CZ301497B6

CZ301497B6 - Peptid, který je variantou cásti parathyroidního hormonu a peptidy proteinu, príbuzného parathyroidnímu hormonu

Info

Publication number: CZ301497B6
Application number: CZ20050594A
Authority: CZ
Inventors: Xin Dong@Zheng
Original assignee: Societe De Conseils De Recherches Et D´Applications Scientifiques, S.A.S.
Priority date: 1997-01-07
Filing date: 1997-12-08
Publication date: 2010-03-24
Also published as: SI0948541T1; ATE321784T1; EP1645566B1; US5955574A; CZ298937B6; CN1137898C; NO993341L; DK0948541T3; PT1645566E; KR100699422B1; CA2276614A1; DE69735603T2; DK1645566T3; RU2198182C2; EP2206725A1; KR20000069952A; ATE471342T1; CA2276614C; KR20060030006A; WO1998030590A9

Abstract

Varianty fragmentu parathyroidního hormonu (PTH) nebo varianty proteinu príbuzného parathyroidnímu hormonu (PTHrP) stimulují rust kostí a jsou tak využitelné napr. pri lécbe osteoporózy ci kostních zlomenin.

Description

Oblast techniky

Parathyroidní hormon (PTH) je polypeptid vytvářený v žláze příštítných tělísek. Zralá, cirkulující forma hormonu se skládá z 84 aminokyselinových zbytků. Biologické působení PTH může být nahrazeno peptidovým fragmentem, který pochází z jeho N-konce (např. aminokyselinovými io zbytky 1 až 34). Parathyroídnímu hormonu příbuzný protein (parathyroid hormone related protein - PTHrP) je 139 až 173 aminokyselin dlouhý protein, mající na svém N-konci homologii s PTH. PTHrP má mnoho biologických účinků společných s PTH, včetné vazby na společný

PTH/PTHrP receptor - l regear a kol, Endocrinol., 93:1349 (1983). Byly charakterizovány PTH peptidy z mnoha různých zdrojů, např. člověka, hovězího dobytka, krysy, kuřete - Nissenson a kol., Receptor, 3: 193 (1993).

Dosavadní stav techniky

Bylo ukázáno, že PTH zvyšuje jak množství kostní hmoty, tak její kvalitu Dempster a kok, Endocrine Rev., 14: 690 25 (1993) a Riggs, Amer. J. Med., 91 (Suppl. 5B): 375 (1991). Anabolický účinek občasně podávaného PTH byl pozorován u mužů ί žen s osteoporozou, a to jak v případě, že byla současně prováděna antiresorpční léčba, tak i bez ní - Slovik a kol., J. Bone Miner. Res., 1: 377 (1986); Reeve a kol., Br. Med. J., 301: 314 (1990) a Hesch, R-D. a kok,

Calcif. Tissue Intl. 44: 176 (1989).

Podstata vynálezu

Vynález charakterizuje peptidy následujících vzorců: [Cha^22, Glu²⁰, Lys^{20, JU}, Leu²\ Aib hPTHrP(I-34)NH2; [Cha²²·²³, Glu²⁵, Lys²⁶·³⁰, Aib²⁹] hPTHrP(l-34)NH2; [Glu²²·²⁵, Leu²³'²⁸·³Lys²⁶, Aib²⁹, Nle³⁰] hPTHrP(l-34)NH2; [Glu²²·²⁵, Leu²³·²’³⁰·³¹, Lys²⁶, Aib²’] hPTHrP(l-34)NH2; [Glu²²· ²⁵' ²⁹, Leu²³· ²⁸‘ ³⁰· ^3I, Lys²⁶] hPTHrP(l-34)NH2; [Glu²²· ²⁵· ²⁹, Leu²³· ²⁸· ^3I, Lys²⁶, Nle³⁰] hPTHrP(l-34)NH2; [Ser¹, lie⁵, Met⁸, Asn¹⁰, Leu·²³·²⁸·³¹, His¹⁴, Cha¹⁵, Glu²²·²⁵, Lys’⁶'³⁰, Aib²⁹] hPTHrP(l-34)NH2; [Glu²²·²⁵, Cha²³, Lys²⁶, Leu²⁸·³¹, Aib²’, Nle³⁰] hPTHrP(l-34)NH2; [Cha²²·²³, Glu²⁵, Lys²⁶'³⁰, Leu²⁸·³¹, Aib²⁹] hPTHrPG -34)N1L; [Cha²², Leu²³·²⁸·³¹, Glu²²'²⁹, Lys²⁶, Nle³⁰] hPTHrP(l-34)NH2; [Cha⁷· · ^l5] hPTHrP(134)NH2; [Cha⁷· ⁸' ^l5] hPTHrP(l-34)NH2; [Glu²², Cha²³, Aib²⁵· ²⁹, Lys²⁶· ³⁰, Leu²⁸· ^3I1 hPTHrP(l-34)NH2; [Glu²², Cha²³, Aib²⁵· ²⁹, Lys²⁶, Leu²⁸] hPTHrP(l-34)NH2; [Glu²², Leu²³ -⁸, Aib²⁵' ²⁹, Lys²⁶] hPTHrPlI 34)NH?; [Aib²⁹] hPTHrP(l34)NH2; [Glu²²·²⁵, Cha²³, Lys²⁶, Leu²⁸'³¹, Aib²⁹, Nle³⁰] hPTHrP(l-34)NH2; [Glu²²·²\ Cha²³, Lys²⁶· ³⁰, Aib²⁹, Leu³¹] hPTHrP(l-34 )NH2; [Glu²²·²⁵, Leu²³·²⁸·³¹, Lys²⁶, Aib²⁹·³⁰] hPTHrP(l-34)NH2; [Glu

22. 25 .29-,

23. 28. 31

Jih , Lys²⁶, Aib⁷’] hPTHrP(l-34)NH2; [Glu⁷⁷·⁷⁷, Leu⁷⁷·^7S-, Aib⁷”·⁷’, Lys’] ;u^{28, 31} Aib²⁹] hPTHrP(l-34)NH2; [Glu²²· ²\ Cha²³, Lys²⁶·³⁰, Aib²⁹] hPTHrP(l-34)NH2; [Glu²²·²⁵, Cha²³, Lys²⁶·³⁰, Leu²⁸, Aib²⁹] hPTHrP(l34)NH2; or [Leu²⁷, Aib²⁹]

Leu hPTHrP(l-34)NH₂; [Glu²²· ²⁵, Cha²³, Lys²⁶’ ³⁰ ’, Cha²⁷, Lys² hPTHrP( 1-34)NH₃ nebojejich farmaceuticky použitelnou sůl.

S výjimkou N-koncové aminokyseliny, všechny zkratky aminokyselin v tomto popisu (např. Ala nebo Al) zastupují strukturu -NH-CH(R)-CO-, kde R je postranní řetězec aminokyseliny (např. CH3 pro Ala). Pro N-koncovou aminokyselinu, zkratka zastupuje strukturu -N-CH(R)-CO-, kde R je postranní řetězec aminokyseliny. /ř-Nal, Nle, Dap, Cha, Nva, Amp, Pal, Ahc a Aib jsou zkratky následujících α-aminokyselin: /?-(2-naftyl)alanin, norleucin, a^-diaminopropionová kyselina, cyclohexylalanin, norvaiin, 4-amino-fenylalanin, /T-(3-pyridínyl)alanin, l-amino-lcyclo-hexankarboxylová kyselina a α-aminoizomáselná kyselina. Ve výše uvedeném vzorci, hydroxyalkyl, hydroxyfenylalkyl a hy droxy nafty laiky I mohou obsahovat 1 až 4 hydroxy sustituCZ 301497 B6 entv. Také COEi znamená strukturu -C~O^-E]. Příklady -C=O‘Ei jsou mimo jiné např. acetyl a fenyípropionyl.

Peptid, který je předmětem tohoto vynálezu, je zde také označován vzorcem jiného formátu, např. [Ahc^7, ) hPTH(1-34)NH2, se substituovanými aminokyselinami v původní sekvenci, které jsou umístěny ve druhé dvojici závorek (např, Ahc za Leu' a Ahc'¹ za Leu v hPTH). Zkratka hPTH označuje lidský PTH, hPTHrP označuje lidský PTHrP, rPTH označuje krysí PTH a bPTH označuje hovězí PTH. Čísla v závorkách označují počet aminokyselin, přítomných v peptidů (např. hPTH(l-34) jsou aminokyseliny 1 až 34 ze sekvence peptidů lidského PTH). Sekvence io hPTH(l-34), hPTHrP(l-34), bPTH( 1-34), and rPTH(l-34) jsou uvedeny v práci Nissenson a kol., Receptor, 3:193 (1993), Označení „NH2^Lt v PTH(1-34)NH₂ označuje, že C-koncová aminokyselina peptidů nese aminoskupinu. Naopak PTH( 1 -34) má volnou aminokyselinu na C-konci.

Každý z peptidů, které jsou předmětem tohoto vynálezu, je schopen stimulovat růst kosti u pacienta (tj. u savce, jako je např. lidský pacient). Je tedy užitečný při léčení osteoporózy a zlomenin kostí, ať je již podáván samostatně neboje současně prováděna antiresorpční léčba např, bifosfonáty nebo kalcitoninem.

Peptidy, které jsou předmětem tohoto vynálezu, mohou být podávány ve formě svých farmaceu20 ticky použitelných solí. Příklady takových solí jsou mimo jiné takové, které jsou vytvořeny s organickými kyselinami (např. octovou, mléčnou, maleinovou, citrónovou, jablečnou, askorbovou, jantarovou, benzoovou, methansulfonovou, toluensulfonovou nebo palmitovou kyselinou), s anorganickými kyselinami (např. chlorovodíkovou, sírovou nebo fosforečnou kyselinou), s polymerními kyselinami (např. tříslovou kyselinou, karboxymethyícelulózou, polymerizovanou kyselinou mléčnou, polymerizovanou kyselinou glykolovou nebo kopolymery polymléčné a polyglykolové kyseliny).

Terapeuticky účinné množství peptidů, který je předmětem tohoto vynálezu, a farmaceuticky použitelný nosič (např. uhličitan hořečnatý, laktóza nebo fosfolipid s nímž léčebná sloučenina .to může vytvářet micely) dohromady tvoří léčebný prostředek (např. pilulku, tabletku, kapsli nebo tekutinu), které jsou vhodné pro podávání pacientovi (např. orálně, intravenózně, transdermálně, pulmonálně, vaginálně, podkožně, nazálně, iontoforeticky nebo intratracheálně). Pilulka, tabletka nebo kapsle, která má být podávána orálně, může být potažena látkou, která chrání aktivní prostředek proti žaludeční kyselině nebo střevním enzymům v žaludku po dobu dostatečnou k tomu, aby prošel nestráven až do tenkého střeva. Léčebný prostředek může být také v biodegradovatelné nebo nebiodegradovatelné formě se zpomateným uvolňováním pro podkožní nebo intramuskulární podávání. Viz např. patenty US 3 773 919 a 4 757 628 a PCT přihlášku WO 94/15587. Kontinuálního podávání lze také dosáhnout pomocí implantovatelné nebo externí pumpy (např. pumpa 1NFUSAIDTM). Podávání se může provádět buď přerušovaně, např. jedna injekce denně, nebo kontinuálně, kdy se podává nízká dávka, např. pomocí formy se zpomaleným uvolňováním.

Množství peptidů, který je předmětem tohoto vynálezu, pro léčení výše uvedených nemocí nebo poruch se mění v závislosti na způsobu podávání, věku a tělesné váze pacienta, na stavu léčeného pacienta, a s konečnou platností o něm rozhodne ošetřující lékař nebo veterinář.

V rámci tohoto vynálezu je uvažován také peptid, odpovídající výše uvedenému obecnému vzorci, vhodný pro léčení nemocí nebo poruch spojených s nedostatečným růstem kostí a podobně, např, osteoporózy nebo zlomenin.

Další rysy a výhody předkládaného vynálezu budou zřejmé z podrobného popisu a z patentových nároků.

Příklady provedení vynálezu

Na základě zde předloženého popisu muže být předkládaný vynález využit ve své největším roz5 sáhu. Následující specifické příklady jsou uvedeny pouze jako ilustrace a nikoli jako jakékoli omezení předkládaného vynálezu. Všechny publikace zde citované jsou zahrnuty v odkazech.

Struktura

U PTH(l-34) a PTHrP(l-34) bylo popsáno, že obsahují dvě amfofilní α-šroubovicové domény. Viz např. Barden a kol., Biochem., 32: 7 126 (1992). První α-šroubovice je vytvořena mezi aminokyselinovými zbytky 4 až 13, zatímco druhá α-šroubovíce je vytvořena mezi aminokyselinovými zbytky 21 až 29.

Syntéza

Peptidy, které jsou předmětem tohoto vynálezu, mohou být připraveny standardní syntézou na pevné fázi. Viz např. Stewart, J.M. a kol., Solid Phase Synthesis (Pierce Chemical Co„ 2. vyd., 1984). Následuje popis, jak byl připraven [Glu^{22 25}, Leu^23,2ři, Lys^26,30, Aib²⁹, Ahcⁿ]hPTH(l20 34)NH;. Ostatní peptidy, které jsou předmětem tohoto vynálezu, lze připravit analogickým způsobem osobou, která má běžnou zkušenost v tomto oboru.

Příklad I: Syntéza 1-[N-terc-butoxy karbonyl· amino)- l-cyklohexankarboxylově kyseliny

-[N-terc butoxycarbonyl-amino)-1 -cyklohexankarboxylová kyselina (Boc- Ahc-()14) byla syntetizována následujícím způsobem:

19,1 g (0,133 mol) of l-amino-l-cyklohexankarboxylové kyseliny (Acros Organics, Fisher so Scientiťic, Pittsburgh, PA) bylo rozpuštěno v 200 ml dioxanu a 100 ml vody, K tomu bylo přidáno 67 mg 2N NaOH, Roztok byl ochlazen v lázni vody s ledem. K tomuto roztoku bylo přidáno

32.0 g (0.147 mol) bi-terc-butylbikarbonátu. Reakční směs byla míchána přes noc pří teplotě místnosti. Poté byl za sníženého tlaku odstraněn dioxan. Ke zbylému vodnému roztoku bylo přidáno 200 ml octanu etylnatého. Směs byla ochlazena v lázni vody s ledem. pH vodné vrstvy bylo upraveno na pH 3 přidáním 4N HCI. Organická vrstva byla oddělena. Vodná vrstva byla extrahována octanem etylnatým (1 x 100 ml). Obě organické vrstvy byly spojeny a promyty vodou (2 x 150 ml), sušeny nad bezvodým MgSO₄, filtrovány a za sníženého tlaku koncentrovány do suchého stavu. Výtěžek byl rekrystalován ze směsi oetan etylnatý/hexany. Bylo získáno 9.2 g čistého produktu 29% výtěžek.

Peptid byl syntetizován na syntezátoru peptidů Applied Biosystems (Foster City, CA) model 430A, který byl upraven pro provádění zrychlené syntézy peptidů na pevné fázi pomocí Bocaminokyselin. Viz Schnoize a kol., Int. J. Peptide Protein Res., 90: 180 (1992). Byla použita 4methylbenz-hydrylarnine (MBHA) pryskyřice (Peninsula, Belmont, CA) která byla substituo45 vána v rozsahu 0.93 mmol/g. Byly použity Soc aminokyseliny (Bachem, CA, Torrance, CA; Nova Biochem., LaJolla, CA) s následující ochranou postranních řetězců: Boc-Ala-OH, BoeArg(Tos)-OH, Boc-Asp(OcHex)OH, Boc-Glu(OcHex>OH:, Boc-His(DNP)-4)H, Boc-ValOH, Boc-Leu-OH, Boe-Gly-OH, BocGIn-OH. Boc-lle-OH, Boc- Lys(2(4/> OH. Boc-AhcOH, Boc-Thr(Bzl)-OH, Boc-Ser(Bzl)OH a Boc-Aib-OH. Syntéza byla provedena v rozsahu

0.14 mmol. Skupiny Boc byly odstraněny působením 100% TFA po dobu 2 x l min. Boc aminokyseliny (2.5 mmol) byly předem aktivovány pomocí ΗΒΤΌ (2.0 mmol) a DIEA (1.0 ml) ve 4 ml DMF a byly připojeny bez předchozí neutralizace TFA soli komplexu peptid-pryskyřice. Připojení probíhalo 5 minut s výjimkou Boc-AibOH ajeho následujícího zbytku Boc-LeuOH, a u Boc-AhcO)H ajeho následujícího zbytku Boc-Lys(2ClZ)-OH, kde připojení těchto čtyřech

5? zbytků probíhalo po dobu 2 hodin.

Po ukončení syntézy peptidového řetězce bylo na pryskyřici působeno roztokem 20% merkaptoetanol/10% DIEA v DMF po dobu 2 x 30 minut, aby došlo k odstranění skupiny DNP na postranním řetězci His. N-koncová skupina Boc byla poté odstraněna pomocí působení 100% TFA po dobu 2x2 minuty. Peptid na pryskyřici, s částečně odstraněnými protekčními skupinami, byl promyt DMF a DCM a sušen za sníženého tlaku. Konečné štěpení bylo provedeno mícháním peptidu na pryskyřici v 10 ml HF, který obsahoval 1 ml anisolu a dithiothreitolu (24 mg) při teplotě 0 °C po dobu 75 minut. HE byl odstraněn proudem dusíku. Zbytek byl promyt éterem (6 x 10 ml) a extrahován 4N HOAc (6x10 ml).

io

Peptidová směs, obsažená ve vodném extraktu, byla čištěna preparativní vysokotlakou kapalnou chromatografií (HPLC) provedené v reverzní fázi. Byl použit sloupec Vydac™ C18 pro reverzní fázi (Nést Group, Southborough, MA). Sloupec byl promýván lineárním gradientem (10% až 45 % roztoku B po dobu 130 minut) při rychlosti průtoku 10 ml/minutu. (Roztok A = 0,1% vod15 ný roztok TFA; Solution B = acetonitril, obsahující 0,1 % TFA). Frakce byly odebírány a kontrolovány pomocí analytické HPLC. Ty frakce, které obsahovaly čistý produkt byly spojeny a lyofilizovány do suchého stavu. Bylo získáno 85 mg bílé pevné látky. Čistota produktu byla >99 %, založeno na analytické HPLC analýze. Hmotnostní spektrometrická analýza zjistila molekulovou hmotnost 3972,4 (v souhlase s vypočtenou molekulovou hmotností 3972,7).

Příklad 2; Syntéza a puriťikace

Syntéza a puriflkace [Cha²², Leu^{22 28}’ ³¹, Glu²⁵, Lys²⁶ ’⁰, Ahc²⁷, Aib²⁹]hPTH(l-34)NH2 byla pro25 vedena stejným způsobem jako výše uvedená syntéza [Glu²²’ ^2S, Leu^{23, 2H}, Lys^26, Aib²⁹, Ahc ']hPTH(l-34)NH2. Chráněná aminokyselina Boc- ChaOH byla zakoupena od Bachem, CA. Čistota výsledného produktu byla >99% a hmotnostní spektrometrická analýza zjistila molekulovou hmotnost 3992,2 (vy počtená molekulová hmotnost je 3996,8).

io Plné názvy pro výše používané zkratky jsou následující: Boc pro t-butyloxykarbony 1, HF pro fluorovodík, Fm pro formyl, Xan pro xanthyl, Bzl pro benzyl, Tos pro tosyl, DNP pro 2,4-dinitrofenyl, DMF pro dimethylformamid, DCM pro dichloromethan, HBTU pro 2JIH-benzotriazol-l-yl)-lj,3,3-tetramethyl uronium hexafluorofosfát, DIEA pro diizopropylethylamin, HOAc pro kyselinu octovou, TEA pro kyselinu trifluoroctovou, 2CIZ pro 2-chlorbenzyloxykarbonyl a

OcHex pro O-cyklohexyl.

Substituenty R] a R₂ ve výše uvedeném obecném vzorci mohou být připojeny k volné aminoskupině N-koncové aminokyseliny standardními postupy, známými v tomto oboru. Např. alkylové skupiny, např. Ci_ π alkyl, mohou být připojeny pomocí redukční alky láce. Hydroxyalkylové skupiny, např. C| _l2 hydroxyalkyl, mohou být také připojeny pomocí redukční alkylace, přičemž volná hydroxyskupina je chráněna t-butylesterem. Acylové skupiny, např. COEi, mohou být připojeny tak, že se volné kyseliny, např. EiCOOH, přisyntetizují k volné aminoskupině N-koncové aminokyseliny a poté se smíchá kompletovaná pryskyřice s třemi molárními ekvivalenty jak volné kyseliny, tak diisopropylkarbodiimidu v methylchloridu na dobu 1 hodiny a výsledná prys45 kyrice je cyklována, jak je popsáno ve stupních (a) až (f) výše uvedeného promývacího programu. Jestliže volná kyselina obsahuje volnou hydroxyskupinu, např. p-hydroxyťenylpropionová kyselina, pak se připojení provádí s dalšími třemi molárními ekvivalenty HOBT.

Jiné peptidy, které jsou předmětem tohoto vynálezu, lze připravit analogickým způsobem osobou.

která má běžnou zkušenost v tomto oboru,

Příklad 3: Funkční testy vazby na PTH receptor

U peptidů, které jsou předmětem tohoto vynálezu, byla testována schopnost vázat se na PTC receptor, který je přítomen na buňkách SaOS-2 (human osteosarcoma cells-buňky lidského s osteosarkomu). Buňky SaOS-2 (Americká sbírka typových kultur, Rockwille, MD;

ATCC #HTB 85) byly udržovány v médiu RPMI 1640 (Sigma. St. Louis, MO), doplněném 10 % fetálního hovězího séra (FBS) a 2 mM glutaminem při teplotě 37 °C ve vlhké atmosféře s 5 % CO2. Médium bylo měněno každé tři nebo čtyři dny a buňky byly každý týden pasážovány pomocí trypsinizace.

Buňky SaOS-2 byly udržovány po dobu Čtyřech dnů, dokud nedosáhly spojitého nárůstu.

Médium bylo zaměněno za RPMI 1640 doplněném 5 % FBS a inkubovány 2 hodiny při teplotě místnosti slOxI0⁴cpm mono-'²⁵1 - [Nle^H '⁸, Tyr³⁴ (3-^t25I)]bPTH(l-34)NH2 v přítomnosti kompetujících pepridů, které jsou předmětem iulioio vynálezu, v různém rozsahu koncentrací v rozmezí 10'¹¹ M až 10 ⁴ M. Buňky byly 4x promyty ledovým PBS, lyžovány 0,1 M NaOH a poté byla pomocí scintilačního měřícího přístroje zjišťována radioaktivita vázaná k buňkám. Syntéza mono-^l25í - [Nle⁸’ ^!\ Tyr³⁴ (3-^,25I)]bPTH(l-34)NH2 byla provedena tak, jak je popsáno v Goldman, Μ. E. a kok, Endocrinol., 123: 1 468 (1988).

Vazebné testy byly provedeny s různými peptidy, které jsou předmětem tohoto vynálezu, a pro každý peptid byla spočtena hodnota Kd (polovina maximální inhibice vazby mono-^L5I - [Nle^8,18, Tyr³⁴ (3-¹²⁵I)]bPTH(l-34)NH₂).

Jak je uvedeno v Tabulce I, všechny testované peptidy měly vysokou vazebnou afinitu k PTH receptorů na buňkách SaSO-2.

Příklad 4: Stimulace aktivity adenylát cyklázy.

Byla měřena schopnost peptidů, které jsou předmětem tohoto vynálezu, vyvolat biologickou odpověď v buňkách SaSO-2. Přesněji řečeno, byla zjišťována jakákoli stimulace aktivity adenylát cyklázy měřením úrovně syntézy cAMP (cyklický adenozin 3', 5' mono fosfát), jak bylo dříve popsáno v Rodan a kol., J. Clin. Invest. 72: 1511 (1983) a Goldman Μ. E. a kok, Endocrinol., 123: I 468 (1988). Souvisle narostlé kultury buněk SaSO-2 v destičkách s 24 kultivaČní35 mi jamkami, byly inkubovány po dobu 2 hodin s0,5pCi [H^J] adeninu (26.9 Ci/mmol, New England Nuclear, Boston, MA) v čerstvém médiu při 37 °C a poté 2x promyty Hanksovým balancovaným solným roztokem (Gibco, Gaihersburg, MD). Na buňky bylo působeno 15 minut 1 mM IBMX [izobutyImethyl xanthin, Sigma, st. Louis, MO] v čerstvém médiu a peptidy, které jsou předmětem tohoto vynálezu, byly k médiu přidány inkubovat na dobu 5 minut. Reakce byla zastavena přidáním 1,2 M kyseliny trichloroctové (TCA) (Sigma, St. Louis, MO), následovala neutralizace vzorku pomocí 4 M KOH. cAMP byl izolován dvousloupcovou chromatografíckou metodou (Salmon a kok, 1974, Anal. Biochem. 58, 541). Radioaktivita byla měřena pomocí scintilačního měřícího přístroje (Liquid Scintilation Counter 2200CA, Packard, Downers Grove, ÍL).

Pro testované peptidy byly spočteny hodnoty EC50 (polovina maximální stimulace adenylát cyklázy) a jsou uvedeny v Tabulce I. Bylo zjištěno, že všechny testované peptidy jsou silnými stimulátory aktivity adenylát cyklázy, která je v biochemické dráze prvotním signálem pro proliferaci osteoblastů (např. růst kosti).

Tabulka I

\| Peptid	Kd (μΜ)	i EC₅₀ (nM)
[Glu^{22 Ξ}\ Leu^{23 2B}, Lys²⁶'³⁰, Alb²⁹, Ahc³¹] hPTHrP(1-34)NH₂;	0,200	3,7
[Glu²²'²⁵, Ahc²³, Lys²⁶'³⁰, Leu²³'²⁸, Aib²⁹] hPTHrP(1-34)NH₂;	0,070	3,9
[Glu²²'²⁵, Leu²³'^{28 31}, Lys^{26 30}, Ahc²', Aib²⁹] hPTHrP{ 1 -34)NH₂;	0,230	3,0
[Glu²²'²⁵'²⁹, Leu²³'²⁰'³¹, Lys²⁶, Ahc³⁰] hPTHrP(1-34)NH₂;	0.230	20
[Cha²², Leu²³'²⁰'³', Glu²⁵, Lys²⁰'³⁰, Ahc²⁷. Aib²⁹] hPTHrP(1-34)NH₂;	0,060	2,0
[Glu^22,25, Leu^23,28'³’, Ahc²⁴, Lys²⁶'³⁰ Aib²⁹] hPTHrP(1-34)NH₂;	0,006	0,5
[Glu²²'²⁹, Leu²³’²⁰'³¹, Aib²⁵, Lys²⁶'³⁰, Ahc²⁷] hPTHrP{1-34)NH_z;		5
[Glu²², Leu²³'²⁸'³¹, Aib^{25 29}, Lys²⁶'³⁰, Ahc²⁷] hPTHrP(1-34)NH₂;		2
[Ahe²², Leu²³'²⁸·³¹, Glu²⁵, Lys²⁶'³⁰, Aib²⁹] hPTHrP(1-34)NH₂;		0.3
[Glu²²'²⁵, Leu²³'³¹, Lys²⁶'³⁰, Aha²⁵, Aib²⁹] hPTHrP(1 -34)NH₂;	0.5
[Cha²², Ahe²³, Glu²⁵, Lys²⁶’³⁰, Leu²⁸'³¹, Aib²⁹] hPTHrP(1-34)NH₂;		0,4 \|

Jiná provedení vynálezu.

Třebaže byl vynález podán spolu sjeho detailním popisem, tento popis je zamýšlen pouze jako ilustrace a nikoli jako omezení rozsahu uplatnění vynálezu, které je definováno rozsahem připo10 jených patentových nároků. Jiné aspekty, výhody a modifikace jsou uvedeny v patentových nárocích.

Průmyslová využitel nost

Varianty fragmentu parathyroidního hormonu (PTH) nebo varianty proteinu příbuzného parathyroidnímu hormonu (PTHrP), kde alespoň jeden aminokyselinový zbytek je nahrazen, stimulují růst kostí a jsou tak využitelné např. při léčbě osteoporózy či kostních zlomenin.

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1.

Peptidy vzorců [Cha²²·²³, Glu²⁵, Lys²⁸’³⁰, Leu²⁸, Aib²⁹] hPTHrP(1-34)NH2; [Cha²²' ²³, Glu²⁵, Lys²⁸'³⁸ Aib²⁹] hPTHrP(1-34)NH2; [Glu²²·²⁵, Leu²³'²⁸'³¹, Lys²⁸, Aib²⁹, Nle³⁰] hPTHrP(1-34)NH2; [Glu²²·²⁵, Leu²³'²⁸'³⁰'³¹, Lys²⁸, Aib²⁹] hPTHrP(1-34)NH2; [Glu²²·^{25 29}, Leu²³'²⁸'³⁰’³¹, Lys²⁶] hPTHrP(1-34)NH2; [Glu²²·²⁵'²⁹, Leu²³' ^2B-³¹, Lys²⁶, Nle³⁰] hPTHrP(1-34)NH2; [Ser¹, Ile⁵, Met⁸, Asn¹⁰, Leu’²³·²⁸·³¹, His¹⁴, Cha¹⁵, Glu²²'²⁵, Lys²⁶'³⁰, Aib²⁹] hPTHrP(1-34)NH2; [Glu^{22 25}, Cha²³, Lys²⁶, Leu²⁸' ³¹, Aib²⁹, Nle³⁰] hPTHrP(1-34)NH2; [Cha²²·²³, Glu²⁵, Lys²⁶'³⁰, Leu²⁸· ³¹, Aib²⁹] hPTHrP(1-34)NH₂; [Cha²², Leu²³'²⁸'³¹, Glu²²'²⁹, Lys²⁶, Nle³⁰] hPTHrP(1-34)NH2; [Cha⁷· ’¹' ¹⁵] hPTHrP(1-34)NH2; [Cha⁷' ⁸' ¹⁵] hPTHrP(1-34)NH2; [Glu²², Cha²³, Aib²⁵· ^z9, Lys²⁶' ³⁰, Leu²⁸' ³¹] hPTHrP(1-34)NH2; [Glu²², Cha²³, Aib²⁵' ²⁹, Lys²⁵, Leu²⁸] hPTHrP(1-34)NH2; [Glu²², Leu^{23 2S}, Aib²⁵' ²⁹, Lys²⁶] hPTHrP(1-34)NH2; [Aib²⁹] hPTHrP(1-34)NH2; [Glu²²· ²⁵, Cha²³, Lys²⁶, Leu²⁸' ³¹, Aib²⁹, Nle³⁰] hPTHrP(1-34)NH2; [Glu^{22 2S}, Cha²³, Lys²⁵' ⁵⁰, Aib²³, Leu³’] hPIHrH(l-34)NH2; [Glu²²·^2S, Leu²³·²⁸'³¹, Lys²⁶, Aib²⁹'³⁰] hPTHrP(1-34)NH2; [Glu²²'²⁵, Leu²³·²⁸'³¹, Lys²⁶, Aib²⁹] hPTHrP(1-34)NH2; [Glu²²'²⁵, Leu²³'²⁸'³¹, Aib²⁸'²⁹, Lys³⁰] hPTHrP(134)NH2; [Giu²²· ”, Cha”, Lys²⁶ ”, Leu^{28 31}, Aib²⁹] hPTHrP(1-34)NHz; [Glu²²·²⁵, Cha²³, Lys²⁵·³⁰, Aib²⁹] hPTHrP(1-34)NH2; [Glu²²·²⁵, Cha²³, Lys²⁶·³⁰, Leu²⁸, Aib²⁹] hPTHrP(1-34)NH2; or [Leu²⁷, Aib²⁹] hPTHrP(1-34)NH2 a jejich farmaceuticky použitelné soli.