PL191898B1

PL191898B1 - Wariant peptydu ludzkiego hormonu przytarczyc oraz wariant peptydu białka pokrewnego ludzkiemu hormonowi przytarczyc

Info

Publication number: PL191898B1
Application number: PL334438A
Authority: PL
Inventors: Zheng Xin Dong
Original assignee: Sod Conseils Rech Applic
Priority date: 1997-01-07
Filing date: 1997-12-08
Publication date: 2006-07-31
Also published as: PT1645566E; DK0948541T3; DK1645566T3; KR20000069952A; AR051906A2; DE69735603D1; EP0948541A2; NO993341L; JP2001508439A; CZ298937B6; BR9714200A; DE69739912D1; SI0948541T1; KR100497709B1; DE69735603T2; SI1645566T1; AR011517A1; HUP9904596A3; NO993341D0; EP2206725A1

Abstract

1. Wariant peptydu ludzkiego hormonu przytarczyc o wzorze: H \ Ser-Val-Ser-Glu-Ile-Gln-Leu-Met-His-Asn-Leu-Gly-Lys-His- / H Leu-Asn-Ser-Met-Glu-Arg-Val-Glu-Trp-A 24-Arg-Lys-A 27-Leu-A 29-Asp-Val-His-Asn-Phe-NH 2, znamienny tym, ze: A 24 oznacza Leu albo Acc; A 27 oznacza Lys albo Leu; A 29 oznacza Glu albo Aib. 5. Wariant peptydu bialka pokrewnego ludzkiemu hormonowi przytarczyc o wzorze: H \ Ala-Val-Ser-Glu-His-Gln-Leu-Leu-His-Asp-Lys-Gly-Lys- / H Ser-Ile-Gln-Asp-A 18-Arg-Arg-A 22-A 23-A 24-A 25-A 26-A 27-A 28-A 29-A 30-A 31-His-Thr-Ala-NH 2, znamienny tym, ze: A 18 oznacza Leu albo Acc; A 22 oznacza Phe, Glu, Acc albo Cha; A 23 oznacza Phe, Leu, Acc albo Cha; A 24 oznacza Leu albo Acc albo Cha; A 25 oznacza His, Lys albo Glu; A 26 oznacza His albo Lys; A 27 oznacza Leu albo Acc; A 28 oznacza Ile, Leu albo Acc;…………………………….. PL PL PL PL PL

Description

Wynalazek dotyczy peptydów analoga hormonu przytarczyc.

Hormon przytarczyc („PTH) jest polipeptydem produkowanym przez przytarczyce. Dojrzała, krążąca postać hormonu obejmuje 84 reszty aminokwasowe. Działanie biologiczne PTH można odtworzyć z użyciem jego N-końcowego fragmentu peptydowego (np. reszt aminokwasowych 1 do 34).

Białko pokrewne hormonowi przytarczyc (parathormonowi) jest białkiem o długości od 139 do 173 aminokwasów o końcu N homologicznym do PTH, PTHrP wykazuje wiele efektów biologicznych takich samych jak PTH, w tym wiązanie z receptorom wspólnym dla PTH/PTHrP. Tregear, i in., Endocrinol., 93:1349 (1983). Scharakteryzowano wiele peptydów PTH pochodzących z różnych organizmów np., człowieka, bydła, szczura, kury. Nissenson, i in., Receptor, 3:193 (1993).

Wykazano, że PTH poprawia zarówno masę jak i jakość kości. Dempster, i in., Endocrine Rev., 14:690 (1993); i Riggs, Amer. J. Med., 91 (Suppl. 5B):37S (1991). Efekt anaboliczny u mężczyzn i kobiet cierpiących na osteoporozę obserwowano przy przerywanej terapii zarówno w trakcie jednoczesnej terapii antyresorpcyjnej, jak i bez niej. Slovik, i in., J. Bone Miner. Res., 1:377 (1986); Reeve, i in., Br. Med. J., 301:314 (1990); i Hesch, R-D., i in., Calcif. Tissue Int'1, 44:176 (1989).

Opis patentowy o numerze GB 2,269,176 ujawnia pochodne związku hormonu przytarczyc (PTH), które zostały zmodyfikowane przez przyłączenie rodnika wybranego spośród L- albo D-a-aminokwasu, C2-C6 alkoksykarbonylu, podstawionego C1-8 alkilu, C2-8 alkenylu, C2-8 alkinylu, aralkilu, aralkenylu lub C3-6-cykloalkilo-C1-4-alkilu do końcowego aminokwasu albo jednej lub więcej grup aminowych łańcucha bocznego. Opis patentowy o numerze GB 2,269,176 nie ujawnia ani analogów ludzkiego hormonu przytarczyc ani analogów białka pokrewnego hormonowi przytarczyc, w których przynajmniej jedna z reszt występujących w postaciach natywnych została podstawiona resztą Acc.

Przedmiotem wynalazku jest wariant peptydu ludzkiego hormonu przytarczyc o wzorze:

H \

Ser-Val-Ser-Glu-Ile-Gln-Leu-Met-His-Asn-Leu-Gly-Lys-His/

H

Leu-Asn-Ser-Met-Glu-Arg-Val-Glu-Trp-A24-Arg-Lys-A27-Leu-A29-Asp-Val-His-Asn-Phe-NH2, charakteryzujący się tym, że:

A24 oznacza Leu albo Acc;

A27 oznacza Lys albo Leu;

A29 oznacza Glu albo Aib.

Korzystnie A27 oznacza Lys.

Korzystniej A29 oznacza Aib.

Korzystnie wariant peptydu ludzkiego hormonu przytarczyc stanowi [Ahc²⁴] hPTH (1-34) NH2; [Ahc²⁴, Aib²⁹] hPTH (1-34)NH2; [Ahc²⁴, Leu²⁷, Aib²⁹] hPTH (1-34) NH2; lub ich farmaceutycznie dopuszczalna sól.

PL 191 898 B1

Przedmiotem wynalazku jest ponadto wariant peptydu białka pokrewnego ludzkiemu hormonowi przytarczyc o wzorze:

H \

Ala-Val-Ser-Glu-His-Gln-Leu-Leu-His-Asp-Lys-Gly-Lys/

H

Ser-Ile-Gln-Asp-A₁₈-Arg-Arg-A₂₂-A₂₃-A₂₄-A₂₅-A₂₆-A₂₇-A₂₈-A₂₉-A₃₀-A₃₁-His-Thr-Ala-NH₂

A31-His-Thr-Ala-NH2 charakteryzujący się tym, że:

A18 oznacza Leu albo Acc;

A22 oznacza Phe, Glu, Acc albo Cha;

A23 oznacza Phe, Leu, Acc albo Cha;

A24 oznacza Leu albo Acc albo Cha;

A25 oznacza His, Lys albo Glu;

A26 oznacza His albo Lys;

A27 oznacza Leu albo Acc;

A28 oznacza Ile, Leu albo Acc;

A29 oznacza Ala, Glu albo Aib;

A30 oznacza Glu, Acc albo Lys;

A31 oznacza Ile, Leu albo Acc;

zakładając, że przynajmniej jeden A18, A22, A23, A24, A27, A28, A30, albo A31 oznacza Acc; lub jego farmaceutycznie dopuszczalna sól.

Korzystnie A22 oznacza Glu, Acc, albo Cha; A23 oznacza Leu, Acc, albo Cha; A24 oznacza Leu, Acc; A25 oznacza Lys albo Glu; A26 oznacza Lys; A31 oznacza Leu, Ile albo Acc.

Korzystniej A18 oznacza Leu albo Ahc.

Jeszcze korzystniej A22 oznacza Glu, Ahc albo Cha; A23 oznacza Leu, Ahc albo Cha; A24 oznacza Leu, Ahc albo Cha; A27 oznacza Leu albo Ahc; A28 oznacza Ile, Leu albo Ahc; A30 oznacza Glu, Ahc albo Lys; A31 oznacza Leu, Ile albo Ahc, w szczególności przynajmniej jeden A22, A23, A24 oznacza Cha.

Najkorzystniej A29 oznacza Aib.

Korzystnie wariant peptydu białka pokrewnego ludzkiemu hormonowi przytarczyc stanowi:

[Glu^{22, 25}, Leu^{23, 28}, Lys^{26, 30}, Aib²⁹, Ahc³¹] hPTHrP (1-34) NH₂;

[Glu^{22, 25}, Ahc^23,, Lys^{26, 30}, Leu^{28, 31}, Aib²⁹] hPTHrP (1-34) NH₂;

[Glu^{22, 25}, Leu^{23, 28, 31}, Lys^{26, 30}, Ahc²⁷, Aib²⁹] hPTHrP (1-34) NH₂;

[Glu^{22, 25, 29}, Leu^{23, 28, 31}, Lys²⁶, Ahc³⁰] hPTHrP (1-34) NH₂;

[Cha²², Leu^{23, 28, 31}, Glu²⁵, Lys^{26, 30}, Ahc²⁷, Aib²⁹] hPTHrP (1-34) NH₂;

[Glu^{22, 25}, Leu^{23, 28, 31}, Ahc²⁴, Lys^{26, 30}, Aib²⁹] hPTHrP (1-34) NH₂;

[Ahc²², Leu^{23, 28, 31}, Glu²⁵, Lys^{26, 30}, Aib²⁹] hPTHrP (1-34) NH₂;

[Glu^{22, 25}, Leu²³, ³¹, Lys^{26, 30}, Ahc²⁸, Aib²⁹] hPTHrP (1-34) NH₂;

[Cha²², Ahc²³, Glu²⁵, Lys^{26, 30}, Leu^{28, 31}, Aib²⁹] hPTHrP (1-34) NH₂;

[Ahc^{22, 24, 27}, Leu^{23, 28, 31}, Glu²⁵, Lys^{26, 30}, Aib²⁹] hPTHrP (1-34)NH₂;

[Cha²², Leu^{23, 28, 31}, Ahc^{24, 27}, Glu²⁵, Lys^{26, 30}, Aib²⁹] hPTHrP (1-34) NH₂;

[Glu²², Leu^{23, 28, 31}, Ahc^{24, 27}, Lys^{25, 26}, Aib²⁹] hPTHrP(1-34)NH₂;

[Ahc^{18, 24, 27}, Glu²², Cha²³, Lys^{25, 26}, Leu²⁸, Aib²⁹] hPTHrP (1-34) NH₂;

[Glu²², Cha²³, Ahc²⁴, Lys^{25, 26}, Leu²⁸, Aib²⁹] hPTHrP (1-34)NH₂; lub ich farmaceutycznie dopuszczalna sól.

Z wyjątkiem aminokwasów końca N, wszystkie skróty aminokwasów (np. Ala) w niniejszym ujawnieniu mają budowę -NH-CH(R)-CO-, w której R oznacza łańcuch boczny aminokwasu (np. CH3 dla Ala). Dla aminokwasów końca N, skróty oznaczają budowę =N-CH(R)-CO-, w której R oznacza łańcuch boczny aminokwasu. b-Nal, Nle, Dap, Cha, Nva, Amp, Pal, Ahc, i Aib są skrótami następujących a-aminokwasów, odpowiednio: b-(2-naftilo)alanina, norleucyna, kwas a,b-diaminopropionowy, cykloheksyloalanina, norwalina, 4-aminofenyloalanina, b-(3-pyridynylo) alanina, kwas 1-amino-1-cyklo-heksanokarboksylowy i kwas a-aminoizomasłowy. Acc oznacza aminokwas wybrany z grupy obejmującej kwas 1-amino-1-cyklopropanokarboksylowy;

PL 191 898 B1 kwas 1-amino-1-cyklobutanokarboksylowy; kwas 1-amino-1-cyklopentanekarboksylowy; kwas 1-amino-1-cykloheksanokarboksylowy; kwas 1-amino-1-cykloheptanokarboksylowy; kwas 1-amino-1-cyklooktanokarboksylowy; i kwas 1-amino-1-cykloonanekarboksylowy.

W powyższym wzorze, hydroksyalkil, hydroksyfenyloalkil, i hydroksynaftyloalkil może obejmować podstawniki 1-4 hydroksylowe. Również, COE₁ oznacza -C=O-E₁. Przykłady -C=O-E₁ obejmują, ale bez ograniczenia, acetyl i fenylopropionyl.

7,11

Peptyd według wynalazku oznaczony jest tu również innym formatem, np. [Ahc^{7, 11} ] hPT(1-34) NH2, przy czym w nawiasach umieszczono aminokwasy podstawione za aminokwasy sekwencji naturalnej (np. Ahc⁷ za Leu⁷ i Ahc¹¹ za Leu¹¹ w hPTH). Skrót hPTH oznacza ludzki PTH, hPTHrP oznacza ludzki PTHrP, rPTH oznacza szczurzy PTH, zaś bPTH oznacza bydlęcy PTH. Liczby w nawiasach dotyczą liczby aminokwasów występujących w peptydzie (np. hPTH(1-34) oznacza aminokwasy od 1 do 34 sekwencji peptydowej ludzkiego PTH). Sekwencja dla hPTH(1-34), hPTHrP(1-34), bPTH(1-34), i rPTH(1-34) podana jest w Nissenson i in., Receptor, 3:193 (1993). Oznaczenie NH2” w PT(1-34)NH2 oznacza, że koniec C peptydu jest amidowany. Z drugiej strony, PTH(1-34), ma wolny koniec C.

Każdy z peptydów według wynalazku jest zdolny do pobudzania wzrostu kości u osobnika (tj. ssaka takiego jak pacjent ludzki). Tak więc, w leczeniu osteoporozy i złamań kości przydatne jest gdy podaje się je same alborównocześnie z leczeniem przeciwresorpcyjnym, np. bisfosfonianami i kalcytoniną.

Peptydy według wynalazku można dostarczać w postaci soli dopuszczalnych farmaceutycznie. Przykłady takich soliobejmują, ale bez ograniczenia, sole wytwarzane z kwasami organicznymi (np. octowym, mlekowym, jabłkowym, cytrynowym, maleinowym, askorbinowym, bursztynowym, benzoesowym, metanosulfonowym, toluenosulfonowym albo pamoinowym), kwasami nieorganicznymi (np. chlorowodorowym, siarkowym albo fosforowym), i kwasami polimerycznymi (np. taninowym, karboksymetylocelulozą, polimlekowym, poliglikolowym albo kopolimerami kwasów polimlekowo-glikolowym).

Terapeutycznie skuteczna ilość peptydu według wynalazku i nośnika dopuszczalnego farmaceutycznie (np. węglanu magnezu, laktozy albo fosfolipidu, z którymi związek czynny może przybrać postać micelli) razem tworzą kompozycję terapeutyczną (np. pigułka, tabletka, kapsułka albo ciecz) do podawania (np. doustnie, dożylnie, przezskórnie, dopłucnie, dopochwowo, podskórnie, donosowo, jontoforetycznie albo dokomorowo). Pigułki, tabletki albo kapsułki do podawania doustnego można pokrywać substancjami do ochrony kompozycji czynnej przed kwasem żołądkowym albo enzymami jelitowymi w żołądku, przez czas odpowiedni do umożliwienia dojścia w stanie niestrawionym do jelita cienkiego. Kompozycja terapeutyczna może być również w postaci ulegającej biodegradacji albo nie ulegającego biodegradacji preparatu o przedłużonym uwalnianiu do podawania podskórnego albo domięśniowego.

Patrz, opispatentowy USA nr 3,773,919 i 4,767,628 oraz zgłoszenie PCT nr WO 94/15587. Ciągłe dostarczanie można również osiągnąć stosując wszczepialne albo zewnętrzne pompy (np. pompa INFUSAID™). Podawanie można również przeprowadzić w sposób przerywany, np. przez pojedyncze codzienne wstrzyknięcia, albo w sposób ciągły w niskich dawkach, np. w postaci preparatu przedłużonym uwalnianiu.

Dawka peptydu do leczenia powyższych chorób i zaburzeń różni się w zależności od sposobu podawania, wieku i masy ciała osobnika, oraz stanu leczonego osobnika i zawsze będzieokreślana przez prowadzącego lekarza albo weterynarza.

Peptyd według wynalazku objęty powyższym wzorem ogólnym może być zastosowany w leczeniuchorób albo zaburzeń związanych z niedoborem wzrostu kości itp., np. osteoporozy albo złamań.

Woparciuoniniejszyopis,wynalazekmożnawykorzystaćw pełni. Poniższe szczegółowe przykłady mają jedynie ilustrować, a nie ograniczać pozostałości opisu w żaden sposób. Dalej, wszystkie wymienione publikacje są włączone jako odnośniki.

Struktura

Opisywano, że PTH(1-34) i PTHrP(1-34) obejmuje dwie amfofilowe domeny helis alfa. Patrz, np. Barden i in., Biochem. 32:7126 (1992). Pierwsza helisa a jest utworzona przez reszty aminokwasowe od 4 do 13, podczas gdy druga helisa a jest utworzona przez aminokwasy od 21 do 29. Niektóre peptydy według wynalazku są podstawione Acc w jednej albo więcej resztach wewnątrz albo w pobliPL 191 898 B1

11 27 żu tych dwóch regionów PTH(1-34) i PTHrP(1-34), np. Ahc⁷ i Ahc¹¹ w pierwszej helisie a albo Ahc²⁷i Ahc²⁸ w drugiej helisie a.

Synteza

Peptydy według wynalazku można wytwarzać standardową syntezą na fazie stałej. Patrz, np. Stewart i in., Solid Phase Synthesis (Pierce Chemical Co., wyd. 2, 1984). Poniżej przedstawiono opis, w jaki sposób wytworzono [Glu^{22, 25}, Leu^{23, 28,} Lys^{26, 30}, Aib^29,, Ahc³¹] hPTH(1-34)NH₂. Inne peptydy według wynalazku specjalista w dziedzinie może wytworzyć w sposób analogiczny.

Kwas 1-[N-tert-butoksykarbonylo-amino]-1-cykloheksanokarboksylowy (Boc-Ahc-OH) syntetyzowano w następujący sposób:

19,1 g (0,133 mola) kwasu 1-amino-1-cykloheksano-karboksylowego (Acros Organics, Fisher Scientific, Pittsburgh, PA) rozpuszczono w 200 ml dioksyny i 100 ml wody. Do tego dodano 67 mg 2 N NaOH. Roztwór schłodzono w łaźni wodnej z lodem. Do tego roztworu dodano 32,0 g (0,147 mola) di-tert-butylo-dikarbonianu. Mieszaninę reakcyjną mieszano przez noc w temperaturze pokojowej. Następnie dioksynę usunięto pod zmniejszonym ciśnieniem. Do pozostałego roztworu dodano 200 ml octanu etylu. Mieszaninę schłodzono w łaźni wodnej z lodem. pH warstwy wodnej ustalono na około 3 przez dodanie 4N HCl. Warstwę organiczną oddzielono. Warstwę wodną ekstrahowano octanem etylu (1x 100 ml). Połączono dwie warstwy organiczne i płukano wodą (2 x 150 ml), suszono nad bezwodnym MgSO4, filtrowano i zatężano do suchości pod zmniejszonym ciśnieniem. Pozostałość rekrystalizowano w octanie etylu/heksanach. Otrzymano 9,2 g czystego produktu z wydajnością 29%. Inne chronione aminokwasy Acc specjalista w dziedzinie może wytworzyć w analogiczny sposób.

Peptyd syntetyzowano na syntezatorze peptydowym Applied Biosystems (Foster City, CA) model 430A, modyfikowanym do syntezy na fazie stałej metodą przyspieszoną Boc. Patrz, Schnoize i in., Int. J. Peptide Protein Res., 90:180 (1992). Zastosowano żywicę 4-metylobenzylo-hydrylaminy (MBHA) (Peninsula, Belmont, CA) z podstawieniem 0,93 mmol/g. Zastosowano aminokwasy Boc (Bachem, CA, Torrance, CA; Nova Biochem., LaJolla, CA) z następującymi łańcuchami bocznymi zabezpieczonymi grupami: Boc-Ala-OH, Boc-Arg(Tos)-OH, Boc-Asp(OcHex)-OH, Boc-Glu(OcHex)-OH, Boc-His(DNP)-OH, Boc-Val-OH, Boc-Leu-OH, Boc-Gly-OH, Boc-Gln-OH, Boc-Ile-OH, Boc-Lys(2ClZ)-OH, Boc-Ahc-OH, Boc-Thr(Bzl)-OH, Boc-Ser(Bzl)-OH i Boc-Aib-OH. Syntezę przeprowadzono w skali 0,14 mmol. Grupy Boc usunięto przez traktowanie 100% TFA 2x1 min. Aminokwasy Boc (2,5 mmol) wstępnie aktywowano HBTU (2,0 mmol) i DIEA (1,0 ml) w 4 ml DMF i sprzęgnięto bez poprzedzającej neutralizacji soli peptyd-żywica TFA. Czasy sprzęgania wynosiły 5 minut, z wyjątkiem Boc-Aib-OH i jego reszty Boc-Leu-OH, oraz Boc-Ahc-OH i jego reszty Boc-Lys(2Clz)-OH, kiedy to czas sprzęgania dla tych reszt wynosił 2 godziny.

Na zakończenie łączenia łańcucha peptydowego, żywicę traktowano roztworem 20% merkaptoetanolu/10% DIEA w DMF 2 x 30 minut, w celu usunięcia grup DNP po stronie His łańcucha. Grupę Boc końca N usunięto przez traktowanie 100% TFA 2x2 minuty. Częściowo odblokowany kompleks peptyd-żywica płukano DMF i DCM, po czym suszono pod zmniejszonym ciśnieniem. Końcowe odcięcie przeprowadzono przez mieszanie peptydu-żywicy w 10 ml HF zawierającego 1ml anizolu i ditiotreitol (24 mg) w 0°C przez 75 minut. HF usunięto pod strumieniem azotu. Pozostałość płukano eterem (6 x 10 ml) i ekstrahowano 4 N HOAc (6 x 10 ml).

Mieszaninę peptydu w ekstrakcie wodnym oczyszczono przez preparatywną wysokociśnieniową chromatografię cieczową z odwróconymi fazami (HPLC), stosując kolumnę z odwróconymi fazami Vydac™ C18 Nest Group, Southborough, MA). Kolumnę eluowano liniowym gradientem (10% do 45% roztworu B w ciągu 130 minut) przy prędkości przepływu 10 ml/min, (roztwór A = 0,1% wodny roztwór TFA; roztwór B = acetonitryl zawierający 0,1% TFA). Frakcje zebrano i sprawdzano analityczną HPLC. Frakcje zawierające czysty produkt połączono i liofilizowano do suchości. Otrzymano 85 mg białego ciała stałego. W oparciu o analizę analityczną HPLC, czystość wynosiła >99%. Analiza spektrometrii mas dała masę cząsteczkową równą 3972,4 (co było zgodne z wyliczoną masą cząsteczkową 3972,7).

Syntezę i oczyszczanie [Cha²², Leu^{23, 28, 31}, Glu^25, Lys^{26, 30}, Ahc²⁷, Aib²⁹] hPTHrP(1-34)NH₂ przeprowadzono w taki sam sposób jak syntezę [Glu^{22, 25}, Leu^{23, 28}, Lys^{26, 30}, Aib²⁹, Ahc³¹] hPTHrP(1-34)NH2. Zabezpieczone aminokwasy Boc-Aha-OH zakupiono z Bachem, CA. Czystość produktu końcowego wynosiła >99%. Analiza spektrometrii mas dała masę cząsteczkową równą 3997,2 (co było zgodne z wyliczoną masą cząsteczkową 3996,8).

Pełne nazwy zastosowanych tu skrótów brzmią następująco: Boc, t-butylokarbonyl; HF, fluorowodór; Fm, mrówczan; Xan, ksantyl; Bzl, benzyl; Tos, tosyl; DNP, 2,4- dinitrofenol; DMF, dimetylofor6

PL 191 898 B1 mamid; DCM, dichlorometan; HBTU, heksafluorofosforan 2-(1H-benzotriazolo-1-il)-1,1,3,3- tetrametylouronium; DIEA, diizopropyloetyloamina; HOAc, kwas octowy; TFA, kwas trifluorooctowy; 2Clz, 2-chlorobenzylooksykarbonyl i OcHex, O-cykloheksyl.

Do wolnej aminy aminokwasu końca N standardowymi sposobami można przyłączać przykładowo grupy alkilowe, np. C1-12 alkilowe, stosując alkilację redukcyjną. Grupy hydroksyalkilowe, np. C1-2 hydroksyalkilowe, można przyłączać stosując alkilację redukcyjną, w której wolne grupy hydroksylowe są zabezpieczone estrem t-butylowym. Grupy acylowe, np. COE1, można przyłączać przez związanie wolnego kwasu, np. E1COOH, do wolnej aminy aminokwasu końca N, przez mieszanie zakończonej żywicy z 3 równoważnikami molowymi wolnego kwasu i diizopropylokarbodiimidu w chlorku metylenu przez godzinę i przeprowadzenie powstałej żywicy przez etapy (a) do (f) powyższego programu płukania. Jeżeli wolny kwas zawiera wolne grupy hydroksylowe, np. kwas p-hydroksyfenylopropionowy, to sprzęganie powinno się prowadzić z dodatkowymi 3 równoważnikarni molowymi HOBT.

Inne peptydy według wynalazku specjalista w dziedzinie może wytworzyć w sposób analogiczny. Testy funkcjonalne

A. Wiązanie receptora PTH

Peptydy według wynalazku badano na ich zdolność do wiązania receptora PTH obecnego na komórkach SaOS-2 (ludzkie komórki mięsaka kości). Komórki SaOS-2 (Amerykański Zbiór Hodowli Typowych (ang. American Type Culture Collection), Rockville, Maryland, USA; ATCC #HBT 85) utrzymywano w pożywce RPMI 1640 (Sigma, St. Louis, MO) z dodatkiem 10% płodowej surowicy cielęcej (FBS) i 2 mM glutaminy w 37°C w nawilżonej atmosferze 5% CO2 w powietrzu. Pożywkę zmieniano co trzy-cztery dni, zaś komórki klonowano co tydzień przez trypsynizację.

Komórki SaOS-2 utrzymywano przez cztery dni do uzyskanią wzrostu zlewnego. Pożywkę zastąpiono RPMI 1640 z 5% FBS i inkubowano przez 2 godziny w temperaturze pokojowej z 10x10⁴ cpm mono-¹²⁵I-[Nle^8,18, Tyr³⁴ (3-¹²⁵I)] bPTH (1-34) NH2 w obecności współzawodniczących peptydów według wynalazku w różnych stężeniach pomiędzy 10^-11 M i 10^-4 M. Komórki płukano trzykrotnie lodowatym PBS i poddano lizie w 0,1 M NaOH, po czym mierzono radioaktywność związaną z komórkami w liczniku scyntylacyjnym. Syntezę mono-¹²⁵I-[Nle^8,18, Tyr³⁴ (3-¹²⁵I)]bPTH(1-34)NH2 przeprowadzono w sposób opisany przez Goldman i in., Endocrinol., 123:1468 (1988).

Test wiązania przeprowadzono dla różnych peptydów według wynalazku i obliczono dla każdego peptydu wartość Kd (połowa maksymalnego hamowania wiązania mono-¹²⁵I-[Nle^8,18, Tyr³⁴(3-¹²⁵I)] bPTH (1-34) NH2).

Jak pokazano w tabeli I, wszystkie badane peptydy wykazują wysokie powinowactwo do receptora PTH na komórkach Sa-OS-2.

B. Pobudzanie aktywności cyklazy adenylanowej

Mierzono zdolność peptydów według wynalazku do wywoływania reakcji biologicznej w komórkach SaOS-2. Konkretnie, pobudzenie cyklazy adenylanowej badano przez pomiar poziomu syntezy cAMP (adenozyno-3',5'-monofosforanu) jak to opisano uprzednio w Rodan i in., J. Clin. Invest. 72:1511 (1983) i Goldman i in., Endocrinol., 123:1468 (1988). Zlewne komórki SaOS-2 w płytkach 24-studzienkowych inkubowano z 0,5 mCi [³H]-adeniny (26,9 Ci/mmol, New England Nuclear, Boston, MA) w świeżej pożywce w 37°C przez 2 godziny i płukano dwukrotnie buforowanym roztworem soli Hank'a (Gibco, Gaithersburg, MD). Komórki traktowano 1mM IBMX (izobutylometyloksantyną, Sigma, St. Louis, MO) w świeżej pożywce przez 15 minut, a następnie do pożywki dodawano peptydy według wynalazku i inkubowano przez 5 minut. Reakcję zatrzymywano przez dodanie 1,2 M kwasu trichlorooctowego (TCA) (Sigma, St. Louis, MO), a następnie neutralizowano próbkę 4 N KOH. cAMP izolowano metodą chromatografii na dwóch kolumnach (Salomon i in., 1974, Anal. Biochem. 58, 541). Radioaktywność zliczano w liczniku scyntylacyjnym (Liquid Scintillation Counter 2200CA, Packard, Dovners Grove, IL).

Odpowiednie wartości EC50 (połowa maksymalnego pobudzenia cyklazy adenylanowej) dla testowanych peptydów obliczono, jak to opisano w tabeli I. Stwierdzono, że wszystkie badane peptydy są silnymi stymulatorami aktywności cyklazy adenylanowej, która jest wskaźnikiem szlaku biochemicznego proksymalnego sygnału proliferacji osteoblastów (np. wzrostu kości).

PL 191 898 B1

T a b e l a I

Peptyd	Kd (mM)	EC50 (nM)
[Glu^{22, 25}, Leu^{23, 28}, Lys^{26, 30}, Aib²⁹, Ahc³¹] hPTHrP (1-34) NH2;	0,200	3,7
[Glu^{22, 25}, Ahc²³, Lys^{26, 30}, Leu^{28, 31}, Aib²⁹] hPTHrP (1-34) NH2;	0,070	3,9
[Glu^{22, 25}, Leu^{23, 28, 31}, Lys^{26, 30}, Ahc²⁷, Aib²⁹] hPTHrP (1-34) NH2;	0,230	3,0
[Glu^{22, 25, 29}, Leu^{23, 28, 31}, Lys²⁶, Ahc³⁰] hPTHrP (1-34) NH2;	0,230	20
[Cha²², Leu^{23, 28, 31}, Glu²⁵, Lys^{26, 30}, Ahc²⁷, Aib²⁹] hPTHrP (1-34) NH2;	0,060	2,0
[Glu^{22, 25}, Leu^{23, 28, 31}, Ahc²⁴, Lys^{26, 30}, Aib²⁹] hPTHrP (1-34) NH2;	0,006	0,5
[Glu^{22, 29}, Leu^{23, 28, 31}, Aib²⁵, Lys^{26, 30}, Ahc²⁷] hPTHrP (1-34) NH2;		5
[Glu²², Leu^{23, 28, 31}, Aib^{25, 29}, Lys^{26, 30}, Ahc²⁷] hPTHrP (1-34) NH2;		2
[Ahc²², Leu^{23, 28, 31}, Glu²⁵, Lys^{26, 30}, Aib²⁹] hPTHrP (1-34)NH₂;		0,3
[Glu^{22, 25}, Leu^{23, 31}, Lys^{26, 30}, Ahc²⁸, Aib²⁹] hPTHrP(1-34)NH2;		0,5
[Cha²², Ahc²³, Glu²⁵, Lys^{26, 30}, Leu^{28, 31}, Aib²⁹] hPTHrP (1-34)NH₂;		0,4

Inne wykonania

Należy rozumieć, że o ile wynalazek został opisany w powiązaniu z jego szczegółowym opisem, powyższy opis ma ilu strować, nie zaś ograniczać zakres wynalazku, który określony jest zakresem dołączonych zastrzeżeń. Inne aspekty, zalety i modyfikacje leżą w zakresie zastrzeżeń.

Claims

1. Wariant peptydu ludzkiego hormonu przytarczyc o wzorze:

H \

Ser-Val-Ser-Glu-Ile-Gln-Leu-Met-His-Asn-Leu-Gly-Lys-His/

H

Leu-Asn-Ser-Met-Glu-Arg-Val-Glu-Trp-A24-Arg-Lys-A27-Leu-A29-Asp-Val-His-Asn-Phe-NH2, znamienny tym, że:

A24 oznacza Leu albo Acc;

A27 oznacza Lys albo Leu;

A29 oznacza Glu albo Aib.

2. Wariant peptydu ludzkiego hormonu przytarczyc według zastrz. 1, znamienny tym, że:

A27 oznacza Lys.

3. Wariant peptydu ludzkiego hormonu przytarczyc według zastrz. 2, znamienny tym, że A29 oznacza Aib.

4. Wariant peptydu ludzkiego hormonu przytarczyc według zastrz. 1, znamienny tym, że stanowi [Ahc²⁴] hPTH (1-34)NH2; [Ahc²⁴, Aib²⁹] hPTH(1-34)NH2; [Ahc²⁴, Leu²⁷, Aib²⁹] hPTH (1-34) NH2; lub jego farmaceutycznie dopuszczalną sól.

PL 191 898 B1

5. Wariant peptydu białka pokrewnego ludzkiemu hormonowi przytarczyc o wzorze:

H \

Ala-Val-Ser-Glu-His-Gln-Leu-Leu-His-Asp-Lys-Gly-Lys/

H

Ser-Ile-Gln-Asp-A₁₈-Arg-Arg-A₂₂-A₂₃-A₂₄-A₂₅-A₂₆-A₂₇-A₂₈-A₂₉-A₃₀-A₃₁-His-Thr-Ala-NH₂, znamienny tym, że:

A18 oznacza Leu albo Acc;

A22 oznacza Phe, Glu, Acc albo Cha;

A23 oznacza Phe, Leu, Acc albo Cha;

A24 oznacza Leu albo Acc albo Cha;

A25 oznacza His, Lys albo Glu;

A26 oznacza His albo Lys;

A27 oznacza Leu albo Acc;

A28 oznacza Ile, Leu albo Acc;

A29 oznacza Ala, Glu albo Aib;

A30 oznacza Glu, Acc albo Lys;

A31 oznacza Ile, Leu albo Acc;

przy czym przynajmniej jeden A18, A22, A23, A24, A27, A28, A30, albo A31 oznacza Acc; lub jego farmaceutycznie dopuszczalna sól.

6. Wariant peptydu białka pokrewnego ludzkiemu hormonowi przytarczyc według znamienny tym, że A22 oznacza Glu, Acc, albo Cha;

A23 oznacza Leu, Acc, albo Cha;

A24 oznacza Leu, Acc;

A25 oznacza Lys albo Glu;

A26 oznacza Lys;

A31 oznacza Leu, Ile albo Acc.

7. Wariant peptydu białka pokrewnego ludzkiemu hormonowi przytarczyc według znamienny tym, że A18 oznacza Leu albo Ahc.

8. Wariant peptydu białka pokrewnego ludzkiemu hormonowi przytarczyc według znamienny tym, że

A22 oznacza Glu, Ahc albo Cha;

A23 oznacza Leu, Ahc albo Cha;

A24 oznacza Leu, Ahc albo Cha;

A27 oznacza Leu albo Ahc;

A28 oznacza Ile, Leu albo Ahc;

A30 oznacza Glu, Ahc albo Lys;

A31 oznacza Leu, Ile albo Ahc.

9. Wariant peptydu białka pokrewnego ludzkiemu hormonowi przytarczyc według znamienny tym, że przynajmniej jeden A22, A23, A24 oznacza Cha.

10. Wariant peptydu białka pokrewnego ludzkiego hormonowi przytarczyc według znamienny tym, że A29 oznacza Aib.

11. Wariant peptydu białka pokrewnego ludzkiemu hormonowi przytarczyc według znamienny tym, że stanowi [Glu^{22, 25}, Leu²³' ²⁸, Lys²⁶' ³⁰, Aib²⁹, Ahc³¹] hPTHrP (1-34) NH₂;

[Glu^{22, 25}, Ahc²³, Lys^{26, 30}, Leu^{28, 31}, Aib²⁹] hPTHrP (1-34) NH₂;

[Glu^{22, 25, 29}, Leu^{23, 28, 31}, Lys²⁶, Ahc³⁰] hPTHrP (1-34) NH₂;

[Glu^{22, 25}, Leu^{23, 31}, Lys^{26, 30}, Ahc²⁸, Aib²⁹] hPTHrP (1-34) NH₂;

[Cha²², Ahc²³, Glu²⁵, Lys^{26, 30}, Leu²⁸' ³¹, Aib²⁹] hPTHrP (1-34) NH₂;

[Ahc^{22, 24, 27}, Leu²³, ^{28, 31}, Glu²⁵, Lys^{26, 30}, Aib²⁹] hPTHrP (1-34)NH₂;

zastrz. 5, zastrz. 6, zastrz. 7, zastrz. 8, zastrz. 9, zastrz. 5,

PL 191 898 B1 [Cha²², Leu^{23, 28, 31}, Ahc^{24, 27}, Glu²⁵, Lys^{26, 30}, Aib²⁹] hPTHrP (1-34)NH2; [Glu²², Leu^{23, 28, 31}, Ahc^{24, 27}, Lys^{25, 26}, Aib²⁹] hPTHrP (1-34) NH2; [Ahc^{18, 24, 27}, Glu²², Cha²³, Lys^{25, 26}, Leu²⁸, Aib²⁹] hPTHrP (1-34) NH2; [Glu²², Cha²³, Ahc²⁴, Lys^{25, 26}, Leu²⁸, Aib²⁹] hPTHrP (1-34)NH2;

lub jego farmaceutycznie dopuszczalną sól.