PT859785E

PT859785E - Analogos peptidicos ciclicos de somatostatina

Info

Publication number: PT859785E
Application number: PT96929913T
Authority: PT
Inventors: John E Taylor; David H Coy
Original assignee: Biomeasure Inc; Univ Tulane
Priority date: 1995-09-29
Filing date: 1996-09-04
Publication date: 2001-11-30
Also published as: ATE201696T1; CN1154657C; EP0859785B1; NO318369B1; CN1197460A; CA2229544C; JP3983806B2; WO1997011962A1; EP0859785A1; HUP9802372A2; CA2229544A1; GR3036447T3; DE69613137D1; IL123357A0; NO981395D0; NZ316822A; HUP9802372A3; BR9610725A; CZ48998A3; DE69613137T2

Description

( descricAo “ANÁLOGOS PEPTÍDICOS CÍCLICOS DE SOMATOSTATINA”

Enquadramento geral da Invenção A somatostatina natural é constituída não só por uma forma isomérica de um 14-aminoácido (somatostatina-14), mas também por uma forma isomérica de um 18-aminoácido (somatostatina-18). Heiman etal, Neuroendocrinology, 45:429-436 (1987). Por causa do curto período de semi-vida da somatostatina natural, foram desenvolvidos vários análogos de somatostatina, por exemplo, para o tratamento de acromegalia. Raynor etal, Molecular Pharmacol. 43:838 (1933). EP 021581, FR 8203852 e US 4428942 referem vários análogos de somatostatina para utilização farmacêutica. FR 900089 divulga a utilização de análogos da somatostatina no tratamento de demência senil degenerativa. O efeito de um análogo de somatostatina conhecido como ODT8-SS foi mencionado pelo seu efeito sobre o sistema nervoso central (Endocrinology, Março de 1999, páginas 714-718).

Foram identificados e caracterizados cinco receptores de somatostatina distintos. Hoyer, etal., Naunyn-Schmiedeberg’s Arch. Pharmacol., 350:441 (1994). A somatostatina produz uma variedade de efeitos, que incluem a modulação da libertação de hormonas, por exemplo, hormona do crescimento, glucagon, insulina, amilina e da libertação de neurotransmissores. Alguns destes efeitos foram associados com a sua ligação a um receptor de somatostatina específico. Por exemplo, a inibição da hormona de crescimento foi atribuída ao receptor de somatostatina do tipo 2 (“SSTR-2”) (Raynor, etal., Molecular Pharmacol. 43:838 (1993); Lloyd et al, Am. J. Physiol. 268:G102 (1995)), enquanto a inibição da insulina foi atribuída ao receptor da somatostatina do tipo 5 (“SSTR-5”) (Coy, et al. 197:366-371 (1993)). Prefere-se ter um análogo que seja selectivo para o subtipo de receptor de somatostatina específico responsável pela resposta biológica pretendida, reduzindo assim a interacção com outros subtipos de receptores, que podiam originar efeitos secundários indesejáveis. 2

Sumário da Invenção A invenção refere-se a um péptido representado pela seguinte fórmula genérica: / A2 —A3 -D-Trp-Lys-A7 “*Ag™A^ **^3 em que A, é o isómero D ou L de Cys ou Mpa; A2 é Asn, Gin, um aminoácido alifático, um aminoácido aromático ou é omitido; A3 é um aminoácido aromático; A4 é His ou um aminoácido aromático; A7 é Thr, Ser ou um aminoácido alifático;

Ag é um aminoácido aromático; A9 é o isómero D ou L de Cys; cada um dos símbolos R, e R2 é, independentemente, H, C142 alquilo, C7.20 fenilalquilo, Cn.20 naftilalquilo, C142 hidroxialquilo, C7.20 hidroxifenilalquilo, Cu_20 hidroxinaftilalquilo ou COE1} em que Ej é C142 alquilo, C7.20 fenilalquilo, Cn_20 naftilalquilo, C142 hidroxialquilo, C7.20 hidroxifenilalquilo ou Cn.20 hidroxinaftilalquilo; e R3 é NH2 ou NH-Y-CH2-Z, em que Y é um grupo hidrocarboneto em C142 (bivalente, por exemplo, grupo alquilo linear ou ramificado) e Z é H, OH, C02H ou CONH2; e uma ligação dissulfureto liga as cadeias laterais dos resíduos Aj e A,; ou um seu sal farmaceuticamente aceitável.

Numa forma de realização, cada um dos símbolos A3 e A8, independentemente, é Phe, p-X-Phe (em que X é halogéneo, OH, OCH3, CH3 ou N02), o-X-Phe (em que X é halogéneo, OH, OCH3, CH3 ouNOj), piridil-Ala, Trp, β-Nal, 2,4-dicloro-Phe, Tyr (f) ou F5-Phe, A4 é His, Phe, p-X-Phe (em que X é halogéneo, OH, OCH3, CH3 ou N02), o-X-Phe (em que X é halogéneo, OH, OCH3, CH3 ouN02), piridil-Ala, Trp, β-Nal, 2,4-dicloro-Phe, Tyr (1) ou F5-Phe, A2 é Asn, Gin, Ala, Aib, Vai, Leu, Ile, Nle, Nva, Abu, Phe, p-X-Phe (em que X é halogéneo, OH, OCH3, CH3 ou N02), o-X-Phe (em que X é halogéneo, (l>H, OCH3, CH3 ou N02), piridil-Ala, Trp, β-Nal, 2,4-dicloro-Phe, Tyr (I) ou F5-Phe, ou é omitido, e A7 é Thr, Ser, Ala, Aib, Vai, Leu, Ile, Nle, Nva ou Abu.

Numa outra forma de realização, A, é Cys, cada um dos símbolos A3 e Ag é, independentemente, Phe, p-X-Phe (em que X é halogéneo, OH ou CH3), Tyr (I) ou Trp, A4 é His, Phe, p-X-Phe (em que X é halogéneo, OH ou CH3), Tyr (I) ou Trp, A2 é Asn, Gin ou é omitido, e A7é Thr ou Ser.

Ainda numa outra forma de realização, A2 é Asn ou omitido, A3 é Phe, A4 é Phe, His, p-X-Phe (em que X é halogéneo, OH ou CH3), Tyr (I) ou Trp, A8 é Phe ou p-X-Phe (em que X é halogéneo, OH ou CH3) e cada um dos símbolos Rx e R2, independentemente, é H e R3 é NH2.

Em seguida, são referidos exemplos dos péptidos desta invenção como representados pela fórmula acima: H2-c[Cys-Phe-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Phe-Cys]-NH2 (Análogo I), H2-c[D-Cys-Phe-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Phe-Cys]-NH2 (Análogo II), H2-c[Cys-Phe-T rp-D-T rp-Lys-Thr-Phe-Cys]-NH2, H2-c[D-Cys-Phe-T rp-D-T rp-Lys-Thr-Phe-Cys]-NH2, H2-c[Cys-Phe-His-D-Trp-Lys-Thr-Phe-Cys]-NH2, H2-c[D-Cys-Phe-His-D-T rp-Lys-Thr-Phe-Cys]-NH2, H2-c[Cys-Phe-Phe-D-Trp-Lys-Ser-Phe-Cys]-NH2 (Análogo IV), H2-c[D-Cys-Phe-Phe-D-Trp-Lys-Ser-Phe-Cys]-NH2, H2-c[Cys-Phe-T rp-D-T rp-Lys-Ser-Phe-Cy s]-NH2 (Análogo ΠΙ), H2-c[D-Cys-Phe-Trp-D-Trp-Lys-Ser-Phe-Cys]-NH2, H2-c[Cys-Phe-His-D-Trp-Lys-Ser-Phe-Cys]-NH2, H2-c[D-Cys-Phe-His-D-Trp-Lys-Ser-Phe-Cys]-NH2, H2-c[Cys-Phe-Ty r (I)-D-Trp-Lys-Thr-Phe-Cys]-NH2 (Análogo VIII), H2-c[D-Cys-Phe-Tyr (I)-D-Trp-Lys-Thr-Phe-Cys]-NH2, H2-c[Cys-Phe-Tyr (I)-D-Trp-Lys-Ser-Phe-Cys]-NH2, H2-c[D-Cys-Phe-Tyr (I)-D-Trp-Lys-Ser-Phe-Cys]-NH2, H2-c[Cys-Asn-Phe-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Phe-Cys]-NH2, (Análogo V), H2-c[D-Cys-Asn-Phe-Phe-D-Trp-Lys-Tlir-Phe-Cys]-NH2, H2-c[Cys-Asn-Phe-T rp-D-T rp-Lys-Thr-Phe-Cys]-NH2, H2-c[D-Cys-Asn-Phe-T rp-D-T rp-Ly s-Thr-Phe-Cys]-NH2, H2-c[Cys-Asn-Phe-His-D-Trp-Lys-Thr-Phe-Cys]-NH2, H2-c[D-Cys-Asn-Phe-His-D-Trp-Lys-Thr-Phe-Cys]-NH2, H2-c[Cys-Asn-Phe-Phe-D-Trp-Lys-Ser-Phe-Cys]-NH2) H2-c[D-Cys-Asn-Phe-Phe-D-Trp-Lys-Ser-Phe-Cys]-NH2, H2-c[Cys-Asn-Phe-T rp-D-T rp-Lys-Ser-Phe-Cys]-NH2) H2-c[D-Cys-Asn-Phe-T rp-D-T rp-Ly s-Ser-Phe-Cys]-NH2, H2-c[Cys-Asn-Phe-His-D-Trp-Lys-Ser-Phe-Cys]-NH2) H2-c[D-Cys-Asn-Phe-His-D-Trp-Lys-Ser-Phe-Cys]-NH2, H2-c[Cys-Asn-Phe-Tyr (I)-D-Trp-Lys-Thr-Phe-Cys]-NH2, H2-c[D-Cys-Asn-Phe-Tyr (I)-D-Trp-Lys-Thr-Phe-Cys]-NH2, H2-c[Cys-Asn-Phe-Tyr (I)-D-Trp-Lys-Ser-Phe-Cys]-NH2, H2-c[D-Cys-Asn-Phe-Tyr (I)-D-Trp-Lys-Ser-Phe-Cys]-NH2) H2-c[Cys-Phe-Tyr-D-Trp-Lys-Thr-Phe-Cys]-NH2, (Análogo VI), H2-c[Cys-Phe-6-Nal-D-Trp-Lys-Thr-Phe-Cys]-NH2, (Análogo VII), H2-c[Cys-Phe-Cpa-D-Trp-Lys-Thr-Phe-Cys]-NH2, (Análogo IX), H2-c[Mpa-Phe-Phe-D-T rp-Lys-Thr-Phe-Cys]-NH2, (Análogo X), H2-c[Cys-Phe-T yr-D-T rp-Lys-Thr-Phe-D-Cys]-NH2, (Análogo XI), H2-c[Cys-Phe-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Tyr-Cys]-NH2,

(Análogo XII), H2-c[Cys-Phe-His-D-Trp-Lys-Thr-Phe-Cys]-NH2, (Análogo XIII).

Com a excepção do aminoácido N-terminal, todas as abreviaturas (por exemplo, Ala ou A2) de aminoácidos nesta descrição significam a estrutura -NH-CH(R)-CO-, em que R é uma cadeia lateral de um aminoácido (por exemplo, CH3 para Ala). Para o aminoácido N-terminal, a abreviatura significa =N-CH(CH2SH)-CO- se ele for isómero D ou L de Cys ou =C(-CH2-SH)-CO- se ele for isómero D ou L de Mpa, em que R é uma cadeia lateral de um aminoácido. Nle, Nva, piridil-Ala, F5-Phe, 2,4-dicloro-Phe, β-Nal, Abu, Mpa, Cpa e Aib são respectivamente abreviaturas dos seguintes α-aminoácidos: norleucina, norvalina, p-piridil-alanina, pentaflúor-fenilalanína, 2,4-dicIorofenxlalanina, β-naftilalanina, ácido a-aminobutírico, ácido mercaptopropiónico,p-clorofenilalaninae ácido a-amino-isobutírico. Tyr (Γ) refere-se a um radical de tirosina iodada (por exemplo, 3-I-Tyr, 5-I-Tyr, 3,5-I-Tyr), em que o iodo pode ser um isótopo radioactivo, por exemplo, I123, I127 ou I131. Um aminoácido alifático é um α-aminoácido que tem uma ou duas cadeias laterais que, independentemente, são hídrocarbonetos, por exemplo, uma cadeia linear ou ramificada de 1-6 átomos de carbono. Exemplos de aminoácidos alifáticos incluem Ala, Aib, Vai, Leu, Ile, Nle, Nva ou Abu. Um aminoácido aromático é um α-aminoácido, cuja cadeia lateral tem um substituinte aromático neutro (por exemplo, nem acídico nem básico), por exemplo, um grupo fenilo, naftilo ou um grupo heterocíclico aromático (por exemplo, piridilo ou indolilo) substituído ou não substituído. Exemplos de aminoácidos aromáticos incluem Phe, p-X-Phe (em que X é halogéneo (por exemplo, F, Cl ou I), OH, OCH}, CH3 ou N02), o-X-Phe (em que X é halogéneo, OH, OCH3, CH3 ou N02), piridil-Ala, Trp, β-Nal, 2,4-dicloro-Phe, Tyr (Γ), F5-Phe. Quando o radical aminoácido for opticamente activo, é o isómero L que se pretende, a não ser que se especifique de outro modo. Também na fórmula genérica acima, hidroxialquilo, hidroxifenilalquilo e hidroxinaftilalquilo podem conter 1-4 substituintes hidroxi e COEi significa -C = 0-Ej. Exemplos de -0 = 0^ incluem, mas não se limitam a p-hidroxi-fenilpropionilo (isto é, -C=OC H 2-CH2-C6H4-OH) e fenilpropionílo. Na fórmula publicada na presente memória descritiva, a ligação dissulfureto entre o grupo tiol na cadeia lateral do grupo Αχ (por exemplo, Mpa, D-Mpa, Cys ou D-Cys) e o grupo tiol da cadeia lateral do resíduo A9 (por exemplo, Mpa, D-Mpa,

Cys ou D-Cys) não está representada. Um péptido desta invenção é também representado na presente descrição por outro formato, por exemplo, H2-c[Cys-Phe-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Phe-Cys]-NH2, com os dois resíduos ligados por dissulfureto (isto é, Cys) colocados entre os dois parêntesis a seguir a “c”.

Os péptidos da invenção podem ser utilizados para inibir a libertação de insulina num paciente (um mamífero, tal como paciente humano). Assim, os péptidos são úteis no tratamento de condições fisiológicas, em que a inibição da libertação de insulina é benéfica, por exemplo, diabetes do tipo Π. Também, péptidos da invenção que têm resíduo Tyr (I) podem ser utilizados para a formação de imagem células que contêm receptores de somatostatina (por exemplo, SSTR-5). Esses péptidos da invenção podem ser usados ou in vivo para detectar células que têm receptores de somatostatina (por exemplo, células cancerosas) ou in vitro como um radioligando num ensaio de ligação de receptor de somatostatina.

Os péptidos desta invenção podem ser proporcionados sob a forma de sais farmaceuticamente aceitáveis. Exemplos desses sais incluem, mas não se limitam no entanto apenas aos sais mencionados, sais formados com ácidos orgânicos (por exemplo, ácido acético, láctico, maleico, cítrico, málico, ascórbico, succínico, benzóico, metanossulfónico, toluenossulfónico ou pamóico), ácidos inorgânicos (por exemplo, ácido clorídrico, ácido sulíúrico ou ácido fosfórico), ácidos poliméricos (por exemplo, ácido tânico, carboximetil celulose, ácidos poliláctico, poliglicólico ou copolímeros de ácidos poliláctico-glicólico).

Uma quantidade terapeuticamente eficaz de um péptido da presente invenção e uma substância veicular farmaceuticamente aceitável (por exemplo, carbonato de magnésio, lactose ou um fosfolípido com que o composto terapêutico pode formar uma micela) formam conjuntamente uma composição terapêutica (por exemplo, uma pílula, comprimido, cápsula ou líquido) para administração (por exemplo, oral, intravenosa, transdérmica, pulmonar, vaginal, subcutânea, nasal, electroforética ou intratraqueamente) a um paciente que necessita o péptido. A pílula, comprimido ou cápsula podem ser revestidos com uma substância capaz de proteger a composição contra o ácido gástrico ou os enzimas intestinais no estômago do paciente, durante um intervalo de tempo suficiente V.j· 7 / / para permitir que a composição passe não digerida para o intestino delgado do paciente. composição terapêutica pode também encontrar-se sob a forma de uma formulação de libertação retardada biodegradável ou não biodegradável, para administração subcutânea ou intramuscular. Ver, por exemplo, Patentes U.S. 3 773 919 e 4 767 628 e Pedido PCT No. WO 94/00148. Pode obter-se também a administração contínua usando uma bomba implantável ou externa (por exemplo, bomba INFUSAID™), para administrar a composição terapêutica. O péptido pode ser administrado antes da hora de deitar do paciente. A dose de um péptido da presente invenção, para tratar as doenças ou perturbações acima mencionadas, varia dependendo do modo de administração, da idade e do peso corporal do paciente e do estado geral do paciente a ser tratado e, fundamentalmente, será decidida pelo médico ou veterinário assistente. Uma tal quantidade do péptido determinada pelo médico ou veterinário assistente é designada na presente memória descritiva como uma “quantidade terapeuticamente eficaz”. E também incluído no âmbito da presente invenção, um péptido representado pela fórmula genérica acima representada para utilização no tratamento de doenças ou perturbações associadas com a necessidade de inibir a libertação de insulina, por exemplo, diabetes do tipo II e para utilização na detecção de receptores de somatostatina, por exemplo, formação de rádio-imagem.

Outras características e vantagens da presente invenção são evidenciadas na descrição pormenorizada e reivindicações.

Descrição Pormenorizada da Invenção A síntese e utilização de análogos de somatostatina desta invenção estão bem dentro da capacidade de uma pessoa com conhecimentos correntes da técnica. A não ser que se defina de outra maneira, todos os termos técnicos e científicos usados na presente memória descritiva têm a mesma significação que é vulgarmente empregada por qualquer pessoa com conhecimentos técnicos correntes do campo a que esta invenção pertence. Também, 8

todas as publicações, pedidos de patente, patentes e outras referências mencionadas na presente memória descritiva são incorporadas como referência.

Supõe-se que um perito no assunto, baseado na descrição feita na presente memória descritiva, utilize a presente invenção na sua máxima extensão. As seguintes formas de realização específicas devem portanto, ser consideradas como meramente ilustrativas e não como limitativas da parte restante da divulgação, qualquer que ela seja. Síntese de Análogos de Somatostatina A síntese de péptidos de cadeia curta é bem investigada na técnica dos péptidos. Ver, por exemplo, Stewart et al., SolidPhase Peptide Synthesis (Pierce Chemical Co., 2a Edição, 1984). A seguinte é a síntese do Análogo I. Outros péptidos da invenção podem ser preparados de uma maneira análoga por uma pessoa com conhecimentos técnicos correntes.

Colocou-se resina de benzil-hidrilamina-poliestireno (Advanced Chem Tech, Inc., Louisville, KY) (1,1 g, 0,5 mmole) na forma de ião cloreto no vaso reaccional de um sintetizador de péptidos Advanced Chem Tech ACT 200, programado para fornecer os seguintes reagentes/solventes: (a) cloreto de metileno; (b) ácido trifluoracético a 33% em cloreto de metileno (2 vezes durante 1 e 25 minutos, cada); (c) cloreto de metileno; (d) etanol; (e) cloreto de metileno; e (f) 10% de trietilamina em clorofórmio.

Agitou-se a resina neutralizada com Boc-S-4-metilbenzil-Cys e di-isopropilcarbodi-imida (1,5 mmole de cada) em cloreto de metileno durante 1 h e a resina de aminoácido resultante foi então, recirculada através das fases operacionais (a) a (í) no processo de lavagem acima referido. Acoplaram-se então, os seguintes aminoácidos (1,5 mmole) sucessivamente pelo mesmo procedimento: Boc-Phe, Boc-O-benzil-Thr, Boc-N-benziloxicarbonil-Lys, Boc-D-Trp, Boc-Phe, Boc-Phe e Boc-S-metílbenzil-Cys. Depois da lavagem e secagem, a resina completada pesou 1,6 g.

Misturou-se então, a resina (1,6 g, 0,5 mmole) com anisol (5 ml), ditiotreitol (100 mg) e fluoreto de hidrogénio anidro (35 ml) a 0°C e agitou-se durante 45 min. O excesso de fluoreto de hidrogénio foi evaporado rapidamente sob uma corrente de azoto seco e o' péptido livre foi precipitado e lavado com éter. O péptido bruto foi então, dissolvido em 500 ml de ácido acético a 90%, a que se adicionou uma solução concentrada de I2/MeOH até se ter observado uma cor castanha permanente. Removeu-se o excesso de I2 por adição de ácido ascórbico e evaporou-se a solução até um pequeno volume, que foi aplicado a uma coluna (2,5 x 90 cm) de SEPHADEX™ G-25, que foi eluída com AcOH a 50%. As fracções que contêm um componente em maiores concentrações medidas por absorção de ultravioleta (UV) e cromatografia em camada fina foram então reunidas, evaporadas até um pequeno volume e aplicadas a uma coluna (1,5 x 70 cm) de octadecil silano sílica VYDAC™ (10-15 pm). Eluiu-se esta coluna com um gradiente linear de 80 por cento de A e 20 por cento de B até 40 por cento de A e 60% de B, em que A é ácido trifluoracético (TF A) 0,1% em água e B é 79,9% de acetonitrilo, 20% de água e 0,1% de TF A. As fracções foram examinadas por cromatografia em camada fina (tlc) e cromatografia em fase líquida de alto rendimento analítica (hplc) e reuniram-se de modo a obter-se a pureza máxima. A liofilizaçlo repetida da solução a partir de água, originou 95 mg do produto como um pó branco fofo. O produto verificou-se ser homogéneo por hplc e tlc. A análise de aminoácidos de um hidrolisado ácido e a espectrometria de massa de dessorção da matriz auxiliada por laser (MALDI MS) confirmou a composição do octapéptido cíclico (peso molecular, calculado, 1077; peso molecular, determinado, 1080).

Em seguida, descreve-se a síntese do Análogo V. Colocou-se resina de benzil-hidrilamina-poliestireno (Advanced Chem Tech, Inc.) (0,7 g, 0,25 mmole) na forma de ião cloreto no vaso reaccíonal de um sintetizador de péptidos ACT 200 de Advanced Chem Tech, programado para fornecer os seguintes reagentes/solventes: (a) cloreto de metileno; (b) ácido trifluoracético a 33% em cloreto de metileno (2 vezes durante 1 e 25 minutos, cada); (c) cloreto de metileno; (d) etanol; (e) cloreto de metileno; e (f) 10% de trietilamina em clorofórmio. A resina neutralizada foi agitada em Boc-S-metilbenzil-Cys e di-isopropilcarbodi-imida (1,5 mmole de cada) em cloreto de metileno durante 1 h e a resina de aminoácido resultante foi então, recirculada através das fases operacionais (a) a (f) do programa de 10 lavagem acima mencionado. Então, acoplaram-se sucessivamente os seguintes aminoácidos pelo mesmo procedimento: Boc-Phe, Boc-O-benzil-Thr, Boc-N-benziloxicarbonil-Lys, Boc-D-Trp, Boc-Phe, Boc-Phe, Boc-Asn e Boc-S-metilbenzil-Cys. Depois de lavar e secar, a resina completada pesou 1,2 g. A resina peptídica foi submetida a clivagem de HF e ciclização de I2, como se descreveu acima. A purificação em coluna, como se descreveu acima, originou 21 mg do nonapéptido cíclico que se verificou ser homogéneo por hplc e tlc. A análise dos aminoácidos de um hidrolisado ácido e o MALDI MS confirmaram a composição do nonapéptido cíclico (massa molecular calculada 1192; determinada, 1192). A síntese de análogos de somatostatina iodados no resíduo da tirosina (por exemplo, o método da cloramina-T) está bem documentada e está dentro da capacidade de qualquer pessoa com conhecimentos vulgares da técnica. Ver, por exemplo, Czernick, etal, J. Biol. Chem. 258:5525 (1993) e Patente Europeia N° 389 180 Bl.

Ensaio de Ligação de Receptor de Somatostatina (1) Ensaio de Ligação de SSTR-2 Humano

Obtiveram-se células CHO-K1 (ovário de hamster chinês) da American Type Culture Collectíon (ATCC) (Rockville, MD) (ATCC N°. CCL61) e transfectaram-se com o cDNA de SSTR-2 humano, descrito em Yamada, etaL> Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 89:251-255 (1992) e também disponível de ATCC (ATCC N°. 79046) usando técnicas usuais conhecidas na técnica da biologia molecular. Ver, por exemplo, Patel et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 198:605 (1994). Membranas brutas foram preparadas, homogeneizando as células CHO-K1 transfectadas com SSTR-2 humano em 20 ml de Tris-HCl 50 mM arrefecido com gelo (tampão A) com um homogeneizador POLYTRON™ (Brinkmann Instruments, Westbury, NY) com regulação na posição 6, durante 15 segundos. Adicionou-se mais Tampão A, para se obter um volume final de 40 ml e centrifugou-se o homogeneizado numa centrífuga SORVAL™ com rotor SS-34 (DuPont, Newtown, CT) a 39 000 g durante 10 min a 0-4°C. O sobrenadante resultante foi decantado e rejeitado. O pelete foi re-homogeneizado em Tampão A arrefecido com gelo, diluído e centrifugado como anteriormente. O pelete final foi ressuspenso no Tris HCl 10 mM e mantido em gelo para o ensaio de ligação do receptor. 11

Alíquotas da preparação da membrana foram incubadas a 25°C durante 90 minutos com [125I-Tyr]MK-678 0,05 nM (2000 Ci/mmol; c[N-metil-Ala-Tyr(II25)-D-Trp-Lys-Val-Phe]) em HEPES 50 mM (pH 7,4), contendo um péptido de ensaio a várias concentrações (por exemplo, 10'11 a 10 é M), 10 mg/ml de albumina de soro bovino (fracção V, Sigma Chemical Co., St. Louis, MO), MgCl2 (5 mM), Trasilol (200 KUI/ml), bacitracina (0,02 mg/ml) e fluoreto de fenilmetil-sulfonilo (0,02 mg/ml). O volume final do ensaio foi 0,3 ml. As incubações foram terminadas por filtração rápida através de filtros GF/C (pré-impregnados em polietilenimina a 0,3% durante 30 min), usando uma tubuladura de filtração (Brandel, Gaithersburg, MD). Cada tubo e filtro foi então lavado três vezes com alíquotas de 5 ml de Tampão A arrefecido com gelo. Ligação específica foi definida como o [125I-Tyr]MK-678 ligado total menos o ligado na presença de somatostatina-14 200 nM.

Ensaiaram-se os seguinte péptidos de teste: somatostatina-14, somatostatina-28, Análogo I, Análogo Π, Análogo ΙΠ, Análogo IV e Análogo V. As estruturas dos Análogos I-V são representadas acima. Os valores Ki para os péptidos de teste foram calculados usando a seguinte fórmula:

Kj = IC50/[1 + (LC/LEC)], na qual IC50 é a concentração do péptido de teste necessária para inibir 50 por cento da ligação específica do radioligando [125I-Tyr]MK-678, LC é a concentração do radioligando (0,05 nM) e LEC é a constante de equilíbrio de dissociação do radioligando (0,155 nM). Os valores de K; calculados para os péptidos de teste são mostrados na coluna com o cabeçalho “SSTR-2” na Tabela I. (2) Ensaio de Ligação de SSTR-5 Humano Células CHO-K1 foram transfectadas com o cDNA de SSTR-5 humano, descrito em Yamada, etal., Biochem. Biophys. Res. Commun., 195-844 (1993), usando técnicas usuais conhecidas na técnica da biologia molecular. Ver, por exemplo, Patel, etal., Biochem. Biophys. Res. Comm., 198-605 (1994). Membranas brutas foram preparadas por homogeneização das células CHO-K1 transfectadas com SSTR-5 humano em 20 ml de Tris-HCl 50 mM arrefecido com gelo, com um homogeneizador POLYTRON™ (ponto de regulação 6,15 s). Adicionou-se tampão de modo a obter-se um volume final de 40 ml e 12 centrifugou-se numa centrífuga SORVAL™ com rotor SS-34 a 39 000 g, durante 10 min a 0-4°C. Decantou-se o sobrenadante resultante e rejeitou-se. O pelete foi re-homogeneizado em tampão arrefecido com gelo, diluído e centrifugado como anteriormente. Ressuspendeu-se o pelete final no Tris-HCl 10 mM e conservou-se em gelo para o ensaio de ligação do receptor.

Incubaram-se alíquotas da preparação da membrana durante 30 minutos a 30°C com [125I-Tyru]somatostatina-14 (2000 CÍ/mmol; Amersham Corp., Arlington Heights, EL) em HEPES 50 mM (pH 7,4), que contém um péptido de teste a várias concentrações (por exemplo, 1041 a 104 M), 10 mg/ml de albumina de soro bovino (fracção V), Mg CI2 (5 mM), Trasilol (200 KUI/ml), bacitracina (0,02 mg/ml) e fluoreto de fenilmetil-sulfonilo (0,02 mg/ml). O volume final do ensaio foi 0,3 ml. As incubações foram terminadas por filtração rápida através de filtros GF/C (pré-impregnados em polietilenimina a 0,3% durante 30 minutos), usando uma tubuladura de filtração Brandel. Cada tubo e filtro foi então lavado três vezes com alíquotas de 5 ml de tampão arrefecido com gelo. Definiu-se a ligação específica como a [125I-Tyrn]somatostatina-14 total ligada menos a ligada na presença de 1000 nM de ligando do receptor de somatostatina tipo-5 BIM-23052 (H2-D-Phe-Phe-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Phe-Thr-NH2). Os valores de K; para os péptidos de teste foram calculados utilizando a seguinte fórmula: IC50/[1 + (LC/LEC)], na qual IC50 é a concentração do péptido de teste necessária para inibir 50 por cento da ligação específica do radioligando [125I-Tyru]somatostatina-14, LC é a concentração do radioligando (0,05 nM) e LEC é a constante de equilíbrio de dissociação do radioligando (0,16 nM). Os valores de K; calculados para os péptidos de teste são mostrados na Tabela I na coluna com o cabeçalho “SSTR-5”. A Tabela I também mostra os respectivos quocientes K; para o SSTR-2 humano e os K; para o SSTR-5 humano. Os péptidos da invenção (por exemplo, Análogos I-V) têm quocientes inesperadamente maiores que um e, assim, são mais selectivos para o SSTR-5 que para o SSTR-2. TABELA 1 COMPOSTO SSTR-2 SSTR-5 SSTR-2/SSTR-5 Somatostatina-14 0,187 0,883 0,212 Somatostatina-28 0,242 0,383 0,632 Análogo I 15,1 0,376 40,2 Análogo II 13,0 2,63 4,94 Análogo III 14,7 1,21 12,1 Análogo IV 19,3 0,928 20,8 Análogo V 129 2,43 53,1 Análogo VI 6,19 0,34 18,2 Análogo VII 8,07 4,145 1,94 Análogo VIII 4,78 0,27 17,7 Análogo IX 6,205 4,77 1,30 Análogo X 15,0 0,744 20,1 Análogo XI 34,83 28,04 1,24 Análogo XII 59,20 5,78 10,2 Análogo ΧΠΙ 32,32 2,01 16,1

Outras Formas de Realização

Deve entender-se que, embora a invenção tenha sido descrita em conjunção com a sua descrição pormenorizada, a anterior descrição pretende-se que ilustre e não limite o âmbito da presente invenção, que é definido pelo âmbito das reivindicações em anexo. 2 3 AGO. 2001

Lisboa,

Dra. Maria Siivina Ferrcira

Agente OfitVò Pr:.··· V; rÚTÍrlal R Cosú.no, Pu - * u-u j * !o3 uSBOA

Telefs. 213 851339 - 213815050

Claims

1 REIVINDICAÇÕES 1. Péptido da fórmula / —Ag *A^*D“Trp“Lys*A^ *Ag*Ag “R3 em que A! é o isómero D ou L de Cys ou Mpa; A2 é Asn, Gin, um aminoácido alifático, um aminoácido aromático ou é omitido; A3 é um aminoácido aromático; A4 é His ou um aminoácido aromático; A7 é Thr, Ser ou um aminoácido alifático; A8 é um aminoácido aromático; A9 é o isómero D ou L de Cys; cada um dos símbolos Rt e R2 é, independentemente, H, Cx.12 alquilo, C7.20 fenilalquilo, Cu.20 naftílalquilo, C142 hidroxialquilo, C7_20 hidroxifenilalquilo, Cu.20 hidroxinaftilalquilo ou COEx, em que Ex é Cj.12 alquilo, C7.20 fenilalquilo, Cn.20 naftilalquilo, Cj.^ hidroxialquilo, C7_20 hidroxifenilalquilo ou Cn.20 hidroxinaftilalquilo; e R3 é NH2 ou NH-Y-CH2-Z, em que Y é um grupo hidrocarboneto em C ,.12 e Z é H, OH, C02H ou CONH2; e uma ligação dissulfureto liga as cadeias laterais dos resíduos Ax e A9; ou um seu sal farmaceuticamente aceitável.

2. Péptido de acordo com a reivindicação 1, em que cada um dos símbolos A3 e A8, independentemente, é Phe, p-X-Phe (em que X é halogéneo, OH, OCH3, CH3 ou N02), o-X-Phe (em que X é halogéneo, OH, OCH3, CH3 ou N02), piridil-Ala, Trp, β-Nal, 2,4-dicloro-Phe, Tyr (I) ou F5-Phe, e A4 é His, Phe, p-X-Phe (em que X é halogéneo, OH, OCH3, CH3 ou NO^, o-X-Phe (em que X é halogéneo, OH, OCH3, CH3 ou N02), piridil-Ala, Trp, β-Nal, 2,4-dicloro-Phe, Tyr (I) ou F5-Phe.

3. / 2 Péptido de acordo com a reivindicação 2, em que A2 é omitido e A7 é Thr, Ser, Ala Aib, Vai, Leu, Ile, Nle, Nva ou Abu.

4. Péptido de acordo com a reivindicação 3, em que A9 é Cys.

5. Péptido de acordo com a reivindicação 4, em que cada um dos símbolos A3 e A8, independentemente, é Phe, p-X-Phe (em que X é halogéneo, OH ou CH3), Tyr (I) ou Trp e A4 é His, Phe, p-X-Phe (em que X é halogéneo, OH, CH3), Tyr (I) ou Trp.

6. Péptido de acordo com a reivindicação 5, em que A7 é Thr ou Ser.

7. Péptido de acordo com a reivindicação 6, em que A3 é Phe, A4 é Phe, p-X-Phe (em que X é halogéneo, OH, OCH3, CH3 ou N02), His, Tyr (I)ouTrpeAgé Phe ou p-X-Phe (em que X é halogéneo, OH, OCH3, CH3 ou NO2).

8. Péptido de acordo com a reivindicação 6, em que A3 é Phe, A4 é Phe, Tyr, Tyr (I) ou Trp e Ag é Phe.

9. Péptido de acordo com a reivindicação 8, em cada um dos símbolos Rj e R2, independentemente um do outro, é H e R3 é NH2.

10. Péptido de acordo com a reivindicação 9 da fórmula: H2-c[Cys-Phe-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Phe-Cys]-NH2, H2-c[D-Cys-Phe-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Phe-Cys]-NH2, H2-c[Cys-Phe-T rp-D-T rp-Lys-Ser-Phe-Cys]-NH2, H2-c[Cys-Phe-Phe-D-Trp-Lys-Ser-Phe-Cys]-NH2 ou H2-c[Cys-Phe-Tyr (I)-D-Trp-Lys-Thr-Phe-Cys]-NH2.

11. Péptido de acordo com a reivindicação 7 da fórmula: H2-c[Cys-Phe-T rp-D-T rp-Lys-Thr-Phe-Cys]-NH2, 3 3

H2-c[D-Cys-Phe-T rp-D-T rp-Lys-Thr-Phe-Cys]-NH2, H2-c[Cys-Phe-His-D-Trp-Lys-Thr-Phe-Cys]-NH2, H2-c[D-Cys-Phe-His-D-Trp-Lys-Thr-Phe-Cys]-NH2, H2-c[D-Cys-Phe-Phe-D-Trp-Lys-Ser-Phe-Cys]-NH2, H2-c[D-Cys-Phe-T rp-D-T rp-Lys-Ser-Phe-Cys]-NH2, H2-c[Cys-Phe-His-D-T rp-Lys-Ser-Phe-Cys]-NH2, H2-c[D-Cys-Phe-His-D-Trp-Lys-Ser-Phe-Cys]-NH2, H2-c[D-Cy s-Phe-Tyr (I)-D-T rp-Lys-Thr-Phe-Cys]-NH2, H2-c[Cys-Phe-Tyr (I)-D-Trp-Lys-Ser-Phe-Cys]-NH2 ou H2-c[D-Cys-Phe-T yr (I)-D-T rp-Lys-Ser-Phe-Cys]-NH2.

12. Péptído de acordo com a reivindicação 2, em que A2 é Asn, Gin, Ala, Aib, Val, Leu, Ile, Nle, Nva, Abu, Phe, p-X-Phe (em que X é halogéneo, OH, OCH3, CH3 ou NOj), o-X-Phe (em que X é halogéneo, OH, OCH3, CH3 ouNO^, piridil-Ala, Trp, β-Nal, 2,4-dicloro-Phe, Tyr (I) ou F5-Phe, e A7 é Thr, Ser, Ala, Aib, Vai, Leu, Ile, Nle, Nva ou Abu.

13. Péptido de acordo com a reivindicação 12, em que A9 é Cys.

14. Péptido de acordo com a reivindicação 13, em que cada um dos símbolos A3, A4 e Ag, independentemente uns dos outros, é Phe, p-X-Phe (em que X é halogéneo, OH ou CH3), Tyr (I) ou Trp, e A4 é His, Phe, p-X-Phe (em que X é halogéneo, OH ou CH}), Tyr (I) ou Trp.

15. Péptido de acordo com a reivindicação 14, em que A2 é Asn ou Gin, e A7 é Thr ou Ser.

16. Péptido de acordo com a reivindicação 15, em que A3 é Phe, A4 é Phe, p-X-Phe (em que X é halogéneo, OH, OCH3, CH3 ouNO^, His, Tyr (I) ou Trp, e A8 é Phe ou p-X-Phe (em que X é halogéneo, OH, OCH3, CH3 ou N02). Péptido de acordo com a reivindicação 16, em que A3 é Phe, A4 é Phe, Tyr, Tyr (Γ) ou Trp, e Ag é Phe.

17.

18.

Péptido de acordo com a reivindicação 17, em que A2 e Asn, cada um dos símbolos Rx e R2, independentemente, é H, e R3 é NH2.

19. Péptido de acordo com a reivindicação 18 da fórmula: H2-c[Cys-Asn-Phe-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Phe-Cys]-NH2.

20. Péptido de acordo com a reivindicação 16 da fórmula: H2-c[D-Cys-Asn-Phe-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Phe-Cys]-NH2, H2-c[Cys-Asn-Phe-T rp-D-Trp-Lys-Thr-Phe-Cy s]-NH2, H2-c[D-Cys-Asn-Phe-T rp-D-T rp-Lys-Thr-Phe-Cys]-NH2, H2-c[Cys-Asn-Phe-His-D-Trp-Lys-Thr-Phe-Cys]-NH2, H2-c[D-Cys-Asn-Phe-His-D-Trp-Lys-Thr-Phe-Cys]-NH2, H2-c[Cys-Asn-Phe-Phe-D-Trp-Lys-Ser-Phe-Cys]-NH2, H2-c[D-Cys-Asn-Phe-Phe-D-T rp-Lys-Ser-Phe-Cys]-NH2, H2-c[Cys-Asn-Phe-T rp-D-T rp-Lys-Ser-Phe-Cys]-NH2, H2-c[D-Cys-Asn-Phe-Trp-D-Trp-Lys-Ser-Phe-Cys]-NH2, H2-c[Cys-Asn-Phe-His-D-Trp-Lys-Ser-Phe-Cys]-NH2, H2-c[D-Cys-Asn-Phe-His-D-Trp-Lys-Ser-Phe-Cys]-NH2, H2-c[Cys-Asn-Phe-Tyr (I)-D-Trp-Lys-Thr-Phe-Cys]-NH2, H2-c[D-Cys-Asn-Phe-Tyr (I)-D-Trp-Lys-Thr-Phe-Cys]-NH2, H2-c[Cys-Asn-Phe-Tyr (I)-D-Trp-Lys-Ser-Phe-Cys]-NH2 ou H2-c[D-Cys-Asn-Phe-Tyr(I)-D-Trp-Lys-Ser-Phe-Cys]-NH2.

21. Péptido de acordo com a reivindicação 1 da fórmula: H2-c[Cys-Phe-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Phe-Cys]-NH2. Lisboa,

Dra. Maria SIlvinaFerreira Agente Oficial Je -Pv-*f.d«trial R. Castilho, tO - 5; - a;j- &VjSuOA Teleís. 21o 851559 - 2156150-50