PT1085896E - Análogos de somatostatina de esqueleto ciclizado conformacionalmente constrangido. - Google Patents

Description

DESCRIÇÃO "ANÁLOGOS DE SOMATOSTATINA DE ESQUELETO CICLIZADO CONFORMACIONALMENTE CONSTRANGIDO"

CAMPO DA INVENÇÃO A presente invenção refere-se a análogos de somatostatina de esqueleto N01 ciclizado conformacionalmente constrangido, ciclizados através de novas ligações e a composições farmacêuticas contendo tais análogos.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

Análogos de somatostatina A somatostatina é um tetradecapéptido cíclico encontrado tanto no sistema nervoso central como nos tecidos periféricos. Foi isolada originalmente do hipotálamo de mamíferos e identificada como um importante inibidor da secreção da hormona do crescimento pela pituitária anterior. As suas múltiplas actividades biológicas incluem a inibição da secreção de glucagon e insulina pelo pâncreas, a regulação da maioria das hormonas intestinais e a regulação da libertação de outros neurotransmissores envolvidos na actividade motora e processos cognitivos em todo o sistema nervoso central (para revisão, ver Lamberts, Endocrine Rev., 9:427, 1988). Além disso, a somatostatina e os seus análogos são agentes antiproliferativos potencialmente úteis para o tratamento de vários tipos de tumores. 1 A somatostatina natural (também conhecida como factor inibidor da libertação de somatotropina, SRIF) tendo a seguinte estrutura: H-Ala1-Gly2-Cys3-Lys4-Asn5-Phe6-Phe7-Trp8-Lys9-Thr10-Phe11-Thr12-Ser13-

Cys14-OH foi isolada pela primeira vez por Guillemin e colaboradores (Bruzeau et al. Science, 179:78, 1973). Exerce os seus efeitos por interacção com uma família de receptores. Recentemente, cinco subtipos de receptores, denominados SST-R1 a 5, foram identificados e clonados. A distinção funcional precisa entre estes subtipos de receptores ainda não foi plenamente elucidada.

Na sua forma natural, a somatostatina é de utilidade limitada como agente terapêutico, dado que apresenta duas características indesejáveis: baixa biodisponibilidade e curta duração de acção. Por esta razão, foram desenvolvidos grandes esforços durante as duas últimas décadas no sentido de encontrar análogos de somatostatina com características superiores seja em potência, bioestabilidade e duração da acção, ou na selectividade em relação à inibição da libertação da hormona do crescimento, da insulina ou do glucagon.

Estudos sobre a relação estrutura-actividade, técnicas espectroscópicas, tais como dicroismo circular e ressonância magnética nuclear, assim como abordagens de modelação molecular têm revelado o seguinte: a conformação da parte cíclica da somatostatina natural é, muito provavelmente, uma folha beta antiparalela; Phe6 e Phe11 desempenham um importante papel na estabilização da conformação do farmacóforo por meio de interacções hidrofóbicas entre os dois anéis aromáticos; os quatro aminoácidos Phe7-Trp9-Lys9-Thr10 que espalhados ao redor da 2 volta beta na folha beta antiparalela são essenciais para o farmacóforo; e (D)Trp8 é preferido a (L)Trp8 para as interacções com os subtipos 2 a 5 de receptores de somatostatina.

No entanto, um hexapéptido análogo da somatostatina, contendo esses quatro aminoácidos ancorados por uma ponte dissulfureto:

Cys-Phe7- (D) Trp8-Lys9-Thr10-Cys é praticamente inactivo tanto in vitro como in vivo, embora apresente a vantagem da ponte dissulfureto covalente que substitui as interacções hidrofóbicas Phe6-Phen da somatostatina natural.

Tentaram-se quatro abordagens principais visando aumentar a actividade deste hexapéptido análogo da somatostatina. (1) Substituindo a ponte dissulfureto ou mediante uma ciclização estimuladora de uma ligação cis-amida, ou realizando uma segunda ciclização à molécula produzindo um análogo biciclico. Em ambos os casos, o análogo resultante tem um número reduzido de graus de liberdade conformacional. (2) Substituindo os resíduos originais na sequência Phe7-(D) Trp8-Lys9-Thr10 por outros aminoácidos naturais ou não-naturais, tal substituindo Phe7 com Tyr7 e Thr10 com Vai10. (3) Incorporando grupos funcionais adicionais a partir da somatostatina natural, visando uma contribuição desses novos elementos para a interacção com o receptor. (4) Eliminando um dos quatro aminoácidos Phe7-(D)Trp8-Lys9-Thr10, com a suposição de que tais análogos seriam mais selectivos. 0 análogo de somatostatina MK-678: cyclo- (N-Me-Ala6-Tyr7- (D) Trp8-Lys9-Val10-Phe) 3 é um exemplo de um análogo de somatostatina altamente potente, concebido utilizando as três primeiras abordagens acima (Veber, et al., Life Science, 34:371, 1984). Neste análogo hexapéptido, uma ligação cis-amida se encontra localizada entre N-Me-Ala e Phe11, Tyr7 e Vai10 substituem Phe7 e Thr10, respectivamente, e Phe11 é incorporada a partir da somatostatina natural.

Outro grupo de análogos de somatostatina (patentes US 4310518 e 4235886) inclui Octreotida:

H- (D) Phe5-Cys-Phe7- (D) Trp8-Lys9-Thr10-Cys-Thr12-CH2OH o primeiro análogo de somatostatina clinicamente disponível.

Foi desenvolvido utilizando a terceira abordagem descrita acima. Aqui, supõe-se que (D)Phe5 e o terminal C reduzido Thr12-CH2OH ocupam uma parte do espaço conformacional disponível, respectivamente, ao Phe6 e ao Thr12 naturais. O composto TT-232: H- (D) Phe-Cys-Phe7- (D) TrpB-Lys9-Cys-Thr-NH2 t r está estreitamente relacionado com a Octreotida e é um exemplo de realização da quarta abordagem descrita acima. A ausência de Thr10 é provavelmente responsável pela sua alta selectividade natural em termos de actividade antitumoral. 4

Estes exemplos de análogos de somatostatina de alta potência sugerem que as fenilalaninas nas posições 6 a 11 não só desempenham um importante papel na estabilização da conformação do farmacóforo, como também têm um papel funcional na interacção com o receptor. Permanece em aberto a questão de saber se uma fenilalanina (Phe6 ou Phe11) é suficiente para a interacção com o receptor ou se ambas são necessárias. É agora conhecido que os receptores de somatostatina constituem uma familia de cinco subtipos diferentes de receptores (Bell e Reisine, Trends Neurosci., 16, 34-38, 1993), que podem ser diferenciados com base na especificidade dos seus tecidos e/ou na sua actividade biológica.

Utilizações terapêuticas de análogos de somatostatina

Em virtude das suas propriedades farmacológicas inibitórias, os análogos de somatostatina podem ser utilizados no tratamento de doentes com tumores secretores de hormona e tumores dependentes de hormona. Presentemente, os sintomas associados com tumores carcinóides metastáticos (vermelhidão, diarreia, doença cardíaca valvular e dores abdominais) e adenomas secretores de péptido vasoactivo intestinal (VIP) (diarreia aguada) são tratados com Octreotida. A Octreotida foi também aprovada para o tratamento de hemorragias gastrointestinais graves e acromegalia. Além disso, a abundância de receptores de alta afinidade de somatostatina em vários tumores possibilita a utilização de análogos de somatostatina radiomarcados ín vivo para a visualização desses tumores (Lamberts et al. N. Engl. J. Med., 334:246 1996). Nos tumores neuroendócrinos, particularmente carcinóides e VIPomas, a Octreotida inibe tanto a secreção como o efeito do agente activo. Assim, nos VIPomas caracterizados por diarreia secretória profusa, os análogos de 5 somatostatina reduzem a diarreia através de inibição da secreção VIP e pelo efeito directo sobre a secreção intestinal. Porém, a resposta ao fármaco frequentemente diminui com o tempo, possivelmente devido à regulação negativa dos receptores de somatostatina nas células do tumor ou à produção de clone receptor negativo. A ausência de efeito antiproliferativo consistente pode estar relacionada com a baixa afinidade da Octreotida em relação a alguns dos subtipos de receptores de somatostatina encontrados nesses tumores (Lamberts et al. ibid.) .

Foi descrito que a somatostatina natural e a Octreotida melhoram os sintomas da diarreia secretora, que não sejam aqueles associados aos tumores neuroendócrinos. Foram descritos casos de controlo de diarreia secretora associada à sindrome do intestino curto, diarreia decorrente da ileostomia, diarreia secretora idiopática, diarreia associada com amiloidose e diarreia diabética. Ambos os compostos têm-se mostrado promissores no controlo da diarreia refratária associada à SIDA, especialmente em doentes que não apresentam agentes patogénicos identificáveis. Os análogos de somatostatina conhecidos no estado da técnica podem não oferecer selectividade suficiente ou selectividade a um subtipo de receptor, particularmente como agentes antineoplásicos (Reubi and Laissue, TIPS, 16, 110-115, 1995).

Os análogos de somatostatina selectivos aos receptores dos tipos 2 e 5 que inibem a hormona do crescimento, mas não a libertação de insulina, podem ser potencialmente utilizados para o tratamento de diabetes mellitus não insulino-dependente (NIDDM). Uma potência mais baixa na inibição da libertação de glucagon é preferida para reduzir a resistência periférica à insulina e melhorar o controlo glicémico. A hormona do crescimento é um antagonista directo do receptor de insulina na 6 periferia e a sobreprodução de hormona do crescimento está associada à resistência periférica à insulina. 0 IGF elevado, que é o principal sinal biológico da hormona do crescimento, está associado a complicações diabéticas, tais como angiopatia, retinopatia e nefropatia. A nefropatia é uma das maiores complicações da angiopatia diabética e uma das principais causas da falência renal em estágio terminal e morte entre os doentes diabéticos. Diversos estudos têm divulgado dados sobre a participação significativa do eixo GH-IGF na nefropatia diabética e outras nefropatias (Flyvbjerg A. Kidney Int. S12-S19, 1997) . Descobriu-se recentemente que níveis aumentados de hormona do crescimento no soro de murganhos diabéticos não-obesos (NOD) são semelhantes às mudanças observadas em humanos (Landau et al. J. Am. Soc. Nephrol. 8:A2990, 1997). Essas descobertas permitem elucidar o papel do eixo hormona de crescimento-IGF na retinopatia diabética e testar análogos de somatostatina quanto à sua acção terapêutica potencial nessas complicações secundárias associadas à diabetes.

Análogos de péptidos melhorados

Seria desejável obter análogos de péptidos de maior especificidade aos subtipos de receptores, obtendo assim selectividade clínica melhorada.

Como resultado dos grandes avanços alcançados na química orgânica e na biologia molecular, muitos péptidos bioactivos podem agora ser preparados em quantidades suficientes para a utilização farmacológica e clínica. Assim, nos últimos anos estabeleceram-se novos métodos para o tratamento e terapia de doenças em que há envolvimento de péptidos. No entanto, a utilização de péptidos como fármacos é limitada pelos seguintes factores: a) a sua baixa estabilidade metabólica em relação à 7 proteólise no tracto gastrointestinal e soro; b) a sua baixa absorção após ingestão oral, em particular devido à sua massa molecular relativamente alta ou à falta de sistemas de transporte específicos ou ambos; c) a sua rápida excreção através do fígado e rins; e d) os seus efeitos colaterais indesejados nos sistemas de órgãos não-alvo, já que os receptores de péptidos podem estar espalhados por todo o organismo.

Seria muito vantajoso produzir análogos de péptidos conformacionalmente constrangidos que superem as desvantagens das moléculas dos péptidos nativas, proporcionando assim características terapêuticas melhoradas.

Uma nova abordagem conceptual para o constrangimento conformacional de péptidos foi introduzida por Gilon, et al., (Biopolymers 31:745, 1991), que propôs a ciclização de péptidos esqueleto a esqueleto. As vantagens teóricas desta estratégia incluem a possibilidade de efectuar a ciclização através de carbonos ou azotos do esqueleto peptídico sem interferir com as cadeias laterais que possam ser cruciais para a interacção com o receptor específico de um dado péptido. Embora o conceito visasse a aplicabilidade a qualquer péptido linear de interesse, o facto é que o factor limitante no esquema proposto era a disponibilidade de unidades constitutivas apropriadas que teriam de ser utilizadas para substituir os aminoácidos que eram para ser ligados através de grupos pontes. A colocação em prática deste conceito de ciclização de esqueleto frustrou-se em virtude da incapacidade de conceber um método prático de preparação de unidades constitutivas de aminoácidos que não a glicina (Gilon et al., J. Orq. Chem. 587:5687, 1992).

As divulgações posteriores de Gilon e colaboradores (documentos WO 95/33765 e WO 97/09344) proporcionaram métodos para a produção de unidades constitutivas necessárias para a síntese de análogos de péptidos de esqueleto ciclizado. Recentemente também foi divulgada a utilização com sucesso destes métodos para produzir análogos de péptidos de esqueleto ciclizado possuindo actividade de somatostatina (documento WO 98/04583) .

Nenhuma das técnicas antecedentes mostra ou sugere os análogos de somatostatina aqui divulgados possuindo selectividade terapêutica melhorada.

RESUMO DA INVENÇÃO A presente invenção refere-se a novos análogos de péptidos, caracterizados por incorporarem novas unidades constitutivas com grupos-ponte ligados aos alfa azotos dos alfa aminoácidos. Especificamente, estes compostos são análogos de somatostatina de esqueleto ciclizado, compreendendo uma sequência peptídica de quatro a vinte e quatro aminoácidos, incorporando cada análogo pelo menos uma unidade constitutiva, contendo a referida unidade constitutiva um átomo de azoto do esqueleto peptídico ligado a um grupo-ponte compreendendo um amida, tioéter, tioéster ou dissulfureto, em que pelo menos uma unidade constitutiva é ligada por meio do referido grupo-ponte para formar uma estrutura cíclica, com uma unidade seleccionada do grupo consistindo de uma segunda unidade constitutiva, a cadeia lateral de um resíduo de aminoácido da sequência ou do resíduo do aminoácido N-terminal.

Até ao presente, os análogos de somatostatina de esqueleto ciclizado conformacionalmente constrangido tinham selectividade predominantemente para o receptor subtipo 5. Tais análogos eram de utilidade terapêutica ou diagnóstica limitada. 9 A presente invenção refere-se a compostos de fórmula N° 7:

como definido abaixo.

Um análogo da presente invenção, actualmente mais preferido, é o PTR 3173 possuindo selectividade de ligação melhorada para os subtipos SSTR2 e SST-R5 do receptor SST.

Para outros análogos muito preferidos divulgados, a ponte está ligada entre um derivado Ν“-ω funcionalizado de um aminoácido e o N-terminal da sequência peptidica. Para outros análogos preferidos da presente invenção, a ponte é ligada entre uma unidade constitutiva compreendendo um derivado Να-ω funcionalizado tendo um grupo tio terminal e um outro desses derivados de um aminoácido, ou à cadeia lateral de um resíduo Cys, a um ácido contendo mercapto ou a qualquer outra unidade contendo SH para formar uma ponte dissulfureto. Os análogos de somatostatina de esqueleto ciclizado mais preferidos de acordo com a invenção são descritos na tabela 1:

Tabela 1. Os análogos mais preferidos da invenção.

PTR Sequência SST-R 3173 GABA*-Phe-T rp-(D)Trp-Lys-Thr-Phe-Gly(C3)-X 2,5 3229 Galactose-Dab*-Phe-Ttp-(D)Trp-Lys-Thr-Phe-Gly (C3)-X em que X é -NH2 ou -OH e o grupo-ponte se estende entre duas 10 unidades constitutivas ou como indicado abaixo: para PTR 3173, o asterisco denota que o grupo-ponte está ligado entre o derivado Ν“-ω funcionalizado de um aminoácido e o N-terminal do péptido. SST-R indica os subtipos de receptores de somatostatina para os quais cada análogo é selectivo.

Estes análogos de péptidos de somatostatina de esqueleto ciclizado são preparados incorporando de pelo menos um derivado Να-ω funcionalizado de um aminoácido numa sequência peptidica e subsequentemente ciclizando selectivamente o grupo funcional com uma das referidas cadeias laterais dos aminoácidos na sequência peptidica ou com outro derivado de aminoácido Να-ω funcionalizado. 0 derivado Να-ω funcionalizado de aminoácido possui, de um modo preferido, a seguinte fórmula:

B-N-CH (R') -CO-OH X

A—G Fórmula N° 1 em que X é um grupo espaçador seleccionado do grupo formado por alquileno, alquileno substituído, arileno, cicloalquileno e cicloalquileno substituído; R' é uma cadeia lateral de aminoácido, opcionalmente ligado com um grupo protector específico; B é um grupo protector seleccionado do grupo consistindo de alquiloxilo, alquiloxilo substituído, ou arilcarbonilos; e G é um grupo funcional seleccionado do grupo consistindo de aminas, tióis, álcoois, ácidos e ésteres carboxílicos, aldeídos, álcoois e halogenetos de alquilo; e A é 11 um grupo protector específico de G.

As unidades constitutivas preferidas são os derivados de aminoácido Ν“-ω funcionalizado em que X é alquileno; G é um grupo tiol, um grupo amino ou um grupo carboxilo; e R' é a cadeia lateral de um aminoácido. Ainda preferidos são os derivados de aminoácido Να-ω funcionalizado em que R' é protegido com um grupo protector específico.

Mais preferidos são os derivados de aminoácido Ν“-ω funcionalizado em que G é um grupo amino, um grupo carboxilo ou um grupo tiol da seguinte fórmula: B-N-CH (R') -CO-OH 1 B-N-CH (R') -CO-OH 1 B-N-CH (R') -1 CO X I X 1 X I 1 HN- o- 0 1 CD 1 S- Fórmula N° 2 Fórmula N° 3 Fórmula N° 4 em que X, R' e B são como acima indicado.

As vantagens mais surpreendentes destes métodos são: 1) a ciclização da sequência peptídica é realizada sem comprometer nenhuma das cadeias laterais do péptido, reduzindo assim as hipóteses de sacrificar grupos funcionais essenciais para o reconhecimento e função biológica. 2) a optimização da conformação peptídica é realizada permitindo a permutação do comprimento da ponte, da direcção e tipo de ligação (e. g., amida, dissulfureto, tioéter, tioéster, etc.) e a posição da ligação no anel. 3) quando aplicada na ciclização de péptidos lineares de 12 actividade conhecida, a ponte pode ser concebida de forma a minimizar a interacçâo com a região activa do péptido e do seu receptor semelhante. Isto diminui a probabilidade de o braço de ciclização interferir no reconhecimento e função, e também cria um sitio adequado para a ligação de marcadores, tais como marcadores radioactivos, fármacos citotóxicos, substâncias captadoras de luz, ou qualquer outro marcador desejado.

Os análogos de esqueleto ciclizado da presente invenção podem ser utilizados em composições farmacêuticas e em métodos para o tratamento de distúrbios, incluindo: cancros (incluindo sindrome carcinóide), distúrbios endócrinos (incluindo acromegalia e NIDDM), complicações associadas à diabetes (incluindo nefropatia diabética, angiopatia diabética e retinopatia diabética), distúrbios gastrointestinais, pancreatite, doenças autoimunes (incluindo artrite reumatóide e psoriase), aterosclerose, restenose, dor pós-cirúrgica e doenças inflamatórias. Além disso, os análogos de somatostatina de acordo com a presente invenção serão úteis na prevenção da aterosclerose e restenose através da inibição de factores de crescimento envolvidos nestes distúrbios.

Os análogos preferidos divulgados na presente invenção possuem caracteristicas únicas de estabilidade metabólica, selectividade nas suas actividades in vivo e segurança. 0 análogo mais preferido divulgado (PTR 3173) oferece um candidato a fármaco com claro potencial terapêutico para o tratamento de tumores carcinóides, acromegalia e complicações associadas à diabetes. Este análogo mais preferido apresenta vantagens significativas sobre qualquer outro análogo de somatostatina actualmente disponível, visto ser equipotente a análogos de somatostatina disponíveis na inibição da hormona do crescimento sem efeitos apreciáveis na insulina ou glucagon. 13

As composições farmacêuticas compreendendo agonistas ou antagonistas farmacologicamente activos de somatostatina de esqueleto ciclizado e um veiculo ou diluente farmaceuticamente aceitável representam outra forma de realização da invenção, como são também os métodos para o tratamento de cancros, distúrbios endócrinos, distúrbios gastrointestinais, complicações associadas à diabetes, pacreatite, doenças autoimunes, doenças inflamatórias, aterosclerose e restenose, utilizando tais composições. As composições farmacêuticas de acordo com a presente invenção compreendem vantajosamente, pelo menos, um análogo de péptido de esqueleto ciclizado que é selectivo para um ou dois subtipos de receptores de somatostatina. Estas composições farmacêuticas podem ser administradas por qualquer via de administração apropriada, incluindo oralmente, topicamente ou sistemicamente. Os modos de administração preferidos incluem, mas não estão limitados, a vias parentéricas, tais como injecções intravenosas e intramusculares, assim como por via nasal ou ingestão oral.

Os análogos de esqueleto ciclizado da presente invenção podem ser utilizados como composições farmacêuticas em métodos de diagnóstico de cancro e em exames imagiológicos para detectar a existência de tumores ou suas metástases. Os métodos de diagnóstico de cancro compreendem a administração a um mamífero, incluindo a um doente humano, de um análogo ou análogos de esqueleto cíclico marcado com uma sonda detectável seleccionada do grupo consistindo de um isótopo radioactivo e um marcador não-radioactivo. Os métodos para o diagnóstico e imagiologia do cancro utilizando tais composições representam outra forma de realização da invenção.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS 14 A Figura 1 é um gráfico que mostra a percentagem de inibição da ligação de SRIF aos 5 receptores de somatostatina humana clonada pelo PTR-3173. A Figura 2 é um gráfico que mostra a ligação não-especifica de análogos de somatostatina (testados a uma concentração de 100 nM) a vários receptores acoplados à proteína G. A Figura 3 é um gráfico que mostra o efeito de análogos de somatostatina da presente invenção sobre a libertação da hormona do crescimento em comparação com a Octreotida. A Figura 4 é um gráfico que mostra o efeito de resposta à dose do análogo de somatostatina da presente invenção sobre a libertação de glucagon.

As Figuras 5a e 5b são gráficos que mostram o efeito de análogos de somatostatina da presente invenção sobre a libertação de insulina em comparação com a Octreotida em três diferentes experiências.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

Os compostos aqui descritos podem ter centros assimétricos. Todas as formas quirais, diastereoméricas e racémicas estão incluídas na presente invenção. Muitos isómeros geométricos de ligações duplas e semelhantes podem também estar presentes nos compostos aqui descritos, e todos esses isómeros estáveis são contemplados na presente invenção.

Entende-se aqui por "composto estável" ou "estrutura estável" um composto que seja suficientemente robusto para suportar o seu isolamento de uma mistura reaccional até um grau 15 de pureza conveniente, e formulação num agente terapêutico eficaz.

Como utilizado aqui e nas reivindicações, os termos "alquilo" ou "alquenileno" visam incluir grupos hidrocarbonetos alifáticos saturados tanto de cadeia linear como de cadeia ramificada que tenham de um a dez átomos de carbono; "alquenilo" visa incluir cadeias de hidrocarbonetos de configuração linear ou ramificada que tenham de dois a dez átomos de carbono e uma ou mais ligações insaturadas carbono-carbono que possam ocorrer em qualquer ponto estável ao longo da cadeia, tais como etenilo, propenilo, e semelhantes; e "alquinilo" visa incluir cadeias de hidrocarbonetos de configuração tanto linear como ramificada tendo de dois a dez átomos de carbono e uma ou mais ligações triplas carbono-carbono que possam ocorrer em qualquer ponto estável ao longo da cadeia, tais como etinilo, propinilo e semelhantes.

Como utilizado aqui e nas reivindicações, entende-se por "arilo" qualquer anel de carbono estável biciclico ou triciclico de 5 a 7 membros ou biciclico ou triciclico de 7 a 14 membros, todos eles podendo ser saturados, parcialmente insaturados ou aromáticos, por exemplo, fenilo, naftilo, indanilo ou tetra-hidronaftilo, etc.

Como utilizado aqui e nas reivindicações, o termo "halogeneto de alquilo" visa incluir os grupos hidrocarbonetos alifáticos saturados tanto de cadeia linear como os de cadeia ramificada que tenham de um a dez átomos de carbono, em que de 1 a 3 átomos de hidrogénio tenham sido substituídos por um átomo de halógeno, tal como Cl, F, Br e I.

Como utilizado aqui e nas reivindicações, a frase "quantidade terapeuticamente eficaz" significa a quantidade do 16 novo análogo de péptido de esqueleto ciclizado ou a composição compreendendo o referido análogo a ser administrado a um hospedeiro para obter os resultados desejados para as indicações aqui descritas, mas não limitadas a elas, tais como doenças inflamatórias, cancro, distúrbios endócrinos e distúrbios gastrointestinais. 0 termo "substituído", tal como utilizado aqui e nas reivindicações, significa que um ou mais átomos de hidrogénio no átomo designado é substituído com uma selecção do grupo indicado, contanto que não se exceda a valência normal do átomo designado, e que a substituição resulte num composto estável.

Quando houver qualquer variável (por exemplo, R, X, Z, etc.) mais de uma vez em qualquer constituinte ou em qualquer fórmula da presente invenção, a sua definição em cada ocorrência é independente da sua definição em todas as outras ocorrências. Além disso, as combinações de substituintes e/ou variáveis são permissíveis apenas se tais combinações resultarem em compostos estáveis.

Como utilizado aqui, o termo "péptido" indica uma sequência de aminoácidos ligados por ligações peptídicas. Os análogos peptídicos de somatostatina desta invenção compreendem uma sequência de aminoácidos, sendo cada resíduo caracterizado por possuir um terminal amino e um terminal carboxilo.

Uma "unidade constitutiva" indica um α aminoácido Ν“ derivado da fórmula geral N° 5: 17

N-CH(R')-CO

X

-G Fórmula N° 5 em que X é um grupo espaçador seleccionado do grupo consistindo de alquileno, alquileno substituído, arileno, cicloalquileno e cicloalquileno substituído; R' é uma cadeia lateral de aminoácido, opcionalmente ligada a um grupo protector específico; e G é um grupo funcional seleccionado do grupo consistindo de aminas, tióis, álcoois, ácidos e ésteres carboxílicos, e halogenetos de alquilo; o qual é integrado na sequência peptídica e, subsequentemente, ciclizado selectivamente através de grupo funcional G com uma das cadeias laterais dos aminoácidos na referida sequência peptídica ou com outro derivado de aminoácido funcionalizado A metodologia para produzir as unidades constitutivas é descrita nos pedidos de patente internacional publicados como WO 95/33765 e WO 98/04583 e nas patentes US 5770687 e 5883293.

As unidades constitutivas são abreviadas pelo código de três letras do correspondente aminoácido modificado, seguido pelo tipo de grupo reactivo (N para amina, C para carboxilo) e uma indicação do número de grupos espaçadores metileno. Por exemplo, Gly-C2 descreve um resíduo Gly modificado com um grupo reactivo carboxilo e um espaçador metileno de dois carbonos, e Phe-N3 designa um grupo fenilalanina modificado com um grupo reactivo amino e um espaçador metileno de três carbonos. 18

Nas fórmulas genéricas, as unidades constitutivas são abreviadas como R, com um sobrescrito correspondente à posição na sequência precedida pela letra N, como indicação de que o azoto do esqueleto nesta posição é o ponto de ligação do grupo ponte especificado nas referidas fórmulas.

Como utilizado aqui, o termo "péptido de esqueleto ciclico" denota um análogo de um péptido linear que contém pelo menos uma unidade constitutiva que foi ligada para formar uma ponte através de alfa azoto do esqueleto peptidico a uma outra unidade constitutiva ou a outro aminoácido na sequência.

Certas abreviaturas são aqui utilizadas para descrever esta invenção e o modo de a produzir e usar. Por exemplo, AcOH refere-se ao ácido acético, Alloc refere-se a aliloxicarbonilo, Boc refere-se ao radical t-butiloxicarbonilo, BOP refere-se a hexafluorofosfato de benzotriazol-l-iloxi-tris-(dimetilamino)-fosfónio, DCC refere-se a diciclo-hexilcarbodiimida, DCM refere-se a diclorometano, DIEA refere-se a diisopropil-etilamina, DMF refere-se a dimetilformamida, EDT refere-se a etanoditiol, Fmoc refere-se ao radical fluorenilmetoxicarbonilo, GH refere-se à hormona do crescimento, HBTU refere-se a hexafluorofosfato de 1-hidroxibenztriazoliltetrametilurónio, HF refere-se ao ácido fluoridrico, HOST refere-se a 1-hidroxibenzotriazole, HPLC refere-se a cromatografia liquida de alta pressão, IGF refere-se a factor de crescimento da insulina, MS refere-se a espectrometria de massa, NIDDM refere-se a diabetes mellitus não-insulino-dependente, NMM refere-se a N-metil-morfolina, NMP refere-se a l-metil-2-pirolidonona, PyBOP refere-se a hexafluorofosfato de benzotriazole-l-il-oxi-tris-pirrolidina-fosfónio, PyBrOP refere-se a hexafluorofosfato de bromo-tris-pirrolidina-fosfónio, TA refere-se a temperatura ambiente, SRIF refere-se a factor inibidor de libertação de somatostatina, TBTU 19 refere-se a tetrafluoroborato de 2-(lH-benzotriazole-l-il)-1,1,3,3-tetrametilurónio, t-Bu refere-se ao radical terciário de butilo, TFA refere-se a ácido trifluoroacético, VIP refere-se a péptido intestinal vasoactivo.

Os aminoácidos utilizados nesta invenção são daqueles disponíveis comercialmente ou que se podem obter utilizando métodos sintéticos de rotina. Determinados resíduos podem necessitar de métodos especiais para a sua integração no péptido e tanto os métodos de síntese convergente e divergente como o método sequencial são úteis nesta invenção, para obter a sequência peptídica. Os aminoácidos codificados naturais e os seus derivados são representados por códigos de três letras de acordo com as convenções da IUPAC. Onde não houver indicação, utilizou-se o isómero L. Os isómeros D são indicados por um "D" antes da abreviatura do resíduo. Lista dos aminoácidos não-codificados: Abu refere-se a ácido 2-aminobutírico, p-Ala refere-se a p-alanina, Dab refere-se a ácido diaminobutírico, GABA refere-se a ácido gama aminobutírico, INal refere-se a 1-naftilalanina, 2Nal refere-se a 2-naftilalanina, o composto e conjugação de unidades de monossacáridos e dissacáridos no terminal amino para aumentar a biodisponibilidade oral (Nelson-Piercy et al. J. Clin. Endocrinol And Metab. 78:329, 1994), ou outras destas substituições que possam melhorar a biodisponibilidade oral, a penetração no sistema nervoso central, tendo por alvo populações celulares específicas, etc.

Abordagens sintéticas

Os análogos peptídicos são ciclizados através de grupos-ponte ligados aos alfa azotos dos aminoácidos que permitem novas ligações não-peptídicas. Em geral, os processoss utilizados para construir tais análogos peptídicos a partir das suas unidades 20 constitutivas baseiam-se nos princípios conhecidos da síntese peptídica; mais convenientemente, os processos podem ser realizados de acordo com princípios conhecidos da síntese de péptidos em fase sólida. A inovação requer a substituição de um ou mais aminoácidos numa sequência peptídica por novas unidades constitutivas da fórmula geral:

HN-CH(R)-COOH

X

I

G Fórmula N° 6 em que R é a cadeia lateral de um aminoácido, X é um grupo espaçador e G é o grupo funcional terminal por meio do qual se fará a ciclização. A cadeia lateral R é a cadeia lateral de qualquer aminoácido natural ou sintético que é seleccionado para ser incorporado na sequência peptídica a escolher. X é um grupo espaçador seleccionado para proporcionar maior ou menor grau de flexibilidade, a fim de obter os constrangimentos conformacionais apropriados do análogo peptídico. Estes grupos espaçadores incluem cadeias de alquileno, alquilenos substituídos ramificados e insaturados, arilenos, cicloalquilenos e cicloalquilenos insaturados e substituídos. Além disso, X e R podem ser combinados para formar uma estrutura heterocíclica.

Os grupos funcionais terminais (ω) a serem utilizados para a ciclização do análogo peptídico incluem, mas não estão limitados a: a. Aminas para reacção com electrófilos tais como grupos carboxilo, aldeídos e cetonas activados (com ou sem subsequente redução), e halogenetos de alquilo ou alquilo 21 substituído. b. Álcoois para reacção com electrófilos tais como grupos carboxilo activados. C. Tióis para formação de ligações dissulfureto e reacção com electrófilos tais como grupos carboxilo activados, e halogenetos de alquilo ou alquilo substituído. d. Dióis 1,2 e 1,3 para a formação de acetais e cetais. e. Alcinos ou alcinos substituídos para reacção com nucleófilos tais como aminas, tióis ou carbaniões; radicais livres; electrófilos tais como aldeídos e cetonas, e halogenetos de alquilo ou alquilo substituído; ou complexos organometálicos. f. Ácidos e ésteres carboxílicos para reacção com nucleófilos (com ou sem activação prévia), tais como aminas, álcoois e tióis. g. Ésteres ou halogenetos de alquilo ou alquilo substituído para reacção com nucleófilos tais como aminas, álcoois, tióis ou carbaniões (de grupos metilenos activos tais como acetoacetatos ou malonatos); e formação de radicais livres para a subsequente reacção com alcenos ou alcenos substituídos, e alcinos ou alcinos substituídos. h. Cetonas e aldeídos de alquilo ou arilo para reacção com nucleófilos tais como aminas (com ou sem subsequente redução), carbaniões (de grupos metileno activos tais como acetoacetatos ou malonatos), dióis (para a formação de acetais e cetais) . 22 i. alcenos ou alcenos substituídos para reacção com nucleófilos tais como aminas, tióis, carbaniões, radicais livres ou complexos organometálicos. j. grupos metilenos activos, tais como ésteres de malonato, ésteres de acetoacetato, e outros para reacção com electrófilos tais como aldeídos e cetonas, halogenetos de alquilo ou alquilo substituído.

Deve ser entendido que durante a síntese dos péptidos, esses grupos terminais reactivos, assim como qualquer outra cadeia lateral reactiva, devem ser protegidos por grupos protectores adequados. Os grupos protectores adequados para aminas são alquiloxilo, alquiloxilo substituído e ariloxi-carbonilos, incluindo, mas não limitados a, terc-butiloxicarbonilo (Boc), fluorenilmetiloxicarbonilo (Fmoc), aliloxicarbonilo (Alloc) e benziloxicarbonilo (Z).

Os grupos carboxílicos terminais para as ciclizações podem ser protegidos como os seus ésteres ou tioésteres alquílicos ou alquílicos substituídos ou ésteres ou tioésteres arílicos ou arílicos substituídos. Os exemplos incluem, mas não estão limitados a éster butílico terciário, éster alílico, éster benzílico, éster 2-(trimetilsilil)etílico e 9-metilfluorenilo.

Os grupos tiol para as ciclizações podem ser protegidos como os seus tioéteres ou dissulfuretos alquílicos ou alquílicos substituídos ou tioéteres ou dissulfuretos arílicos ou arílicos substituídos. Os exemplos incluem, mas não estão limitados a, butilo terciário, tritilo (trifenilmetila), benzilo, 2--(trimetilsilil)etil, pixil(9-fenilxanten-9-il), acetamidometilo, carboximetilo, 2-tio-4-nitropiridilo.

Será ainda entendido pelo especialista que as várias 23 unidades reactivas serão protegidas por diferentes grupos protectores, para permitir a sua remoção selectiva. Assim, um aminoácido especifico será acoplado ao seu vizinho na sequência peptidica quando o N“ estiver protegido, por exemplo, pelo grupo protector A. Se se utilizar uma amina como grupo terminal para a ciclização no esquema de reacção, o N“ é protegido pelo grupo protector B, ou um grupo ε amino de qualquer lisina na sequência será protegido pelo grupo protector C, e assim por diante. 0 acoplamento dos aminoácidos uns aos outros é realizado como uma série de reacções conhecidas na técnica da síntese peptidica. As novas unidades constitutivas da invenção, nomeadamente os derivados de aminoácido Ν“-ω funcionalizados, são integradas na sequência peptidica para substituir um ou mais dos aminoácidos. Se se seleccionar apenas um derivado de aminoácido Να-ω funcionalizado, este será ciclizado a uma cadeia lateral de outro aminoácido na sequência ou a qualquer um dos dois aminoácidos terminais da sequência peptidica. Por exemplo: (a) é possível ligar um N“-(ω-amino alquileno) aminoácido ao grupo carboxilo de um resíduo de ácido aspártico ou glutâmico; (b) é possível ligar um N“-(ω-carboxílico alquileno) aminoácido ao grupo ε-amino de um resíduo de lisina; (c) é possível ligar um N“-(ω-tio alquileno) aminoácido ao grupo tiol de um resíduo de cisteína; e assim por diante. Uma forma de realização mais preferida da invenção incorpora dois desses derivados de aminoácido Ν“-ω funcionalizado que podem ser ligados entre si para formar análogos peptídicos cíclicos de N-esqueleto a N-esqueleto. Três ou mais dessas unidades constitutivas podem ser integradas na sequência peptidica para criar análogos de péptidos bicíclicos, como se detalhará mais adiante.

Assim, os análogos de péptidos podem ser construídos com duas ou mais ciclizações, incluindo N-esqueleto a N-esqueleto, assim como esqueleto para cadeia lateral ou qualquer outra 24 ciclização peptídica.

Como referido acima, os processos utilizados para construir os análogos de somatostatina da presente invenção a partir de novas unidades constitutivas baseiam-se de forma geral nos princípios conhecidos da síntese peptídica. No entanto, deve ser entendido que poderá ser necessário adaptar os processos às unidades constitutivas mais volumosas da presente invenção. 0 acoplamento dos aminoácidos na química peptídica em fase sólida pode ser obtida por meio de um agente acoplador tal como, mas não limitados a, diciclo-hexicarbodiimida (DCC), cloreto bis (2-oxo-3-oxazolidinil)fosfínico (B0P-C1), hexafluorofosfato de benzotriazolil-N-oxitrisdimetil-aminofosfónio (30P), 1-oxo-l-clorofosfolano (Cpt-Cl), hidroxibenzotriazole (HOBT), ou as suas misturas.

Descobriu-se que para acoplar o aminoácido subsequente às unidades constitutivas volumosas da presente invenção pode ser preciso utilizar reagentes de acoplamento adicionais, incluindo, mas não se limitando a: reagentes de acoplamento tais como PyBOP (hexafluorofosfato de benzotriazole-l-il-oxi-tris-pirrolidino-fosfónio) , PyBrOP (hexafluorofosfato de bromo-trispirrolidino-fosfónio) , HBTU (hexafluorofosfato de 2-(lH-benzotriazole-l-il) -1,1,3,3-tetrametilurónio), TB-TU (tetrafluoroborato de 2-(lH-benzotriazole-l-il)-1,1,3,3-tetrametilurónio).

Podem ser utilizadas novas químicas de acoplamento, tais como anidridos N-carboxilo pré-formados protegidos por uretano (UNCA), halogenetos de acilo pré-formados, de um modo muito preferido cloretos de acilo.

Vantajosamente, é também possível utilizar cloretos de aminoácido produzidos in situ. Os cloretos de aminoácido podem ser produzidos utilizando reagentes tais como 25 bis-(triclormetil)carbonato, habitualmente conhecido como trifosgénio, por exemplo.

Este acoplamento pode ocorrer à temperatura ambiente e

também a temperaturas elevadas, em solventes tais como tolueno, DCM (diclorometano), DMF (dimetilformamida), NMP (N-metilpirrolidinona) , dioxano, tetra-hidrofurano, diglima e 1,3-dicloropropano, ou as misturas dos solventes acima. São agora descritos os análogos de somatostatina de esqueleto ciclizado da presente invenção.

Os análogos de somatostatina de esqueleto ciclizado da presente invenção têm a seguinte fórmula. Q-Rs-R6-R1“R8-R9-Ri0-R11-NR12-X 1-C0-(CH2)n--1 Fórmula N° 7 em que n é 1 a 5; X designa um ácido carboxilico, amida ou grupo álcool terminal; Q é hidrogénio ou um mono- ou di-sacárido; R5 é ácido gama aminobutirico, ácido diaminobutirico, Gly, β-Ala, ácido 5-aminopentanóico ou ácido amino-hexanóico; R6 é (D)- ou (L)-Phe ou Tyr; R7 é (D)- ou (L)-Trp, (D)- ou (L)-Phe, (D)- ou (L) -INal ou (D)- ou (L)-2Nal, ou Tyr; R8 é (D)- ou (L)-Trp; R9 é (D)- ou (L)-Lys; R10 é Thr, Gly, Abu, Ser, Cys, Vai, (D)- ou (L)-Ala, ou (D)- 26 ou (L)-Phe; R11 é (D) - ou (L)-Phe, (D)- ou (L)-Ala, Nle, ou Cys; R12 é Gly, Vai, Leu, (D) - ou (L)-Phe ou INal ou 2Nal;

Um composto muito preferido de acordo com esta forma de realização é designado PTR 3173, em que os resíduos são os seguintes: Q é hidrogénio; R5 é GABA; R6 é Phe; R7 é Trp; R8 é (D)Trp; R9 é Lys; R10 é Thr; R11 é Phe; R12 é Gly; X é uma amida.

Outro composto muito preferido de acordo com esta forma de realização é designado PTR 3229, em que os resíduos são os seguintes: Q é galactose; R5 é Dab; R6 é Phe; R7 é (L)-Trp; R8 é (D)Trp; R9 é Lys; R10 é Thr; R11 é Phe; R12 é Gly; n é 3; e X é amida. 27

Os análogos de somatostatina de esqueleto cíclico mais preferidos de acordo com a presente invenção são descritos na tabela 3:

Tabela 3: Os análogos mais preferidos.

PTR Sequência 3173 GABA*-Phe-Trp-(D)Trp-Lys-Thr-Phe-Gly(C3)-X 3229 Galactose-Dab*-Phe-Trp-(D)Trp-Lys-Thr-Phe-Gly(C3)-X em que X é -NH2 ou -OH e o grupo-ponte estende-se entre as duas unidades constitutivas ou como indicado abaixo: Em PTR 3173, o asterisco denota que o grupo-ponte está ligado entre o derivado Ν“-ω funcionalizado de um aminoácido e o N-terminal do péptido. A somatostatina é uma hormona tetradecapeptídica cujas inúmeras funções reguladoras são mediadas por uma família de cinco receptores, cuja expressão é dependente do tecido. Acredita-se que os análogos de somatostatina específicos dos receptores são agentes terapêuticos vantajosos para o tratamento de várias doenças. As tentativas para desenvolver pequenos análogos peptídicos possuidores de tal selectividade não têm sido muito bem-sucedidas. Foi agora inesperadamente descoberto riu que os análogos de somatostatina de esqueleto ciclizado conformacionalmente constrangido da presente invenção são altamente selectivos aos subtipos de receptores SST.

Os péptidos de esqueleto cíclico desta invenção são novos análogos selectivos e, de um modo preferido, ligam-se com maior afinidade a um receptor individual da família de receptores de somatostatina. 28 A sequência de aminoácidos dos correspondentes análogos de esqueleto hexacíclico (PTR 3113, 3123 e 3171 não incluídos na presente invenção) está baseada no que se acredita serem os mais importantes aminoácidos derivados do SRIF-14 natural. A partir de dados da literatura (Bauer, et al. Life Sciences, 31: 1133, 1982), concluiu-se que os aminoácidos do SRIF-14 natural, pelos menos nas posições de 7 a 10, nomeadamente, Phe7, Trp8, Lys9, e Thr10, e de um modo preferido nas posições de 6 a 10, nomeadamente, Phe6, Phe7, Trp8, Lys9, e Thr10, são essenciais ao farmacóforo da hormona.

Os presentes análogos de esqueleto inovadores incluem de um modo preferido 9 aminoácidos com modificações especiais dos aminoácidos. Para determinados análogos preferidos, o aminoácido Asn foi substituído pela unidade constitutiva de esqueleto Phe na posição 5. Fez-se a substituição da configuração do L-Trp natural na posição 8 por D-Trp para melhorar a estabilidade do análogo. O resíduo Thr na posição 10 foi removido e a sequência foi completada pela correspondente unidade constitutiva de esqueleto Phe. A substituição de configuração única na posição 9 de L-Lys para D-Lys, conforme mostrado nos PTR 3123 e 3171, em comparação com PTR 3113, proporciona selectividade melhorada de ligação ao subtipo SST-R3 do receptor SST ao invés do subtipo SST-R5 (não incluído na presente invenção).

Em mais outros análogos foram realizadas outras modificações de aminoácidos. Por exemplo, a substituição dos resíduos Phe com Tyr para facilitar a iodação. A substituição dos resíduos Phe vom resíduo N-metil-Phe (por exemplo, substituição de Phe6 em PTR 3173 para obter PTR 3223 e substituição de Phe6 e Phe11 em PTR 3173 para obter PTR 3225) para aumentar a biodisponibilidade do composto (não incluído na presente invenção). A adição de unidades de mono- e di-sacáridos no terminal amino de determinados compostos é realizada para melhorar a 29 biodisponibilidade oral (Nelson-Piercy et al. ibid.). Por exemplo, a galactose foi conjugada ao N-terminal do composto semelhante a PTR 3173 para obter um análogo com a seguinte sequência:

Galactose-Dab-Phe-Trp-(D)Trp-Lys-Thr-Phe-Gly(C3) -NH2, aqui designada PTR 3229.

Num determinado análogo muito preferido (PTR 3173, por exemplo) a ponte é ligada entre um derivado Ν“-ω funcionalizado de um aminoácido e o N-terminal da sequência peptidica. Para outros análogos preferidos da presente invenção, a ponte é ligada entre uma unidade constitutiva de um derivado Να-ω funcionalizado tendo um grupo tio terminal e outro desse derivado de um aminoácido, ou à cadeia lateral de um resíduo Cys, a um ácido contendo mercapto ou a qualquer outra unidade contendo SH para formar uma ponte dissulfureto.

Os novos análogos da presente invenção proporcionam uma dimensão adicional à novidade da tecnologia de ciclização de esqueleto, na utilização de uma ponte de esqueleto encurtada (i. e., apenas um a três metilenos para além da ligação peptidica). Esta abordagem permite obter uma rigidez muito maior do péptido, e constringir adicionalmente a conformação desejada do farmacóforo natural.

Uma vantagem adicional dos análogos hexapeptídicos da presente invenção está relacionada com o seu peso molecular relativamente baixo (a sua sequência consiste de apenas seis aminoácidos), até apenas 1000 daltons, em comparação com os análogos sintéticos de somatostatina mais comuns que são habitualmente hepta ou octapeptídicos.

Descobriu-se que os análogos de somatostatina de esqueleto 30 cíclico da presente invenção (por exemplo PTR 3173) possuem uma considerável bioestabilidade metabólica contra a sua degradação pelas enzimas. Este atributo parece sugerir uma duração potencialmente longa da actividade no organismo. A estabilidade dos análogos de esquelto cíclico era comparável à do fármaco metabolicamente estável Octreotida utilizando medições de estabilidade experimentais baseadas na degradação por várias misturas de enzimas (e. g., homogenato renal, homogenato de fígado de ratos e soro humano). Todos os compostos testados mostram bioestabilidade significativamente superior do que a hormona natural SRIF-14. Em alguns dos correspondentes péptidos não-ciclizados, observou-se alguma degradação duas horas após a incubação, indicando que a ciclização contribuiu notavelmente para a estabilidade dos péptidos. Esperava-se que a incorporação dos aminoácidos N-alquilados utilizados para a ciclização de esqueleto conferissem bioestabilidade metabólica a estes péptidos.

Os análogos de esqueleto cíclico da presente invenção ligam-se in vitro com alta afinidade a um subconjunto definido dos receptores da somatostatina humana. Esta selectividade para os receptores é indicativa da sua selectividade fisiológica potencial in vivo.

Consistentemente com a ligação ao receptor in vitro, os análogos de esqueleto cíclico da presente invenção afectam selectivamente um sistema definido no organismo, sem afectar outras actividades fisiológicas conhecidas da hormona natural somatostatina.

Por exemplo, o PTR 3173 exerce uma inibição significativa, com duração de acção prolongada sobre o eixo da hormona do crescimento IGF-1, de magnitude semelhante à do fármaco 31

Octreotida, mas não apresenta as desvantagens da Octreotida, tais como a inibição da secreção de insulina. 0 PTR 3173 tem também um efeito consideravelmente menor sobre a libertação de glucagon do que a Octreotida apresentando, portanto, a vantagem de não causar hiperglicemia, o que faz dele um composto muito atraente para o tratamento da diabetes tipo 2 (NIDDM).

Como resumido na tabela 4, o PTR 3173 possui selectividade fisiológica significantemente superior ao fármaco Octreotida. 0 PTR 3173 é um potente inibidor da hormona do crescimento, mas tem muito menos actividade sobre a glucagon e nenhum efeito considerável sobre a insulina.

Tabela 4: Selectividade fisiológica de PTR 3173 em comparação com Octreotida.

Análogo GH ID50 Glucagon Insulina GH/ GH pg/kg ID50 pg/kg ID50 pg/kg Insulina Glucagon Octreotida 0,08 0, 65 26 309 lllllllllllllll PTR 3173 0,1 >100 >1000 >10.000 0 PTR 3173 mostra uma inibição significativa do crescimento das células CHO expressando SST-R5 humano clonado, indicando um potencial papel para o tratamento de tumores expressando SST-R5 (e. g., carcinóides, tumores pituitários). Este análogo também inibe a libertação de Cromogranina A da linha de células carcinóides humanas, indicado um efeito antitumoral (exemplo 5); 0 perfil farmacocinético único de PTR 3173 como avaliado em animais é consistente com a sua bioestabilidade metabólica, tal como avaliada in vitro. Este análogo de somatostatina de esqueleto cíclico apresenta um perfil farmacocinético de 32 flip-flop (cinética de libertação lenta). Após administração subcutânea, a meia-vida de circulação aparente é resultado desta taxa de absorção; mas não da sua taxa de eliminação. Após administração subcutânea a ratos, o PTR 3173 apresentou meia-vida de circulação de aproximadamente 3 horas. Esta actividade excede significativamente a do fármaco de acção prolongada Octreotida que tem uma meia-vida de circulação de apenas 40 minutos. Os principais parâmetros farmacocinéticos de PTR 3173 vs Octreotida estão resumidos na tabela 5.

Tabela 5: Principais parâmetros farmacocinéticos de PTR 3173 vs Octreotida após administração IV e SC em ratos Wistar conscientes.

Via Fármaco F(%) Vss T/l β F,% Eliminação (mL/min/kg) (mL/kg) (min) IV PTR 3173 - 653 31 10,3 13,0 Octreotide* - 602 49 21,3 17, 6 SC PTR 3173 996 - 11111:11 15, 9 133 Octreotide* 103 — sis 23,0 17,1 * De Sandostatina (acetato de Octreotida), OverView and clinicai summary. Sandoz Pharmaceutical Corporation, 1992. F- biodisponibilidade Vs. - volume de distribuição

Ti/2- meia-vida circulante E - Extraído em urina O análogo de somatostatina de esqueleto cíclico PTR 3173 é selectivo para os receptores de somatostatina e liga significativamente menos outros receptores associados à proteína G do que Octreotida, como observado por rastreio tanto dos análogos como SRIF quanto à ligação a vários desses receptores (exemplo 6) . Esta característica é de grande vantagem porque a ligação a receptores não-somatostatínicos poderia causar efeitos 33 potencialmente adversos no corpo.

Em ensaios de proliferação de linfócitos no sangue periférico humano (PLB), observou-se ainda que o PTR 3173 não é mitogénico de linfócitos humanos. 0 PTR 3173 foi testado em várias espécies quanto às suas caracteristicas de segurança iniciais. Sob os requisitos da Farmacopeia Europeia para testes de segurança foi declarado como um candidato a fármaco seguro nesta fase de desenvolvimento. Não foram observados sinais de toxicidade em roedores e cães quando injectados com uma dose 10.000 vezes mais elevada do que a dose eficaz para iniciar a libertação da hormona do crescimento. Método geral de síntese, purificação e caracterização de péptidos de esqueleto cíclico Síntese:

Resina: 1 g de resina amida Rink ou Tenta-Gel, com carga de 0,2-0,7 mmol/g.

Desprotecção Fmoc: Com 7 mL de piperidina a 20% em NMP. Duas vezes durante 15 minutos seguido de 5 lavagens com 10 mL de NMP durante 2 minutos com agitação.

Acoplamentos: 1. Acoplamentos regulares (acoplamento a aminoácidos simples): com uma solução contendo 3 equivalentes de aminoácido, 3 equivalentes de PyBroP e 6 equivalentes de DIEA em 7 mL de NMP. Durante 0,5 a 2 horas com agitação. O 34 acoplamento é monitorizado peço teste da ninidrina e repetido até a solução de ninidrina ficar amarela. 2. Acoplamento de His e Asn com solução contendo 5 equivalentes de DIC e 5 equivalentes de HOBT em 107 mL de DMF. 3. Acoplamento às unidades constitutivas Gly: com uma solução contendo 3 equivalentes de aminoácido, 3 equivalentes de PyBroP e 6 equivalentes de DIEA em 7 mL de NMP. Duas vezes durante 1 a 4 horas com agitação 4. Acoplamento a unidades constitutivas que não são Gly: com uma solução contendo 5 equivalentes de aminoácido, 1,5 equivalentes de trifosgénio e 13 equivalentes de colidina em 15 mL de dioxano ou THF. Duas vezes durante 0,5 a 2 horas a 50 °C com agitação.

Remoção dos grupos protectores alilo e alloc das unidades constitutivas: com 1,5 equivalentes por péptido de Pd(PPh3)4 em 30 mL de DCM contendo 5% de ácido acético e 2,5% de NMM. Durante 0,5 a 2 horas com agitação.

Ciclização: com uma solução contendo 3 equivalentes de PyBOP e 6 equivalentes de DIEA em 7 mL de NMP. Durante 0,5 a 2 horas com agitação. A ciclização é monitorizada pelo teste da ninidrina e repetido se necessário.

Clivagem: com 82%-95% de TFA suplementado com neutralizadores: 1-15% de H20, 1-5% de TIS e 1-5% de EDT.

Purificação: 35 É desenvolvido um método individual de purificação para cada péptido de esqueleto cíclico em HPLC analítica, para produzir o isolamento máximo do péptido cíclico em relação a outros componentes não purificados. 0 método analítico é habitualmente realizado utilizando uma coluna C18 Vydac de 250X4,6 mm como a fase estacionária e gradiente em mistura de água/ACN contendo 0,1% de TFA. O método preparativo é concebido incluindo o método de separação analítica realizado na coluna C18 Vydac de 2 polegadas. Durante o processo de purificação, o pico contendo o péptido cíclico é recolhido utilizando um colector de fracções semi-automático. As fracções recolhidas são injectadas na HPLC analítica para verificação da pureza. As fracções puras são combinadas e liofilizadas.

Caracterização: O material liofilizado puro combinado é analisado quanto à pureza por HPLC, MS e electroforese capilar e por análise de aminoácidos quanto ao seu conteúdo peptídico e determinação da razão de aminoácidos.

Rastreio geral de análogos de somatostatina.

Os análogos de somatostatina de esqueleto cíclico são rastreados por teste in vitro quanto à sua inibição da ligação do péptido natural (SRIF-14) aos seus receptores acoplados à proteína G (exemplo 3). Os análogos que se ligam com alta afinidade de ligação são depois testados quanto à sua influência sobre segundos mensageiros, tal como níveis de monofosfato cíclico de adenosina (cAMP), actividade de tirosina fosfatase, hormona do crescimento e secreção de cromogranina A, assim como sobre o crescimento celular. 36

Os análogos activos são ainda testados in vivo quanto à inibição de hormonas e à secreção de enzimas; sistemas de modelos particularmente relevantes, baseados nas informações da literatura, indicam que SST-R2 e SST-RS mediam a maioria dos efeitos endócrinos da somatostatina, entre eles, a inibição da libertação da hormona do crescimento, amilase, a secreção de ácido gástrico, insulina e glucagon, que são baseados nas actividades endócrinas conhecidas da hormona natural SRIF, e o análogo de somatostatina, Octreotida. Foi utilizado o análogo de somatostatina de esqueleto cíclico muito preferido: PTR-3173 que possui especificidade para os receptores SST-R2 + SST-R5, para elucidar o papel fisiológico de cada receptor de somatostatina nos perfis endócrinos, além da pesquisa sobre os seus potenciais como fármacos candidatos.

Nos exemplos abaixo são apresentados análogos de somatostatina conformacionalmente constrangidos, construídos com base em parte nas sequências de uma variedade de péptidos biologicamente activos conhecidos ou baseados em novas sequências anteriormente desconhecidas. Os exemplos seguintes pretendem ilustrar o modo de fazer e utilizar os compostos e métodos desta invenção e não devem ser de forma alguma interpretados como uma limitação.

EXEMPLOS

Exemplo 1. Síntese detalhada de PTR 3173.

Cinco gramas de resina amida Rink (ΝΟΒΑ) (0,56 mmol/g) foram expandidos em N-metilpirrolidona (NMP) num vaso reaccional com fundo de vidro sinterizado e colocados num agitador. O grupo protector Fmoc foi removido da resina mediante reacção com 37

piperidina a 20% em NMP (duas vezes 10 minutos, 25 mL cada) . A remoção de Fmoc foi monitorizada através de medição do espectro de absorção ultravioleta a 290 nm. Realizou-se um ciclo de acoplamento com Fmoc-Gly-C3(Alilo) (3 equivalentes) PyBrop (3 equivalentes) DIEA (6 equivalentes) em NMP (20 mL) durante 1 hora à temperatura ambiente. O fim da reacção foi monitorizado pelo teste qualitativo da ninidrina (teste de Kaiser). Depois do acoplamento, a resina peptidica foi lavada com NMP (7 vezes com 25 mL de NMP, dois minutos cada) . O capeamento foi efectuado mediante reacção da resina de péptidos com anhidrido acético (mistura de capeamento: HOBt 400 mg, NMP 20 mL, anhidrido acético 10 mL, DIEA 4,4 mL) durante 0,5 horas à temperatura ambiente. Após o capeamento, procedeu-se a lavagens com NMP, conforme referido acima (7 vezes, 2 minutos cada). A remoção de Fmoc foi feita conforme descrito acima. O acoplamento Fmoc-Phe-OH foi realizado do mesmo modo, e o grupo Fmoc foi removido como indicado acima. A resina peptidica foi feita reagir com Fmoc-Thr(OtBu)-OH: as condições de acoplamento foram como acima. A remoção de Fmoc foi realizada como acima. O Fmoc-Lys(Boc)-OH foi acoplado à resina peptidica com as mesmas condições de acoplamento. O fim do acoplamento foi monitorizado com o teste Fmoc (tirou-se e pesou-se uma amostra da resina peptidica, removeu-se o Fmoc como indicado acima, e mediu-se a absorção ultravioleta). Acoplou-se Fmoc-D-Trp-OH à resina peptidica com PyBrop, como descrito acima. Após remoção de Fmoc, efectuou-se o acoplamento de Fmoc-Trp-OH do mesmo modo. Após a remoção de Fmoc, efectuou-se o acoplamento de Fmoc-Phe-OH do mesmo modo. Após a remoção de Fmoc, efectuou-se o acoplamento de Fmoc-GAB-OH do mesmo modo. O grupo protector alilo foi removido por reacção com Pd(PPh3)4 e ácido acético a 5%, morfolina a 2,5% em clorofórmio, sob árgon, durante 2 horas à temperatura ambiente. Lavou-se a resina peptidica com NMP, conforme referido acima. O grupo protector Fmoc foi removido do péptido mediante reacção com piperidina a 20% em NMP (2 vezes 10 minutos, 25 mL 38 cada vez). A ciclização foi efectuada com 3 equivalentes de PyBOP , 6 equivalentes de DIEA, em NMP, à temperatura ambiente durante 2 horas. A resina peptidica foi lavada e seca. 0 péptidos foi clivado da resina por reacção com TFA a 94%, água a 2,5%, EDT a 2,5%, TIS (tri-isopropil-silano) 1%, a 0 °C durante 15 minutos e 2 horas à temperatura ambiente, sob árgon. Filtrou-se a mistura em éter frio (30 mL, 0 °C) e lavou-se a resina com um pequeno volume de TFA. Colocou-se o filtrado num evaporador rotativo e removeram-se todos os componentes voláteis. Obteve-se um produto oleoso. Foi triturado com éter e decantado em éter, três vezes. Obteve-se um pó branco. Este produto foi seco em estado natural. O peso do produto em estado natural era de 4 g.

Após purificação com HPLC obteve-se um pico isolado com 100% de pureza, conforme detectou-se por HPLC analítica e electroforese capilar. A massa prevista de 1123 daltons foi detectada por espectroscopia de massa.

Exemplo 3: Resistência à biodegradação.

Mediu-se a bioestabilidade dos análogos peptídicos cíclicos SST: PTRs 3113,* 3123,* 3171* e 3173 em homogenato renal, e estabeleceu-se uma comparação entre eles e Octreotida (Sandostatina TM) e somatostatina natural (SRIF-14). Os resultados estão na tabela 6 abaixo. Nesta análise, os análogos de péptidos de esqueleto cíclico da presente invenção foram tão estáveis quanto Octreotida e foram muito mais estáveis do que SRIF. O ensaio teve por base a determinação, por HPLC, da degradação do péptido em função do tempo em homogenato renal a 37 °C.

Tabela 6: Percentagem de moléculas intactas após incubação em homogenato renal. 39

Tempo (h) SRIF I Octreotida PTR- 3113* PTR- 3123* PTR- 3171* PTR- 3173 0 100 100 100 100 100 100 1 5 100 100 100 100 100 3 0 100 100 100 100 100 24 0 100 100 100 100 100 * não incluído na presente invenção

Exemplo 4: Ligação dos análogos aos receptores de somatostatina.

Os análogos de somatostatina foram testados quanto à sua potência de inibição da ligação de 125I-Tyrll-SRIF (com base no método descrito por Raynor et al., Molecular Pharmacology 43: 838, 1993) a preparações de membranas expressando os receptores de somatostatina transmembranares (SST-Rl, 2, 3, 4 ou 5) . As preparações de receptor utilizadas para estes testes eram de receptores humanos clonados expressos selectiva e estavelmente em células de ovário de hamster chinês (CHO) ou de linhas celulares que expressam naturalmente os SST-R. Tipicamente, as membranas celulares foram homogeneizadas em tampão Tris na presença de inibidores de protease e incubados durante 30-40 minutos com 125I-Tyrll-SRIF com diferentes concentrações da amostra analisada. As reacções de ligação foram filtradas, os filtros lavados e fez-se a contagem da radioactividade ligada num contador gama. A ligação não-especifica foi definida como a radioactividade residual ligada na presença de 1 μΜ de SRIF-14 não marcada. A fim de validar os sinais positivos dos testes de ligação e para eliminar os sinais nâo-especificos, testaram-se as amostras 40 de péptidos irrelevantes, tais como GnRH, que haviam sido sintetizados e tratados utilizando os mesmos processos, nos mesmos ensaios como amostras de controlo negativas. Estas amostras não tiveram actividade de ligação em nenhum dos ensaios. Os resultados são apresentados nas tabelas 8 e 9 e na Figura 1.

Tabela 8: Percentagem de inibição da ligação de SRIF-14 a receptores de somatostatina humanos clonados por PTR 3173

Receptor Concentração (M) Subtipo t1 o τ—1 10'1U 10‘a 10'° 1 O τ—1 10~D SST-Rl 0 0 0 0 5 15 SST-R2 15 30 42 80 95 96 SST-R3 2 1 1 4 50 89 SST-R4 0 0 0 0 5 5 SST-R5 20 48 63 82 95 95

Tabela 9: Concentração (mM) de análogos de somatostatina para inibir em 50% a ligação de SRIF a cada um dos receptores de somatostatina humanos clonados. PTR IC50 SST-Rl SST-R2 SST-R3 SST-R5 3173 >10~D 10‘a ΠΗ 10_a

Exemplo 5. Bio-resposta in vitro de análogos de somatostatina de esqueleto cíclico preferidos. 41 A. Inibição de cAMP em células carcinóides humanas BON-1 pelo análogo de somatostatina de esqueleto cíclico PTR 3173: A activação de SST-R5 conduz à redução da actividade da adenilato ciclase. Os receptores de somatostatina, incluindo os receptores tipo 5 são expressos na linha celular BON-1 derivada do carcinóide humano. Esta cultura celular humana serviu como um ensaio in vitro de descoberta de novas terapêuticas carcinóides. A interacção de análogos de somatostatina com os receptores de somatostatina expressos neste sistema afecta posteriormente a funcionalidade celular de BON-1. Verificou-se que os análogos de esqueleto cíclico preferidos da presente invenção inibem a produção de cAMP após a estimulação pelo forskolin. Nesta via de transdução de sinal, PTR 3173 é equipotente ao fármaco Octreotida utilizado clinicamente. B. Inibição in vitro de crescimento celular pelo análogo de somatostatina de esqueleto cíclico PTR 3173:

Efectuou-se a avaliação farmacológica da inibição do crescimento utilizando células CHO expressando SST-R5 humana clonada. Associou-se o reconhecimento de SST-R5 pelo PTR 3173 ao nível celular a uma potência de inibição do crescimento muito superior, comparada com a hormona natural e o fármaco Octreotida. C. Inibição da libertação de cromoqranina A pelo análogo de somatostatina de esqueleto cíclico PTR 3173: A avaliação da libertação de cromogranina A de BON-1 é um 42 ensaio importante que visa identificar potenciais fármacos anticarcinóides. A cromogranina é um dos principais mediadores na desgranulação dos grânulos tumorais que segregam quantidades excessivas de substâncias vasoactivas dos tumores carcinóides. 0 PTR 3173 possui um efeito significativo antilibertação nesta via. Uma das descobertas mais intrigantes do análogo de esqueleto ciclico no ensaio com BON-1 humana é a potência equivalente à da hormona natural somatostatina, indicando um potencial efeito benéfico na sindrome carcinóide.

Exemplo 6: Comparação de PTR3173, Octreotida e SRIF para a ligação de receptores não-somatostatina acoplados a G.

Os receptores de somatostatina pertencem à superfamilia dos sete receptores transmembranares acoplados à proteína G. Os receptores acoplados à proteína G estão amplamente distribuídos pelo corpo e medeiam actividades fisiológicas de várias hormonas, tais como adrenalina, acetilcolina, opiáceos, neurocininas, gastrina e muitas outras hormonas. Um fármaco candidato poderia ser reconhecido por um subtipo definido de receptores intra-familia. Contudo, poderia causar potenciais efeitos adversos no corpo devido ao reconhecimento de outros receptores distintos da sua família. Esta consideração aumentou a importância da sensibilidade inter-receptor versus intra-receptor, no contexto do desenvolvimento de fármacos fisiológicos activos.

NovaScreen (Hanover, MO) realizou uma avaliação da ligação não-específica a várias famílias de receptores acoplados à proteína G. Os estudos sobre a ligação aos receptores de neurocinina, opiáceos e muscarínicos basearam-se numa comparação entre a hormona natural somatostatina, Octreotida e PTR 3173. 43

Num ensaio de rastreio realizado pela NovaScreen, encontrou-se afinidade significativamente elevada de Octreotida para os receptores opiáceos, enquanto que, sob as mesmas condições experimentais, PTR 3173 e a hormona natural somatostatina não se ligaram a estes receptores (Figura 2). Também se encontrou afinidade significativamente elevada de Octreotida para o receptor 2-muscarínico, acima de PTR 3173 e da hormona natural. A importância da ligação reactiva cruzada de Octreotida aos receptores opiáceos foi ainda investigadaem ileo de porquinho-da-índia. Os resultados preliminares confirmaram o efeito da Octreotida como antagonista opiáceo, enquanto que sob as mesmas condições experimentais, o PTR 3173 não afecta a contracção nervosa evocada por metencefalina.

Exemplo 7: 0 efeito in vivo de análogos de somatostatina de esqueleto cíclico sobre a libertação da hormona do crescimento. Métodos:

Mediu-se a inibição da libertação da hormona do crescimento (GH) como resultado da administração de péptidos em ratos Wistar machos. Comparou-se, neste estudo, a actividade do análogo com a de SRIF ou a de Octreotida utilizando 4 ratos em cada grupo. Os ratos Wistar machos adultos de 200-250 9 de peso mantiveram-se num ciclo luz/escuro constante (luz das 8:00 às 20:00 h), temperatura (21+3 °C) e humidade relativa (55+10%) . Ração e água de torneira estavam disponíveis ad libitum no laboratório. No dia da experiência, os ratos foram anestesiados com Nembutal (IP, 60 mg/kg) . Dez minutos após a anestesia, os fármacos foram administrados S.C a uma dose de 0,01-100 micrograma/kg. Realizou-se estimulação de GH por administração I.V. de 0,5 g/kg de L-arginina através da veia femural. A amostragem foi efectuada 5 minutos depois da estimulação, 15 ou 30 minutos dois 44 da administração do péptido. As amostras de sangue foram recolhidas da veia cava abdominal em tubos contendo heparina (15 unidades por mL de sangue) e foram centrifugadas imediatamente. Separou-se o plasma e congelou-se a -20 °C até a sua análise. Os niveis da hormona do crescimento dos ratos (rGH) [125I] foram determinados mediante um kit de radioimunoensaio (Amersham) . O padrão deste kit foi calibrado em relação a uma preparação padrão de referência (NIH-RP2) obtida do National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases. Todas as amostras foram medidas em duplicado. Os resultados destas experiências são apresentados na Figura 3.

Resultados: A libertação da hormona do crescimento foi estimulada nos ratos por injecção em bólus de L-arginina sob anestesia de

Nembutal. O ED50 descrito para a Octreotida (Bauer, et al. ibid.) neste modelo é de aproximadamente 0,1 microgramas por quilograma. Por conseguinte, a Octreotida e os análogos de esqueleto cíclico específicos do receptor analisados foram administrados a uma dose relativamente elevada de 100 microgramas por quilograma. Sob estas condições experimentais, PTR-3205, não incluído na presente invenção, e PTR 3173 foram inibidores equipotentes da libertação da hormona do crescimento em comparação com Octreotida (Figura 3) .

Obtiveram-se resultados intrigantes com PTR-3201, não incluído na presente invenção, que é um análogo específico do receptor 5. Este análogo selectivo não afecta a libertação de hormona do crescimento, demonstrando assim que a inibição da hormona do crescimento não está mediada pelo subtipo 5 do receptor de somatostatina. Por outro lado, a importante inibição encontrada com PTR 3205, não incluído na presente invenção, que é selectivo para o subtipo 2 do receptor, indica que este é o receptor 45 principal que medeia a inibição da hormona do crescimento. Por tanto, podemos deduzir que o efeito na hormona do crescimento encontrado com o fármaco Octreotida ou PTR 3173 se deve ao seu reconhecimento do subtipo 2 do receptor.

Exemplo 8: O efeito in vivo dos análogos de somatostatina de esqueleto cíclico específicos do receptor sobre a libertação de glucagon.

Mediu-se a inibição da libertação de glucagon como resultado da administração de péptidos em ratos Wistar machos. Comparou-se, neste estudo, a actividade do análogo com a de SRIF ou a de Octreotida utilizando 4 ratos em cada grupo. Mediram-se os perfis da libertação de glucagon no decurso do tempo sob condições experimentais constantes.

Os ratos Wistar machos jejuaram durante a noite. Os animais foram anestesiados com Nembutal (IP, 60 mg/kg). Dez minutos após a anestesia, os fármacos foram administrados S.C. a uma dose de 0,01-100 micrograma/kg. Efectuou-se a estimulação da secreção de glucagon por administração I.V. de 0,5 g/kg de L-arginina, 5 antes da recolha de sangue da veia porta. Mediu-se a concentração de hormona por RIA. A única diferença estatisticamente significativa nos níveis de glucagon comparados com o controlo foi obtida com a dose elevada de 100 microgramas por quilograma de PTR 3173 (Figura 4), uma dose 1000 vezes maior em comparação com a ED50 de PTR 3173 na libertação de hormona do crescimento. Estes resultados enfatizam a importante selectividade fisiológica deste análogo de esqueleto cíclico comparado com Octreotida, conforme resumido na Tabela 4 acima. 46

Exemplo 9: O efeito in vivo de análogos de somatostatina de esqueleto cíclico específicos do receptor sobre a libertação de insulina. A inibição da libertação de insulina pelos análogos de somatostatina está bem documentada na literatura (Bauer, et al. ibid., Lamberts et al. 1996, ibid.) . Contudo, tem-se descrito que os análogos de somatostatina sintéticos de actividade fisiológica de longa duração são menos activos na insulina em comparação com a sua potente inibição da libertação da hormona do crescimento ou glucagon (Bauer, et al. ibid., Lamberts et al. 1996, ibid.). A Sandoz reivindica que há selectividade fisiológica de Octreotida sobre a hormona do crescimento versus insulina. No entanto, na diabetes tipo 2 o análogo de acção longa, a Octreotida, suprime a libertação de insulina e glucagon, deixando os níveis de glucose inalterados ou um pouco elevados.

Outros ensaios clínicos mostraram que o facto de Octreotida não conseguir diminuir as taxas de glicemia na diabetes tipo 2, apesar da sua capacidade de baixar a glucagon e a hormona do crescimento, era provavelmente dependente no bloqueio temporário da secreção residual de insulina endógena induzida pela sua administração. Em indivíduos saudáveis a administração de Octreotida resultou no desenvolvimento de uma moderada hiperglicemia em jejum e uma pronunciada hipoinsulinemia em jejum. Além disso, a octreotida é prescrita para o tratamento de nesidioblastose, uma síndrome associada à libertação excessiva de insulina pelo pâncreas, o que enfatiza o efeito fisiológico não-específico de octreotida sobre a insulina (Kane et al. J. Clin. .Invés. 100:1888, 1997). 47

Para avaliar os efeitos fisiológicos dos análogos de somatostatina de esqueleto cíclico específicos do receptor na libertação de insulina, realizou-se o mesmo protocolo experimental usado pela Sandoz para a avaliação de octreotida. A estimulação da insulina foi induzida pela administração de bólus intravenoso de D-glicose a ratos que jejuaram durante a noite. Método:

Mediu-se a determinação in vivo da libertação de insulina como resultado da administração de péptido em ratos Wistar machos. Neste estudo, comparou-se a actividade do análogo com a de SRIF ou a de octreotida usando 4 ratos em cada grupo. Mediram-se os perfis da libertação de GH no decurso do tempo Sob condições experimentais constantes.

Os ratos Wistar machos jejuaram durante a noite. Os animais foram anestesiados com Nembutal (IP, 60 mg/kg) . Dez minutos depois da anestesia, os fármacos foram administradas subcutaneamente a uma dose de 0,01-100 micrograma/kg 30 minutos antes da estimulação da secreção de insulina mediante administração intravenosa de 0,5 g/kg de D-glucose, 5 minutos antes da recolha de sangue da veia cava abdominal. Mediram-se os níveis de hormona Por RIA.

Resultados:

PTR-3205, não incluído na presente invenção, e Octreotida foram ambos inibidores activos da libertação de insulina (Figura 5a) . O ED50 de Octreotida depois da injecçâo subcutânea estava entre 10 a 100 microgramas por quilograma, de acordo com o ED50 indicado pela Sandoz - 26 microgramas por quilograma. O 48 efeito significativo encontrado com PTR-3205; não incluído na presente invenção, indica que o subtipo 2 de receptor de somatostatina medeia o efeito sobre a hormona do crescimento e também sobre a insulina. Correlacionou-se esta relação receptor-efector com os dados publicados anteriores que indicam que a somatostatina inibe a secreção de células β através de subtipo 2 do receptor no pâncreas humano isolado submetido a perfusão. Em contraste com o significativo efeito encontrado com PTR-3205, não incluído na presente invenção, e Octreotida, altas doses (100 microgramas por quilograma) de PTR-3201, não incluído na presente invenção, e 3173, foram inactivas na insulina. Deve-se ter em conta que PTR 3173 em dose semelhante teve um efeito significativo na libertação de hormona do crescimento. Esta intrigante selectividade fisiológica de PTR 3173 levou a repetir esta experiência com uma dose muito mais elevada até 1 miligrama por quilograma. Sob estas condições experimentais, definiu-se PTR 3173 como um análogo de somatostatina fisiologicamente selectivo sem efeito apreciável sobre a insulina, em comparação com o fármaco Octreotida (Figura 5b).

LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS <110> Peptor Ltd. <120> Análogos de Somatostatina de Esqueleto Cicllzado

Conformacionalmente Constrangido <130> SCB/CDM/-56756/000 <140> 99957020.3 <141> 2000-12-20 <150> PCT/IL99/0032 <151> 1999-06-15 <150> 09/100360 <151> 1998-06-19 <150> 09/203389 49 <151> 1998-12-02 <16 0 > 102

<170> FastSEQ para Windows Versão 4.0 <210> 1 <211> 14 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> VARIANTE <222> (1) .. . (10) <223> Xaa = Qualquer aminoácido < 4 0 0 > 1

Ala Gly Cys Lys Asn Phe Phe Trp Lys Thr Phe Thr Ser Cys 15 10

<210> 2 <211> 6 <212> PRT <213> Homo sapiens < 4 0 0 > 2

Cys Phe Trp Lys Thr Cys 1 5

<210> 3 <211> 6 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> VARIANTE <222> (1) ... (6) <223> Xaa na posição 1 = NmeAla (N-metilalanina) <2 2 0>

<221> VARIANTE 50 <222> (1) . . . (6) <223> Xaa na posição 3 = (D)Trp < 4 0 0 > 3

Xaa Tyr Xaa Lys Vai Phe 1 5

<210> 4 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <2 2 0 > <221> VARIANTE <222> (1)...(10) <223> Xaa na posição 2 = (D)Phe <220> <221> VARIANTE <222> (1)...(10) <223> Xaa na posição 5 = (D)Trp <220> <221> VARIANTE <222> (1)...(10) <223> Xaa na posição 10 = CH20H < 4 0 0 > 4

His Xaa Cys Phe Xaa Lys Thr Cys Thr Xaa 15 10

<210> 5 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <220>

<221> VARIANTE 51 <222> (1) . . . (8) <223> Xaa na posição 2 = (D)Phe <220> <221> VARIANTE <222> (1) .. . (8) <223> Xaa na posição 5 = (D)Trp <400> 5

His Xaa Cys Phe Xaa Lys Cys Thr 1 5

<210> 6 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> VARIANTE <222> (1) .. . (7) <223> Xaa na posição 4 = (D)Trp <2 2 0 > <221> VARIANTE <222> (1) .. . (7) <223> Xaa na posição 5 = (D)Lys <220> <221> VARIANTE <222> (1) .. . (7) <223> Xaa na posição 6 = Phe(C2) <220> <221> VARIANTE <222> (1) .. . (7) <223> Xaa na posição 7 = -NH2 ou -OH <400> 6

Phe Phe Phe Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 52 <210 > 7 <211 > 7 <212 > PRT <213> Homo sapiens <2 2 0 > <2 21 > VARIANTE <222> (D · · · (7) <223> Xaa na posição 1 = Phe(C2) <2 2 0 > <2 21 > VARIANTE <222> (D · · · (7) <223> Xaa na posição 4 = (D)Trp <220> <2 21 > VARIANTE <222> (D · · · (7) <223> Xaa na posição 6 = Phe(N2) <2 2 0 > <221> VARIANTE <222> (D . . . (7) <223> Xaa na posição 7 = -NH2 ou <400> 7 Xaa Phe Phe Xaa Lys Xaa Xaa 1 5 <210 > 8 <211 > 7 <212 > PRT <213> Homo sapiens <2 2 0 > <2 21 > VARIANTE <222> (D . . . (7) <223> Xaa na posição 1 = Phe(Cl) 53 <2 2 Ο > <221> VARIANTE <222> (1) .. . (7) <223> Xaa na posição 4 = (D)Trp <220> <221> VARIANTE <222> (1) .. . (7) <223> Xaa na posição 5 = (D)Lys <220> <221> VARIANTE <222> (1) .. . (7) <223> Xaa na posição 6 = Phe(N2) <220> <221> VARIANTE <222> (1) .. . (7) <223> Xaa na posição 7 = -NH2 ou -OH < 4 0 0 > 8

Xaa Phe Phe Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5

<210> 9 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> VARIANTE <222> (1) .. . (8) <223> Xaa na posição 1 = Phe(N2) <220> <221> VARIANTE <222> (1) . . . (8) <223> Xaa na posição 3 = (D)2Nal (2Nal = 2-naftilalamina) <220> 54 A \—1 C\] C\] V VARIANTE <222> (D · · · (8) <223> <220> Xaa na posição 6 = Gly(C2) Λ \—1 CM CM V VARIANTE <2 2 2 > (D . . . (8) <223> Xaa na posição 8 = -NH2 ou -OH <400> 9 Xaa Tyr Xaa Lys Vai 1 5 Xaa Thr Xaa

<210> 10 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> VARIANTE <222> (D · · · (8) <223> Xaa na posição 1 = Phe(N2) <2 2 0 > <221> VARIANTE <222> (D · · · (8) <223> Xaa na posição 3 = (D)Trp <220> <221> VARIANTE <222> (D · · · (8) <223> Xaa na posição 6 = Gly(C2) <220> <221> VARIANTE <222> (D . . . (8) <223> Xaa na posição 7 = 2Nal (2Nal <220> <221> VARIANTE 2-naftilalamina) 55 <2 2 2 > (D . . . (8) <223> Xaa na posição 8 = -NH2 ou - < 4 0 0 > 10 Xaa Tyr Xaa Lys 1 Val Xaa Xaa Xaa 5 <210> 11 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> VARIANTE <222> (D . . . (8) <223> Xaa na posição 1 = Phe (N2) <220> <221> VARIANTE <222> (D · · · (8) <223> Xaa na posição 3 = (D)Trp <2 2 0 > <221> VARIANTE <222> (D · · · (8) <223> Xaa na posição 7 = Gly(C2) <220> <221> VARIANTE <222> (D · · · (8) <223> Xaa na posição 8 = -NH2 ou - < 4 0 0 > 11

Xaa Tyr Xaa Lys Vai Vai Xaa Xaa 1 5

<210> 12 <211> 8 <212> PRT 56 <213> Homo sapiens <220> <221> VARIANTE <222> (D · · · (8) <223> Xaa na posição 1 = Phe (N2) <2 2 0 > <221> VARIANTE <222> (D · · · (8) <223> Xaa na posição 3 = (D)Trp <220> <221> VARIANTE <222> (D · · · (8) <223> Xaa na posição 6 = 2Nal (2Nal <220> <221> VARIANTE <222> (D · · · (8) <223> Xaa na posição 7 = Gly(C2) <220> <221> VARIANTE <222> (D . . . (8) <223> Xaa na posição 8 = -NH2 ou -OH <400> 12 Xaa Tyr Xaa Lys Ser Xaa Xaa Xaa 1 5 <210> 13 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> VARIANTE <222> (D · · · (8) <223> Xaa na posição 1 = Phe (N2) 2-naftilalamina) 57 <2 2 Ο > <2 21 > <222> <223> <2 2 Ο > <2 21 > <222> <223> <2 2 Ο > <2 21 > <222> <223> <2 2 Ο > <221> <222> <223> < 4 Ο Ο > <210 > <211 > <212> <213> <2 2 Ο > <221> <222> <223> <2 2 Ο > <2 21 > <222> <223> <2 2 Ο >

VARIANTE (1) · · · (8)

Xaa na posição 3 = (D)Trp VARIANTE (D · · · (8)

Xaa na posição 6 = 2Nal (2Nal = 2-naftilalamina)

VARIANTE (D . . . (8)

Xaa na posição 7 = Gly(C2) VARIANTE (D . . . (8)

Xaa na posição 8 = -NH2 ou -OH 13

Xaa Phe Xaa Lys Thr Xaa Xaa Xaa 1 5 14 8

PRT

Homo sapiens VARIANTE (D · · · (8)

Xaa na posição 3 = (D)Trp

VARIANTE (D · · · (8)

Xaa na posição 7 = Gly(S2) 58 <221> VARIANTE <222> (1) .. . (8) <223> Xaa na posição 8 = -NH2 ou -OH < 4 0 0 > 14

Phe Trp Xaa Lys Thr Phe Xaa Xaa 1 5

<210> 15 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> VARIANTE <222> (1) ... (9) <223> Xaa na posição 4 = (D)Trp <2 2 0 > <221> VARIANTE <222> (1) ... (9) <223> Xaa na posição 8 = Gly(S2) <220> <221> VARIANTE <222> (1) ... (9) <223> Xaa na posição 9 = -NH2 ou -OH < 4 0 0 > 15

Cys Phe Trp Xaa Lys Thr Phe Xaa Xaa 1 5

<210> 16 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> 59 <2 21 > <222> <223> <2 2 Ο > <2 21 > <2 2 2 > <223> <220> <2 21 > <222> <223> <2 2 Ο > <2 21 > <222> <223> < 4 Ο Ο > <210> <211 > <212 > <213> <2 2 Ο > <2 21 > <222> <223> <220> <2 21 > <2 2 2 > <223> <2 2 Ο > <2 21 >

VARIANTE (1) · · · (10)

Xaa na posição 1 = Phe(C3)

VARIANTE (D . . . (10)

Xaa na posição 4 = (D)Trp VARIANTE (D . . . (10)

Xaa na posição 9 = Phe(N3)

VARIANTE (D . . . (10)

Xaa na posição 10 = -NER ou -OH 16

Xaa Cys Phe Xaa Lys Thr Cys Phe Xaa Xaa 15 10 17 10

PRT

Homo sapiens

VARIANTE (D . . . (10)

Xaa na posição 1 = (D)Phe

VARIANTE (D . . . (10)

Xaa na posição 5 = (D)Trp VARIANTE 60 <222> (1) .. . (10) <223> Xaa na posição 9 = Gly(S2) <220> <221> VARIANTE <222> (1)...(10)

<223> Xaa na posição 10 = -NH2 ou -OH < 4 0 0 > 17

Xaa Cys Phe Trp Xaa Lys Thr Phe Xaa Xaa 15 10

<210> 18 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> VARIANTE <222> (1) ... (9) <223> Xaa na posição 1 = Dab (ácido diaminobutirico) <220> <221> VARIANTE <222> (1) ... (9) <223> Xaa na posição 4 = (D)Trp <220> <221> VARIANTE <222> (1) ... (9) <223> Xaa na posição 8 = Gly(C3) <220> <221> VARIANTE <222> (1) ... (9)

<223> Xaa na posição 9 = -NH2 ou -OH < 4 0 0 > 18 61

Xaa Phe Trp Xaa Lys Thr Phe Xaa Xaa 1 5 <210> 19 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> VARIANTE <222> (D . . . (7) <2 2 3> Xaa na posição 1 = Phe (N2) <220> <221> VARIANTE <222> (D · · · (7) <223> Xaa na posição 2 = (p-NH2) Phe <2 2 0 > <221> VARIANTE <222> (D · · · (7) <223> Xaa na posição 3 = (D)Trp <220> <221> VARIANTE <222> (D · · · (7) <223> Xaa na posição 6 = Gly (C2) <220> <221> VARIANTE <222> (D · · · (7) <223> Xaa na posição 7 = 2Nal (2Nal < 4 0 0 > 19 Xaa Xaa Xaa Lys Val Xaa Xaa 1 5 <210> 20 <211> 7 = 2-naftilalamina) (para-aminofenilalanina) 62

<212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> VARIANTE <222> (1) .. . (7) <223> Xaa na posição 1 = Phe(N2) <220> <221> VARIANTE <222> (1) .. . (7) <223> Xaa na posição 2 = (p-Cl)Phe (para-clorofenilalanina) <220> <221> VARIANTE <222> (1) .. . (7) <223> Xaa na posição 3 = (D)Trp <220> <221> VARIANTE <222> (1) ... (7) <223> Xaa na posição 6 = Gly(C2) <220> <221> VARIANTE <222> (1) .. . (7) <223> Xaa na posição 7 = 2Nal (2Nal = 2-naftilalamina) <400> 20

Xaa Xaa Xaa Lys Vai Xaa Xaa 1 5

<210> 21 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> VARIANTE <222> (1) . . . (7) 63 <2 2 3> <2 2 Ο > <2 21 > <222> <223> <2 2 Ο > <2 21 > <222> <223> <2 2 Ο > <2 21 > <222> <223> <220> <2 21 > <222> <223> < 4 Ο Ο > <210 > <211 > <212> <213> <2 2 Ο > <221> <222> <2 2 3> <2 2 Ο > <2 21 > <222> <223>

Xaa na posição 1 = Phe(N2) VARIANTE (D · · · (7)

Xaa na posição 2 = (p-F)Phe (para-fluorofenilalanina) VARIANTE (D · · · (7)

Xaa na posição 3 = (D)Trp VARIANTE (D · · · (7)

Xaa na posição 6 = Gly(C2) VARIANTE (D · · · (7)

Xaa na posição 7 = 2Nal (2Nal = 2-naftilalamina) 21

Xaa Xaa Xaa Lys Vai Xaa Xaa 1 5 22 7

PRT

Homo sapiens VARIANTE (D . . . (7)

Xaa na posição 1 = Phe(N2) VARIANTE (D · · · (7)

Xaa na posição 2 = (p-N02)Phe (para-nitrofenilalanina) 64 <2 2 Ο > <221> VARIANTE <222> (1) .. . (7) <223> Xaa na posição 3 = (D)Trp <220> <221> VARIANTE <222> (1) .. . (7) <223> Xaa na posição 6 = Gly(C2) <220> <221> VARIANTE <222> (1) .. . (7) <223> Xaa na posição 7 = 2Nal (2Nal = 2-naftilalamina) <400> 22

Xaa Xaa Xaa Lys Vai Xaa Xaa 1 5

<210> 23 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> VARIANTE <222> (1) .. . (7) <223> Xaa na posição 1 = Phe(N2) <220> <221> VARIANTE <222> (1) .. . (7) <223> Xaa na posição 2 = (p-Cl)Phe (para-clorofenilalanina) <2 2 0 > <221> VARIANTE <222> (1) .. . (7) <223> Xaa na posição 3 = (D)Trp <220> 65 <2 21 > <222> <223> < 4 Ο Ο > <210 > <211 > <212 > <213> <2 2 Ο > <2 21 > <222> <223> <2 2 Ο > <2 21 > <222> <223> <2 2 Ο > <221> <2 2 2 > <223> <220> <2 21 > <222> <223> <2 2 Ο > <2 21 > <222> <223> <2 2 Ο > <2 21 > VARIANTE (1) · · · (7)

Xaa na posição 6 = Gly(C3) 23

Xaa Xaa Xaa Lys Gly Xaa Thr 1 5 24 8

PRT

Homo sapiens VARIANTE (D · · · (8)

Xaa na posição 1 = 2Nal (2Nal = 2-naftilalamina)

VARIANTE (D · · · (8)

Xaa na posição 2 = Gly-(N3)

VARIANTE (D . . . (8)

Xaa na posição 3 = ChxGly (ciclo-hexilglicina)

VARIANTE (D . . . (8)

Xaa na posição 4 = (D)Trp

VARIANTE (D . . . (8)

Xaa na posição 6 = (D)ChxGly

VARIANTE 66 <222> (1) . . . (8) <223> Xaa na posição 7 = Gly(C2) <400> 24

Xaa Xaa Xaa Xaa Lys Xaa Xaa Thr 1 5

<210> 25 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> VARIANTE <222> (1) .. . (7) <223> Xaa na posição 1 = Phe(N2) <220> <221> VARIANTE <222> (1) . . . (7) <223> Xaa na posição 3 = (D)Trp <220> <221> VARIANTE <222> (1) .. . (7) <223> Xaa na posição 7 = Gly(C2) <400> 25

Xaa Tyr Xaa Lys Vai Ile Xaa 1 5

<210> 26 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> VARIANTE 67 <2 2 2 > <223> <2 2 Ο > <2 21 > <222> <2 2 3> <2 2 Ο > <221> <222> <223> <2 2 Ο > <2 21 > <222> <223> < 4 Ο Ο > <210 > <211 > <212 > <213> <2 2 Ο > <2 21 > <222> <223> <2 2 Ο > <2 21 > <222> <2 2 3> <2 2 Ο > <221> <222> (1) . . . (7)

Xaa na posição 1 = Phe(N2) VARIANTE (D . . . (7)

Xaa na posição 2 = (p-NH2)Phe (para-aminofenilalanina) VARIANTE (D · · · (7)

Xaa na posição 3 = (D)Trp VARIANTE (D · · · (7)

Xaa na posição 7 = Gly(C2) 26

Xaa Xaa Xaa Lys Vai Vai Xaa 1 5 27 7

PRT

Homo sapiens VARIANTE (D . . . (7)

Xaa na posição 1 = Phe(N2) VARIANTE (D . . . (7)

Xaa na posição 2 = (p-Cl)Phe (para-clorofenilalanina) VARIANTE (D · · · (7) 68 <223> Xaa na posição 3 = (D)Trp <220> <221> VARIANTE <222> (1) .. . (7) <223> Xaa na posição 7 = Gly(C2) <400> 27

Xaa Xaa Xaa Lys Vai Ala Xaa 1 5

<210> 28 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> VARIANTE <222> (1) .. . (7) <223> Xaa na posição 1 = Phe(N2) <220> <221> VARIANTE <222> (1) .. . (7) <223> Xaa na posição 2 = (p-N02)Phe (para-nitrofenilalanina) <220> <221> VARIANTE <222> (1) .. . (7) <223> Xaa na posição 3 = (D)Trp <220> <221> VARIANTE <222> (1) .. . (7) <223> Xaa na posição 7 = Gly(C2) <400> 28

Xaa Xaa Xaa Lys Vai Vai Xaa 1 5 69

<210> 29 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <2 2 0 > <221> VARIANTE <222> (1) .. . (7) <223> Xaa na posição 3 = (D)Trp <220> <221> VARIANTE <222> (1) .. . (7) <223> Xaa na posição 7 = Gly(C3) <400> 29

Phe Trp Xaa Lys Ala Phe Xaa 1 5

<210> 30 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> VARIANTE <222> (1) .. . (7) <223> Xaa na posição 3 = (D)Trp <220> <221> VARIANTE <222> (1) .. . (7) <223> Xaa na posição 5 = Abu (ácido 2-aminobutírico) <220> <221> VARIANTE <222> (1) .. . (7) <223> Xaa na posição 7 = Gly(C3) 70 <4 Ο Ο> 30

Phe Trp Xaa Lys Xaa Phe Xaa 1 5

<210> 31 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> VARIANTE <222> (1) .. . (7) <223> Xaa na posição 3 = (D)Trp <220> <221> VARIANTE <222> (1) . . . (7) <223> Xaa na posição 5 = Nle (Norleucina) <220> <221> VARIANTE <222> (1) .. . (7) <223> Xaa na posição 7 = Gly(C3) < 4 0 0 > 31

Phe Trp Xaa Lys Xaa Phe Xaa 1 5

<210> 32 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> VARIANTE <222> (1) .. . (7) <223> Xaa na posição 3 = (D)Trp 71 <2 2 Ο > <221> VARIANTE <222> (1) .. . (7) <223> Xaa na posição 7 = Gly(C3) <400> 32

Phe Trp Xaa Lys Vai Phe xaa 1 5

<210> 33 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> VARIANTE <222> (1) ... (7) <223> Xaa na posição 3 = (D)Trp <220> <221> VARIANTE <222> (1) .. . (7) <223> Xaa na posição 7 = Gly(C3) <400> 33

Phe Trp Xaa Lys Thr Phe Xaa 1 5

<210> 34 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <2 2 0 > <221> VARIANTE <222> (1) .. . (7) <223> Xaa na posição 3 = (D)Trp <220> 72 <221> VARIANTE <222> (1) .. . (7) <223> Xaa na posição 6 = (p-NH2)Phe (para-aminofenilalanina) <220> <221> VARIANTE <222> (1) . . . (7) <223> Xaa na posição 7 = Gly(C3) <400> 34

Phe Trp Xaa Lys Thr Xaa Xaa 1 5

<210> 35 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens 220> <221> VARIANTE <222> (1) .. . (7) <223> Xaa na posição 3 = (D)Trp <220> <221> VARIANTE <222> (1) .. . (7) <223> Xaa na posição 6 = (p-Cl)Phe (para-clorofenilalanina) <220> <221> VARIANTE <222> (1) .. . (7) <223> Xaa na posição 7 = Gly(C3) <400> 35

Phe Trp Xaa Lys Thr Xaa Xaa 1 5 <210> 36 73

<211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> VARIANTE <222> (1) . . . (7) <223> Xaa na posição 3 = (D)Trp <220> <221> VARIANTE <222> (1) .. . (7) <223> Xaa na posição 6 = (p-F)Phe (para-fluorofenilalanina) <220> <221> VARIANTE <222> (1) .. . (7) <223> Xaa na posição 7 = Gly(C3) <400> 36

Phe Trp Xaa Lys Thr Xaa Xaa 1 5

<210> 37 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> VARIANTE <222> (1) .. . (7) <223> Xaa na posição 3 = (D)Trp <220> <221> VARIANTE <222> (1) .. . (7) <223> Xaa na posição 6 = (p-N02) Phe (para-nitrofenilalanina) <220>

<221> VARIANTE 74

<2 2 2 > (1) . . . (7) <223> Xaa na posição 7 = Gly(C3) < 4 0 0 > 37 Phe Trp Xaa Lys Thr Xaa Xaa 1 5 <210 > 38 <211 > 7 <212 > PRT <213> Homo sapiens <2 2 0 > <2 21 > VARIANTE <222> (D . . . (7) <223> Xaa na posição 3 = (D)Trp <2 2 0 > <2 21 > VARIANTE <222> (D . . . (7) <223> Xaa na posição 7 = Gly(C3) < 4 0 0 > 38 Phe Trp Xaa Lys Thr Tyr Xaa 1 5 <210 > 39 <211> 9 Λ c\] \—1 c\] V PRT <213> Homo sapiens <2 2 0 > <2 21 > VARIANTE <222> (D . . . (9) <223> Xaa na posição 1 = b-Ala <2 2 0 > <221> VARIANTE 75 <2 2 2 > (1) . . . (9) <223> Xaa na posição 2 = (p-Cl)Phe (para-clorofenilalanina) <2 2 0 > <2 21 > VARIANTE <222> (D . . . (9) <2 2 3> Xaa na posição 4 = (D)Trp <2 2 0 > <221> VARIANTE <222> (D · · · (9) <223> Xaa na posição 7 = ChxGly (ciclo-hexilglicina) <2 2 0 > <2 21 > VARIANTE <222> (D · · · (9) <223> Xaa na posição 8 = Gly(C3) <2 2 0 > <2 21 > VARIANTE <222> (D · · · (9) <223> Xaa na posição 9 = (D)Phe <400> 39 xaa Xaa Trp Xaa Lys Thr xaa xaa xaa 1 5 <210 > 40 <211 > 9 <212 > PRT <213> Homo sapiens <2 2 0 > <2 21 > VARIANTE <222> (D · · · (9) <223> Xaa na posição 1 = b-Ala <2 2 0 > <2 21 > VARIANTE <222> (D · · · (9) 76 <223> Xaa na posição 2 = (p-F)Phe (para-fluorofenilalanina) <220> <221> VARIANTE <222> (1) ... (9) <223> Xaa na posição 4 = (D)Trp <2 2 0 > <221> VARIANTE <222> (1) ... (9) <223> Xaa na posição 7 = ChxGly (ciclo-hexilglicina) <220> <221> VARIANTE <222> (1) ... (9) <223> Xaa = Xaa na posição 8 = Gly(C3) <220> <221> VARIANTE <222> (1) ... (9) <223> Xaa = Xaa na posição 9 = (D)Phe <400> 40

Xaa Xaa Trp Xaa Lys Thr Xaa Xaa Xaa 1 5

<210> 41 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> VARIANTE <222> (1) ... (9) <223> Xaa na posição 1 = b-Ala <2 2 0 > <221> VARIANTE <222> (1) ... (9) <223> Xaa na posição 4 = (D)Trp 77 <2 2 Ο > <221> VARIANTE <222> (1) ... (9) <223> Xaa na posição 7 = ChxGly (ciclo-hexilglicina) <220> <221> VARIANTE <222> (1) ... (9) <223> Xaa na posição 8 = Gly(C3) <220> <221> VARIANTE <222> (1) ... (9) <223> Xaa na posição 9 = (D)Phe < 4 0 0 > 41

Xaa Val Trp Xaa Lys Thr Xaa Xaa Xaa 1 5

<210> 42 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> VARIANTE <222> (1) ... (9) <223> Xaa na posição 1 = b-Ala <220> <221> VARIANTE <222> (1) . . . (9) <223> Xaa na posição 4 = (D)Trp <220> <221> VARIANTE <222> (1) ... (9) <223> Xaa na posição 8 = Gly(C3) <220> 78 <221> VARIANTE <222> (1) ... (9) <223> Xaa na posição 9 = (D)Phe <400> 42

Xaa Phe Tyr Xaa Lys Thr Vai Xaa Xaa 1 5

<210> 43 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> VARIANTE <222> (1) ... (9) <223> Xaa na posição 1 = b-Ala <220> <221> VARIANTE <222> (1) ... (9) <223> Xaa na posição 3 = (p-N02)Phe (para-nitrofenilalanina) <220> <221> VARIANTE <222> (1) ... (9) <223> Xaa na posição 4 = (D)Trp <220> <221> VARIANTE <222> (1) ... (9) <223> Xaa na posição 8 = Gly(C3) <2 2 0 > <221> VARIANTE <222> (1) ... (9) <223> Xaa na posição 9 = (D)Phe <400> 43 79

Xaa Phe Xaa Xaa Lys Thr Vai Xaa Xaa 1 5

<210> 44 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> VARIANTE <222> (1) . . . (9) <223> Xaa na posição 1 = b-Ala <220> <221> VARIANTE <222> (1) ... (9) <223> Xaa na posição 3 = (p-Cl)Phe (para-clorofenilalanina) <220> <221> VARIANTE <222> (1) ... (9) <223> Xaa na posição 4 = (D)Trp <220> <221> VARIANTE <222> (1) ... (9) <223> Xaa na posição 8 = GlyC3 <2 2 0 > <221> VARIANTE <222> (1) ... (9) <223> Xaa na posição 9 = (D)Phe <400> 44

Xaa Phe Xaa Xaa Lys Thr Vai Xaa Xaa 1 5

<210> 45 <211> 9 <212> PRT 80 <213> Homo sapiens <220> <221> VARIANTE <222> (1) ... (9) <223> Xaa na posição 1 = b-Ala <2 2 0 > <221> VARIANTE <222> (1) ... (9) <223> Xaa na posição 3 = (p-F)Phe (para-fluorofenilalanina) <220> <221> VARIANTE <222> (1) ... (9) <223> Xaa na posição 4 = (D)Trp <220> <221> VARIANTE <222> (1) ... (9) <223> Xaa na posição 8 = GlyC3 <220> <221> VARIANTE <222> (1) ... (9) <223> Xaa na posição 9 = (D)Phe <400> 45

Xaa Phe Xaa Xaa Lys Thr Vai Xaa Xaa 1 5

<210> 46 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> VARIANTE <222> (1) ... (9) <223> Xaa na posição 1 = b-Ala 81 <2 2 Ο > <2 21 > <222> <223> <2 2 Ο > <2 21 > <222> <223> <2 2 Ο > <2 21 > <222> <223> <2 2 Ο > <221> <222> <223> < 4 Ο Ο > <210 > <211 > <212 > <213> <2 2 Ο > <2 21 > <222> <2 2 3> <2 2 Ο > <2 21 > <222> <223> <2 2 Ο > VARIANTE (1) · · · (9)

Xaa na posição 3 = (p-NH2)Phe (para-aminofenilalanina) VARIANTE (D · · · (9)

Xaa na posição 4 = (D)Trp VARIANTE (D . . . (9)

Xaa na posição 8 = GlyC3 VARIANTE (D . . . (9)

Xaa na posição 9 = (D)Phe 46

Xaa Phe Xaa Xaa Lys Thr Vai Xaa Xaa 1 5 47 9

PRT

Homo sapiens VARIANTE (D . . . (9)

Xaa na posição 1 = b-Ala VARIANTE (D . . . (9)

Xaa na posição 3 = ChxGly (ciclo-hexilglicina) 82

<2 21 > VARIANTE <222> (1) · · · (9) <223> Xaa na posição 4 = (D)Trp <2 2 0 > <2 21 > VARIANTE <2 2 2 > (D . . . (9) <223> Xaa na posição 8 = GlyC3 <220> <2 21 > VARIANTE <222> (D . . . (9) <223> Xaa na posição 9 = (D)Phe < 4 0 0 > 47 Xaa Phe Xaa Xaa Lys Thr Vai Xaa Xaa 1 5 <210 > 48 <211 > 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <2 21 > VARIANTE <222> (D · · · (7) <223> Xaa na posição 4 = (D)Trp <2 2 0 > <2 21 > VARIANTE <222> (D . . . (7) <223> Xaa na posição 5 = (D)Lys <220> <2 21 > VARIANTE <2 2 2 > (D . . . (7) <223> Xaa na posição 6 = Phe (C2) <2 2 0 > <2 21 > VARIANTE 83 <2 2 2 > (D . . . (7) <223> Xaa na posição 7 = -NH2 ou < 4 0 0 > 48 Phe Phe Phe Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 <210> 49 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> VARIANTE <222> (D · · · (7) <223> Xaa na posição 1 = Phe(Cl) <220> <221> VARIANTE <2 2 2 > (D . . . (7) <223> Xaa na posição 4 = (D)Trp <220> <221> VARIANTE <222> (D . . . (7) <223> Xaa na posição 6 = Phe(N2) <220> <221> VARIANTE <222> (D . . . (7) <2 2 3> Xaa na posição 7 = -NH2 ou < 4 0 0 > 49

Xaa Phe Phe Xaa Lys Xaa Xaa 1 5 <210> 50 <211> 7 84 A C\] \—1 C\] V PRT <213> Homo sapiens <220> <221> VARIANTE <222> (D . . . (7) <2 2 3> Xaa na posição 1 = Phe (Cl) <220> <221> VARIANTE <222> (D · · · (7) <223> Xaa na posição 4 = (D)Trp <220> <221> VARIANTE <222> (D · · · (7) <223> Xaa na posição 5 = (D)Lys <220> <221> VARIANTE <222> (D · · · (7) <223> Xaa na posição 6 = Phe(N2) <220> <221> VARIANTE <222> (D · · · (7) <223> Xaa na posição 7 = -NH2 ou < 4 0 0 > 50

Xaa Phe Phe Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5

<210> 51 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <220>

<221> VARIANTE <222> (1) .. . (8) 85 <223> Xaa na posição 1 = <220> <221> VARIANTE <222> (1) .. . (8) <223> Xaa na posição 3 = <2 2 0 > <221> VARIANTE <222> (1) ... (8) <223> Xaa na posição 6 = <220> <221> VARIANTE <222> (1) .. . (8) <223> Xaa na posição 8 = <400> 51

Xaa Tyr Xaa Lys Vai 1 5

<210> 52 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <2 2 0 > <221> VARIANTE <222> (1) .. . (8) <223> Xaa na posição 1 = <220> <221> VARIANTE <222> (1) .. . (8) <223> Xaa na posição 3 = <220> <221> VARIANTE <222> (1) .. . (8) <223> Xaa na posição 6 =

Phe (N2) (D)2Nal

Gly (C2)

-NH2 ou -OH

Xaa Thr Xaa

Phe (N2) (D)Trp

Gly (C2) 86 <2 2 0 > <221> VARIANTE <222> (D · · · (8) <223> Xaa na posição 7 = 2Nal (2Nal <220> <221> VARIANTE <222> (D · · · (8) <223> Xaa na posição 8 = -NH2 ou -OH < 4 0 0 > 52 Xaa Tyr Xaa Lys Val Xaa Xaa Xaa 1 5 <210> 53 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <2 2 0 > <221> VARIANTE <222> (D · · · (8) <223> Xaa na posição 1 = Phe (N2) <220> <221> VARIANTE <222> (D · · · (8) <223> Xaa na posição 3 = (D)Trp <220> <221> VARIANTE <222> (D · · · (8) <223> Xaa na posição 7 = Gly(C2) <220> <221> VARIANTE <222> (D . . . (8) <223> Xaa na posição 8 = -NH2 ou -OH <400> 53 2-naftilalamina) 87

Xaa Tyr Xaa Lys Vai Vai Xaa Xaa 1 5 <210> 54 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> VARIANTE <222> (D . . . (8) <223> Xaa na posição 1 = Phe (N2) <220> <221> VARIANTE <222> (D . . . (8) <223> Xaa na posição 3 = (D)Trp <220> <221> VARIANTE <222> (D · · · (8) <223> Xaa na posição 6 = 2Nal (2Nal <2 2 0 > <221> VARIANTE <222> (D · · · (8) <223> Xaa na posição 7 = Gly(C2) <220> <221> VARIANTE <222> (D · · · (8) <223> Xaa na posição 8 = -NH2 ou -OH < 4 0 0 > 54 Xaa Tyr Xaa Lys Ser Xaa Xaa Xaa 1 5 <210> 55 <211> 8 2-naftilalamina) 88 A C\] \—1 C\] V PRT <213> Homo sapiens <220> <221> VARIANTE <222> (D . . . (8) <2 2 3> Xaa na posição 1 = Phe (N2) <220> <221> VARIANTE <222> (D · · · (8) <223> Xaa na posição 3 = (D)Trp <220> <221> VARIANTE <222> (D · · · (8) <223> Xaa na posição 6 = 2Nal (2Nal <220> <221> VARIANTE <222> (D · · · (8) <223> Xaa na posição 7 = Gly(C2) <220> <221> VARIANTE <222> (D · · · (8) <223> Xaa na posição 8 = -NH2 ou -OH < 4 0 0 > 55 Xaa Phe Xaa Lys Thr Xaa Xaa Xaa 1 5 Λ o T-1 Cs] V 56 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> VARIANTE <222> (D · · · (8) 2-naftilalamina) 89 <2 2 3> Xaa na posição 3 = (D)Trp <220> <221> VARIANTE <222> (D · · · (8) <223> Xaa na posição 7 = Gly(C3) <2 2 0 > <221> VARIANTE <222> (D · · · (8) <223> Xaa na posição 8 = -NH2 ou -OH < 4 0 0 > 56 Phe Trp Xaa Lys Thr Phe Xaa Xaa 1 5 <210> 57 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> VARIANTE <222> (D · · · (9) <223> Xaa na posição 4 = (D)Trp <2 2 0 > <221> VARIANTE <222> (D · · · (9) <223> Xaa na posição 8 = Gly (S2) <220> <221> VARIANTE <222> (D · · · (9) <223> Xaa na posição 9 = -NH2 ou -OH < 4 0 0 > 57 Cys Phe Trp Xaa Lys Thr Phe Xaa Xaa 1 5 90

<210> 58 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <2 2 0> <221> VARIANTE <222> (1)...(10) <223> Xaa na posição 1 = Phe(C3) <220> <221> VARIANTE <222> (1) . . . (10) <223> Xaa na posição 4 = (D)Trp <220> <221> VARIANTE <222> (1) .. . (10) <223> Xaa na posição 9 = Phe(N3) <220> <221> VARIANTE <222> (1) ... (10) <223> Xaa na posição 10 = -NH2 ou -OH <400> 58

Xaa Cys Phe xaa Lys Thr Cys Phe Xaa Xaa 15 10

<210> 59 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> VARIANTE <222> (1) .. . (10) <223> Xaa na posição 1 = (D)Phe 91 <2 2 Ο >

<221> VARIANTE <222> (1)...(10) <223> Xaa na posição 5 = (D)Trp <220>

<221> VARIANTE <222> (1)...(10) <223> Xaa na posição 9 = Gly(S2) <220>

<221> VARIANTE <222> (1)...(10) <223> Xaa na posição 10 = -NH2 ou -OH <400> 59

Xaa Cys Phe Trp Xaa Lys Thr Phe Xaa xaa 15 10

<210> 60 <211> 6 <212> PRT <213> Homo sapiens <220>

<221> VARIANTE <222> (1) ... (6) <223> Xaa na posição 1 = NmeAla (N-metilalanina) <220> <221> VARIANTE <222> (1) . . . (6) <223> Xaa na posição 3 = (D)Trp <220>

<221> VARIANTE <222> (1) ... (6) <223> Xaa na posição 6 = Phe(C3) <400> 60 92

Xaa Tyr Xaa Lys Vai Xaa 1 5 <210> 61 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> VARIANTE <222> (D · · · (8) <223> Xaa na posição 1 = = (D)Phe <220> <221> VARIANTE <222> (D · · · (8) <223> Xaa na posição 3 = = Phe(N2) <220> <221> VARIANTE <222> (D . . . (8) <223> Xaa na posição 4 = = (D)Trp <220> <221> VARIANTE <222> (D . . . (8) <223> Xaa na posição 7 = = Phe (C3) < 4 0 0 > 61 Xaa Phe Xaa Xaa Lys Thr Xaa Thr 1 5 <210> 62 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> 93

<2 21 > VARIANTE <222> (1) · · · (8) <223> Xaa na posição 1 = (D)Phe (N2) <2 2 0 > <2 21 > VARIANTE <2 2 2 > (D . . . (8) <223> Xaa na posição 3 = Phe(C3) <220> <2 21 > VARIANTE <222> (D . . . (8) <223> Xaa na posição 4 = (D)Trp < 4 0 0 > 62 Xaa Phe Xaa Xaa Lys Thr Phe Thr 1 5 <210> 63 <211 > 9 <212 > PRT <213> Homo sapiens <2 2 0 > <2 21 > VARIANTE <222> (D . . . (9) <223> Xaa na posição 2 = (D)Phe <2 2 0 > <2 21 > VARIANTE <222> (D . . . (9) <223> Xaa na posição 3 = Ala- (N3) <2 2 0 > <2 21 > VARIANTE <222> (D . . . (9) <2 2 3> Xaa na posição 5 = (D)Trp <2 2 0 > <2 21 > VARIANTE 94 <222> (1) . . . (9) <223> Xaa na posição 8 = Ala-(C3) <400> 63

His Xaa Xaa Phe Xaa Lys Phe Xaa Thr 1 5

<210> 64 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> VARIANTE <222> (1) .. . (8) <223> Xaa na posição 1 = (D)Nal <2 2 0> <221> VARIANTE <222> (1) .. . (8) <223> Xaa na posição 2 = Gly(S2) <220> <221> VARIANTE <222> (1) . . . (8) <223> Xaa na posição 4 = (D)Trp <400> 64

Xaa Xaa Tyr Xaa Lys Vai Cys Thr 1 5

<210> 65 <211> 6 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> VARIANTE 95 <2 2 2 > <223> <2 2 Ο > <2 21 > <222> <2 2 3> <2 2 Ο > <221> <222> <223> <2 2 Ο > <2 21 > <222> <223> < 4 Ο Ο > <210 > <211 > <212> <213> <2 2 Ο > <221> <222> <223> <2 2 Ο > <2 21 > <222> <223> < 4 Ο Ο > (1) . . . (6)

Xaa na posição 1 = Phe(Cl)

VARIANTE (D . . . (6)

Xaa na posição 3 = (D)Trp VARIANTE (D · · · (6)

Xaa na posição 5 = (D)Thr VARIANTE (D · · · (6)

Xaa na posição 6 = Phe(N2) 65

Xaa Phe Xaa Lys Xaa Xaa 1 5 66 8

PRT

Homo sapiens VARIANTE (D · · · (8)

Xaa na posição 4 = (D)Trp

VARIANTE (D · · · (8)

Xaa na posição 7 = Phe(C3) 66 96

Phe Phe His Xaa Lys Thr Xaa Thr 1 5

<210> 67 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> VARIANTE <222> (1) .. . (8) <223> Xaa na posição 4 = (D)Trp <220> <221> VARIANTE <222> (1) .. . (8) <223> Xaa na posição 7 = Phe(C3) <400> 67

Ala Phe His Xaa Lys Thr Xaa Thr 1 5

<210> 68 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <2 2 0 > <221> VARIANTE <222> (1) .. . (8) <223> Xaa na posição 1 = (D)Ala <220> <221> VARIANTE <222> (1) .. . (8) <223> Xaa na posição 4 = (D)Trp <220> <221> VARIANTE <222> (1) .. . (8) 97 <223> Xaa na posição 7 = Phe(C3) <400> 68

Xaa Phe His Xaa Lys Thr Xaa Thr 1 5

<210> 69 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> VARIANTE <222> (1) .. . (8) <223> Xaa na posição 1 = (D)Phe <220> <221> VARIANTE <222> (1) .. . (8) <223> Xaa na posição 4 = (D)Trp <220> <221> VARIANTE <222> (1) .. . (8) <223> Xaa na posição 7 = Phe(C3) <400> 69

Xaa Phe His Xaa Lys Thr Xaa Thr 1 5 <210> 70 <211> 8 <212> PRT A co T-1 Cs] V Homo sapiens <220> <221> VARIANTE <222> (D .. . · (8) 98 <223> Xaa na posição 1 = Aib (ácido 2-amino-isobutírico) <220> <221> VARIANTE <222> (1) .. . (8) <223> Xaa na posição 4 = (D)Trp <2 2 0 > <221> VARIANTE <222> (1) ... (8) <223> Xaa na posição 7 = Phe(C3) <400> 70

Xaa Phe His Xaa Lys Thr Xaa Thr 1 5

<210> 71 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> VARIANTE <222> (1) .. . (8) <223> Xaa na posição 1 = (D)Phe <220> <221> VARIANTE <222> (1) . . . (8) <223> Xaa na posição 2 = Orn (Ornitina) <220> <221> VARIANTE <222> (1) .. . (8) <223> Xaa na posição 4 = (D)Trp <220> <221> VARIANTE <222> (1) .. . (8) <223> Xaa na posição 7 = Phe(C3) 99 < 4 Ο Ο > 71

Xaa Xaa Phe Xaa Lys Thr Xaa Thr 1 5 <210> 72 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> VARIANTE <222> (D · · · (8) <223> Xaa na posição 1 = (D)Phe <2 2 0 > <221> VARIANTE <222> (D · · · (8) <223> Xaa na posição 2 = Phe (C3) <220> <221> VARIANTE <222> (D · · · (8) <223> Xaa na posição 4 = (D)Trp <220> <221> VARIANTE <222> (D . . . (8) <223> Xaa na posição 7 = DAP < 4 0 0 > 72 Xaa Xaa Phe Xaa Lys Thr Xaa Thr 1 5

<210> 73 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens 100 <2 2 Ο > <221> VARIANTE <222> (1) .. . (8) <223> Xaa na posição 1 = (D)Phe <220> <221> VARIANTE <222> (1) .. . (8) <223> Xaa na posição 2 = Phe(C3) <220> <221> VARIANTE <222> (1) .. . (8) <223> Xaa na posição 4 = (D)Trp <400> 73

Xaa Xaa Phe Xaa Lys Thr Lys Thr l 5

<210> 74 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> VARIANTE <222> (1) .. . (7) <223> Xaa na posição 1 = (D)Ph3 <220> <221> VARIANTE <222> (1) .. . (7) <223> Xaa na posição 2 = Gly(Sl) <220> <221> VARIANTE <222> (1) .. . (7) <223> Xaa na posição 3 = (D)Trp <400> 74 101

Xaa Xaa Xaa Lys Thr Cys Thr 1 5 <210> 75 <211> 6 A C\] \—1 C\] V PRT <213> Homo sapiens <220> <221> VARIANTE <222> (D . . . (6) <2 2 3> Xaa na posição 1 = Phe (Cl) <220> <221> VARIANTE <222> (D . . . (6) <223> Xaa na posição 4 = (D)Trp <220> <221> VARIANTE <222> (D · · · (6) <223> Xaa na posição 5 = (D)Lys <2 2 0 > <221> VARIANTE <222> (D · · · (6) <223> Xaa na posição 6 = Phe (N2) < 4 0 0 > 75

Xaa Phe Leu Xaa Xaa Xaa 1 5

<210> 76 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> 102 <221> VARIANTE <222> (D · · · (8) <223> Xaa na posição 2 = Ala-(C 3) <220> <221> VARIANTE <2 2 2 > (D . . . (8) <223> Xaa na posição 4 = (D)Trp <220> <221> VARIANTE <222> (D . . . (8) <223> Xaa na posição 7 = Ala-(C3) < 4 0 0 > 76 His Xaa Phe Xaa Lys Phe Xaa Thr 1 5 <210> 77 <211> 6 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> VARIANTE <222> (D . . . (6) <223> Xaa na posição 3 = (D)Trp <220> <221> VARIANTE <222> (D . . . (6) <2 2 3> Xaa na posição 6 = Phe (C2) < 4 0 0 > 77

Phe Phe Xaa Lys Thr Xaa 1 5 <210> 78 103

<211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> VARIANTE <222> (1) . . . (5) <223> Xaa na posição 2 = (D)Trp <220> <221> VARIANTE <222> (1) ... (5) <223> Xaa na posição 5 = Phe(C2) <400> 78

Phe Xaa Lys Thr Xaa 1 5

<210> 79 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> VARIANTE <222> (1) ... (5) <223> Xaa na posição 2 = (D)Trp <220> <221> VARIANTE <222> (1) ... (5) <223> Xaa na posição 3 = (D)Lys <220> <221> VARIANTE <222> (1) ... (5) <223> Xaa na posição 5 = Phe(C2) <400> 79 104

Phe Xaa Xaa Thr Xaa 1 5

<210> 80 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> VARIANTE <222> (1) . . . (5) <223> Xaa na posição 1 = Ala-(Cl) <220> <221> VARIANTE <222> (1) .. . (5) <223> Xaa na posição 2 = (D)Trp <220> <221> VARIANTE <222> (1) ... (5) <223> Xaa na posição 4 = Ala-(N2) <400> 80

Xaa Xaa Lys Xaa Phe 1 5

<210> 81 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> VARIANTE <222> (1) ... (5) <223> Xaa na posição 1 = Ala-(Cl) <220>

<221> VARIANTE 105

<2 2 2 > (1) . . . (5) <223> <22 0> Xaa na posição 2 = (D)Trp <221> VARIANTE <222> (1) . . . (5) <2 2 3> Xaa na posição 5 = Phe(N2) < 4 0 0 > 81 Xaa Xaa Lys Thr Xaa 1 5 Λ ο Τ-1 Os] V 82 <211 > 5 <212 > PRT <213> <2 2 0> Homo sapiens <221> VARIANTE <222> (D . · · (5) <223> <220> Xaa na posição 1 = Ala-(Cl) Λ \—1 C\] C\] V VARIANTE <222> (D . · · (5) <223> <2 2 0 > Xaa na posição 2 = (D)Trp Λ \—1 CM CM V VARIANTE <222> (D . . . (5) <223> Xaa na posição 5 = Ala-(N2) < 4 0 0 > 82 Xaa Xaa Lys Thr Xaa 1 5 <210 > 83 <211 > 6 Λ Ον] \—1 Ον] V PRT 106 <213> Homo sapiens <220> <221> VARIANTE <222> (1) ... (6) <223> Xaa na posição 1 = <2 2 0 > <221> VARIANTE <222> (1) .. . (6) <223> Xaa na posição 3 = <220> <221> VARIANTE <222> (1) ... (6) <223> Xaa na posição 5 = <400> 83

Xaa Phe Xaa 1

<210> 84 <211> 6 <212> PRT <213> Homo sapiens <2 2 0> <221> VARIANTE <222> (1) ... (6) <223> Xaa na posição 1 = <220> <221> VARIANTE <222> (1) .. . (6) <223> Xaa na posição 3 = <220> <221> VARIANTE <222> (1) ... (6) <223> Xaa na posição 5 =

Ala- (Cl) (D)Trp

Ala- (N2)

Lys Thr Xaa 5

Ala- (Cl) (D)Trp

Phe (N2) 107 < 4 Ο Ο > 84

Xaa Tyr Xaa Lys Vai Xaa 1 5

<210> 85 <211> 6 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> VARIANTE <222> (1) ... (6) <223> Xaa na posição 3 = (D)Trp <220> <221> VARIANTE <222> (1) ... (6) <223> Xaa na posição 4 = (D)Lys <2 2 0 > <221> VARIANTE <222> (1) ... (6) <223> Xaa na posição 6 = Ala-(N2) <400> 85

Ala Phe Xaa Xaa Thr Xaa 1 5

<210> 86 <211> 6 <212> PRT <213> Homo sapiens <2 2 0 > <221> VARIANTE <222> (1) ... (6) <223> Xaa na posição 1 = (D)Phe <220> 108 <2 21 > VARIANTE <222> (1) · · · (6) <223> Xaa na posição 2 = Ala- (Cl) <2 2 0 > <2 21 > VARIANTE <2 2 2 > (D . . . (6) <223> Xaa na posição 3 = (D)Trp <220> <2 21 > VARIANTE <222> (D . . . (6) <223> Xaa na posição 6 = Ala- (N2) < 4 0 0 > 86 Xaa Xaa Phe Xaa Lys Xaa 1 5 <210 > 87 <211> 5 <212 > PRT <213> Homo sapiens <2 2 0 > <2 21 > VARIANTE <222> (D · · · (5) <223> Xaa na posição 2 = (D)Trp <2 2 0 > <2 21 > VARIANTE <222> (D · · · (5) <223> Xaa na posição 5 = Ala- (C2) <400> 87 Ala Xaa Lys Thr Xaa 1 5 <210 > 88 109 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> A \—1 CM CN] V VARIANTE <2 2 2 > (D . . . (5) <223> Xaa na posição 1 = Ala-(S2) <220> <221> VARIANTE <222> (D . . . (5) <223> Xaa na posição 2 = (D)Trp < 4 0 0 > 88 Xaa Xaa Lys Thr Cys 1 5 <210> 89 <211> 6 A C\] \—1 CN] V PRT <213> Homo sapiens <220> <221> VARIANTE <222> (D . . . (6) <2 2 3> Xaa na posição 1 = Ala-(S2) <220> <221> VARIANTE <222> (D . . . (6) <223> Xaa na posição 2 = (D)Trp < 4 0 0 > 89

Xaa Xaa Lys Thr Cys Thr 1 5 <210> 90 <211> 5 110

<212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> VARIANTE <222> (1) ... (5) <223> Xaa na posição 1 = Ala-(S2) <220> <221> VARIANTE <222> (1) ... (5) <223> Xaa na posição 3 = (D)Trp <400> 90

Xaa Phe Xaa Lys Cys 1 5

<210> 91 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> VARIANTE <222> (1) .. . (7) <223> Xaa na posição 1 = Ala-(S2) <220> <221> VARIANTE <222> (1) .. . (7) <223> Xaa na posição 3 = (D)Trp <400> 91

Xaa Phe Xaa Lys Thr Cys Thr 1 5 <210> 92 <211> 7 111 <212 > <213> <2 2 Ο > <2 21 > <222> <2 2 3> <2 2 Ο > <221> <222> <223> < 4 Ο Ο > <210 > <211 > <212 > <213> <2 2 Ο > <2 21 > <222> <223> <2 2 Ο > <221> <2 2 2 > <223> <400>

PRT

Homo sapiens

VARIANTE (D . . . (7)

Xaa na posição 1 = Gly(Sl)

VARIANTE (D · · · (7)

Xaa na posição 3 = (D)Trp 92

Xaa Phe Xaa Lys Thr Cys Thr 1 5 93 6

PRT

Homo sapiens VARIANTE (D · · · (6)

Xaa na posição 1 = Gly(Sl)

VARIANTE (D . . . (6)

Xaa na posição 2 = (D)Trp 93

Xaa Xaa Lys Thr Cys Thr 1 5 <210 > <211 > 112 94 7

<212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> VARIANTE <222> (1) . . . (7) <223> Xaa na posição 1 = Phe(S4) <220> <221> VARIANTE <222> (1) .. . (7) <223> Xaa na posição 3 = (D)Trp <400> 94

Xaa Tyr Xaa Lys Vai Cys Thr 1 5

<210> 95 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> VARIANTE <222> (1) .. . (7) <223> Xaa na posição 1 = Phe(S4) <220> <221> VARIANTE <222> (1) .. . (7) <223> Xaa na posição 3 = (D)Trp <400> 95

Xaa Tyr Xaa Lys Vai Cys Trp 1 5 <210> 96 <211> 8 113 Λ C\] \—1 C\] V PRT <213> Homo sapiens <2 2 0 > <2 21 > VARIANTE <222> (D . . . (8) <2 2 3> Xaa na posição 4 = (D)Trp <2 2 0 > <221> VARIANTE <222> (D · · · (8) <223> Xaa na posição 8 = Gly(S2) < 4 0 0 > 96 Cys Phe Trp Xaa Lys Thr Phe Xaa 1 5 <210 > 97 <211 > 9 Λ Ον] \—1 Ον] V PRT <213> Homo sapiens <2 2 0 > <2 21 > VARIANTE <222> (D . . . (9) <223> Xaa na posição 1 = (D)Phe <2 2 0 > <2 21 > VARIANTE <222> (D . . . (9) <223> Xaa na posição 5 = (D)Trp <2 2 0 > <2 21 > VARIANTE <222> (D · · · (9) <223> Xaa na posição 9 = Gly (S2) < 4 0 0 > 97 114 xaa cys Phe Trp Xaa Lys Thr Phe Xaa 1 5

<210> 98 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> VARIANTE <222> (1) .. . (7) <223> Xaa na posição 3 = (D)Trp <220> <221> VARIANTE <222> (1) .. . (7) <223> Xaa na posição 7 = Gly(S2) <400> 98

Phe Trp Xaa Lys Thr Phe Xaa 1 5

<210> 99 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> VARIANTE <222> (1) .. . (8) <223> Xaa na posição 1 = Gly(S2) <220> <221> VARIANTE <222> (1) .. . (8) <223> Xaa na posição 4 = (D)Trp <220>

<221> VARIANTE 115

<2 2 2 > (1) . . . (8) <223> Xaa na posição 7 = Gly(S2) < 4 0 0 > 99 Xaa Phe Trp Xaa Lys Thr Phe Xaa 1 5 <210 > 100 <211 > 7 <212 > PRT <213> Homo sapiens <2 2 0 > <2 21 > VARIANTE <222> (D · · · (7) <223> Xaa na posição 3 = (D)Trp <2 2 0 > <2 21 > VARIANTE <222> (D · · · (7) <223> Xaa na posição 7 = Gly(S2) < 4 0 0 > 100 Phe Trp Xaa Lys Thr Phe Xaa 1 5 <210 > 101 <211 > 9 <212 > PRT <213> Homo sapiens <220> <221> VARIANTE <222> (D · · · (9) <223> Xaa na posição 1 = (D)Phe <2 2 0 > <2 21 > VARIANTE 116 <2 2 2 > (1) . . . (9) <223> Xaa na posição 2 = Gly(S2) <2 2 0 > <2 21 > VARIANTE <222> (D . . . (9) <2 2 3> Xaa na posição 5 = (D)Trp <2 2 0 > <221> VARIANTE <222> (D · · · (9) <223> Xaa na posição 9 = Gly(S2) < 4 0 0 > 101 Xaa Xaa Phe Trp xaa Lys Thr Phe Xaa 1 5 <210 > 102 <211 > 9 <212 > PRT <213> Homo sapiens <2 2 0 > <2 21 > VARIANTE <222> (D · · · (9) <223> Xaa na posição 1 = (D)Nal <2 2 0 > <2 21 > VARIANTE <222> (D · · · (9) <223> Xaa na posição 2 = Gly(S2) <220> <2 21 > VARIANTE <222> (D · · · (9) <223> Xaa na posição 5 = (D)Trp <2 2 0 > <221> VARIANTE <222> (D . . . (9) 117

Claims (12)

1. <223> Xaa na posição 9 = Gly(S2) <400> 102 Xaa Xaa Phe Trp Xaa Lys Thr Phe Xaa 1 5 Lisboa, 16 de Agosto de 2007 REIVINDICAÇÕES 1. Análogo de somatostatina de esqueleto cíclico que incorpora pelo menos uma unidade constitutiva, contendo a referida unidade constitutiva um átomo de azoto do esqueleto peptídico ligado a um grupo ponte compreendendo um amida, tioéter, tioéster ou dissulfureto, em que pelo menos uma unidade constitutiva é ligada por meio do referido grupo-ponte para formar uma estrutura cíclica, com uma unidade seleccionada do grupo consistindo de uma segunda unidade constitutiva, a cadeia lateral de um resíduo de amioácido da sequência ou o resíduo do aminoácido N-terminal, tendo a seguinte fórmula geral 7. Q-RS-Rí-R1“Re-R9-R10-Rll-yRlí-X I-CO- (CHz) n- Fórmula N° 7 em que 118 n é 1 a 5; X designa um ácido carboxilico, amida ou grupo álcool terminal; Q é hidrogénio ou um mono- ou di-sacárido; R5 é ácido gama aminobutírico, ácido diaminobutirico, Gly, β-Ala, ácido 5-aminopentanóico ou ácido amino-hexanóico; R6 é (D)- ou (L)-Phe ou Tyr; R7 é (D)- ou (L)-Trp, (D)- ou (L)-Phe, (D)- ou (L)-lNal ou (D)- ou (L)-2Nal, ou Tyr; R8 é (D)- ou (L)-Trp; R9 é (D)- ou (L)-Lys; R10 é Thr, Gly, Abu, Ser, Cys, Vai, (D)- ou (L)-Ala, ou (D)- ou (L)-Phe; R11 é (D)- ou (L) -Phe, (D) - ou (L)-Ala, Nle, ou Cys; R12 é Gly, Vai, Leu, (D)- ou (L)-Phe ou INal ou 2Nal;
2. 2. Análogo de somatostatina de esqueleto cíclico da reivindicação 1, tendo a fórmula geral 7, em que: Q é hidrogénio; R5 é GABA; R6 é Phe; R7 é Trp; R8 é (D)Trp; R9 é Lys; R10 é Thr; R11 é Phe; R12 é Gly; n é 3; e X é uma amida.
3. 3. Análogo de somatostatina de esqueleto cíclico da reivindicação 1, tendo a fórmula geral 7, em que: Q é galactose; R5 é Dab; R1 é Phe; R2 é (L)-Trp; R3 é (D)Trp; R9 é Lys; R10 é Thr; R11 é Phe; R12 é Gly; n é 3; e X é amida.
4. 4. Análogo de somatostatina de esqueleto cíclico da reivindicação 1, tendo a fórmula: Galactose-Dab*-Phe-Trp-(D)Trp-Lys-Thr-Phe-Gly(C3)-X em que X designa um ácido carboxílico terminal, um grupo amida ou álcool; o asterisco denota que o grupo-ponte está ligado entre o derivado Να-ω funcionalizado de um aminoácido e o N terminal do péptido ou a cadeia lateral do resíduo Cys.
5. 5. Composição farmacêutica compreendendo um análogo de somatostatina de esqueleto cíclico como definido em qualquer uma das reivindicações 1-4. 1 Composição de acordo com a reivindicação 5, em que o análogo 2 de esqueleto cíclico é selectivo para um subtipo de receptor 3 de somatostatina.
6. 7. Composição de acordo com a reivindicação 5, em que o análogo de esqueleto cíclico é selectivo para dois subtipos de receptor de somatostatina.
7. 8. Utilização de uma composição farmacêutica compreendendo uma quantidade terapeuticamente eficaz de um análogo de somatostatina de esqueleto ciclizado de acordo com as reivindicações 1-4 na produção de um fármaco para tratamento ou prevenção de distúrbios seleccionadas do grupo consistindo de cancros, doenças autoimunes, distúrbios endócrinos, complicações associadas à diabetes, distúrbios gastrointestinais doenças inflamatórias, pancreatite, aterosclerose, restenose e dor pós-operatória.
8. 9. Utilização de acordo com a reivindicação 8, em que o análogo de esqueleto cíclico é selectivo para um subtipo de receptor de somatostatina.
9. 10. Utilização de acordo com a reivindicação 8, em que o análogo de esqueleto cíclico é selectivo para dois subtipos de receptor de somatostatina.
10. 11. Utilização de um análogo de somatostatina de esqueleto ciclizado das reivindicações 1-4 para a preparação de uma composição diagnóstica para o diagnóstico do cancro.
11. 12. Utilização de acordo com a reivindicação 11, em que o análogo de esqueleto cíclico é utilizado para imagiologia da existência de metástases.
12. 13. Utilização de acordo com a reivindicação 12, em que o análogo de esqueleto cíclico é marcado com uma sonda detectável. Lisboa, 16 de Agosto de 2007