CZ292972B6 - Polypeptid, molekulový komplex GLP-1 s jeho obsahem, léčivo pro léčení diabetes mellitus, farmaceutický prostředek pro podporu exprese inzulinu a farmaceutický prostředek obsahující polypeptid nebo komplex - Google Patents

Abstract

Je popsán nový polypeptid obecného vzorce R.sub.1.n.-X-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Y-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Z-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-R.sub.2,.n. molekulový komplex GLP-1 s obsahem uvedeného polypeptidu a dvoumocného kovového kationtu, léčivo pro léčení diabetes mellitus u savců, nastupující v dospělosti, založeného na tomto komplexu, farmaceutický prostředek zaměřený na pankreatické ostrůvkové buňky .beta.-typu pro podporu exprese inzulinu a farmaceutický prostředek s obsahem uvedeného polypeptidu nebo komplexu.ŕ

Description

Oblast techniky

Tento vynález se týká polypeptidu, molekulového komplexu GLP-1 s obsahem uvedeného polypeptidu a dvoumocného kovového kationtů, léčiva pro léčení diabetes mellitus u savců, nastupující v dospělosti, založeného na tomto komplexu, farmaceutického prostředku zaměřeného na pankreatické ostrůvkové buňky β-typu pro podporu exprese inzulínu a farmaceutického prostředku s obsahem tohoto polypeptidu nebo komplexu.

Dosavadní stav techniky

Endokrinní sekrece pankreatických ostrůvků je pod komplexní kontrolou nejen metabolitů z krve (například glukóza, aminokyseliny, katecholaminy), ale také místních vlivů paracrinu. Hlavní pankreatické ostrůvkové hormony (glukagon, inzulín a somatostatin) navzájem působí svými specifickými typy buněk (A, B a D buňky) k modulaci sekretační odezvy zprostředkovávané shora uvedenými metabolity. Jakkoliv je sekrece inzulínu převážně řízena hladinou glukózy v krvi, inhibuje somatostatin glukózou zprostředkovávanou inzulínovou sekretační odezvu. Kromě interostrůvkové paracrinové regulace sekrece inzulínu je jasná podpora existence inzulinotropických faktorů ve střevu. Tento poznatek je založen na pozorování, že glukóza podávaná orálně je mnohem mocnějším stimulantem inzulínové sekrece než porovnatelné množství glukózy, podané intravenózně.

Lidský hormon glukagon je 29-aminokyselinový peptidový hormon produkovaný A-buňkami pankreatu. Hormon patří do multigenové rodiny strukturálně příbuzných peptidů, mezi něž patří sekretin, gastrický inhibiční peptid, vazoaktivní střevní peptid a glicentin. Tyto peptidy regulují různě metabolismus cukrů, gastrointestinální mobilitu a sekreční pochody. Hlavními poznanými činnostmi pankreatického glukanonu jsou však podpora hepatické glykogenolýzy a glykoneogeneze, jejichž důsledkem je zvýšení hladiny cukru v krvi. Z tohoto hlediska působí glukagon protiregulačně se zřetelem na inzulín a může přispívat k hyperglykémii jež doprovází diabetes mellitus [Lund, P. K. a kol., Proč. Nati. Acad. Sci. U. S. A., 79, str. 345 až 349 (1932)].

Zjistilo se, že glukagon je schopen vázat se na specifické receptory spočívající na povrchu buněk produkujících inzulín. Je-li glukagon vázán na tyto receptory, stimuluje rychlou syntézu cAMP těmito buňkami. Jak bylo zjištěno, cAMP stimuluje expresi inzulínu [Korman, L. Y. a kol., Diabetes 34, str. 717 až 722 (1985)]. Inzulín působí proti syntéze glukagonu [Ganong, W. F., Review of Medical Physiology, Lange Publications, Los Altos, Kalifornie, str. 273 (1979)]. Exprese glukagonu je tudíž pečlivě regulována inzulínem a konečně hladinou glukózy v séru.

Glukagonový gen je napřed translatován z prekurzoru o 360 párech bází k vytvoření polypeptidu, preproglukagonu [Lund P. K. a kol., Proč. Nati. Acad. Sci. U. S. A., 79, str. 345 až 349 (1932)]. Tento polypeptid se následně zpracovává k vytvoření proglukagonu. Patzelt, C. a kol. [Nátuře 282, str. 260 až 266 (7979)] ukázal, že proglukagon byl následně rozštěpen na glukagon a druhý polypeptid. Následná práce Lunda, P. K. a kol, [Lopeze, L. C. a kol. Proč. Nati. Sci. U. S. A. 80 str. 5485 až 5489 (1983)] a Bella, G. I. a kol., [Nátuře 302, str. 716 až 718] ukázala, že proglukagonová molekula byla rozštěpena bezprostředně za zbytky lysin-argininového dipeptidu. Studie proglukagonu, produkovaného sumcem (Ictacalurus punctata) naznačuje, že glukagon z tohoto zvířete byl také proteolyticky rozštěpen těsně za zbytky lysin-argininového dipeptidu. [Andrews, P. C. a kol. J. Biol. Chem. 260, str. 3910 až 3914 (1985), Lopez, L. C. a kol., Proč. Nati Sci. U. S. A. 80 str. 5485 až 5489 (1983)]. Bell, G. I. a kol. objevil, že savčí proglukagon se štěpí na lysin-argininových nebo arginin-argininových dipeptidech a ukázal, že

-1CZ 292972 B6 molekula proglukagonu obsahovala tři diskrétní a vysoce homologované peptidové molekuly, jež byly označeny glukagon, glukagonu podobný Peptid 1 (GLP-1) a glukagonu podobný peptid 2 (GLP-2). Lopez a kol. dospěl k názoru, že glukagonu podobný peptid 1 má délku 37 aminokyselinových zbytků a glukagonu podobný peptid 2 má délku 34 aminokyselinových 5 zbytků. Analogické studie struktury krysího preproglukagonu ukázaly podobný obraz proteolytického štěpení mezi sousedním lysein-argininovým nebo arginin-argininovým dipeptidovým zbytkem, což vede k vytvoření glukagonu, GLP-1 a GLP-2. [Heinrich G. a kol. Endokrinol. 115, str. 2176 až 2181 (1984)]. Zjistilo se, že lidské, krysí, hovězí a křeččí sekvence GLP-1 jsou identické [Ghiglione, M. a kol. Diabetologia 27, str. 599 až 600 (1984)].

Závěr, ke kterému dospěl Lopez a kol., pokud jde o rozměr GLP-1, byl potvrzen prací Uttenhalovou L. O. a kol. [J. Clin. Endokrinol, Metabol. 61, str. 472 až 479 (1984)]. Uttenhal a kol. zkoumali molekulové formy GLP-1, jež byly přítomny v lidském pankreatu. Jejich výzkum ukázal, že GLP-1 a GLP-2 jsou v pankreatu přítomny jako 37 aminokyselinové a 34 amino15 kyselinové peptidy.

Podobnost mezi GLP-1 a glukagonem naznačovala dřívějším badatelům, že GLP-1 by mohl mít biologickou aktivitu. Ačkoli někteří badatelé zjistili, že by GLP-1 mohl vyvolávat u krysích mozkových buněk syntézu cAMP [Hoosein, N. M. a kol. Febs. Lett. 178, str. 83 až 86 (1984)], 20 jiným autorům se nepodařilo identifikovat jakoukoli fyziologickou úlohu GLP-1 (Lopez, L. C. a kol.). To, že se nepodařilo identifikovat žádnou fyziologickou úlohu GLP-1, vedlo mnohé badatele k otázce, zda GLP-1 je skutečně hormonem a zda příbuznost mezi glukagonem a GLP1 nemohla být umělá.

Byly též objeveny varianty GLP-1 (7-37) a jeho analogy. Mezi tyto varianty a analogy patří například Gln’-GLP-1 (7-37), D-GLN⁹-GLP-1 (7-37), acetyl-Lys⁹-GLP-l (7-37), Thr¹⁶Lys^l8-GLP-1 (7-37), Lys¹⁸-GLP-1 (7-37) a jejich deriváty včetně například kyselých adičních solí, karboxylátových solí, nižších alkylesterů a amidů (viz například WO 91/11457). Obecně je o různých objevených formách GLP-1 známo, že stimulují sekreci inzulínu (inzulinotropické působení) a vytvářejí cAMP [viz například Mojsov S., Int. J. Peptide Protein Research, 40, str. 333 až 343 (1992)].

Ještě významnější je, že někteří autoři poukázali na blízkost mezi laboratorním experimentováním a savčími, zejména lidskými inzulinotropními odezvami na exogenní podávání GLP-1, 35 zejména GLP-1 (7-36) NH₂ a GLP-1 (7-37) [viz například Nauck M. A. a kol., Diabetologia 36, str. 741 až 744 (1993), Gutniak M. a kol., New England J. of Medicine, 326, (20) str. 1316 až 1322 (1992), Nauck M. A. a kol. J. Clin. Invest., 91., str. 301 až 307 (1993) Thorens, B. a kol.. Diabetes 42, str. 1219 až 1225 (1993)].

Ještě významnější je, že základními defekty, o nichž se zjistilo, že způsobují hyperglykémii při diabetes začínající ve zralém věku, jsou zhoršená sekrece endogenního inzulínu a svalová a jatemí rezistence vůči účinkům inzulínu [Galloway, J. S Diabetes Care 13, str. 1209 až 1239, 1990)], což vede k nadměrné produkci glukózy z jater. Tudíž, zatímco u normálního jedince se vylučuje glukóza rychlostí přibližně 2 mg/kg/min, přesahuje toto množství u pacienta s nástupem 45 diabetes ve zralém věku 2,5 mg/kg/min, což vede k čistému nadbytku nejméně 70 gramů glukózy za 24 hodin. Skutečnost, že existují mimořádně velké korelace mezi produkcí hepatické glukózy, glukózou v krvi v lačném stavu a celkovým metabolickým řízením indikovaným glykohemoglobinovým měřením (Galloway, J. S Diabetes Care 13, str. 1209 až 1239 (1990) a Galloway J. A. a kol.. Clin. Therap. 12, str. 460 až 472 (1990)], je dostatečně zřejmé, že řízení, glukózy v krvi nalačno je nutnou podmínkou k dosažení celkové normalizace metabolismu postačující k prevenci komplikací hyperglykémie. Vzhledem ke skutečnosti, že současné formy inzulínu zřídka normalizují, hepatickou produkci glukózy bez vytváření významné hyperinzulinémie a hypoglykémie (Galloway J. A a Galloway J. A. a kol., citované shora), jsou nutné alternativní přístupy.

— 2CZ 292972 B6

Intravenózní infúze GLP-1 (7-36) NH₂ k vytvoření dvojnásobku normální sérové koncentrace ukázaly vytvoření jevů vyznačených následující tabulce:

	A	B
Glykémie z jídla (1)	beze změny	snížená
Glykémie nalačno (2)	-	snížená
Glukagon nalačno (2)	—	snížený
Post-prandiální glukagon (1)	—	snížený
Endogenní sekrece inzulínu jako odezva na jídlo (1)	beze změny	zvýšená
Volné mastné kyseliny	snížené (3)	snížené (3)

A normální jedinci

B jedinci s nástupem diabetes v dospělosti (1) Gutniak M. a kol., New England J. of Medicine, 326, (20) str. 1316 až 1322 (7992), (2) Nauck M. A. a kol., Diabetologia 36, str. 741 až 744 (1993), (3) Orskov C. a kol., Diabetes 42, str. 658 až 661 (1993).

Avšak dlouhodobá stabilita GLP-1 a zvláště GLP-1 jakožto složky farmaceutického prostředku pro podávání savcům je sporná. Ve skutečnosti při skladování při nízké teplotě 4 °C se nalézají vedlejší produkty GLP-1 (7-37) již dříve než za jedenáct měsíců po přípravě vzorku (Mojsov S., Int. J. Peptide Protein Research, 40, str. 333 až 343 (1992)]. Proto se jeví potřeba vyvinout stabilnější GLP-1 sloučeninu, která by se mohla podávat savcům, kteří takové ošetření potřebují.

Kromě toho biologický poločas molekul GLP-1, zvláště molekul, které jsou ovlivněny aktivitou dipeptidylpeptidázy IV (DPPIV) je velmi krátký. Například biologický poločas GLP-1 (7-37) je jen 3 až 5 minut a je dále ovlivněn rychlou absorpcí po parenterálním podání savcům. Také existuje potřeba GLP-1 sloučeniny, která vykazuje pozdrženou absorpci po podání.

Vynález tedy řeší problém sérové nestability a krátkého nového poločasu, spojeného s nativní GLP-1 molekulou. Kromě toho sloučeniny podle vynálezu rovněž vykazují odloženou absorpci po parenterálním podání a proto mají prodloužený biologický poločas. Vynález se také týká farmaceutických prostředků, které obsahují jako účinnou látku sloučeninu podle vynálezu a použití sloučenin podle vynálezu.

Podstata vynálezu

Předmětem tohoto vynálezu je polypeptid obecného vzorce

Ri-X-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Y-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-ZPhe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-R₂ ve kterém

Ri je vybrán ze souboru zahrnujícího L-histidin, D- histidin, desaminohistidin, 2-aminohistidin, β-hydroxyhistidin, homohistidin, α-fluormethylhistidin a a-methylhistidin,

X je vybrán ze souboru zahrnujícího Val, Thr, Ile a a-methyl-Ala,

Y e vybrán ze souboru zahrnujícího Glu, Gin, Ala, Thr, Ser a Gly,

Z je vybrán ze souboru zahrnujícího Glu, Gin, Ala, Thr, Ser a Gly,

R₂ je vybrán ze souboru zahrnujícího NH₂ a Gly-OH,

-3CZ 292972 B6 nebo jeho farmaceuticky přijatelná sůl, přičemž uvedený polypeptid má izoelektrický bod v rozmezí od 6,0 do 9,0.

Předmětem tohoto vynálezu také je molekulový komplex GLP-1, který obsahující dvoumocný kovový kation a polypeptid popsaný výše.

Předmětem tohoto vynálezu dále je použití účinného množství komplexu uvedeného výše, zvláště pokud jeho kationtem je zinek, pro výrobu léčiva pro léčení diabetes mellitus u savců, který nastupuje v dospělosti.

Předmětem tohoto vynálezu rovněž je použití účinného množství svrchu uvedeného komplexu pro výrobu farmaceutického prostředku zaměřeného na pankreatické ostrůvkové buňky β-typu pro podporu exprese inzulínu.

Předmětem tohoto vynálezu také je farmaceutický prostředek, jehož podstata spočívá v tom, že obsahuje polypeptid uvedený výše nebo jeho farmaceuticky přijatelnou sůl s alespoň jedním jeho farmaceuticky přijatelným nosičem, ředidlem nebo excipientem.

Předmětem tohoto vynálezu konečně je farmaceutický prostředek, jehož podstata spočívá v tom, že obsahuje svrchu uvedený komplex s alespoň jedním jeho farmaceuticky přijatelným nosičem, ředidlem nebo excipientem.

Dále je popsán předmětný vynález podrobněji a v širších souvislostech.

Způsob léčení diabetes mellitus u savců, kteiý nastupuje v dospělosti, spočívá v podávání komplexu uvedeného výše savci. Způsob podpory exprese inzulínu je založen na dodávání množství svrchu uvedeného komplexu do pankreatických ostrůvkových buněk.

Výraz „molekula GLP-1“ se v předchozím i následujícím textu a patentových nároků používá v souvislosti s jejich přírodními nebo nepřírodními funkčními analogy, deriváty a solemi. Aminokyselinová sekvence GLP-1 (7-36)NH₂ je dobře známa v oboru, ale pro pohodlí čtenáře tohoto popisu se přesto uvádí dále:

His⁷-Ala-Glu-Gly¹⁰-Thr-Phe-Thr-Ser-Asdp¹⁵-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu²⁰-Glu-Gly-Gln-AlaAla²⁵-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala³⁰-Trp-Leu-Val-Lys-Gly³⁵-Arg-NH₂.

Pro GLP-1 (7-37) je amidová funkce zakončená karboxyskupinou na Arg³⁶ nahrazena Gly v poloze 37 molekuly GLP-1 (7-36)NH₂.

Kromě toho je ve známém stavu techniky [viz například americké patentové spisy číslo 5 120 712 a 5 118 666, které jsou zde zahrnuty ve svém celku, a Orskov C. a kol., J. Biol. Chem. 264 (22), 12826 až 12829 (1989) a dokument WO 91/11457 (Buckley D. I. a kol., zveřejněno dne 8. srpna 1991)] popsána existence a způsob přípravy četných chráněných, nechráněných a částečně chráněných přírodních a nepřírodních funkčních analogů a derivátů GLP-1 (7-36)NH₂ a GLP-1 (7-37) molekul.

Jak je v oboru známo, aminokyselinové zbytky mohou být ve své chráněné formě, přičemž jak aminoskupiny, tak karboxyskupiny mají vhodné chránící skupiny, v částečně chráněné formě, ve které buď aminoskupiny nebo karboxyskupiny mají vhodné chránící skupiny, nebo v nechráněné formě, ve které ani aminoskupiny ani karboxyskupiny nemají vhodnou chránící skupinu. Četné reakce pro vytváření a odstraňování takových chráněných skupin jsou popsány v četných základních publikacích, jako je například publikace „Protective Groups in Organic Chemistry“ (Chrániči skupiny v organické chemii), Plenům Press, (Londýn a New York, 1973), Green T. H.,

-4CZ 292972 B6 „Protective Groups in Organic Synthesis“ (Chrániči skupiny v organické syntéze), Wiley, (New

York, 1981) a Schroder a Liibke, The Peptides (Peptidy), svazek I, Acaemic Press (Londýn a

New York, 1965).

Jakožto reprezentativní skupiny, které chrání aminoskupinu, se příkladně uvádějí formylová, acetylová, izopropylová, butoxykarbonylová, fluorenylmethoxykarbonylová skupina a karbobenzyloxyskupina a podobné skupiny.

Kromě chráněných forem, kdy je chráněna jak aminoskupina, tak karboxyskupina vhodnou chránící skupinou, se výraz „chráněný“ týká také molekul GLP-1, ve kterých je aktivita dipeptidylpeptidázy IV rezistentní nebo inhibovaná [viz například Mentlein R. a kol., Eur. J. Biochem. 214, 829 až 835 (1993)]. Kromě GLP-1 (7-36)NH₂ jsou výhodné molekuly, které jsou chráněny před aktivitou DPP IV, a výhodnější jsou Gly⁸-GLP-1 (7-36)NH2, Va¹⁸Ý3LP-l (737)OH, a-methyl-Ala⁸-GLP-l (7-36)NH2 a Val⁸-Gln²‘-GLP-1 (7-37)OH.

Deriváty přírodně se vyskytujících molekul GLP-1 jsou takové peptidy, které se získají fragmentací přírodně se vyskytující sekvence nebo se syntetizující na základě znalostí sekvence přírodně se vyskytující aminokyselinové sekvence genetického materiálu (DNA nebo RNA), které kódují tuto sekvenci. Výraz „deriváty“ také zahrnuje chemickou modifikaci přírodních nebo nepřírodních molekul GLP-1. Způsoby přípravy takových derivátů jsou odbornému pracovníkovi v oboru dobře známy z organické chemie a z chemie peptidů (viz například dokument WO 91(11457).

Molekuly GLP-1 podle tohoto vynálezu zahrnují také analogy GLP-1 (7-36)NH₂ a GLP-1 (737), kde se zavádí nebo vypouští jedna nebo několik aminokyselin, které nejsou obsaženy v originální sekvenci. Zvláště jsou vhodné His a desaminohistidin jakožto R_b pokud celkový izoelektrický bod molekuly je od 6 do 9 Ala, Gly a Val jsou vhodnými významy pro polohu „X“, pokud celkový izoelektrický bod molekuly je od 6 do 9. Podobně jsou Glu a Gin vhodnými významy pro polohu „Y“, pokud celkový izoelektrický bod molekuly je od 6 do 9. Podobně jsou Glu a Gin vhodnými významy pro polohu „Z“, pokud celkový izoelektrický bod molekuly je v rozmezí od 6 do 9. Konečně je Gly-ΌΗ výhodný pro R₂, pokud celkový izoelektrický bod molekuly je v rozmezí od 6 do 9.

Tento vynález zahrnuje také formu soli molekuly GLP-1. GLP-1 podle tohoto vynálezu má dostatečně kyselých funkčních skupin, dostatečně bazických funkčních skupin nebo jak bazických, tak kyselých funkčních skupin, aby mohly reagovat s různými anorganickými zásadami a anorganickými nebo organickými kyselinami pro přípravu farmaceuticky vhodných solí.

Kyseliny, běžně používané pro přípravu adičních solí s kyselinami, jsou anorganické kyseliny, například kyselina chlorovodíková, bromovodíková, jodovodíková, fosforečná a sírová. Jakožto příklady farmaceuticky vhodných organických kyselin, kterých lze použít pro přípravu farmaceuticky vhodných solí, se uvádějí kyselina P-toluensulfonová, methansulfonová, šťavelová, p-bromfenylsulfonová, karboxylová, jantarová, citrónová, benzoová a octová kyselina.

Jakožto takové farmaceuticky vhodné soli, připravené za použití minerálních nebo organických kyselin, se uvádějí příkladně sulfát, pyrosulfát, hydrogensulfát, sulfit, hydrogensulfit, fosfát, monohydrogenfosfát, dihydrogenfosfát, metafosfát, pyrofosfát, chlorid, bromid, jodid, acetát, propionát, dekanoát, kaprylát, akrylát, formát, isobutyrát, kaproát, heptanoát, propiolát, oxalát, malonát, sukcinát, suberát, sebekát, fumarát, maleát, butin-l,4-dioát, hexin-l,6-dioát, benzoát, chlorbenzoát, methylbenzoát, dinitrobenzoát, hydroxybenzoát, methoxybenzoát, ftalát, sulfonát, xylensulfonát, fenylacetát, fenylpropionát, fenylbutyrát, citrát, laktát, gama-hydroxybutyrát, glykolát, tartrát, methansulfonát, propansulfonát, naftalen-l-sulfonát, naftalen-2-sulfonát a mandelát. Výhodnými, farmaceuticky vhodnými adičními solemi s kyselinou, jsou soli

-5CZ 292972 B6 s minerálními kyselinami, například s kyselinou chlorovodíkovou a bromovodíkovou, zvláště s kyselinou chlorovodíkovou.

Adiční soli se zásadami se odvozují od anorganických zásad, jako jsou například amonium a hydroxidy, uhličitany a hydrogenuhličitany alkalických kovů a kovů alkalických zemin. Jakožto takové zásady, vhodné pro přípravu farmaceuticky vhodných solí, se příkladně uvádějí hydroxid sodný, draselný a amonný a uhličitan draselný. Forma soli je obzvláště výhodná.

Samozřejmě pokud se sloučenin podle vynálezu používá pro farmakoterapeutické účely, mohou 10 být tyto sloučeniny ve formě soli, která však musí být rovněž farmaceuticky přijatelná.

GLP-1 molekuly podle vynálezu zahrnují například GLP-1 molekuly, jejichž funkční skupiny mají inzulinotropickou aktivitu. Výraz „inzulinotropická aktivita“ se týká schopnosti stimulu nebo způsobovat stimulaci syntézy nebo exprese hormonu inzulínu.

Inzulinotropická vlastnost sloučenin se může stanovit podáním sloučeniny živočišným buňkám nebo vstřikováním sloučeniny zvířatům a monitorováním uvolňování imunoreaktivního inzulínu u (IRI) do prostředí nebo do oběhového systému živočicha. Přítomností IRI se zjišťuje použitím radioimunozkoušky, která je schopna specificky zjišťovat inzulín.

Jakkoliv se může použít každá radioimunozkouška, schopná detekce přítomnosti TRI, je výhodné používat modifikovaného způsobu, který popsal Albano J. D. M., a kol., Acta Endocrinol., 70, str. 487 až 509 (1972). Podle této modifikace se používá fosfát/albuminový pufr o hodnotě pH 7,4. Inkubace se připravuje s následným přidáním 50 μΐ fosfátového pufru, 50 μΐ 25 perfusátového vzorku nebo krysího inzulínového standardu v perfusátu 100 μΐ antiinzulinového antiséra (Wellcome laboratories, zředění 1:40 000) a 100 μΐ [¹²⁵I] inzulínu za získání celkového objemu 750 μΐ ve skleněné zkumavce 10x75 mm. Po inkubaci po dobu dvou až tří dnů při teplotě 4 °C se odděluje volný inzulín od inzulínu vázaného na protilátku oddělováním na uhlí. Citlivost zkoušky je 1 až 2 uJ/ml. K měření uvolňování IRI do buněčného kultivačního prostředí 30 buněčného růstu ve tkáňové kultuře je výhodné proinzulin radioaktivně značit. Jakkoliv je možno použít jakéhokoliv radioaktivního značení polypeptidu, je výhodné použít ³H leucinu pro získání značeného proinzulinu. Značení je možné ve kterékoliv době dostatečné k vytvoření zjistitelné značené oblasti proinzulinových molekul; je však výhodné inkubovat buňky v přítomnosti dioaktivního značení po dobu 60 minut.

Ačkoliv se může použít mnohých buněčných linií schopných exprese inzulínu pro stanovení, zdali má sloučenina inzulinotropické působení, je výhodné použít buněk krysího inzulinomu a zvláště buněk RIN-38 krysího inzulinomu. Takové buňky se mohou nechávat růst v jakémkoliv vhodném prostředí; je však výhodné používat prostředí DME, obsahujícího 0,1 % BSA a 25 mM 40 glukózy.

Inzulinotropická vlastnost sloučeniny se také může stanovit pankreatickou infuzí. Způsob přípravy in šitu isolovaného perfiisovaného krysího pankreatu je modifikací způsobu, který popsal Penhos J. C. a kol. [Diabetes 18, str. 733 až 738 (1969)]. Vyhladovělí samečci albínu 45 krysy kmene Charles River o hmotnosti 350 až 600 g se anestetizují intraperitoneálním vstřiknutím prostředku Amytal Sodium (Eli Lilly and Co.: 160 ng/kg). Podváží se renální, adrenální, gastrické a nižší tračníkové krajní cévy. Celé střevo se vyřízne s výjimkou přibližně 4 cm dvanáctníku, sestupného tračníku a rekta. Proto se jen malá část střeva perfuzuje za minimalizace interference střevních látek s glukagonovitou imunoreaktivitou. Perfusátem je 50 modifikovaný Krebs-Ringerův hydrogenuhličitanový pufr se 4 % dextranu T70 a 0,2 % hovězího sérového albuminu (frakce V) a probublávaný plynem, sestávajícím z 95 % kyslíku a 5 % oxidu uhličitého. Používá se nepulzativního toku, čerpadla se 4 kanálovým válcem (Buchler polystatic společnosti Buchler Instruments Division, Nuclear-Chicago Corp.) a sepnutí jednoho zdroje perfuzátu se druhým zdrojem se provádí spínáním trojcestného kohoutu. Perfuze, monitorování a

-6CZ 292972 B6 analýza se provádí způsobem, který popsal Weir G. C. a kol. [J. Clin. Inestigat, 54, str. 1403 až

1412(1974)].

Je třeba, aby GLP-1 molekuly podle vynálezu měly histidinovou funkční skupinu na aminozakončení. GLP-1 molekuly podle vynálezu mohou mít také modifikovanou histidinovou funkční skupinu místo požadované histidinové skupiny.

Výrazem „modifikovaný histidin“ se zde vždy míní histidinová funkční skupina, která je chemicky nebo biologicky změněna nebo změněná histidinová funkční skupina, která je syntetizovaná nově, která si však ponechává svoji schopnost vázat kov.

Četné takto modifikované histidinové funkční skupiny a způsob jejich přípravy jsou v oboru známy, například D-histidin (WO 91/11457), desaminohistidin (WO 92/18531), 2aminohistidin, [Levine-Pinto H. a kol., Biochem. Biophys. Res. Commun., 103(4), str. 1121 až 1730 (1981)], β-hydroxyhistidin [Owa T. a kol., Chemistry Letters, str. 1873 až 1874 (1988)], Lhomohistidin [Altman J. a kol., Synthetic Commun., 19 (11&12), str. 2069 až 2089)], afluormethylhistidin [americký patentový spis číslo 4 347374] a α-methylhistidin [O'Donnell M. J., Synthetic Commun., 19 (7 & 8), str. 1157 až 1165 (1989)].

GLP-1 molekuly podle vynálezu dále vyžadují, aby izoelektrický bod byl přibližně 6,0 až přibližně 9,0. Byly objeveny četné GLP-1. molekuly mající izoelektrický bod v tomto oboru. Příkladně se uvádějí:

GLP-1 (7-36)NH₂

Gly⁸-GLP-1 (7-36)NH₂, Gly⁹-GLP-1 (7-37), D-Gly⁹-GLP-1 (7-37), acetyl-Lys⁹-GLP-l (7-37),

Thr⁹-GLP-1 (7-37), D-Thr⁹-GL P-l (7-37), Asn⁹-GLP-1 (7-37), D-Asn⁹-GLP-1 (7-37), Ser²²-Arg²³-Arg²⁴-Gln²⁶-GLP-1 (7-37), Thr^I6-Lys¹⁸-GLP-l (7-37),

Lys¹⁸-GLP-1 (7-37), Arg²³-GLP-1 (7-37), Arg²⁴-GLP-1 (7-37), a další molekuly (například WO 91/11457). Kromě toho GLP-1 molekuly podle vynálezu v případě, kdy mají kteroukoliv se shora uvedených modifikovaných histidinových funkčních skupin místo histidinové funkční skupiny mají izoelektrické body ve shora uvedeném rozmezí. Způsoby pro výpočet nebo pro experimentální stanovení izoelektrického bodu jiných GLP-1 molekul jsou pracovníkům v oboru známy.

Způsoby přípravy molekul podle vynálezu jsou také normálním pracovníkům v oboru peptidů dobře známy.

Podle jednoho způsobu se GLP-1 molekuly připravují dobře známým způsobem syntézy peptidů v pevné fázi, který popsal Merrifield J. M. [Chem. Soc., 85, str. 2149 (1962)] a Stewart a Young [Solid Phase Peptide Synthesis, str. 24 až 66, Freeman (San Francisco, 1969)]. Je však možné získat fragmenty proglukagonového polypeptidu nebo GLP-1 (1-37) fragmentací přírodně se vyskytující aminokyselinové sekvence za použití například proteolytického enzymu. Kromě toho

-7CZ 292972 B6 je možné získat žádoucí fragmenty proglukagonového peptidu nebo GLP-1 (1-37) použitím rekombinantní DNA technologie, kterou popsal Maniatis T. a kol. [Molecular Biology: A

Laboratory Manual., CSH (Cold Spring Harbor, 1982)].

Podobně nabízí současný stav techniky v oboru molekulární biologie pracovníkovi v oboru jiné způsoby získání sloučenin podle vynálezu. Jakkoliv se mohou připravovat způsobem syntézy v pevné fázi nebo rekombinantními způsoby, mohou být rekombinantní způsoby výhodnější, jelikož umožňují vyšší výtěžky. Rekombinantní způsob má tyto základní stupně:

a) izolace přírodní DNA sekvence kódující GLP-1 molekulu nebo konstruující syntetickou nebo poíosyntetickou DNA kódující sekvenci pro GLP-1 molekulu,

b) vnesení kódující sekvence do expresního vektoru způsobem vhodným pro expresi proteinů buď samotných nebo jako konjugovaných proteinů,

c) transformace vhodné eukaryotické nebo prokaryotické hostitelské buňky s expresním vektorem,

d) kultivace transformovaná hostitelské buňky za podmínek, které umožňují expresi GLP-1 molekuly a

e) získání a čištění rekombinantně produkované GLP-1 molekuly.

Jak shora uvedeno, může být kódující sekvence plně syntetická nebo může být výsledkem modifikace větší nativní glukagon kódující DNA. DNA sekvenci, která kóduje preproglukagon, popsal Lund a kol. [Proč. Nati. Acad. Sci. U. S. A. 79, str. 345 až 349 (1982)] a může se použít jako výchozí látky v polosyntetické produkci sloučenin podle vynálezu měněním nativní sekvence k dosažení žádoucího výsledku.

Syntetické geny, in vivo nebo in vitro transkripce a translace, jejichž výsledkem je produkce GLP-1 molekuly, se mohou konstruovat o sobě známými způsoby v oboru. Díky přirozené degeneraci genetického kódu pracovník v oboru pozná, že je možno konstruovat velký avšak definitivní počet DNA sekvencí, které všechny kódují. GLP-1 molekuly.

Metodika syntetické genové konstrukce je dobře v oboru známa [Brown. a kol. (1979) Methods in Enzymology, Academie Press, N. Y., svazek 68, str. 109 až 151]. DNA sekvence, která kóduje GLP-1 molekulu, se může určit na základě zde uváděných aminokyselinových sekvencí. Samotná určená sekvence se může generovat použitím běžného zařízení pro syntézu DNA, například syntetizéru Model 380A nebo 380B DNA (Pe-Applied Biosystems, lne., 850 Lincoln Center Drive, Foster City, CA 94404).

K dosažení exprese GLP-l-molekuly se vkládá konstruovaná syntetická DNA sekvence do jakýchkoliv z četných vhodných rekombinantních DNA expresních vektorů prostřednictvím použití vhodných restrikčních endonukleáz [Maniatis a kol. (1989) Molecular Cloning; A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, N. Y., svazek 1 až 3]. Restrikční endonukleázová místa štěpení se konstruují buď do konce GLP-l-molekulu kódující DNA k usnadnění izolace ze známých amplifikačních a expresních vektorů a integrace do těchto vektorů. Použití určitých endonukleáz je dáno restrikcí obrazce endonukleázového štěpení mateřského expresního vektoru. Volba restrikčních míst se řídí tím, aby vhodně orientovaly kódující sekvenci s kontrolní sekvencí k dosažení vhodného čtecího rámce a exprese žádaného proteinu. Kódující sekvence musí být umístěna tak, aby byla ve vhodném čtecím rámci s promotorem a s ribozomovým vazebným místem expresního vektoru v hostitelské buňce, ve které se má protein expresovat.

8CZ 292972 B6

K dosažení účinné tranksripce syntetického genu musí být gen operativně spojen s promotorovou-operátorovou oblastí. Proto se promotorová-operátorová oblast vnese do syntetického genu v téže sekvenciální orientaci se zřetelem na ATG startový kodón syntetického genu.

Rozličné expresní vektory, užitečné pro transformaci prokaryotických a eukaryotických buněk, jsou v oboru dobře známy [The Promega Biological Research Products Catalogue (1992) (Promega Corp., 2800 Woods Hollow Road, Madison, WI, str. 53711 až 5399); a The Stratagene Cloning Systems Catalogue (1992) (Stratagene Corp., 11011 North Torrey Pines Road, La Jolla, CA, 92037)]. Také americký patentový spis číslo 4 710473 popisuje cirkulámí DNA plazmicové transformační vektory, užitečné pro expresi exogenních genů v E. coli ve vysokých hladinách. Tyto plazmidy jsou užitečné jakožto transformační vektory v rekombinantních DNA prekurzorech a

a) přispívají kapacitě plazmidu pro autonomní replikaci v hostitelské buňce,

b) řídí autonomní plazmidovou replikaci ve vztahu k teplotě, při které se udržují hostitelské buněčné kultury,

c) stabilizují udržení plazmidu v hostitelských buněčných populacích,

d) přímo syntetizují proteinový produkt indikativní pro udržení plazmidu v hostitelské buněčné populaci,

e) poskytují řady restrikčních endonukleázových rekognizačních míst jedinečných pro plazmid a

f) zakončují mRNA transkripci.

Tyto cirkulámí DNA plazmidy jsou užitečné jakožto vektoiy v rekombinantních DNA procedurách pro zajištění vysokých hladin exprese exogenních genů.

Po konstruování expresivního vektoru pro GLP-l-molekulu je dalším stupněm umístění vektoru do vhodné buňky, to je konstrukce rekombinantní hostitelské buňky, užitečné pro expresi polypeptidu. Techniky transformace buněk s rekombinantními DNA vektory jsou v oboru dobře známy a popsal je například Maniatis a kol. [(1989) Molecular Cloning; A Laboratory Manual, Cold Springs Harbor Laboratory Press, N. Y., svazek 1 až 3], Hostitelské buňky se mohou konstruovat buď z eukaryotických nebo z prokaryotických buněk.

Hostitelské prokaryotické buňky obecně produkují protein ve vysokých výtěžcích a snadněji se kultivují. Proteiny, které jsou expresovány ve vysoké hladině bakteriálními expresními systémy, charakteristicky agregují na granule nebo na inkluzní částice, které obsahují vysoké koncentrace nadexpresovaného proteinu. Takové proteinové agregáty se typicky musejí solubilizovat, denaturovat a ohýbat za použití v oboru o sobě známých způsobu [Kreuger a kol. (1990) Protein Folding, Gierasch and King, vyd., str. 136 až 142, Američan Association for the Advancement of Science Publication N. 89-18S, Washington D. C.; a americký patentový spis číslo 4 923967].

Jakmile se připraví žádaná GLP-l-molekula za podmínky, že má izoelektrický bod přibližně 6,0 až 9,0, připravují se komplexy podle vynálezu komplexováním žádané GLP-1 molekuly se dvoumocným kovovým kationtem v oboru o sobě známým způsobem. Jakožto takové dvoumocné kovové kationty se uvádějí kationt zinečnatý, manganatý, železnatý, kobaltnatý, kademnatý a nikelnatý. Z kovových kationtů je výhodným kationt nikelnatý.

Obecně se žádná GLP-1 molekula, mající žádaný izoelektrický bod, kombinuje se směsí vodného pufru a vhodné formy kovového kationtů.

-9CZ 292972 B6

Vhodnými jsou pufry, které udržují směs na hodnotě pH přibližně 6,0 až přibližně 9,0, které však neovlivňují nepříznivě reakci. Výhodnými pufry jsou Goode pufry, zvláště HEPES a Tris acetát.

Vhodnými formami kationtu jsou jakékoliv formy dvoumocného kovového kationtu, které jsou dostupné pro formu komplexu s LP-1 molekulou podle vynálezu. S výhodou se soli dvoumocného kovového kationtu, například chloridu zinečnatého, používá v nadbytku za získání molámího poměru až přibližně 50 molekul dvoumocného kovového kationtu na každou molekulu GLP-1 substrátu. V tomto stupni se používá teploty, která je dostatečná k úplnému proběhnutí reakce. Zpravidla se reakce provádí při teplotě místnosti.

Produkt podle vynálezu, krystalický nebo amorfní suspenze, se izoluje a čistí o sobě známými způsoby.

Vynález se rovněž týká farmaceutického prostředku, který jako účinnou látku obsahuje sloučeninu podle vynálezu a farmaceuticky vhodný nosič, ředidlo nebo excipient. Takové farmaceutické prostředky se připravují o sobě známým způsobem ve farmaceutickém průmyslu a podávají se jednotlivě nebo ve směsi s jinými terapeutickými účinnými látkami, s výhodou parenterální cestou. Obzvláště výhodnou cestou je intramuskulámí a subkutánní podání.

Parenterální denní dávky, s výhodou jedna denní dávka účinné látky je přibližně 1 pg/kg až přibližně 1000 pg/kg tělesné hmotnosti, jakkoliv se mohou podávat i menší nebo větší dávky. Určitou dávku podávané sloučeniny podle vynálezu stanovuje ostatně lékař se zřetelem na okolnosti ošetřovaného případu, jako je závažnost stavu, výška, hmotnost, sex, věk a vývoj ošetřování jedince.

Pro výrobu farmaceutického prostředku podle vynálezu se účinná složka, obsahující alespoň jednu sloučeninu podle vynálezu, zpravidla mísí s excipientem nebo se ředí excipientem. Jestliže se excipientu používá jakožto ředidla, může být pevný, polopevný nebo kapalný a působí jako nosič, pojidlo nebo prostředí pro účinnou látku.

Při přípravě farmaceutického prostředku může být nutné mlít účinnou látku k dosažení vhodné velikosti částic před smícháním s ostatními složkami. Pokud je účinná látka v podstatě nerozpustná, mele se zpravidla na velikost částic menší než 200mesh (průměr ok síta 75 mikrometrů). Pokud je účinná látka v podstatě ve vodě rozpustná, nastavuje se mletím velikost částic na rovnoměrné rozdělení velikosti například odpovídající přibližně 40 mesh (průměr ok síta 425 mikrometrů).

Jakožto příklady vhodných excipientů se uvádějí laktóza, dextróza, sacharóza, trehalóza, sorbitol a mannitol. Sloučeniny podle vynálezu se mohou formulovat tak, aby lychle, prodlouženě nebo odložené uvolňovaly účinnou látku po podání ošetřovanému jedinci.

Prostředky se s výhodou formulují v jednotkové dávkovači formě, přičemž každá dávka obsahuje přibližně 50 pg až přibližně 100 mg, zpravidla přibližně 1 až přibližně 10 mg účinné látky. Výrazem Jednotková dávkovači forma“ se zde vždy míní fyzikálně oddělená jednotka vhodná pro podání lidem nebo jiným savcům, přičemž každá taková jednotka obsahuje předem stanovené množství účinné látky, vypočtené k dosažení požadovaného účinku, spolu s farmaceuticky vhodným nosičem.

Pro účely parenterálního podání se sloučenina podle vynálezu s výhodou mísí s destilovanou vodou a hodnota pH se nastavuje na přibližně 6,0 až 9,0.

Přídavné farmaceutické způsoby se mohou používat k řízení délky trvání působení farmaceutického prostředku podle vynálezu. Řízeného uvolňování se může dosáhnout použitím polymerů ke komplexování nebo absorpci sloučeniny podle vynálezu. Řízeného uvolňování se může dosáhnout volbou vhodných makromolekul (například polyesterů, polyaminokyselin,

-10CZ 292972 B6 polyvinylpyrrolidonu, ethylenvinylacetátu, methylcelulózy, karboxymethylcelulózy a protaminsulfátu) a koncentrace makromolekul, jakož také způsobů včlenění.

Jiným možným způsobem řízení délky působení řízeným uvolňováním účinné látky je včlenění sloučeniny podle vynálezu do částic polymemího materiálu, jako jsou například polyestery, polyaminokyseliny, hydrogely, poly(mléčná kyselina) nebo ethylenvinylacetátové kopolymery.

Místo včleňování sloučeniny podle vynálezu do těchto polymemích částic je možno vnášet sloučeninu podle vynálezu do mikrokapslí, například konzervačním způsobem nebo mezifázovou polymerací například za získání hydroxymethylcelulózových nebo želatinových mikrokapslí, nebo do koloidního systému uvolňujícího účinnou látku, jako jsou liposomy, albuminové mikrokuličky, mikroemulze, nanočástice a nanokapsle, nebo do makroemulzí. Takové techniky jsou v oboru známy a jsou popsány například v publikaci Remingtion's Pharmaceutical Sciences (1980).

Sloučeniny podle vynálezu mají inzulinotropickou účinnost. Vynález se proto také týká způsobu podpory exprese inzulínu, přičemž se savčím pankreatickým B-typovým ostrůvkovým buňkám podává účinné množství sloučeniny podle vynálezu.

Podobně se vynález týká způsobu ošetřování diabetes mellitus nastupující v dospělém věku savců, zvláště lidí, přičemž se takovým lidem podává účinné množství sloučeniny nebo farmaceutického prostředku podle vynálezu.

Vynález objasňují, nijak však neomezují následující příklady praktického provedení.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

Jednotlivé podíly pěti různých GLP-1 molekul se připraví o sobě známým způsobem přípravy peptidu v pevné fázi a lyofilizují se v malých fiolách. Přidají se podíly 0,lM HEPES (N-[2hydroxyethyl]piperazin-N'-[2-ethansulfonová kyselina]) jakožto pufru o hodnotě pH 7,4, obsahující různá množství chloridu zinečnatého, do podílů k získání koncentrace proteinu přibližně 0,1 mg/ml. Vzorky se promísí a uschovají se při teplotě místnosti (22 °C) po dobu přibližně 18 hodin. Směs se pak odstřeďuje (mikroodstředivka Fisher Model 235C) po dobu 5 minut. Čirý supematant se pipetuje ze zkumavek. Obsah proteinu v supematantu se stanovuje měřením absorbance při 280 nm ve skeptrofotometru (Gilford 260). Teoretická hodnota absorbance pro roztoku GLP-1 molekul 0,1 mg/ml při této vlnové délce v 1 cm kyvetách je 0,207. Výsledky zkoušek jsou uvedeny v tabulce I.

-11CZ 292972 B6

Tabulka I

Zn/GLP-1 molekula	280 nm absorbance
Molámí poměr	GLP-1 (7-35)NH2	Gly8-GLP-1 (7-36)NH2	Val8 GLP-1 (7-37)OH	a-methyl Ala8-GLP-1 (7-36)NH2	Glys-Gln21GLP-1 (7-37)OH
0	0,172	0,736	0,187	0,163	0,167
0,3	0,099	0,079	0,791	0,134	0,113
0,5	0,057	0,070	0,784	0,098	0,082
0,7	0,035	0,058	0,180	0,079	0,069
1,0	0,039	0,057	0,173	0,076	0,065
3,0	0,048	0,044	0,170	0,055	0,055

Tento příklad dokládá, že toliko malé množství zinku je zapotřebí k vytvoření komplexu a k vysrážení značného množství GLP-1 molekul z jejich zředěných roztoků.

Příklad 2

Dokonale se rozpustí 5 mg GLP-1 (7-36)NH₂ ve 2,5 ml O,1M HEPES pufru o hodnotě pH 7,4 prostého zinku. Rychle se přidá dalších 2,5 ml O,1M HEPES pufru o hodnotě pH 7,4 obsahujícího 0,6 mM choridu zinečnatého. Přibližný molámí poměr zinku k GLP-1 (7-36)NH₂ je v tomto vzorku 1:1. Roztok se bezprostředně zakalí a rychle se vytvoří sraženina. Směs se 15 uloží při teplotě místnosti (22 °C) na dobu 18 hodin.

Sraženina se pevně váže na dno skleněné fioly. Supematant se dokonale dekantuje pipetou. Sraženina se pak dokonale rozpustí v 5,0 ml 0,ln kyseliny chlorovodíkové. Absorbance při 280 nm se stanoví jak pro supematant, tak pro roztoky získané rozpuštěním sraženiny. Koncen20 trace zinku v těchto roztocích se kvantitativně stanovuje atomovou absorpční spektrofotometru.

Výsledky této zkoušky j sou v tabulce II.

Tabulka II

	280 nm absorbance	Koncentrace zinku díly na milion
supematant (5 ml)	0,118	9,02
rozpuštěná sraženina (5 ml)	1,932	13,3

Tento příklad dokládá, že většina GLP-1 (7-36)NH₂ vysráží z roztoku, když se přidá roztok HEPES obsahující zinek. Hodnota absorbance 280 nm 1,932 dokládá, že koncentrace GLP-1 (736)NH₂ znova rozpuštěné sraženiny je 0,933 mg/ml nebo 283 μΜ. Koncentrace zinku v tomtéž 30 roztoku, 13,3 dílů na milion, je ekvivalentní koncentraci zinku 203 μΜ. Molámí poměr zinku ke GLP-1 (7-36)NH₂ ve sraženině je 0,717 až 1.

Průmyslová využitelnost

Molekulový komplex určitých GLP-1 molekul s dvoumocným kovovým kationtem, schopným společného vysrážení s GLP-1 molekulou, podporuje expresi inzulínu v β-typu ostrůvkových buněk a je vhodný pro výrobu farmaceutických prostředků proti diabetes mellitus nastupující v dospělém věku u savců, zvláště u lidí.

Claims (13)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Polypeptid obecného vzorce

   Ri-X-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Y-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-ZPhe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-R₂ ve kterém

   Ri je vybrán ze souboru zahrnujícího L-histidin, D-histidin, desaminohistidin, 2-aminohistidin, β-hydroxyhistidin, homohistidin, α-fluormethylhistidin a a-methylhistidin,

   X je vybrán ze souboru zahrnujícího Val, Thr, Ile a a-methyl-Ala,

   Y je vybrán ze souboru zahrnujícího Glu, Gin, Ala, Thr, Ser a Gly,

   Z je vybrán ze souboru zahrnujícího Glu, Gin, Ala, Thr, Ser a Gly,

   R₂ je vybrán ze souboru zahrnujícíhoNH₂ a Gly-OH, nebo jeho farmaceuticky přijatelná sůl, přičemž uvedený polypeptid má izoelektrický bod v rozmezí od 6,0 do 9,0.
2. 2. Polypeptid podle nároku 1, kde R] je vybrán ze souboru zahrnujícího L-histidin a desaminohistidin.
3. 3. Polypeptid podle nároku 1 nebo 2, kde X znamená Val.
4. 4. Polypeptid podle některého z nároků 1 až 3, kde Y je vybrán ze souboru zahrnujícího Glu a Gin.
5. 5. Polypeptid podle některého z nároků 1 až 3, kde Z je vybrán ze souboru zahrnujícího Glu a Gin.
6. 6. Polypeptid podle nároku 1, obecného vzorce

   Rj-X-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Y-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-ZPhe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-R₂ ve kterém

   Ri znamená L-histidin,

   X znamená Val,

   Y znamená Glu,

   Z znamená Glu a

   R₂ znamená Gly-OH.

   -13CZ 292972 B6
7. 7. Polypeptid podle nároku 1, obecného vzorce

   Ri-X-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Y-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Z5 Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-V al-Lys-Gly-Arg-R₂ ve kterém

   R] znamená L-histidin,

   X znamená Val,

   Y znamená Gin,

   15 Z znamená Glu a

   R₂ znamená Gly-OH.
8. 8. Molekulový komplex GLP-1, obsahující dvoumocný kovový kation a polypeptid podle 20 některého z nároků 1 až 7.
9. 9. Komplex podle nároku 8, kde dvoumocným kovovým kationtem je zinek.
10. 10. Použití účinného množství komplexu podle nároku 8 nebo 9 pro výrobu léčiva pro léčení 25 diabetes mellitus u savců, kteiý nastupuje v dospělosti.
11. 11. Použití účinného množství komplexu podle nároku 8 nebo 9 pro výrobu farmaceutického prostředku zaměřeného na pankreatické ostrůvkové buňky β-typu pro podporu exprese inzulínu.

    30
12. 12. Farmaceutický prostředek, vyznačující se tím, že obsahuje polypeptid nebo jeho farmaceuticky přijatelnou sůl podle některého z nároků 1 až 7 s alespoň jedním jeho farmaceuticky přijatelným nosičem, ředidlem nebo excipientem.
13. 13. Farmaceutický prostředek, vyznačující se tím, že obsahuje komplex podle nároku 35 8 nebo 9 s alespoň jedním jeho farmaceuticky přijatelným nosičem, ředidlem nebo excipientem.

    40 —-----------