd, et al. , Am. J. Physiol. 268:G1Ó2 (1995)), zatímco inhibice insulinu je přisuzována somatostatlnovému receptorů typu -5 ( S3TP.-5)' (Coy, et al. 197:366-371 (1993)).

Dává se přednost analogu, který je selektivní pro specifický subtyp receptorů somatostatinú odpovědný za požadovanou biologickou odpověď, čímž se sníží interakce jiných subtypů . receptářů)' které by ' mohly vést k. nei

n.^edj.sgiJjLTn ú£*ŤrtkJ3ht.

Podstata vynálezu'

- Vynález'se' týká peptidCL.vyjádřených následujícím, sumárním vzorcem: . ' '' --9' -9'-O

Ri ' ‘ ' . ' /'·9' Γ'' . ’

Ai—Αζ^;—A3 A4 -D-Trp-Lys-A?-Ae-Ag -íU (I) ^R2 - . . - ;

'kde'' ; ?9“ 9’ . . .. £ . j 'S£ 99/'< ' ' /. . 9* λ.ύ .£_ Á

Ai je Dr .nebo L- isomér Cys nebo Mpa;

A2 je Asn, Gin, alifatická aminokyselina, nebo je vynechaná;

A3 je aromatická kyselina;

A4 je His nebo aromatická aminokyselina;

,A? je Thr, Sernebo alifatická aminokyselina;

Aa je aromatická aminokyselina;

A9 je D- nebo L- isomer Cys;

každý Ri a R2 je, nezávisle, H, C1-12 alkyl, C7-.20 fenylaikyl,

Ci 1-20 naftylalkyl, Ci_₁₂ hydroxyalkyl, C7-20 hydroxy fenylaikyl Ci i_2o hydroxynaftylalkyl nebo COEi, kde Ei ' je. Ci-iz alkyl, C7-20 fenylaikyl, Cu-ϊο naf ty.lalkyl, ' Ci _ 12 hydroxyalkyl, C7-20 hydroxy feny laiky 1 nebo Cn-20 hydroxynaf týlalky 1 a R3· je NH2 nebo . NH-Y-CHa ~Z, kde Y je Ci-iz hydrokarbonová část (dvojvázná,· riapř. rovná'nebo rozvětvená alkylová skupina) a Z je H, OH, COzH, nebo CONHz; a disulíidoojmi můstky vázané postranní řetězce' zbytků. Ai a A9; nebo jejich farmaceuticky přijatelné soli.

V jednom vyjádření obě- skupiny A3 a Ab nezávisle je Phe, p-X-Phe (kde X je halogen, OH, OCH3, nebo NO2 ) , o-X-Phe (kde X je halogen, OH, OCH3 , CHa nebo NO2 ), pyridy 1-Ala., Trp, β-Nal,

Ξ,4-dichloro-Phe, Tyr (I), nebo F-Phe, Au je His, Phe, p-XrPhe (kde X⁵ je halogen, OH, OCHg , CHg nebo NOz ) , pyridyi-Ala, Trp, 0-Nal, 2,4-dichloro-Phe, Tyr (I) nebo F&-Phe,'A2 je Asn, Gin,

Ala, Aib, Val, Leu, Ile, Nle, Nva, Abu, Phe, p-X-Phe (kde' X je halogen, OH, OCH3, CH3 nebo N02), o-X-Phe (kde X je halogen, OH, OCH3 , CH3 nebo NOz), pyridyl“Ala, Trp,.(3-Nal, 2,4-dichloro-Phe, Tyr (I), Fs~Phe nebo je vynechán, a A? je Thr, Ser, Ala, Aib,

Val, Leu, Ile, Nle, Nva nebo Abu,

V následujícím vyjádření A9 je Cys, každá A3 a Ab nezávisle . je Phe, každá p-X-Phe (kde X je halogen, OH, nebo CH3 ) , Tyr (I) nebo Trp, A4 -Je .'Hrg/řPhe; p-X-Phe (kde >X oe^háloorerr,· Ο^,',Γίβ^ό- řCHa), Tyr (I) riebo Trp, A2 je Asn, Gin nebo je vynechán a Á7 je

Thr nebo Ser..,

V posledním vy jádřeni Az je Asn nebo ' je vynechán, A3. je Phe, · A4 je. Phe, His, p-X-Phe (kde X(je halogen, OH nebo.'CH3 ) a každý z Ri a Rz nezávislé Ή a R3 je .NHz '

Níže jsou uvedeny příklady- peptidO tohoto- vynálezu, kterálze vyjádřit výše uvedeným vzorcem:

H2 -c[Čýs-Phé-PKé-p-Trp-Lys“TftřťPhe-Cýsl“NHz;. (Analog I). '.Hz-c[D-Cys-Phe-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Phe-Cys]-NH2 (Analog íl),

H2-c[Cys-Phe-Trp^D-Trp-Lys-Thi—Phe-Cys]-NHz,

H2-c{D-Cys-Phe~Trp-D-Trp-Lyš-Thr-Phe~Cys]-NHz, Hz-c(Cys-Phe-His-D-Ťrp-Lyg-Thr-Phe-LysÍ-NHz ,

H2 -c[D-Cys-Phe-rHis-DTrp-Lys-Thr-Phe-Lys].-NHz ,

H2 -cCCys-Phe-Phe-D-Trp-Lys-Ser.-Phe-Oýs.] ~NHz (Analog IV), H2-c[D-Lys-Phe-Phé-D-Trp-Lys-Sěr-Phe-Cýs]“NH2,

H2-cCCys-Phe-Trp-D-Trp-Lys-Ser-Phe-CyšJ-NHz (Analog III), Hz-c[D-Cýs-Phe-Trp-D-Trp-Lys-Ser-Phe-Cys]-NHz,

H2 -c[Cys-Phe-His-D-Trp-Lys-Ser-Phe-Cys]-NH-,_; ,

H2-c[D-Cys-Phe~HiSDTrp-Lys--Ser-Phe-Cys3--NH2 ,

Hz c[Cys-Phe-Tyr.(I)-D-Trp-Lýš-Thr-Phe-Cys ]-NHz (Analog VITI) , Hz-c[D-Cys-Phe-Tyr(I)-D-Třp-LyS-Thr-P'hé-Cys]-NHz, ’

Hz -c[Cys-Phe-Tyr(I) -D-Trp-Lys-Seř-Phe-Cys]-NH2',

H2-c[D-Čys-Phe-Tyr(I)-D-Trp-Lys-Ser-Phe-Cys]—NH2,

Hz-cíCys-Asn-Phe-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Phe-Cysj-NHz (Analog V), Hz-c(D-Cys-Asri-Phe-Phe-D-^Trp-Lys-Thr-Phe-Cys] -NH2,

H2-c[Cys-Asn-Phe^Trp-D-Trp-Lys-Thr-Phe-Cys]-NHz,

H2-c[D-Cys-Asn-Phe-Trp-D-Trp-Lys-Thi—Phe-Cys]-NHz,

Hz-c[Cys-Asn-Phe~His-D-Trp-Lys-Thr-Phe-Cys]-NHz,

Hz-c[D-Cys-Asn-Phe-His-D-Trp-Lys-Thr-Phe-Cysj-NHz,

Hz -c[Cys-A'sň-Phe-Phe-D-Trp-Lys^Ser-Phe-Cysj-NHz ,

Hz-c[D-Cys-Asn-Phe-Phe-D-Trp-Lys-Seř-Phe-Cys]-NH2,

Hz -cCCýs-Asn-Phe-.Trp-D-Trp-Lys-Sér-Phe-Cys ] -NHz ,

H2 -c ED-Cys-Asn-Phe-Tr-p-D-Trp-Lys-Sei—Phe-Cys ] -NHz ,

H2-c[Cys-Asn-Phe-His-D~Trp-Lys-Ser-Phe-Cys]-NHz,

Hz —c[D-Cys-Asn-Phe-His-D-Trp-Lys-Sei—Phe-Cys]-NH2,

Hz-c[Cys-Asn-Phe-Tyr(I)-D-Trp-Lys-Thr-Phe-Cys]-NHz,

H2-c[D-Cys-Asn-Phe-Tyr(I)-D-Trp-Lys-Thr-Phe-Cys]-NHz >

’H2^-ct.CÝ.s-Aan-Ptíě-Ťýř('lý-D-:.Třp.—Lýs-Sěr-áhQ-*Cj*B*)

Hz -c [IPCys-Asn-Phe-Tyr (I) -Ď-Trp-Lys-Ser-Phe-Cys ] -NH2 ,

H2 7c[.Cýs-Phe-Tyr-D-Trp-Lýs-ThrrPhe-Cysj-NHz (Analog VI),

Hz -c[Cys-Phe-i3-NáÍ-D“Trp-Lys-Thř-Phe -CysÍ-NH2 (Analog VII) , .¾ -čCGýs.-Phé-Cpa-D-Trp.éLya-TI-ir-Phe-Cysl-ŇHz '( Analog IX) ,

H2-c[Mpa-Phe-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Phe-Cys]-NH2 i( Analog X).,

H2-c[Cys-Phe-Tyi—D~Trp-Lys-Thi—Phe-D-Cys]-ŇH2 (Analog XI),

Hz-c[Cys-Phe-Phe-D-Trp-Lys-Thi—Tyr-Cys]-NJ-Í2 ( Analog XII) ,

Hz-cCCyá-Phe-His-D-Trp-Lýs-Thr-Phe-CysI-NH2 ; ( Analog XIII) .. ./.¹ ,S výjimkou N-koncft aminokyseliny, váechny zde publikované zkratky aminokyselin (např. Ala nebo Az j znamenají strukturu. -NH-CH-(R)-CO- kde R je postranní řetězec aminokyseliny (např.

ČH3 pro Ala). Pro N-konec aminokyseliny znamená.zkratka -N-CHíCHzSH)-CO- jestliže se jedná o D- nebo L-isomer Cys nebo· = C(-rCHz -£H)-CO- jedná-li se .0 D- nebo L- isomer řípa, kde R. je. postranní řetězec aminokyseliny. Nle, Nva,. pýridyl-Ala, F&-<Phe,

2,4.-dicftloro~Phe, Í3-Nal, Abu, Mpa, Cpa a Aib jsou zkratky, následujících ^-aminokyselin: norleucin, norvalin,

0-pyridyí-alanin, pentaílůo.řo-fenylalanin,. , /2,4-dichlorofeny 1-aianin, í3-naftylalanin, kyselina '/E-áminojnáselná, kyselina merkapto-propionová; p-chlorofenylalanin a kyselina /E-aminoisomáselná.

Tyr(I) znamená iodovaný tyrosinový zbytek (např. 3-I-Tyr, 5-I-Tyr, 3,-5-I-Tyr), kde jód může být ve formě radioaktivního' izotopu, např, I¹²⁶, lis? nebo I¹³¹. Alifatická aminokyselina je· S-aminokyselina s jedním nebo dvěma postranními řetězci, které jsou (nezávisle) hydrouhlikaté,· např. rovný nebo rozvětvený řetězec s 1 - 6 uhlíky.

Jedná se např. o tyto alifatické aminokyseliny: Ala, Aib, Val, Leu, IIe, Nle, Nva nebo Abu..

Aromatická aminokyselina je /E-aminokyselina, jejíž postranní řetězec má neutrální (např. ne kyselý nebo zásaditý) aromatický substituent, např. substituovaný nebo nesubstituovaný fenyi, naítyl nebo aromatickou beterocyklickou skupinu (např. pyridyl nebo indolyl). Jedná se riapř. o tyto aromatické aminokyseliny: Phe, p-X-Phe (kde X je halogen (např. F, Cl nebo I), OH, OCH3 ,

CH3 nebo NO2 ) , o-X-Phe (kde X je halogen, 0H-, OCHa , CH3 nebo NO2 ), pyridy.l-Ala, Trp, 0-Nal, 2,4-dichloro-Phe, Tyr(I), Fs~Phe.

•I·»

- Ύ, ΎιΥ .·..··' , * *·'··'· . ·, · ' '· · ‘ τ ·'. ' ·?/5

Kde aminokyselinový zbytek je ' opticky ikCiνι»Γϋ* blíže’ ‘*í ϊ ·^:.ί · '· 'nh

- γ. - ./u . · ·_ · »·· _j , 9 9 ·. * .· , ' ·’ · ·.·.·- ··*- .'.··*· · · * - _r‘ ' - : «. ·, · · ·/ nespec ií i kovaný L-isomer.

Hydroxyalkyl, hydroxfenylalkyl a hydroxynaftylaiky1, uvedené . v obecném vzorci výše, mohou' těž obsahovat 1 4 hyďroxy ’ , ; ' .

.substituenty a COEi -známéhají' -C=O-..’Ei·. '--Υ Y’^:

Příkladem -CeO;Ei jsou p-hydroxy feny Ipřopióny 1. (ňapř.. 7-7· —G—0. CH2 -CH2 ^_C<s H4 ~OH) a feny lpr.opi ony 1, ale i jiné.

Stanovením nebyly prokázány disulíidové můstky mezí ^; thiolóvou skupinou .na poštranním řetězci. zbytku'Ay;(např. Mpa, ’'

D-Mpa, Cys nebo D—Cys) a thiolovou skupinou na postranním řetězci. : zbytku A9 (např. Mpa, D-Mpa, Cys nebo D-Cys). Zkoumaný peptid je zde též vyjádřen jiným vzorcem, např. . '

Hz-O[Čys-Phe-Phe-D-Trp-Lys-Thi—Phe-CysJ-NH2 ., s dvěma disulí ídicky vázanými zbytky (např. Cys) umístěnými v hranaté závorce.. . / následující ve vzorci, po C”.

Zkoumané peptidy mohou být použity k inhibici uvolňování; : h insulinu u savců (zvířat i lidí).

Peptidy jsou. tedy užitečné při léčbě za takových fyziologických podmínek, při nichž’ je potřebná inhibiče G ... ' .

uvolňování insulinu např. diabetes II.. typu. Ty ze zkkoumaných peptidů obsahujících v molekule Tyr (I) zbytek, k rozpoznání buněk obsahujících somatostatinové recepťory (např. SSTP.-5) . ' ¹

Takovéto peptidy mohou být použity buď in vivo -k detekci buněk, jež mají sómatostatinové receptořy (např. nádorové buňky) nebo in vitro jako raďioligand při stanovení vazeb receptorů·' - ‘ somatostatinu.

Tyto zkoumané peptidy mohou být dodávány ve formě farmaceuticky přijatelných solí. Příklady takových' soli (nikoli však vyčerpávající) představují soli tvořené s organickými kyselinami (např. octová, mléčná, maleinová, citrónová, maleová, askorbová, Šťavelová, benzoová, methánsulfonová,.toluenstflfonová nebo kyselina pamoová), s anorganickými kyselinami (např. kyselina chlorovodíková, kyselina sírová nebo kyselina fosforečná), s polymerickými kyselinami (např. kyselina gallová, karboxymethylcelulóza, polymléčná, polyglykolová) nebo kopolymery pólylakto-glykolových kyselin.

Léčebně účinné množství zkoumaného peptidu a farmaceuticky přijatelný nosič (např. uhličitan hořečnatý, laktóza nebo : ‘ f osf blysid,- s/.hímž léčebná, složka' mSže ·1νό?ί*€* miéélLí)· snůíi£*tvoří , _ň -^U ’· ' ; ' ' ' .'•A* ‘ <-Tf*· '' ' · ty, Ϊ i ' ' ς r . ' / l ^: · · ' '> · · τ · · ***· '. _t ^J’ í- · '.’ · léčebnou smČB (např. pilulky, tablety, kapsule nebo kapalina) pro podávání . (např.·· .orální , intravenózní, trans dermální , pulmonární vaginální, subkutaní, nasálníiontoforetické nebo

../;' ; i.ntřatracheální )*' páčientům ^; v; pří pádě potřeby peptidu. . , ·

Pilulky, tablety' či. kápsuiemohou být; potaženy substancí / ' chránící směs před rozkladem Žaludečními kyselinami nebo enzymy

.. tenkého střeva v'žaludku pacienta, po dobu pasáže ne hatráve něj, léčebné? směšií; ci6<·,tenké ho střeva) žLěčébhá-••směs, mftžé .být.tdbyáyářiá·/·;· též v biologicky odbouráte1né nebo. néodbouratelné formě podporující uvolnění přípravku pro subkutání a intrámuskulární podávání. Viz např.. U. S. Patennts 3, 773, 919 a 4, 767., .628 a PCT. Application No. WO. 94/00148, ' Lze též zajistit nepřetržité podávání léčebné směsi použitím impiantovatelné nebo vnější pumpy (např. INSUSAID™ pump).. -Peptid by měl být podáván přednostně před.spaním.

Dávkování tohoto peptidu při léčení výše uvedených choroba disbalancí'se mění v závislosti na způsobu podávání, věku á' tělesné hmotnosti, pacienta,.a též podmínkách . léčení . . Přesné - ./ dávkování určí vždy ošetřující, případně veterinární.lékař. Takovéto množství.peptidu. určené ošetřujícím Či veterinárním, lékařem je zdě uváděno jako léčebně_:účinné množství.

UvaŽujeme-li v rozsahu tohoto výzkumu, je peptid, vyjádřený výše uvedeným obecným vzorcem, vhodný jak při léčení chorob á disbalancí spojených s potřebou inhibice uvolňování· inzulínu, např. diabetes II. typu, tak i pro óe.íekci somatostatinových receptprů, ňapř. radiologické.

Ostatní znaky a výhody tohoto vynálezu jsou zřejmé z podrobného popisu a patentových nároků.

Syntéza a použití analogů somatostatinu, které .jsou předmětem tohoto výzkumu, jsou velmi dobře zvládnutelné odborníkem znalým v oboru na běžné úrovni. Není-li definováno jinak, všechny zde uvedené technické a vědecké termíny mají Stejný význam jako je běžně užíván v oblasti oboru tohoto výzkumu. Zmíněné publikace, přihlášky patentů, patenty a jiná osvědčení jsou začleněny v odkazech.

Je samozřejmé, že odborník znalý v oblasti tohoto výzkumu může vycházet ze zde uvedených postupů a využít současného stavu * w

//výzkumu· v. plném ' rozsahu. -Následuj ící' edeáířjfcXŠtpřij»í’a«^;*fejry*méÍý.·'· být chápány pouze, jako ilustrativní, žádným způsobem nelimitující , možnosti dalšího výzkumu.

. Pří kl ady provedení .·vynálezu.

' : 1· gy n t é z a ána1OQŮ sómatostatinu

Syntéza krátkých, peptidů je dobře odzkoušena na příslušných · '-· 1/· ' , '· pracovišť ích, zabývaj ící ch se peptidy.. Viz: např. Stewart·, át sl;, '

Solid Phasé Peptidé.Synthesis (Pieřce Chemical Co., 2d'ed; 1984). Níže bude uvedena syntéza Analogu I. Ostatní výše uvedené zkoumané peptidy lze připravit obdobným způsobem odborníkem znalém v oboru.

. 1,1 g, 0,5 mmol benzylhydrylamin-polystyřenové přýskyřice (Advanced Chem Tech, lne., Lousville KY) 've formě chloridu bylo umístěno do reakíní nádoby., (advánced Chem Tech ACT 200: peptidé' synthesizer naprogramovaného na dávkování'následujících .reagencií) rozpouštědel: (a) methylen, chlorid; (b). 33^:SSní kys.

. . trifluoroctová v methylerichloridu (2 krát podobu- 1 a 25 minut . každý); (c) methylen chlorid; (d) ethanol; (e) methylen chlorid; a (f) 10 %ní triethylamin chloroformu. . · '' . '

Neutralizovaná pryskyřice byla míchána po dobu 1 hod. s Bo-S-4-methylbenzyl-Čys a diisopropyl-karbodii'midem (oba 1,5 mmol) v methylenchloridu a vzniklá aminokyselinová pryskyřice.· ' byla cyklována na reaktoru (koloně) výše uvedeným promývacím. ' programem dle kroků (a) až (f). Následující aminokyseliny.(1,5. mmol) byly pak postupně párovány stejným způsobem; Boe-Phe, Boc-O-benzy1-Thr, Boc-Ň-benzyloxykarboyl-Lys, Boc-D-Trp, Boc-Phe, Boc-Phe, a Boc-S-methylbenzyl.-Cys. Po promytl a. usušení byla . takto připravená pryskyřice zvážena a usušena (1,5 g).

v

Pryskyřice (1,6 g; 0,5 mmol) byla pak smíchána s anisolem (5 ml), dithiothreitolem (100 mg) á ánhydrid kyseliny fluorovodíkové (35 ml) při O.°C a směs mícháme po dobu 45 minut. Přebytek kyseliny fluorovodíkové byl rychle odpařen v proudu suchého dusíku a volný peptid byl vysrážen a promyt etherem. Smový peptid byl pak rozpuštěn v 500 ml 90 Sání kyseliny octové, ke které byl přidán koncentrovaný roztok Ϊ2/ΜθΟΗ až do stabilního hnědého zbarvení. Přebytek Iz byl odstraněn přidáním kyseliny askorbové a

I -P roztok; bý 1 odpařen na ',óbjěm./. který' óiíT ínaírěseň *n*a' kóiortu i, (2.,5 x, 90 cm) s náplní SĚPHADÉXTM G-25, který byl eluován·50 Sáním A_COH. . . .'·. ?··.Funkce .obsahující hlavni složku byly detekovány ÚV absorpcí a chromatograf ií na tenké'·/vrstvě, čbýly. sbírány, odpařeny 'na malý; objem a naneseny na kolonu (1,5 x70 cm) VYDAC™1 octadecy.lsiláne silica (10 - 15 um). Tato kolona byla eluována lineárním ' gradientem od 80 %. A a 20 % B do 40 % A a.6'0 % B, kde. A?jé 0,1 Sání ' kysl trif lúbřoctová ;.(TF.A)ýye; vodě a. Bje;9’.^.^aée^oriif rieh;.'· '20 % vody a 0,1 % TFA. Frakce byly delegovány chromatograf i í na tenké frstvě (tle) a analytickou vysokovýkonnou kapalinovou derematografií (hplc) a jímány odděleně za účelem dosažení maximální čistoty. Opakovanou lyofilizaci z vodného roztoku bylo . získáno 95 mg produktu ve formě . bí lého. chmýřovitého prášku. . . U. takto získaného·homogenního produktu byla provedena analýza aminokyselin kyselého hydrolyzátu a' směsi cyklického oktapeptidu fixovaného na matrici pomocí techniky MALDIMS ' .(matriční laserová desořpční hmotová spěktromětrie).

. (ÍW vypočtená,. 1077, MW nalezená 1080) . .·.

Dalším příkladem je syntéza analogu V. ...

0,7 g, 0,25 mmoi běnzylhydřylamin polystyrénové pryskyřice. (Advanced Chem Tech, lne.)' ve formě hydrochloridu bylo umístěno do reakční nádoby fy Advanced Chem Tech ACT 200 peptide synthěsíser programovaného na dávkování následujících reagencií/rozpouštědla: (a) methylen chlorid, (b) 33 Sání kys. trifluoroctová v methylenchloridu (2' krát po dobu 1 a 25 min. každá}; (c) methylenchlo.rid, (d) ethanol, (e) methy.lenchlor.í d, (f) 10 %ní triethylamin v chloroformu.

Neutralizovaná pryskyřice' byla míchána s.

Boc~S-methylfeny 1-Cys a di.isopropy lkarbodi imidem (1,5 mmol oba) v ť J, methylen chloridu po dobu lha vzniklá aminokyselinová pryskyřice byla pak cyklována postupně kroky (a) až (g) dle výše uvedeného promývacího programu. Následující aminokyseliny (1,5 mmol) byly postupně párovány stejným způsobem jako výše. Boc-Phe, Boc-O-benzyl Thr, Boc-N-benzyloxykarbony1-Lys, Boc-D-Trp,

Boc-Phe, Boc-Phe, Boc-Asn a Boc-S-methy1-benzy1-Cys. Po promytí a usušení bylo získáno 1,2 g pryskyřice.

Peptxdová pryskyřice byla podrobena HF Štěpení a I2 .fcSíňS •j;· «Κ-Κ·:.

•75r .v í>

- ’ ,.·.·,·,·;.-·,;····,.-· i ... _Γ. .,i . ; r»:'·:···'?.p. \'·Χ·ί,’Χ , . '·.· '<·. , ' ... i ' · · ’ , ·'-.··. ·’. . . X , · - · · · · ·..·' ·.< . -«&

. v·,;· , ·' ‘ Ύ .*''· · b ·;···’ ύ A/·.·····;’-. Α . ·«·*'. ' 4;, ' cýkTízaci/jstéjným způsobem jako je uveileá<».«Výtěž ejj · řý,še '-?· · uvedené purifikáce na koloně byl 21 mg cyklického nonapeptidu, který .byl-dále homogenizován^ na hplc a.tlč. Dále byla .provedena . ' .'i analýza aminokyselin kyselého hydrolyzátu a vzorku směsi,, _; /.cdA'.?

cyklického;.nonapeptidu 'fixpvahého.na nosiči technikou MALDI .MS, V? ζ (MW vypočtená 1192; MW nalezená 1192) . ’ ⁷ⁱ <

Syntéza analogů .sómat ostat i nu ibdovaných na. ty ros i novém, ..</ zbytku (např; chlóramin-T metodou) je velmi dobře .dokumentována a sriadňo proveditelná .odborníkem :S.' běžnými, znalostmi v. obora.' Viz např. Czernick, et al. , J. Bíol.. Chem. 258:5525 (1993) a Europeah Patent No. 389, 180, Bl,

2- Stanoveni vazeb receptorů- sómat ostat inu ...... ^: hl

a) Stanoveni vazeb lidského SSTR-2: CHO-Kl (vaječníky, Čínský ' křeček) buňky byly získány, od American. Type Cultare Čollection (ÁTCC) (Rockville, MD) (ATCC Ňo. CCL61) a byly transfektováriys lidskou SSTB-2 cDNA, metodou popsanou v Yamada, et al. , Pe.oc. ’ 'A;

Nati. Acad, Sci. USA, 89:251-255..(1992)., též dostupné u ATCC . , (ATCČ No. 79046), ..použitím standardních technik známých z ' molekulární biologie. Viz např. Patel, et. al. , Biochem. Biophyš. , .,,, . ·, Bes. Commun. 198:605 (1994) . Surově membrány.byly připraveny:·, Y;^,!'. V homogenizací lidským SSŤR-2 transíektováným. s, CHO -Ki buňkami v 20 ' - -/ ml ledově chladném 50 nM Tris-HCl (puír A) na POLYTRON™ ' homogenizátoru (Brinkmann Instrumente, Wéstbury, NY) při .

nastavěni 6, po dobu ·5 s.

Přidávaný puír byl doplněn do konečného objemu .40 ml a homogenát. byl odstředěn na odstředivce SORVAL^TM SS-34 rotor .(Du. .). ·,Χ·

Pont, Newtoron, CT) pří 39 000 g po dobu 10 min. při 0 - .4-°C. .,

Supernatant byl odstraněn. Sediment (pelety) byl znova, smíchán s ledově chladným puírem A, zředěn a odstředěn stejným * k způsobem.

Takto získaný sediment byl resuspendován v 10 mři Tris HC1 a uchováván v mrazáku pro stanovení vazby receptorů somatostat inu..

Jednotlivé podíly z membránové preparace byly inkubovány 90 min. při 25 °C s 0,5 nM [iz'si-Tyr] MK-678 (2 000 Ci/mmol; c[N-methyl-Ala-Tyr (Πzs)-D-Trp-Lys-Val-Phe]) v 50 mM HPES (pH 7,4) obsahujícím různé koncentrace testovaného peptidu (napň.

10^-11 až 10~⁶ M) , 10 mg/ml hovězího sérového albuminu (frakce V, •'«CM** 4 /···.· »- >·»'··“* ·-··« » < -S¹ ·“·.·. ,,.·.·. I ř .

• ¢. f..' ii~ . ·.· . . . z. . .·. ·<:«;. ·:·..·*·/«;·· ·. v· · .·*« ·^5, · · ,*? „ * ,χ' 7* ^,Γ * •''•'.•.•.•'<Šigmachěm'ical-C.o;^;/ SťS Louis' MO) , MgCl2.v$5'ímíí}:; ϊ,Ťras*y ι’Λΐ',ϊ· (-20Ó¹ ?> * ' · ' * - . · .Λ · ·* · · '-· ·. ' ·,♦ -\i/ '/?*·>···' ' * Z*i ' t *

KlCÍ/ml) , Ba.cit.rac i· n (0,02 mg/ml) a feny 1 ňóthy 1-suliony 1 ..fluorid (0,02 jng/ml) . Vždy do konečného objemu 0,3 ml. Inkubace.byly., _;.. . : ukončeny rychlou-'vakuovou filtrací přes GF/C filtry (předem ' prómyté 0,3 polýethýlenimívem po' dobu_; SÓ/minuť)' za použití filtrační trubice' (Brandel, Gaithusburg,.MD). '’.

Každá trubice i filtr byly pak promyty ,třikrát 5 ml alikvótního množství ledově chladného pufru A. .

:-//.. : Špeci f ičká.'5yazbá<býT-a' def inováná · -jako pozdí i yěech‘ vazeb ’ [Ti^{2 5} I/Tzr] MK-678 a vazeb' stanovených v přítomnosti 200 nM somátostatinu-14.

-ij

Dále byly stanovovány tyto testované peptidy· ’_: somatostatin-14,' somatostatin-28, Ahal.ogl, Analog II, Analog. III, ·

Analog IV a Analog V. ,

Struktury Analogů I - V jsou uvedeny, výše. Hodnoty K_x u testovaných peptidů bylý vypočteny dle následujícího vzorce:

Kc '.= IC©o/[l ⁺ (LC/LEC)], kde ICso' je koncentrace testovaného . ' peptidu potřebného inhibici 50 procent specificky vázaného \ radioliganelu C^1z5I-Tyr]MK-678; LC je. koncentrace rádiollganelu . - -1 (0,05 nM) a LEC je rovnovážná disocíační konstanta radioligandu (0,155 nM) . ' ·. /

Hodnoty Ki vypočtené pro testované peptidý -jsou uvedeny ve . /' sloupci pod hlavičkou SSTB- v Tabulce I.

b) Stanovení vazeb lidského SSTR-5/

CH0-K1 buňky byly transfektovány s lidskou SSTR-5 c DNA metodou popsanou v Yamada, et al. ,. Biochem:Bioptys. Res. Commun., 195-844 (1993) použitím standardních technik známých z molekulární biologie. Viz např. Patel,.et al., Biochem. Bioptys. Res. Comm. 198:605 (.1994).. Surové membrány byly připraveny homogenizaci SSTR-5 transfektovaného s CH0-K1 Křeččímí buňkami v 20 ml ledově chladné 50 mM Tris-HČI na POLYTRON™ homogenizátoru (nastavení 6, 15- sekund). Puír byl doplněn do konečného objemu 40 ml a homogenát byl odstředěn na' přístroji S0RVAL^TM SS-34 rotor při 39 000 g po dobu 10 min. pří 0-4 °C.

Vzniklý supernatant byl odstraněn. Získaný sediment byl resuspendován v ledově chladném pufru, zředěn a odstředěn' stejným způsobem jako výče.

, ' Finální: seáiměhť/ feyř\:řěsuspehdóváiš'ív Íiď mft:· Ťria *HG*f · *.-· ··-·/''.·

-..uchováván v mrazáku· pro stahovaní vazeb děceptórO 'somatostatíriu . Jednotlivé podíly z membránové preparace byly inkubovány...'po x ďobu. 30 minut při· 30-:^oC/s._;0,.05' nM :Ú ^2s I-Tyr·?· i] somatostatin-ijí. (2'

ÓOÓ Ci/mmol; Ameršham/-Corp. , Aclihghtoh ;He igKts, 'ÍC). v 50 ·.mM - <

: HEPES (pH 7,4)' obsahujícím rSzné koncentrace .testovaného' peptidu .·.

(např. 10^-11 až 1O^-6M), 10 mg/ml hovězího sérového albuminu . (frakce V), •ffercij}·, .(5mM)., TrasyloT- ·(200^:KICÍ/ml),.bacitračih (0,.G2.o Img/mTíla .. fenyIméthyisúl?fonyl·.'; fluor i ďí j(O,..02lmčř/'ml·)''.

jednotlivých stanovení byly 0,3 ml,

Inkubace, byly. ukončeny rychlou filtrací přes GF/C filtry’ (předem promyté v 0,3 %ním polyethyleniminu po dobu 30 .min.) s použitím Brandelovy- filtrační aparatury. Každá trubice i filtr.

•bylypak 3 krát. promyty ‘5 ml podíly ledově chladného. pufru. '·

Specifická /vazba byla- definována jako: roždí 1' všech vazeb [125i-Tyr¹¹ ] sómatdstatin-14 a vazeb stanovených v přítomnosti 1

000 nM ligandů .· · '

BÍM-23b52(H₂-D-Phe-Phe-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Phe-Thr-NHz ) pro . rečéptor somatostatinu typ -5. . ...·'..· . ·.·

Hodnoty Ki testovaných péptidťS byly vypočteny podle následujícího vzorce:.ICso/[1 + (LC/LECj], kde IC50 je koncentrace testovaného peptidu potřebná k inhibici' 50 % ' .· ^fspecifických vazeb na raďioligandu (¹²®T-Tyr¹¹] somatostatin-Í4, LC je koncentrace rádioligandů (0,Ů5 nM) á LEC je rovnovážná desociační konstanta radioligándu (0,l'6 nM).

Vypočtené hodnoty Ki testovaných peptidd jsou uvedeny ve sloupci pod hlavičkou SSTR-5 v Tabulce 1.

. V Tabulce I jsou též uvedeny poměry Ki pro lidský SSŤP-2 a Ki pro lidský SSTR-5, Zkoumané peptidy. (např. Analogy I -, V) mají tyto poměry neočekávaně vyšší než i a tudíž jsou selektivnější pro SSTR-5 než pro SSTPi-2.

TABULKA 1

i- j,.-./-:~ (složka ','/..//'/^;-	V . ~ '- ¹ \| SSTR-2	¹ ' - ' \|- SSTR-5	1 . . . —-~\“Ί \| SSTR-2/SŠTR/5 1
L-zO₌O = = =	.(=/-=====	‘ M.i’· -.Λ ,. _{{ z}. '	\|======~==Oi===O\|'.
( S oma t os t a t i n-^ 14 I '' '	(. 0.187	I 0.883 I	( / 0.212 j) (
I. ., -. \| Sornatóstatin-28	1. 1 ]. 0.242	_ (o.383	-) ./.,- ,1 '- . ' 0,632 . 1
	'}'-·- -.· . >; ·	i	r. . γ ),--./
	T r.;, ;_?1: .·	Γ . - * ¹	ιλ ·ν· ' v ·,> “ ^; ./‘Ό
(Analog I	i 15.i !	I 0.376	1 ' 40.2 . (
i —- -	+——-	h—~.........-	1' ' - · -........-• -Η
( Analog. '11 \|	I 13.0 i 1 '	\|- 2,63 I	1 4.94 (
t (Analog III ' 1 '	i . ..i I .14.7 . .1 1	i ( 1.21 '	1 .’') ·· 12,1...; .
1 (Analog IV i	t . - 1' 19.3 ' 1 - ^!	1., ! 0.928 ' -^: I ‘	ί . , ,,.:-.-...1 1 ' 20.8 '// ( ( ..... '· I
1. JAnalog V	\|l29 i- - · - -- i	1 .... \| . 2.43 . 1 .	1 .. - 53.1 . (
• ; . - (Analog VI I .........	~1 l 6.19 \|	μ, — ... ! .0.34 ·' i	1 - ——ττ—] ί /’. ' 18.2 ( 1 - :·,, <' :* i
1 1 Analog VII	.1 - 1 t 8.07	I (. 4.145	1 . . .1 1 ) 1,9.4 ř·'4.:. \|
L	) :		1 ··.·. I
1		1	ΐ -,.--1
\|Analog VIII I	( 4,78 i	I 0:27 1'	i 17.7 f
1 1 Analog IX j	! i 6.2.05 (	1. 4.7? 1'	( - -----_:-———-—·-—j i 1.30 1’ 1
! - ( Ana 1 og X 1 '	1 '— : l 15.0 ........	I 0.744 1	\| 20.1 ·.·· \| 1- ' 1
i (Analog XI ( '	1 \| 34.83 I	S 28.04 i-	1 1.24 1 t ....... . - \|
1 (Analog XII l.....	1 ( 59.20 1	I ( 5,78	1 10.2 (
1 \|Analog XIII 1::	1 ) 32.32	1 . (. 2.01	1 1 ) 16-, 1 1 L

.>.•<•6·: ·γ Υ ’·· _k. λ'γ-» » : «·. .· > ¹ , ·.--·♦'·.· , ·>· < Υ ·^,ι\..v.·:·· .·-···· · ·.

.·.··« :· ·;b · ·· . · ·· V · ,· ’·' · ·' · ’ ·· „· ► ··. ' ··* · - ,1

- ·· ···'.

Samozřejmě/·· ífe tento detailní ,popis vynálezu· je pouze ilustrativní., nikoli .limitující; rozsah/dalšího-: výzkumu,, .který, je =·/?'' definován yjpřiiožených patentových nárocích. Ostatní aspekty, ; ./.'·./ výhody, a'modifikace/vyplývají též)z' nároků. ' - ///·///'// ’’ / < / 7/7

Μ .:-··«·, » 0 '· » .0.400·· »'· · ··. « » 4 4 «

44

Claims

00 000 Ri x. A1-A2 —A3 -A4-D-Trp-Lys“ft7 -Ae -A© -Rj (I) Rz .γ· '.•Awrtť ve kterém ./ Ai je D- nebo L- esomer Cya nebo Mpa; Az je Asn, Gin, alifatická aminokyselina, aromatická aminokyselina nebo je. vynechána; .. Aj je aromatická aminokyselina;. ' ; A< je His nebo aromat ičká. ami noky sel i na; . 9.9,γ: 0.7 A? . je Thr, Ser.nebo alifatická aminokyseliná; 9 ; Ae je aromatická aminokyselina; , , A9 je D- nebo L- isomer Cys; přičemž každý Rf aj R2 9je? nezávisle,' H, Čili,2 alkyl, C?-2o 9 Y-: ·; fenylalkyl> Cn-20 naftylalkyl, Cý-iz hyďroxyalkyl, ' C7-2o : hydroxyfenylalky1, Cn-20 hydroxynaftylaiky1 nebo COEi , kde Ei je ' C1-12 -alkyl, C7-2.0 ‘ fény 1-alkýlC11-20 naftylalkyl, Ci_12 9 l/g hydroxyalkyl, C7-20 hydroxyfenylaiky 1 nebo Cii-zo hydroxynaftylaiky 1 a R3 je NH2 nebo NH.Y.ČH2.2 kde Y jeC-.-:2' hydrokarbonová část a 2 je H, OH, COz H nebo C0NH2 . a - ' . \ disulíidovými mftstky vázané postranní řetězce zbytkO Ai a As’ nebo ’ jejich farmaceuticky přijatelné soli. V Ρ A Τ Ε Ν Τ Ο V Ε Ν Α Ε Ο.Κ Υ

1. Analogy cyklického peptidu soma-tostatinu (I) .:.

2,4-dichloro-Phe, Tyr(I) nebo F&~Phe.

2,4-dichloro-Phe, Tyr(I), nebo Fs-Phe, a A₄. je His, Phe, p-X-Phe (kde X je halogen, OH, OCHa, CHa nebo NOz), o-X-Phe kde X je halogen, OH, OCH3 , CHa nebo NO2 ) , pyřidyl-Ala, Trp, (3-Nal,

2. Peptid podle nároku 1, kde každá A3 a Ae, nezávisle, je Phe, . p-X-Phe (kde X je halogen, OH, OCHa, CHa nebo NO2 ) , o-X-Phe (kde X je halogen, ÓH, OCH3 , CH3 nebo NO2 ) , pyridyl-Ala, Trp, ’ (3-Nal,

3. Peptid podle nároku 2, kde A2 je vynechána a A? je Thr, Ser, Ala, Aib, Val, Leu, Ile, Nle, Nva nebo Abu.

'·♦ - .··»*· φ · • - · 999 • '» »· .·« > - ΐ’έ·;. ·;>· ••-.Λ-···, r ·<’ ♦ y ·. * - ·-* , * <<* ·' ··· ’?- η • .· ·' ; , Λ · r ;·-.·,'.··· · · · \ ,< .

·->·' ·· / \ · · , . - · * • ····.. ♦·'·.- ·· . ···..·.·.

4 '4-9 4\ ♦ 4 9'

Aí A x

Hz-c[Gyš-Phe-Tyř(I)'-D“Trp-Lys-Ser-Phe-<*y^Í-h{Hť: AefcxJ * í í - Ϊ ' 4t «9 4 4 94»' 94 '··/

Hz-c [D-Cys-Fhe^Tyř.C I)-D-Trp-Lya-Šer-Fhe-Cys ] ~NH2^:

4 *5 · > ·4 -

4. Peptid podle nároku '3, kde^: Α_θ je Cys.

4 . 4 0 0 4 « \ ‘ ' 4’ '

0· · 0· 4

5.^: Peptid podle. nároku' 4'; kde · každá Aa a _: ;Ab ., nezávisle,.Ije] Phe, ' p-X-Phe' (kde X je halogen, ÓH,. neboCHá ) > Týr (I);;.. nebo Trp' a Α4 je His, Phe, p-X-Phe (kde X je halogen, OH, nebo CH3), Tyr(I) · nebo Trp. ' “V .

6’ Peptid podle, .nároku; :5l·, ikde A? je Thr nebócSer.

7. Peptid podle nároku 6,. kde Aa je Phe, Á4 je Phě, p-X-Phe (kde X je halogen, OH, OCHa, CH3 , nebo NOz ) , His, Tyr(I), nebo. Trp, a '

Αθ je Phe. nebo p-X-Phe (kde X je .halogen, OH, OCH3 , CH3 nebo

NO₂) . ' - ; . .· ' ?. . ·'· . .. ... ; . ·'·:· ^: >

8. Peptid podle nároku 6, kde A3 . je Phe, A4 jé 'Phe., . Týr,. .Týr(I) ,? .nebo Trp_; a.Ae je Phe. '

91 Peptid podle nároku i 8 , kde každý. Ři . .a R2 , nezávisle,, je H ' a;· Ra je NHz . . .' ... ' ' . 7 ·/. ’·

• , '· · ·: «·« « . » '9 9. 9.

·· ** .

Hz-cíD-Cys-Ásn-Phe-His-D-Trp-Lys-Thr-PherČysl-ŇHz,

Hz-ctCys-Asn-Phe-Phe-D-Trp-Lys-Ser-Phe-Cyg]-NH2,

Hz.-c [D-Cys-Asn-Phe-.Phe-D-Trp-Ly.s~Ser-Phe-Cys ] ~ŇHz ,

H2-c [Cys-Asn-Phe-Trp-D-Trp-Lyá-Ser-Phe^Cys]-NHz ,

Hz -c [D-Cys-Asn-Phe^Trp-D-Trp-Lys-Ser-Phe-Cýs ]-NH2 ,

H2-c(Cys-Asn-Phé-His~D-Trp-Lys-Ser-Phe-Cys]-NH2,

Hz-ctD-Cys-Asn^Phe-His-D-Trp-Lyg-Ser-Phe-Cyš]“NHz,

Hž “C tCys-físh-PhevTyří I)-Ď-Trp-Lys-Thr-Phe-Cý.s]-NHz ,.‘

Hz-c [D-Cys-Aen-Phe-T.yr (I )-D-Trp-Lys-Thr-Phe-Cys]-NHz ,

H2 -c [Cys-Asn-Phe-Tyr (I) -D-Trp-Lys-Sei—Phe-Cys] -NH2 nebo Hz—c [D-Cys-Ášn-Phe-Tyr í I) -D-Trp-Lys-Seř-Phe-Cys ] -NHz .

í'

*.9 '9 9 9 4 '

44 ·«··

).49 4 < ·99«

9 44 · '*044; • 4 4 *

10. Peptid podle nároku 9 vzorce:

Hz-cÍCys-Phe-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Phe-Cys]-NHz,

H2~c[D-Cys-Phe-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Phe~Cýš]-NH2,

Hz-ct.Cys-Phe-Ťrp-D-Třp-Lys-Sei—Phe-Cys] -NHz , '

Hz-c [Cys-Phé-Phe-D-T.rp-Lyé-Ser-Phe-Cys]-NH2 nebo Hz-c[Cys-Phe-Tyr(I)~D-Trp-Lys-Thr-Phe-Cys]-NH2.

11; Peptid podle nároku 7 vzorceHz -cfCys-Phe-Trp-D-Trp-Lys-Thr-Phe-Cýs]-NH2 ,

H2-c[D-Cys~Phe-Trp-D-Trp-Lya-Thr-Phe-Cys]-NH2,

Hz -c[Cys-Phe-His-D-Trp-Lys-Thr-Phe-Gys]-NHz,

Hz-c[D-Cys-Phe-His-D-Trp-Lys-Thr-Phe-Cýs]-NHz,

H2-c[D-Cys-Phe-Phe-D-Trp-Lys-Ser-Phe-Cys]-NHz,

H2-c[D-Cys-Phe-Trp-D-Trp-Lyc-Set—Phe-Cys]-NH2,

Hz-c[Cys-Phe-His-D-Trp-Lys-Ser-Phe-Cys]-NHz,

K2-c[D-Cys-Phe-His-D-Trp-Lys~Sei—Phe-Cys]-NHz,

H2-c[D-Cys-Phe-Tyr(I)-D-Trp-Lys-Thr-Phe-Cys]-NH₂, » 9»

12. Peptid podle nároku 2, kde Az je Asn, Gin, Ala, Aib, Val, ' Leu, Zle, Nle,·Nva, Abu, Phe, p-X-Phe; (kde X jé halogen, OH,

ÓCH3 , CHa, neboNOz), o-X-Phe (kde Xje halogen, OH, OCH3 , CH3 , nebo NO2), pyridy1-Ala, Trp, β-Nal, 2,4-dichloro-Phe, Tyr(I), nebo Fs,-Phe> a A? je Thr, Ser, Ala, Áib, Val, Leu, Ile, Nle, Nva gcvrgg-·. - '“ftebo’’ Abu, /'

13. Peptid podle nároku 12, kde Ag jeCys.

14. Peptid podle -nároku 13, kde každá Aa , A4 a As ,. nezávisle, . je'

Phe> p-X-Phe .(kde X je halogen, OH, . nebo CH3 ),' Tyr(.I) nebo Trp, á Ad je His, Phe, p-X-Phe (kde Xje halogen, ΌΗ, nebo CHa ), Tyr(l) nebo Trp.

15. Peptid podle nároku 14, kde Az je Asn nebo Gin, a A? je Thr nebo Ser. ~ · .....- - '· ....

16. Peptid podle nároku 15, kde Aa' je Phe,. A4 je Phe,.p-X-Phe (kde X je halogen, OH, OCHa, CHa, nebo NO2),· His, Tyr(l), nebe Trp, a Ag je Phe nebo p-X-Phe (kde X je halogen, OH, OCHa > CH3 nebo NO2 ) .

17. Peptid podle nároku 16,- kde A3 je Phe, A4 je Phe, Tyr,

Tyr(I), nebo Trp a Ae je Phe.

18. Peptid podle nároku 17, kde Az je Asn, každé Ki. a E2 , nezávisle, je H a E3 je NHz .

19. Peptid podle nároku 18 vzorce:

H2-c[Cys-Ash-Phe-Phe~D-Trp-Lys~Thr~Phe-Cys]-NHz .

20. Peptid podle nároku 16 vzorce:

Hz-c[D-Cys-Asn-Phe-Phe-D-Trp-Lys-Thi—Phe-Cys] -NHz,

H2-c[Cya-Asn-Phe-Trp-D-Trp-Lys-Thi—Phe-Cys]-NHz,

H2-c[D-Cys-Asn-Phe-Trp-D-Trp-Lys-Thr-Phe-Cys]-NHz,

Hz ~c [Cyš-Asn-.Phe-HisyD-Trp--Lys-Thť’-Pheíc^45-íNHÍ > « • ««« «· «« • - · ·.

21. Peptid podle nároku 1 vzorce:

Hz-c[Cys-Phe-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Phe~Cys]-NHz.