PT1133312E - Uso sinergístico de tiazolidinodionas com péptido 1 semelhante ao glucagon e os seus agonistas para tratar diabetes não insulino-dependente - Google Patents

Description

ΡΕ1133312 1 DESCRIÇÃO "USO SINERGÍSTICO DE TIAZOLIDINODIONAS COM PÉPTIDO 1 SEMELHANTE AO GLUCAGON E OS SEUS AGONISTAS PARA TRATAR DIABETES NÃO INSULINO-DEPENDENTE"

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO A presente invenção refere-se a uma combinação de uma tiazolidinodiona(TZD), com péptido 1 semelhante ao glucagon (GLP-1) ou um agonista do GLP-1, essa combinação possui actividade hormonal desejada e pode ser usada para regular homeostase da glicose em doentes que sofrem de diabetes mellitus não insulino-dependente (diabetes Tipo II) ·

Resistência à insulina é uma caracteristica clássica de muitas condições de doenças humanas, por exemplo Diabetes Mellitus Não Insulino-dependente(DMNID), obesidade, hipertensão, envelhecimento, etc. Diabetes Mellitus é uma perturbação do metabolismo dos hidratos de carbono, caracterizada por hiperglicemia e glicosúria que resultam da produção ou utilização inadequada da insulina. DMNID é uma forma de diabetes onde a utilização da insulina é inadequada. Ocorre predominantemente em adultos, nos quais a produção adequada da insulina está disponível para uso, apesar disso existe um defeito na utilização e 2 ΡΕ1133312 metabolismo da glicose e tecidos periféricos mediados pela insulina. Para algumas pessoas com diabetes, uma mutação na codificação de gene(s) para a insulina, para receptor da insulina e/ou para factor(es) de transdução do sinal mediado (s) pela insulina conduz a insulina ineficaz e/ou efeitos mediados pela insulina, que comprometem a utilização ou metabolismo da glicose.

Diabetes mellitus frequentemente desenvolve-se a partir de certas populações em risco; sabe-se que uma dessas populações é de indivíduos com tolerância diminuída à glicose (TDG). 0 significado usual de tolerância diminuída à glicose é que é uma condição intermédia entre francos, diabetes mellitus não insulino-dependente e tolerância normal à glicose. TDG é diagnosticada por um procedimento em que a resposta à glicose pós-prandial de uma pessoa afectada é determinada ser anormal como avaliada por níveis de duas horas de glicose plasmática pós-prandial. Neste ensaio, uma quantidade calculada da glicose é fornecida ao doente e o nível da glicose no sangue avaliado a intervalos regulares, usualmente de 1/2 em 1/2 hora para as primeiras duas horas e de hora em hora daí em diante. Em um indivíduo "normal" ou não TDG, níveis da glicose sobem durante as primeiras duas horas para um nível menor que 140 mg/dL e depois descem rapidamente. Em um indivíduo debilitado (TDG) os níveis da glicose no sangue são mais elevados e o nível de queda gradual é a uma velocidade mais lenta. Uma elevada percentagem da população debilitada(TDG) sabe-se progredir para diabetes mellitus não insulino-dependente. 3 ΡΕ1133312 A patofisiologia de diabetes mellitus não insulino-dependente(DMNID) consiste em três componentes maioritários, (1) resistência periférica à insulina; (2) produção aumentada da glicose hepática; (3) diminuição de secreção da insulina. Investigação intensa tem sido devotada a cada uma destas áreas, independentemente, a fim de determinar qual é a anormalidade primária e quais são as secundárias. A opinião predominante é que uma abordagem farmacológica terapêutica racional devia envolver intervenção na resistência à insulina para melhorar homeostase da glicose. Suter et al., Diabetes Care 15:193-203 (1992). Como resultado da focalização em anormalidades individuais, várias terapêuticas modelo foram desenvolvidas para regular homeostase da glicose em doentes diabéticos Tipo II.

Quando se focaliza na resistência periférica à insulina, o fármaco de eleição é uma tiazolidinodiona, que é um tipo de agente insulino-sensibilizante. Troglitazo-na(TRG), por exemplo, é um agente antidiabético oralmente activo da série quimica da tiazolidinodiona. Este fármaco tem-se mostrado inverter a resistência à insulina em doentes com DMNID e tolerância dimunuida à glicose, e pode intensificar a acção da insulina em numerosos modelos genéticos e adquiridos de roedores de resistência à insulina. Os efeitos anti-hiperglicémicos de TRG resultam da sua capacidade em aumentar remoção da glicose insulino-dependente e reduzir produção da glicose hepática. Acredita-se, que ao intensificar a acção da insulina, o trata- 4 ΡΕ1133312 mento com TRG resulta em euglicemia a um nível inferior da insulina em circulação. A este respeito, estudos em roedores normais e diabéticos e ensaios clínicos em seres humanos não revelaram hipoglicemia como uma complicação da terapêutica com tiazolidinodiona. Por outro lado, administração destes fármacos a animais normais ou diabéticos com insuficiência da insulina falhou em alterar glicose plas-mática ou insulina ou tolerância à glicose, embora a sensibilidade à insulina foi todavia aumentada.

Os efeitos de TRG e outras tiazolidinodionas na remoção da glicose pensa-se resultarem da sensibilização à insulina, indicando um requisito necessário absoluto para insulina. Por outro lado, TRG melhora a sensibilidade à insulina como avaliado pelo grampo hiperinsulinémico. Suter et al., supra. Efeitos dependentes da dose de tiazolidinodionas em insulina plasmática e tolerância à glicose foram demonstrados em modelos de ratinhos e ratos salvo para o modelo de rato GK.

Inibir gliconeogénese in vivo resultaria em uma diminuição em reservas de glicogénio. Ao seguir o tratamento com TRG, presumivelmente começamos com uma pequena quantidade de glicogénio e por esse motivo mostra uma diminuição na produção total da glicose hepática. É também possível que TRG possua um efeito directo no caminho glicogenolítico. 0 exacto mecanismo bioquímico responsável por este efeito está ainda sob investigação. Dados in vivo e ex vivo no rato GK apoia ainda a possibilidade que os 5 ΡΕ1133312 efeitos deste fármaco no fígado e tecido periférico possam ser independentes e diferentes em alguns aspectos.

Tratamentos com tiazolidinodiona estão baseados na suposição que se você se focaliza na resistência periférica à insulina, produção aumentada de glicose hepática e diminuição de secreção da insulina serão aliviadas a seu devido tempo. Adicionalmente, determinar a dose óptima de TZD para aumentar sensibilidade à insulina tem sido uma tarefa difícil. Existe um dilema adicional que, mesmo à dose óptima, monoterapêutica com TZD causa hipertrofia cardíaca em modelos animais. Smits et al., Diabetologia 38:116-121 (1995). Este efeito secundário profere à monoterapêutica com TZD uma medida profiláctica indesejável no tratamento de diabetes mellitus Tipo II. A outra abordagem primária para tratar diabetes mellitus Tipo II focaliza-se em facilitar a secreção da insulina, usa agentes potências de secreção da insulina. As secreções endócrinas de ilhéus pancreáticos estão sob controlo complexo não só por metabolitos originários do sangue (glicose, aminoácidos, catecolaminas, etc.), mas também por influências parácrinas. As hormonas maioritárias de ilhéus pancreáticos (glucagon, insulina e somatostatina) interactuam entre os seus tipos específicos de células (células A, B e D, respectivamente) para modular respostas secretórias mediadas pelos metabolitos mencionados atrás. Embora secreção da insulina seja predominantemente controlada por níveis da glicose no sangue, somatostatina 6 ΡΕ1133312 inibe respostas secretórias da insulina mediada pela glicose. Além da proposta regulação parácrina inter-ilhéus de secreção da insulina, há evidência para apoiar a existência de factores insulinotrópicos no intestino. Por exemplo, glicose tomada oralmente é um estimulante muito mais potente de secreção da insulina do que é uma quantidade comparável da glicose dada por via intravenosa.

Ao focalizar-se em primeiro lugar na secreção da insulina endógena, este método confia na suposição que resistência periférica à insulina e produção aumentada da glicose hepática seriam reguladas só por tratamentos de secreção da insulina. Contudo, de igual importância ao tratamento eficaz de diabetes mellitus não insulino-dependente é a sensibilização à insulina que é a promoção de utilização da glicose por acção intensificada à insulina. Aumentar secreção e/ou síntese da insulina sem diminuir resistência à insulina tem pequeno efeito na utilização da glicose.

Tentativas para procurar resolver as múltiplas anormalidades associadas com diabetes mellitus não insulino-dependente têm chamado para a co-administração de GLP-1 em conjunção com glibenclamida, que é uma sulfonilureia. Ver Patente U.S. N° 5.631.224. Derivados da sulfonilureia estimulam secreção da insulina sem um efeito na síntese da insulina. As sulfonilureias actuam pelo encerramento de canais de potássio dependentes de ATP e células beta pancreáticas. Isto conduz a despolarização das membranas do plasma com abertura de canais de cálcio dependentes da 7 ΡΕ1133312 tensão com influxo de iões de cálcio. Iões de cálcio ligados a calmodulina, conduzem à activação da exocitose da insulina de uma maneira semelhante aquela encontrada depois de estimulação com glicose. Em contraste com convicções anteriores, algumas sulfonilureias, por exemplo glibencla-mida, podem interactuar com canais vasculares humanos dependentes de ATP. Isto pode ter consequências para respostas vasculares durante isquemia, que são, pelo menos em parte, mediadas por canais de potássio dependentes de ATP.

Durante isquemia em animais de experimentação, tem sido sugerido que o encurtamento do potencial de acção exerce um efeito de protecção, desse modo reduz contracti-lidade, necessidade de oxigénio e lesão de repercussão. Sob estas condições sulfonilureias por exemplo glibenclamida podem inibir os canais do cálcio no miocárdio isquémico, e assim evitar o encurtamento do potencial de acção. Isto pode resultar em menos vasodilatação coronária, mais lesão dos tecidos e mais arritmias de reperfusão.

Levando em consideração hipertrofia cardíaca, que é um efeito secundário de TZD e lesão aumentada dos tecidos que resultam de administração de sulfonilureia, uma nova abordagem para tratar diabetes mellitus Tipo II é necessária. A nova abordagem devia ser uma abordagem multifacetada para a patofisiologia de DMNID, que não é limitada ao tratamento só de resistência periférica à insulina, ou só secreção diminuída da insulina. 0 tratamento apropriado devia melhorar resistência periférica ΡΕ1133312 à insulina, aumentar produção da glicose hepática, e facilitar secreção da insulina sem hipertrofia cardíaca e lesão aumentada dos tecidos.

SOMARIO DA INVENÇÃO É portanto um objectivo da presente invenção preparar-se para o uso sinergístico de tiazolidinodionas e agonistas do péptido 1 semelhante ao glucagon, para tratar instabilidade metabólica associada com diabetes mellitus não insulino-dependente.

Ao realizar estes e outros objectivos, foi fornecido, de acordo com um aspecto da presente invenção, um uso terapêutico que compreende co-administrar uma dose farmacologicamente eficaz de um agonista do péptido GLP-1 e uma tiazolidinodiona, tal que os níveis da glicose no sangue sejam diminuídos e a secreção da insulina seja aumentada. A dose eficaz do agonista do péptido GLP-1 é na gama de 5 até 200 mg por dia. Numa forma de realização preferida, a invenção inclui co-administração de uma dosagem eficaz de trogliazona, e um agonista do péptido 1 semelhante ao glucagon.

Tiazolidinodionas podem ser usadas, em combinação com agonistas do péptido 1 semelhante ao glucagon, para tratar diabetes mellitus não insulino-dependente, opcionalmente com outras terapêuticas, pelo melhoramento do controlo glicémico enquanto minimização dos efeitos secundários, 9 ΡΕ1133312 por exemplo hipertrofia cardíaca, lesão dos tecidos e glicose plasmática elevada no estado alimentado, que estão associados com monoterapêuticas com TZD e GLP-1. A invenção diz respeito a um método de tratar diabetes mellitus não insulino-dependente, que compreende co-administrar uma dosagem eficaz de (a) um agonista do péptido GLP-1 (b) uma tiazolidinodiona. 0 agonista do péptido GLP-1 é seleccionado do grupo que consiste em Péptido l(7-37)OH Semelhante ao Glucagon, Péptido 1(7— 36)amida Semelhante ao Glucagon, VAL8-GLP-1 (7-37), GLY8-GLP-1(7-37), THR8-GLP-1(7-37), MET8-GLP-1(7-37), e IP7. A TZD pode ser seleccionada do grupo que consiste em piogli-tazona, troglitazona, rosiglitazona e TZD 300.512.

Em uma outra forma de realização, a invenção inclui um uso para tratar diabetes mellitus não insulino-dependente, que compreende co-administrar uma dosagem eficaz de (a) um agonista do péptido GLP-1 (b) uma tiazolidinodiona, onde a dosagem eficaz do agonista do péptido GLP-1 é na gama de cerca de 20 até cerca de 100 pg por dia. Em uma outra forma de realização, a dosagem eficaz da TZD é na gama de cerca de 0,1 até cerca de 200 miligramas por dia.

Em uma outra forma de realização, o agonista do péptido GLP-1 e a TZD são administrados simultaneamente, no uso para tratar diabetes mellitus não insulino-dependente, que compreende co-administração de uma dosagem eficaz de (a) um agonista do péptido GLP-1 (b) uma tiazolidinodiona. 10 ΡΕ1133312

Em ainda uma outra forma de realização o agonista do péptido GLP-1 e a TZD são administrados em sequência. A presente invenção também diz respeito a um método de tratamento de diabetes mellitus não insulino-dependente, que compreende co-administração de uma dosagem eficaz de (a) uma tiazolidinodiona e (b) um agonista do péptido 1 semelhante ao glucagon, tal que os níveis da glicose no sangue são diminuídos e a secreção da insulina é aumentada.

DESCRIÇÃO PORMENORIZADA DE FORMAS DE REALIZAÇAO PREFERIDAS

De acordo com a presente invenção, TZD e os seus derivados farmacologicamente activos podem ser usados, em combinação com GPL-1 e os seus agonistas, para tratar diabetes não insulino-dependente pelo melhoramento do controlo glicémico enquanto minimização dos efeitos secundários, por exemplo hipertrofia cardíaca e elevada glicose plasmática em estado alimentado, que estão associados com ambas as monoterapêuticas com TZD e GLP-1. Esta abordagem terapêutica pode ser empregue com outras terapêuticas que utilizam, por exemplo, proteínas, sulfonilureias, biguanidas, e/ou inibidores da 2-glicosidase, para melhorar controlo glicémico e minimizar os efeitos secundários associados com terapêuticas individuais.

Tiazolidinodionas e agonistas do GLP-1 foram submetidos a avaliação para eficácia em tratar dibetes tipo 11 ΡΕ1133312 II. Tiazolidinodionas têm mostrado, em vários modelos animais insulino-resistentes tipo II, alterar o metabolismo de hidratos de carbono e glicose favoravelmente, que melhora resistência à insulina. Além do aumento de sensibilidade à insulina, TZD também causa hipertrofia cardíaca em doses óptimas em modelos animais. Por contraste, agonistas do GLP-1, por exemplo IP7, são antidiabéticos devido à sua actividade de libertação da insulina de forma dependente de glicose. Em estudos recentes em doentes diabéticos tipo II, prefusão de GLP-1 reduz excursões da glicose após comida, reduz requisitos necessários da insulina relacionados com comida, e baixa os níveis de glucagon; contudo, resultou na lesão aumentada dos tecidos.

Como demonstrado na presente especificação, o uso sinergístico de uma TZD, e um agonista do GLP-1, levou a resultados favoravelmente inesperados. Estudos foram desenhados para avaliar os efeitos de um agonista do GLP-1 e uma TZD, como uma terapêutica de combinação, no metabolismo da glicose, e na ocorrência de hipertrofia cardíaca associada com monoterapêutica com TZD, em ratos diabéticos. Os dados mostraram que a hipertrofia cardíaca associada com monoterapêutica com TZD foi evitada quando uma TZD foi administrada em conjunção com um agonista do GLP-1. 0 melhoramento foi estatisticamente significativo, usando um teste t. Por conseguinte, este novo método evitou os efeitos cardiovasculares associados com agentes insulino-estimulantes. 12 ΡΕ1133312

Além disso, como pormenorizado aqui, os níveis da glicose plasmática de ratos diabéticos tratados com monoterapêuticas com GLP-1 e TZD aumentaram durante um período de tratamento de 42 dias. Em contraste, quando uma TZD e GLP-1 foram co-administrados, os ratos mostraram uma leve diminuição nos níveis da glicose plasmática seguida por um nível de estado estacionário durante o período de tratamento de 42 dias. Por conseguinte, a nova terapêutica de combinação da presente invenção aumenta o controlo glicémico, mas não causa hipertrofia cardíaca, em ratos diabéticos.

Desta maneira, a co-administração de uma molécula de TZD e uma de GLP-1 devia aumentar a regulação de homeostase da glicose em doentes humanos com DMNID, sem os efeitos secundários associados com agentes potenciais de secreção da insulina e agentes insulino-sensibilizantes.

I. TERMOS

Os termos que se seguem são usados neste pedido:

Co-administração - Como usado neste pedido, "co-administração" significa a administração de dois ou mais compostos ao mesmo doente, dentro de um período de tempo acima de cerca de três até cerca de quatro horas. Por exemplo, co-administração abrange (1) administração simultânea de um primeiro e segundo composto; (2) administração de um primeiro composto, seguida por administração de um 13 ΡΕ1133312 segundo composto cerca de 2 horas depois de administração do primeiro composto; (3) administração de um primeiro composto, seguida por administração de um segundo composto cerca de 4 horas depois de administração do primeiro composto. Como descrito aqui, a presente invenção abrange co-administração de uma molécula TZD e uma de GLP-1 a um doente que sofre de diabetes mellitus não insulino-dependente.

Agente potencial de secreção da insulina: Qualquer composto, que estimula a secreção da insulina quer o composto possua um efeito na síntese da insulina, quer não. 0 mecanismo mais comum pelo qual estes compostos estimulam a insulina é por vários efeitos em canais de potássio dependentes de ATP em células pancreáticas beta. Agentes potenciais de secreção da insulina são tipicamente sulfo-nilureias, secretagogos não sulfonilureia da insulina, ou hormonas incretinas. Péptido 1 Semelhante Ao Glucagon (GLP-1): Um fragmento insulinotrópico da molécula de proglucagon. Duas formas mais curtas de GLP-1, a (7-37) e (7-36) amidas, são estimuladoras fortes de secreção da insulina de forma dependente da glicose, como demonstrado in vitro e in vivo.

Insulinotrópica: A capacidade de uma substância de estimular ou causar a estimulação de, a síntese, expressão e/ou mobilização da hormona insulina. 14 ΡΕ1133312

Tiazolidinodionas(TZDs): Uma classe de compostos que trabalha por aumento da acção da insulina e promoção da utilização da glicose em tecido periférico. TZDs incluem compostos conhecidos na arte como "derivados de TZD". TZDs não têm efeito na secreção da insulina. Elas aparentemente trabalham por aumento da acção da insulina e por conseguinte promoção da utilização da glicose em tecidos periféricos, possivelmente por estimulação do metabolismo não oxidativo da glicose no músculo, e supressão da glico-neogénese no fígado. Os compostos químicos que compreendem a classe de compostos Tiazolidinodiona(TZD) é excepcional-mente grande. Ver, por exemplo, Bowen, et al. Metabolism 40:1025 (1991); Chang, et al. Diabetes 32:630 (1984);

Colca, et al. Metabolism 37:276 (1988); Diani, et al.

Diabetologia 27:225 (1984); Fujita, et al. Diabetes 32:804 (1983); Fujiwara, et al. Diabetes 37:1549 (1988). Exem plares da família de tiazolidinodionas são troglitazona, ciglitazona, pioglitazona (ver Pat. U.S. NoS 4.687.777 e 4.287.200), englitazona, CS-045 [ (±)-5[4-(6-hidroxi-2,5,7,8-tetrametilcromano-2-YL-metoxi)benzil]-2,4-tiazolidinodio-na], TZD 300.512, e BRL 49.653. TZDs preferidas da presente invenção incluem pioglitazona, troglitazona, rosiglitazona e TZD 300.512.

Preparação: A formulação do composto activo com material encapsulante como um veículo que fornece uma cápsula na qual o componente activo com ou sem outros veículos, é rodeado por um veículo, que está por 15 ΡΕ1133312 conseguinte em associação com ele. Isto inclui comprimidos, pós, cápsulas, pilulas, hóstias, e pastilhas que podem ser usados como formas de dosagem sólida apropriadas para administração oral.

Dosagem eficaz: Uma dosagem eficaz é a quantidade de um composto que evita ou melhora condições adversas ou sintomas de doença(s) ou perturbação(ões) a serem tratadas. Com respeito às tiazolidinodionas, dosagem eficaz significa uma dose farmacológica na gama de 0,1 mg/dia até 200 mg/dia. Uma gama de dosagem preferida é 50 mg/dia até 200 mg/dia. O artífice experiente compreenderá e apreciará que a dosagem eficaz de uma dada TZD variará com a potência da TZD. Com respeito a moléculas de GLP-1, dosagem eficaz é na gama de 5 até 200 yg por dia, preferencialmente 20 até 100 yg/dia, mais preferencialmente 30 até 50 yg/dia. O artífice experiente compreenderá e apreciará que a dosagem eficaz de uma dada molécula de GLP-1 dependerá da potência da molécula particular que é usada. II. MOLÉCULAS DE GLP-1 GLP-1 (7-37) que ocorrem Péptido 1 semelhante ao glucagon (GLP-1) e os seus análogos potenciam secreção da insulina, e têm sido sugeridos possuir um efeito na utilização da glicose em tecidos periféricos. GLP-1 e os seus análogos são conhecidos na arte. Ver, por exemplo, Patente U.S. N° 5.705.483. Como usado na presente especificação, o termo "molécula de GLP-1" refere-se a GLP-1(7-36)NH2, 16 ΡΕ1133312 naturalmente, análogos funcionais naturais e não naturais, variantes, e os seus derivados, e os seus sais. Estas moléculas estão descritas em maior pormenor adiante. A hormona humana glucagon é uma hormona peptidica de 20 aminoácidos produzida nas células A do pâncreas. A hormona pertence a uma família multigene de péptidos estruturalmente relacionados que incluem péptido de secreção, inibitório gástrico, um péptido do intestino vasoactivo e glicentina. Estes péptidos regulam de modo variado o metabolismo dos hidratos de carbono, mobilidade gastrointestinal e processamento secretório. As principais acções reconhecidas do glucagon pancreático, contudo, são promover glicogenólise hepática e gliconeogénese, que resulta em uma elevação de níveis do açúcar no sangue. A este respeito, as acções do glucagon são contra-reguladoras às da insulina e podem contribuir para a hiperglicemia que acompanha diabetes mellitus. Lund et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 79:345-49 (1982).

Glucagon verificou-se ser capaz de se ligar a receptores específicos, que assentam na superfície das células produtoras da insulina. Glucagon, quando ligado a estes receptores, estimula a síntese rápida de AMPc por estas células. AMPc, por sua vez, verificou-se estimular expressão da insulina Korman et al., Diabetes 34:717-722 (1985) . A insulina actua para inibir síntese do glucagon, Ganong, Review of Medicai Physiology 273 (1979). Por conseguinte, a expressão do glucagon é cuidadosamente 17 ΡΕ1133312 regulada por insulina, e em última análise pelo nivel da glicose no soro. 0 gene do glucagon é inicialmente traduzido a partir de um precursor com 360 pares de bases para formar o polipéptido pré-proglucagon, Lund et al., Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 79:345-349 (1982). Este polipéptido é subsequentemente processado para formar proglucagon. Patzlet et al., Nature 282:260-266 (1979), demonstraram que o proglucagon foi subsequentemente clivado em glucagon em um segundo polipéptido. Subsequente trabalho por Lund et al., Lopez et al., Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 80:5.485-5.489 (1983), e Bell et al., Nature 302:716-718 (1983), demonstrou que a molécula do proglucagon foi clivada imediatamente depois de resíduos dipeptídicos de lisina-arginina. Estudos do proglucagon produzidos por peixe-gato pontuado (ictalurus punctata) indicaram que o glucagon deste animal foi também clivado por via proteolítica depois de avançados resíduos dipeptídicos de lisina-arginina, Andrews et al., J. Biol. Chem. 260:3.910-3.914 (1985),

Lopez et al., Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A., 80:5.485-5.489 (1983) .

Bell et al., supra, constataram que o proglucagon de mamíferos foi clivado em lisina-arginina ou arginina-dipéptidos, e demonstraram que a molécula do proglucagon continha três moléculas peptídicas distintas e altamente homólogas que foram designadas glucagon, péptido 1 semelhante ao glucagon (GLP-1) e péptido 2 semelhante ao 18 ΡΕ1133312 glucagon (GLP-2). Lopez et al., concluíram que GLP-1 tinha o comprimento dos resíduos de 37 aminoácidos e que GLP-2 tinha o comprimento dos resíduos de 35 aminoácidos. Estudos análogos na estrutura de pré-proglucagon de ratos revelaram uma forma semelhante de clivagem proteolítica entre resíduos dipeptídicos adjacentes de lisina-arginina ou arginina-arginina, que resultam na formação do glucagon, GLP-1 e GLP-2 Heinrich et al., Endocrinology 115:2.175-2.181 (1984). Sequências de GLP-1 humanas, de ratos, bovinos e hamsters verificou-se serem idênticas Ghiglione et al., Diabetologia 27:599-600 (1984). A conclusão alcançada por Lopez et al., com respeito ao tamanho de GLP-1 foi confirmada pelo trabalho de Uttenthal et al., J. Clin. Endocrinol. Metabol. 61:472-479 (1984). Uttenthal et al., examinaram as formas moleculares de GLP-1 que estavam presentes no pâncreas humano. A investigação mostrou que GLP-1 e GLP-2 estão presentes no pâncreas como péptidos de 37 aminoácidos e de 34 aminoácidos, respectivamente. A semelhança entre GLP-1 e glucagon sugeriu a investigadores anteriores que GLP-1 pode possuir activi-dade biológica. Embora alguns investigadores verificassem que GLP-1 podia induzir células cerebrais de ratos a sintetizar AMPc Hoosein et al., FEBS Lett. 178:83-86 (1984), outros investigadores fracassaram em identificar qualquer função fisiológica para GLP-1, Lopez et al, . supra. O fracasso em identificar qualquer função 19 ΡΕ1133312 fisiológica para GLP-1 causou a alguns investigadores questionar se GLP-1 era de facto uma hormona e se a relacionação entre glucagon e GLP-1 podia ser artefactual. É agora conhecido que as várias formas expostas de GLP-1 são conhecidas em estimular secreção da insulina (acção insulinotrópica) e formação de AMPc, ver, e.g., Mojsov, Int. J. Peptide Protein Research 40:333-343 (1992). Mais notavelmente, múltiplos autores têm demonstrado o nexo entre experimentação laboratorial e mamífera, particularmente humana, respostas insulinotrópicas à administração exógena de GLP-1, particularmente, GLP-1(7-36)NH2 e GLP-1(7-37), ver, e.g., Nauck et al., Diabetologia 36:741-744 (1993); Gutniak et al., New England J. of Medicine 326(20):1.316-1.322 (1992); Nauck et al., J. Clin. Invest. 91:301-307 (1993); e Thotenes et al., Diabetes 42:1.219— 1.225 (1993) . GLP-1(7-36)NH2 é bem conhecido na arte, mas é apresentado aqui como uma conveniência para o leitor. His7-Ala-Glu-Gly10-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp15-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu20-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala25-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala30-Trp-Leu-Val-Lys-Gly35-Arg-NH2 (SEQ ID NO:l).

Para GLP-1 (7-37), a funcionalidade da amida no terminal carboxilo de Arg36 é substituída por Gly na 37a posição da molécula de GLP-1 (7-36)NH2. Além disso, a existência e preparação de uma multitude de análogos e derivados funcionais protegidos, não protegidos, e 20 ΡΕ1133312 parcialmente protegidos naturais e não naturais de moléculas de GLP-1(7-36)NH2 e GLP-1 (7-37) têm sido descritos na arte. Ver, por exemplo . Pat. U.S. NoS 5.120.712 e 5 .118.666; e Orskov, c., et al., J. Biol.

Chem., 264(22):12.826 (1989) e WO 91/11457 (Buckley, D.I., et al., published August 8, 1991).

Variantes de GLP-l(7-37) e os seus análogos também têm sido expostos. Estas variantes e análogos incluem, GLN9-GLP-1(7-37), D-GLN9-GLP-1(7-37) , acetil LYS9-GLP-1 (7-37) , THR16-LYS16-GLP-1 (7-37) , LYS18-GLP-1 (7-37) , e GLP (7-37)OH(a/k/a IL7), e outros semelhantes, e os seus derivados que incluem, por exmplo, sais ácidos de adição, sais de carboxilato, ésteres de alquilo inferior, e amidas. Ver, por exemplo, WO 91/11457. Análogos de GLP-l(7-37) preferidos da presente invenção incluem VAL8-GLP-1(7-37), GLY8-GLP-1 (7-37), THR8-GLP-1(7-37) , MET8-GLP-1(7-37) , e IP7. "IP7" é um análogo de GLP-1 que é 4-imidazopropionil-GLP-l(7-37)OH. Durante toda esta descrição pormenorizada, este composto 4-amidazo é referido como "IP7-GLP-1(7-37)OH" ou "IP7". Este análogo é de facto desamino-histidilo na posição 7 (terminal amino) de GLP-1 (7-37)OH. Este composto, e a sua síntese, está descrito na Patente U.S. N° 5.512.549.

III. COMPOSIÇÕES

Os defeitos fundamentais identificados que causam hiperglicemia e diabetes não insulino-dependente são secre- 21 ΡΕ1133312 ção diminuída da insulina endógena e resistência aos efeitos da insulina pelo músculo e fígado, ver Galloway, Diabetes Care 13:1.209-1.239 (1990). O último defeito resulta em produção em excesso da glicose pelo fígado. Por conseguinte, ao passo que um indivíduo normal liberta glicose a uma velocidade de aproximadamente 2 mg/kg/minuto, em doentes com diabetes não insulino-dependente, esta quantidade usualmente excede 2,5 mg/kg/minuto, que resulta em um excesso efectivo de pelo menos 70 gramas de glicose por 24 horas. Porque existe uma correlação excessivamente alta entre produção da glicose hepática, glicose sanguínea em jejum e total controlo metabólico (como avaliado por níveis da glico-hemoglobina), Galloway, supra; e Galloway et al., Clin. Therap. 12:460-472 (1990), foi aparente aos insvestigadores que controlo da glicose sanguínea em jejum é um sine qua non para alcançar total normalização de metabolismo suficiente para evitar a complicação de hiperglicemia. Com vista ao facto que presentes formas da insulina raramente normalizam produção da glicose hepática sem que produzam significante hiperinsulinemia e hipoglicemia, Galloway e Galloway et al., supra, abordagens alternativas são necessárias. A presente invenção refere-se à inesperada constatação que co-administração de uma molécula de TZD e uma de GLP-1 exerce efeitos sinergísticos beneficiais em níveis da glicose, níveis da insulina, e peso do coração, em mamíferos diebéticos. Como discutido aqui, "co-administração" significa a administração de dois ou mais 22 ΡΕ1133312 compostos ao mesmo doente, dentro de um período de tempo de acima de cerca de três até cerca de quatro horas.

Formulações farmacêuticas das moléculas de TZD e GLP-1 podem ser preparadas de acordo com métodos conhecidos. A molécula de GLP-1 e a de TZD podem ser preparadas juntamente ou preferencialmente em etapas separadas. A via preferida de administrar a molécula de GLP-1 é administração parentérica. A via preferida de administrar a TZD é administração mucosa, mais preferencialmente ainda administração oral. Contudo, é possível administrar ambas a molécula de GLP-1 e a de TZD por administração parentérica. Se uma TZD é administrada por via parentérica, o artífice experiente compreenderá e apreciará que essas técnicas descritas adiante para preparação de uma molécula de GLP-1 podem ser usadas para preparar uma formulação parentérica de uma TZD. A. Agonista do péptido GLP-1 0 agonista do péptido GLP-1 é combinado em mistura adicionada com um veículo transportador farmaceuti-camente aceitável. Veículos apropriados e a sua formulação, incluindo outras proteínas humanas, por exemplo albumina do soro, estão descritos em Remington's PHARMACEUTICAL SCIENCES, 16th ed. (1980), por exemplo. A fim de formar uma composição farmaceuticamente aceitável apropriada para administração eficaz, essas composições conterão uma quantidade eficaz de um agente, por exemplo uma molécula de 23 ΡΕ1133312 GLP-1, junto com uma quantidade apropriada de veiculo transportador.

Composições que contêm uma molécula de GLP-1 podem ser administradas por via intravenosa, por via intramuscular, por via subcutânea ou por vias pulmonares, por exemplo inalação. Dosagens podem ser na gama de desde 20 até 100 yg/dia, embora uma dosagem mais baixa ou mais alta possa ser administrada, se apropriado. Uma gama de dosagem preferida para uma molécula de GLP-1 é 30 até 50 yg/dia. A dosagem requerida pode depender da gravidade da condição do doente e dos critérios por exemplo a altura do doente, peso, sexo, idade, e historial médico.

Para o objectivo de administração parentérica, composições que contêm uma molécula de GLP-1 são dissolvidas em água destilada e o valor do pH é ajustado a cerca de 6 até 8. A fim de facilitar o processo de liofilização que resulta em um produto apropriado, um açúcar por exemplo lactose podia ser adicionado. A solução é depois esterilizada em coador, introduzida em frascos-ampola, e liofilizada. A concentração da molécula de GLP-1 nestas composições pode variar desde 10“12 M até 10~5 M. Métodos farmacêuticos adicionais podem ser empregues para controlar a duração da acção. Preparações de libertação controlada podem ser alcançadas pelo uso de polímeros para complexar ou absorver moléculas de GLP-1. A destribuição controlada pode ser exercida por selecção de 24 ΡΕ1133312 macromoléculas apropriadas, por exemplo poliésteres, poliaminoácidos, polivinilpirrolidona, vinilacetato de etileno, metilcelulose, carboxi metilcelulose e sulfato de proamina, e a concentração de macromoléculas, bem como os métodos de incorporação de macromoléculas, a fim de controlar libertação. Uma outra abordagem para controlar a duração da acção por meio de libertação controlada impõe incorporar moléculas de GLP-1 em partículas de um material polimérico, por exemplo um poliéster, um poliaminoácido, um hidrogel, um ácido poliláctico, ou um polímero de vinilacetato de etileno. Alternativamente, é possível capturar uma molécula de GLP-1 em microcápsulas preparadas, por exemplo, por técnicas de coacervação ou por polimerização interfacial, por exemplo, hidroximetilcelulose ou microcápsulas de gelatina, respectivamente, ou em sistemas de destribuição de fármaco coloidal, por exemplo, liposomas, microesferas de albumina, microemulsões, nanopartículas, e nanocápsulas ou em macroemulsões. Esses ensinamentos estão expostos em Remington's FARMACEUTICAL SCIENCES, supra.

B. TZDS

Para preparar composições farmacêuticas a partir de uma TZD, veículos farmaceuticamente aceitáveis podem ser ou sólidos ou líquidos. Preparações de forma sólida incluem pós, comprimidos, pílulas, cápsulas, hóstias, supositórios, e grânulos dispersos. Um veículo sólido pode ser uma ou mais substâncias que podem também actuar como diluentes, agentes aromatizantes, aglutinantes, conservantes, agentes 25 ΡΕ1133312 de desintegração de comprimidos, ou um material de encapsulação.

Em pós, o veiculo é um sólido finamente dividido que está em uma mistura com o componente activo finamente dividido. Em comprimidos, o componente activo é misturado com o veiculo que possui as propriedades aglutinantes necessárias em proporções apropriadas e compactado na forma e tamanho desejados. Os pós e comprimidos preferencialmente contêm desde cinco ou dez até cerca de setenta por cento do composto activo. Veículos apropriados são carbonato de magnésio, estearato de magnésio, talco, açúcar, pectina, dextrina, amido, gelatina, tragacante, metilcelulose, carboxi metilcelulose sódica, uma cera de baixo ponto de fusão, manteiga de cacau, e outros semelhantes.

Para preparar supositórios, uma cera de baixo ponto de fusão, por exemplo mistura de glicéridos de ácidos gordos ou manteiga de cacau, é primeiro derretida e o componente activo é disperso homogeneamente ali, por agitação. A mistura homogénea derretida é depois vazada em moldes de tamanho conveniente, deixada a arrefecer, e desse modo a solidificar.

Preparações de forma líquida incluem soluções, suspensões, e emulsões, por exemplo, água ou soluções de água e propilenoglicol. Para preparações liquidas de injecção parentérica podem ser formuladas em solução e numa solução aquosa de polietilenoglicol. 26 ΡΕ1133312

Soluções aquosas apropriadas para uso oral podem ser preparadas por dissolução do componente activo em água e adição de apropriados agentes corantes, aromatizantes, estabilizantes e de espessamento como desejado. Suspensões aquosas apropriadas para uso oral podem ser feitas por dispersão do componente activo finamente dividido em água com material viscoso, por exemplo gomas naturais ou sintéticas, resinas, metilcelulose, carboxi metilcelulose sódica, e outros agentes de suspensão bem conhecidos.

Também incuidas estão preparações de forma sólida que tencionam ser convertidas, pouco tempo antes de usar, em preparações de forma liquida para administração oral. Essas formas liquidas incluem soluções, suspensões, e emulsões. Estas preparações podem conter, além do componente activo, agentes corantes, aromatizantes, estabilizadores, tampões, edulcorantes artificiais e naturais, dispersantes, de espessamento, solubilizantes, e outros semelhantes. A preparação farmacêutica é preferencialmente em forma farmacêutica unitária. Em essa forma a preparação é subdividida em doses unitárias que contêm quantidades apropriadas do componente activo. A forma farmacêutica unitária pode ser uma preparação embalada, a embalagem que contem quantidades distintas da preparação, por exemplo comprimidos, cápsulas, e pós embalados em frascos-ampola ou ampolas. Também, a forma farmacêutica unitária pode ser 27 ΡΕ1133312 ela própria uma cápsula, comprimido, cápsula tipo hóstia, ou pastilha, ou pode ser o número apropriado de qualquer destas em forma embalada. A quantidade de componente activo em uma preparação de dose unitária pode ser variada ou ajustada desde 50 yg até 100 mg, mais usualmente desde 1 mg até 10 mg do componente activo, de acordo com o pedido particular e a potência do composto activo. A composição pode, se desejado, também conter outros agentes terapêuticos compatíveis, além da TZD.

Dosagens podem ser na gama de desde 0,1 até 200 mg/dia, embora uma dosagem mais baixa ou mais alta possa ser administrada, se apropriado. Uma gama de dosagem preferida para uma TZD é 50 até 200 mg/dia. A dosagem requerida pode depender da gravidade da condição do doente e desses critérios como altura do doente, peso, sexo, idade, e historial médico. C. Co-Administração A presente invenção contempla usar TZD e derivados de TZD em combinação com agonistas de GLP-1, para regular homeostase da glicose em doentes com diabetes tipo II. Esta abordagem terapêutica pode ser empregue com outras terapêuticas, que usam proteínas, sulfonilureias, biguani-das, e/ou inibidores da 2-glicosidase, por exemplo, para melhorar controlo glicémico e para minimizar os efeitos secundários associados com terapêutica individual. 28 ΡΕ1133312

Mais geralmente, a presente invenção encontrará aplicação no tratamento de indivíduos em risco, por exemplo esses com tolerância diminuída à glicose, para evitar, atrasar ou tratar o início de DMNID e complicações surgidas disso. Para este efeito, compostos são co-administrados, como descrito atrás, ou juntos ou em uma forma progressiva, com um veículo farmaceuticamente aceitável na dosagem inicial de cerca de 0,1 até cerca de 200 mg/dia da TZD e cerca de 20 até 100 yg/dia do agente potencial de secreção da insulina. Uma gama de dosagem diária preferida é cerca de 50 até cerca de 200 mg/dia para a TZD e cerca de 30 até cerca de 50 yg/dia do agente potencial de secreção da insulina. As dosagens podem ser variadas, contudo, dependem dos requisitos necessários do doente, a gravidade da condição a ser tratada, e dos compostos particulares empregues.

Por conseguinte, determinação da dosagem própria para uma situação particular está dentro da perícia da arte. Em geral, o tratamento é iniciado com dosagens mais pequenas que são menos que a dose óptima dos compostos. Daí em diante, a dosagem é aumentada em pequenos incrementos até que o efeito óptimo devido às circunstâncias seja alcançado. Para conveniência, a dosagem diária total pode ser dividida e administrada em porções durante o dia, se desejado.

Os aspectos expostos na presente descrição, 29 ΡΕ1133312 exemplos e reivindicações, ambos separadamente e em sua combinação, são matéria-prima para realizar esta invenção e as suas formas diversas. A invenção é além disso ilustrada pelos exemplos que se seguem, que não devem ser analisados como limitativos, mas meramente como uma ilustração de alguns aspectos preferidos da invenção. EXEMPLO 1

Efeito Sinergístico de uma Co-Administração de Derivado de TZD e Molécula de GLP-1 em Peso de Coração, Glicose no Sangue e Níveis da Insulina

Tiazolidinodionas têm sido ilustradas em vários modelos de animais tipo II resistentes à insulina para favoravelmente alterarem metabolismos de hidratos de carbono e lipidos, que melhoram resistência à insulina. TZD 300.512 (TZD) é uma tiazolidinodiona potente. Ver Pedido de Patente Europeia EP 0 177 353. Além de aumentar sensibilidade à insulina, TZD também aumenta peso corporal e causa hipertrofia cardíaca em doses óptimas. Em contrate, GLP-1(7-37)OH é antidiabético devido à sua actividade potente de libertação da insulina de forma dependente da glicose. Em estudos recentes em doentes diabéticos Tipo II, prefusão de GLP-1 reduziu ambas as excursões da glicose após comida, reduziu requisitos necessários da insulina relacionados com comida, e diminuiu níveis do glucagon.

Este estudo foi desenhado para avaliar os efeitos de uso de uma combinação de doses subóptimas de uma TZD e 30 ΡΕ1133312 um agonista do GLP-1 em metabolismo da glicose e além disso, se esta terapêutica de combinação evitasse ocurrência de hipertrofia cardíaca que está associada com doses óptimas de derivados de TZD. Ratos Zucker de oito semanas Gordos Diabéticos (Modelos Genéticos, Inc.) (ZDF) com peso de cerca de 350 gramas foram usados neste estudo. Aos animais foi-lhes permitido livre acesso à água, e comida de Purina Fórmula b 5.008. TZD 300.512 foi administrada a 0,00006% como mistura adicionada da dieta enquanto IP7-GLP-1(7-37)OH, um agonista do GLP-1, foi infundido por via subcutânea a uma velocidade constante de 0,06 ug/min por meio de bombas Aztet implantadas. A duração do estudo foi de sete semanas, e consumo alimentar e peso corporal foram monitorizados diariamente. Glicose plasmática e níveis da insulina foram medidos semanalmente, e hemoglobina Glicada Alc foi medida no fim do estudo. Pesos do coração também foram medidos no fim do estudo.

Os dados destes estudos, que estão resumidos na Tabela 1, demonstram controlo elevado da glicose no rato ZDF com co-administração de doses subóptimas de IP7 e TZD sem causar hipertrofia cardíaca. A Tabela 1 resume peso final do rato, consumo alimentar, níveis da glicose plasmática, níveis da insulina plasmática, Hbalc, e peso do coração. Os valores foram arredondados à casa decimal mais próxima. No conjunto, os dados na Tabela 1 demonstram contolo glicémico elevado sem um aumento no tamanho do coração em doses subóptimas de terapêutica de combinação de TZD e agonista do GLP-1. ΡΕ1133312 31

Tabela 1 - Resumo de Dados

Controlo TZD TZD+IP7 1—1 Peso(g) 414,6±8,2 510,7113,5 498,415,8 414,717,9 Cons Alimentar(g/d) 37,911,7 37,311,4 34,310,9 30,411,2 Glicose (mg/dL) 639,2129 330,0160,5 166,2113,3 367,5158,0 Insulina(ng/mL) 4,6111,2 19,713,4 19,911,5 13,012,9 Hbalc (%) 12,910,3 8,211,1 5,010,21 9,511,0 Peso do coração(g) 1,210,5 1,310,5 1,210,01 1,210,03 0 peso do coração não foi significativamente aumentado no grupo de TZD/IP7, comparado com o grupo de controlo, e o peso do coração no grupo de TZD/IP7 foi mais baixo que nos ratos tratados só com TZD. Por esse motivo, a hipertrofia cardíaca associada com monoterapêutica com TZD foi evitada quando TZD foi administrada em conjunção com um agonista do GLP-1. Além do mais, não houve nenhum dos efeitos adversos cardiovasculares associados com agentes insulino-estimulantes. Por exemplo, ver Smits et al., Dibetologia 38:116-121 (1995).

Em contraste com o controlo de ratos diabéticos, níveis da glicose foram mais baixos no grupo TZD/IP7. Em particular, os níveis da glicose plasmática em estado alimentado de ratos diabéticos tratados com monoterapêutica com TZD e agonista do GLP-1 foram 51,6% e 57,5% de níveis de controlo, respectivamente, durante um período de tratamento de 42 dias. Em contraste, níveis da glicose em ratos tratados com co-administração de TZD e GLP-1 foram 32 ΡΕ1133312 26% dos níveis de controlo, o que demonstra uma melhoria significativa no controlo da glicose plasmática. Além disso, durantes estas experiências, uma leve diminuição em níveis da glicose plasmática foi observada, seguida de um nível de estado estacionário durante o tempo do tratamento de 42 dias.

Finalmente, comparados com os grupos não tratados, níveis da insulina foram preservados nos grupos tratados com TZD, o que sugere impedimento de deterioração de células beta com terapêutica.

Lisboa, 20 de Novembro de 2007

Claims (13)

1. ΡΕ1133312 1 REIVINDICAÇÕES 1. Uso de uma quantidade eficaz de um agonista do péptido GLP-1 na preparação de um medicamento para o tratamento de diabetes mellitus não insulino-dependente em que o tratamento compreende a co-administraçâo de uma quantidade eficaz de um agonista do péptido GLP-1 com uma quantidade eficaz de uma tiazolidinodiona em que a quantidade eficaz de agonista do péptido GLP-1 é na gama de 5 até 200 yg por dia.
2. 2. Uso de acordo com a reivindicação 1, em que a tiazolidinodiona é proglitazona ou rosiglitazona.
3. 3. Uso de acordo com a reivindicação 1 ou reivindicação 2, em que o tratamento compreende a co-administração de uma tiazolidinodiona dentro de um periodo de tempo acima de três horas até quatro horas de administração do agonista do péptido GLP-1.
4. 4. Uso de acordo com a reivindicação 3, em que o tratamento compreende a co-administração de uma tiazolidinodiona dentro das duas horas de administração do agonista do péptido GLP-1.
5. 5. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, em que o tratamento compreende administração simultânea do agonista do péptido GLP-1 e da tiazolidinodiona. 2 ΡΕ1133312
6. 6. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 até 4, em que o tratamento compreende administração sequente do agonista do péptido GLP-1 e da tiazolidinodiona.
7. 7. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, em que o agonista do péptido GLP-1 é um análogo de GLP-1 que compreende Valina, Glicina, Teorina, ou Metionina na posição 8.
8. 8. Uso de acordo com com qualquer uma das reivindicações precedentes, em que a quantidade eficaz do agonista do péptido GLP-1 é na gama de 20 até 100 yg por dia.
9. 9. Uso de acordo com a reivindicação 8, em que a quantidade eficaz do agonista do péptido GLP-1 é na gama de 30 até 50 yg por dia.
10. 10. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, em que o tratamento compreende a administração do agonista do péptido GLP-1 como uma composição que compreende uma molécula de GLP-1 a uma concentração entre 10’12 M e 10’5 M.
11. 11. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, em que a quantidade eficaz da tiazolidinodiona é na gama de 0,1 mg até 200 mg por dia. 3 ΡΕ1133312
12. 12. Uso de acordo com a reivindicação 11, em que a quantidade eficaz da tiazolidinodiona é na gama de cerca de 50 mg até 200 mg por dia.
13. 13. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, em que o tratamento compreende a administração do agonista do péptido GLP-1 como uma preparação de libertação controlada. Lisboa, 20 de Novembro de 2007 ι ΡΕ1133312 REFERÊNCIAS CITADAS NA DESCRIÇÃO Esta lista de referências citadas pelo requerente é apenas para conveniência do leitor. A mesma não faz parte do documento da patente Europeia. Ainda que tenha sido tomado o devido cuidado ao compilar as referências, podem não estar excluídos erros ou omissões e o IEP declina quaisquer responsabilidades a esse respeito. Documentos de patentes citadas na Descrição US 5118666 A WO 9111457 A US 5512-549 A EP 0177353 A * US 5631224 A » US 4687777 A * US 42872G0 A * US 5705483 A * US 5120712 A Literatura que não é de patentes citada na Descrição • SOIER et aí. Diabetes Qws, 1892, vei 15f 193-203 * SMtTS et aí. DlaaetoiOQla, 1985, voL 38,116-121 ♦ BOWEH et si. Aísíafeota, 1991, «4. 40, 1025 CHANG et ai. Oiaàetes. 1383, vd 32.630 COLCA fit ai. MêiSboOSBK 1988, VOL37,276 * DtANtei al, Dmbetotog®, 1884, voL 27,225 ♦ FJJJ1TA et ai. Oisbeíss. 1983, vot. 32.804 * FUJIWARA et aí. Diabetes1 2 1908, VOL 37, 1548 • LUND et ali, Pwc. HaS. Âcad. Sei USA. 1SS2, vcf. 7S, 345-49 KQRMAM et aí. Diabetes, 1SS5, voi 34, 717-722 ♦ LU ND et al. Pfsc. íVbíí. Acati. Sei U.S.A. ., 1982, vol. 79, 345-349 PATZLET ei al. Tíafeae. 1979, vd. 282, 260-266 * KEÍNRICH et al. Endõtmõk>g?, 1984, vot t1e 2175-2181 GHÈGLIGNE et ai. Dmss&m&a, 1984, vsi ·» 593-630 * UTTENTHAL et aí, J. Cikt. EntioamoS, Aísígw 5984, vel. 61,472-479 ‘ HOOSEiN el al.. FESS Leií-, 1984. YOl. 1?g • hgjsgv. mi. j. Pepm PiMm Rexmh ^ vffi. 40. 333-343 ' * NAtiCK et aí. Dtobetoloç&í, 1993, vcl. 36,741.74, ♦ GUTMAK et ai. ftfew EngfendJ. stMe&smg vai. 326 <2Q>. 1316-1322 "" ^ • NAUCK et al. J. C®}. tomL, 1993, voL 91, 33^ * THORENES et al, Oáõe&s. 1SS3, vot 5219-1225 ‘ ^ • ORSKGV, C. ei ai, 3. Bíoí. Omm.. 1989 m _ (22),12328 3 • GALLOVVAY. DiatMSS Cm. 1993, vo| 1209-1239 '' 13 * GALLOVVAY et al. C&>. Tter-ap.., ISSO. m 460-472 " 1 LOPEZ et ai, Proe. Nati. Asatl. Sei USA, 1583, VCi 80,5435-5469 2 * BELL et ai. fitatune, 1333, vel. 302, 716-718 3 • ANDREWS et aí. J. SM. Chmr,., 1985, voi. 260, 3910-3314