CZ2003848A3

CZ2003848A3 - Způsob léčby poruch spojených s bcl-2 za použití antisense oligomerů bcl-2

Info

Publication number: CZ2003848A3
Application number: CZ2003848A
Authority: CZ
Inventors: Raymond P. Warrel Jr.; Robert E. Klem; Howard Fingert
Original assignee: Genta Incorporated
Priority date: 2000-08-25
Filing date: 2001-08-23
Publication date: 2003-11-12
Also published as: YU13603A; HUP0303125A2; ES2327904T3; AP2003002761A0; EA200300294A1; CY1109340T1; EP1313514B1; NO20030858D0; US7795232B1; CN1471408A; BG107641A; EP1313514A4; NO20030858L; EP1313514A2; IL154409A0; BR0113447A; EP2135623A1; HK1056505A1; HRP20030102A2; MXPA03001575A

Description

Způsob léčby poruch spojených s bcl-2 za použití pesrn oligomerů bcl-2

Oblast techniky

Popisůje se použití antisense oligomerů bcl-2 při léčbě a prevenci poruch spojených s bcl-2. Tyto poruchy zahrnují zhoubné bujení, nádory a poruchy proliferace buněk. V jednom provedení vynálezu se nesmyslné oligomery bcl-2 aplikují ve vysokých dávkách. Dále se popisuje způsob prevence nebo léčby poruch spojených s bcl-2, zvláště zhoubného bujení, přičemž uvedený způsob zahrnuje aplikaci nesmyslného oligomerů bcl-2 v krátkých časových úsecích. Dále se popisuje použití nesmyslných oligomerů bcl-2 ke zvýšení citlivosti subjektu vůči léčebným prostředkům při léčbě zhoubného bujení.

Dosavadní stav techniky

Tradiční léčba zhoubného bujení není specifická. Většina vyrobených léků jsou přirozené produkty nebo deriváty, které blokují dráhu enzymů nebo náhodně reagují s DNA. Většina prostředků určených pro léčbu zhoubného bujení je limitována toxicitou dávky, což způsobuje nízké terapeutické indexy. Většina farmaceutických prostředků po aplikaci pacientovi neusmrcují pouze buňky zhoubného bujení, ale také normální buňky, tedy buňky, které nejsou součástí zhoubného bujení. Vzhledem k těmto nežádoucím účinkům, je nutné vyvinout léčbu, která ovlivňuje buňky zhoubného bujení s vyšší specifítou.

Zjistilo se, že na transformaci buněk a jejich udržování ve stádiu zhoubného bujení se podílí třída genů, které se nazývají onkogeny. Je nutné poznamenat, že přerušení transkripce uvedených genů nebo jiné účinky inhibující působení jejich proteinových produktů mohou vykazovat významné farmaceutické výsledky. Úloha onkogenů v etiologii řady typů • · · · · · · · ·

ζ) ········ · 4 · · *

Z. ·. · ········ •4 4 · · ·· « · 44 . ,4 4 zhoubného bujení u lidí se popisuje v publikaci Bishop, 1987, Celular Oncogenes and Retroviruses, Science, 235:305-311. U řady typů zhoubného bujení u lidí je gen nazvaný bcl-2 (lymfom buňky B/leukemie 2) nadměrně exprimován a tato nadměrná exprese je pravděpodobně spojena tumorogenicitou (popisuje se v publikaci Tsujimoto et al., Involvement of the bcl-2 gene in human follicular lymphoma, Science 228: 1440-1443). Uvažuje se, že gen bcl-2 se podílí na patogenitě zhoubného bujení a také na rezistenci vůči léčbě, primárně tím, že prodlužuje životnost buněk, spíše než zrychluje jejich dělení.

Lidský gen bcl-2 se podílí na etiologii jistého druhu leukémií, lymfoídních nádorů, neuroblastů a karcinomů nazofaryngu, prostaty, prsu a tlustého střeva (popisuje se v publikaci Croce et al., 1987, Molecular Basis of Human B and

T Cell Neoplasia, Advance in viral Oncology, 7 Klein (ed.),

Differential

35-51,

New Yourk: Raven Press, Reed et al., 1991, expression of bcl-2 protooncogene in neuroblasťoma and other human tumor cell lineš of neural origin, Cancer res. 51: 6529-38, Yunis et al., 1989, Bcl-2 and other genomíc alterations in the prognosis of large-cell lymphomas, N. Engl. J. Med. 320: 1047-54, Campos et al., 1993, High expression of bcl-2 protein in acute myeloid leukemia is associated with poor response to chemotherapy, Blood 81: 30916, McDonnellet al., 1992, Expression of the protooncogene bcl2 and its association with emergence of androgen-independent prostatě cancer, Cancer Res. 52: 6940-4, Lu et al. , 1993, Bcl2 protooncogene expression in Ebstein Barr Virus-Associated Nasopharyngeal Carcinoma, Int. J. Cancer 53: 29-35, Bonner et al., 1993, Bcl-2 protooncogene and the gastrointestinal mucosal epithelial tumor progression model as related to proposed morphologic and molecular sequences, Lab. Invest. 68: 43A) . Zjistilo se, že gen bcl-2 se nadměrně exprimuje v různých nádorech, které zahrnují lymfom, jenž není Hodgkinův • · · · · • · · · • · · ·

lymfom, karcinom plic, prsu, kolorektálni karcinom, karcinom prostaty, karcinom rohovky a akutní a chronickou leukémii (popisuje se v publikaci Reed, 1995, Regulation of apoptosis by bcl-2 family proteins and its role in cancer and chemoresistence, Curr. Opin. Oncol. 7:541-6).

Nesmyslné oligonukleotidy tvoří účinné terapeutické prostředky při specifickém porušení funkce onkogenů. Tyto krátké (obvykle obsahují méně než 30 baží) jednořetězcové úseky uměle vytvořené DNA obsahují úseky komplementární s oblastmi pre-mRNA nebo mRNA cílového genu a tvoří hybridní duplexy párováním baží pomocí vodíkových vazeb. Tato hybridizace může porušit expresi jak cílové mRNA, tak proteinu, který je uvedenou mRNA kódován, a tak může interferovat s interakcemi po směru exprese genu a signalizací. Protože z jedné molekuly mRNA vzniká více kopií proteinu, inhibice mRNA může být více účinná a více specifická než porušení na úrovni proteinu, například inhibicí aktivního místa enzymu.

Syntetické oligonukleotidy komplementární s mRNA onkogenů c-myc se používaly ke specifické inhibici produkce proteinu cmyc, čímž se blokuje růst lidským leukemických buněk in vitro (popisuje se v publikaci Holt et al., 1988, Mol. Cell Biol. 8: 963-73, Wickstrom et al., 1988, Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 85: 1028-32). Oligonukleotidy se také používají jako specifické inhibitory retroviru, které zahrnují HIV (popisuje se v publikaci Zamecnik and Stephenson, 1978, Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 75: 280-4, Zamecnik et al., 1986, Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 83: 4143-6).

Použití nesmyslných oligonukleotidů se schopností cílit a inhibovat jednotlivé geny spojené se zhoubným bujením tvoří možnost preklinických modelů zhoubného bujení. Tyto • · · • · ·· · · • · fosforothioátové nesmyslné oligomery vykazují schopnost inhibovat expresi genu bcl-2 in vitro a tak dochází k vymizení nádorů v myších modelech zavedených lymfomů. Rezistence některých nádorů vůči chemoterapii je spojena s expresí onkogenu bcl-2 (popisuje se v publikaci Grover et al., 1996, Bcl-2 expression in malignant melanoma and its prognostic significance, Eur. J. Surg. Oncol. 22(4): 347-9). Aplikace nesmyslného oligomeru bcl-2 může selektivně redukovat množství proteinu bcl-2 v nádoru zavedeném do laboratorních myší (popisuje se v publikaci Jansen et al., 1998, bcl-2 antisense therapy chemosensitizes human melanoma in SCID mice. Nat. Med. 4(2): 232-4). Aplikace nesmyslného oligomeru bcl-2 může změnit citlivost nádoru zavedeného do laboratorní myši na více citlivý vůči. chemoterapeutickým činidlům (popisuje se v publikaci Jansen et al., 1998, bcl-2 antisense therapy chemosensitizes human melanoma in SCID mice, Nat. Med. 4(2): 232-4). U myší systémová léčba nesmyslným oligomerem bcl-2 snižuje množství proteinu bcl-2 a zesiluje apoptózu. Léčba samotným nesmyslným oligomerem bcl-2 vykazuje slabou antinádorovou aktivitu, ale poměrně silná antinádorová aktivita se pozorovala, když se oligomer kombinoval s chemoterapeutickým činidlem DTIC (který je také znám jako dakarbazin). U deseti ze třinácti zvířat se po aplikaci nesmyslného oligomeru bcl-2 spolu s DTIC nedetekoval žádný ze zavedených maligních melanomů. Tato skutečnost vede k myšlence použít tuto protinádorovou léčbu v boji proti zhoubnému bujení u člověka.

Navzdory zvyšujícím se možnostem aplikace biologické, farmaceutické léčby nebo kombinováné léčby je prognóza řady pacientů trpících zhoubným bujením velmi malá. Ačkoliv se například DTIC běžně používá k léčbě melanomů tvořícího metastázy, pouze u několika pacientů se prokázal dlouhodobý pozitivní účinek. Ve skutečnosti extenzivní fáze III klinické • · • · · · · · ······· · · · • · · · · · ···· · ·· ··

studie neprokázala zvýšení počtu přeživších jedinců, ani když se DTIC aplikoval v kombinaci s cis-platinou, karmustnem a tamofinem (popisuje se v publikaci Chapman et al., 1999, Phase III multicenter randomized trial of the Darmouth regimen versus dacarbazine in patients with metastatic melanoma, J. Clin. Oncol. 17(9): 2745-51). Tyto vážné problémy léčby zhoubného bujení zdůrazňují potřebu vytvoření nových léčebných přístupů.

Podstata vynálezu

Vynález popisuje farmaceutické prostředky obsahující nesmyslné oligomery bcl-2 a způsoby léčby poruch spojených s onkogenem bcl-2. Vynález je založen z části na objevu, že nesmyslný oligomer, pokud se aplikuje pacientům trpících poruchami spojenými s onkogenem bcl-2, zvláště v případě zhoubného bujení, ve vysoké dávce vede k podstatné léčebné odezvě zahrnující nízkou prodloužení doby přežití, oligomery bcl-2, když se toleranci a že nesmyslné toxicitu, vysokou

Také se zjistilo, aplikují pacientům ve vysokých dávkách v krátkém časovém úseku, to znamená méně než 14 dní, vedou k podstatné léčebné odezvě u pacientů trpících zhoubným bujením. Tyto terapeutické režimy dále zesilují aplikaci nesmyslného oligomeru bcl-2 ve vysoké dávce po krátký časový úsek v kombinaci s jedním nebo více terapeutickými činidly vhodnými pro aplikaci při zhoubnému bujení. Překvapivě, snížená dávka jednoho nebo více terapeutických činidel, když se aplikuje spolu s krátkodobou aplikací nesmyslného oligomeru bcl-2, také vykazuje podstatnou léčebnou odezvu při léčbě pacientů se zhoubným bujením. Léčebné režimy podle vynálezu pak poskytují účinné metody léčby zhoubného bujení se sníženou dobou trvání a toxicitou a vedou ke zlepšení tolerance.

• · · • 4 • 4 · 4 4 4 4 4 • · · · • · · · · 4 • 4····· ·

4 4 · ·

444 4 44 4 4

V jednom provedení vynálezu se popisuje způsob léčby poruch spojených s onkogenem bcl-2 a farmaceutický prostředek ve formě jednotkové dávky obsahující zvláště vysokou dávky oligomeru bcl-2 tak, že účinné množství nesmyslného oligomeru bcl-2 v uvedeném farmaceutickém prostředku je dávka účinná, aby se dosáhlo dávky přibližně 10 až 50 mg/kg/den. V souladu s tímto provedením vynálezu účinné množství nesmyslného oligomeru bcl-2 uvedeného farmaceutického prostředku je dávka účinná k dosažení minimálního cirkulujícího množství nesmyslného oligomeru bcl-2, což je 30 nM. V jednom provedení vynálezu cirkulující množství nesmyslného oligomeru bcl-2 je 1 až 10 μΜ. V jiném provedení vynálezu požadovaného množství cirkulujícího nesmyslného oligomeru bcl-2 alespoň 30 nM je dosaženo přibližně 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 nebo 10 hodin po aplikaci nesmyslného oligomeru bcl-2. V jiném provedení vynálezu množství cirkulujícího nesmyslného oligomeru bcl-2 alespoň 30 nM se dosáhlo během přibližně 36 až 48 hodin, s výhodou během 24 až 35 hodin, výhodněji během 12 až 24 hodin, nejvýhodněji během méně než 12 hodin.

V jiném provedení vynálezu se popisuje způsob léčby poruch spojených s bcl-2 a farmaceutický prostředek obsahující dávku nesmyslného oligomeru bcl-2. Prostředek se aplikuje v krátkém časovém úseku, to znamená v kratším než 14 dní, tak, že účinné množství nesmyslného oligomeru bcl-2 se aplikuje během krátkého cyklu léčby a dávka je v rozmezí přibližně od 0,01 až 50 mg/kg/den. V jiném provedení vynálezu účinné množství nesmyslného oligomeru bcl-2 se zavede během trvání krátkého cyklu léčby, přičemž se aplikuje účinná dávka tak, aby se dosáhlo minimální koncentrace cirkulujícího nesmyslného oligomeru bcl-2 50 nM. V jiném provedení vynálezu koncentrace cirkulujícího nesmyslného oligomeru bcl-2 je 1 až 10 μΜ.

• 00 0 0 · ·· 0 *7 · ···· · · 0 0 0 0 0 0 » · · *0000000 ···· · 00 00 00 00

V jiném provedení vynálezu se popisuje způsob léčby poruchy spojené s bcl-2 a farmaceutický prostředek zahrnující aplikaci dávky nesmyslného oligomeru v krátkém časovém úseku, to je méně než 14 dní, v kombinaci s jedním nebo více terapeutickými činidly. Uvedené prostředky působící proti zhoubnému bujení se aplikují před aplikací nesmyslného oligomeru bcl-2, následně nebo společně s ním. Účinné množství nesmyslného oligomeru bcl-2 aplikované během krátkého časového úseku je v rozmezí přibližně 0,01 až 50 mg/kg/den. Účinné množství terapeutických činidel určených pro zhoubné bujení, které se aplikuje společně s nesmyslným oligomerem bcl-2, se může aplikovat ve své standardní dávce nebo v jiném případě se může aplikovat ve snížené dávce. V souladu s provedením vynálezu účinné množství nesmyslného oligomeru uvedeného farmaceutického prostředku je dávka účinná k dosažení koncentrace cirkulujícího nesmyslného oligomeru bcl-2 alespoň 30 nM. Ve specifickém provedení vynálezu se požadované koncentrace cirkulujícího nesmyslného oligomeru bcl-2 dosáhne během přibližně 36 až 48 hodin, s výhodou během přibližně 24 až 35 hodin, nejvýhodněji během 24 hodin.

V souladu s vynálezem poruchy spojené s onkogenem bcl-2 jsou nádory, zhoubné bujení, karcinomy a poruchy dělení buněk.

V souladu s vynálezem krátký časový úsek zahrnuje časový úsek vhodný pro aplikaci nesmyslného oligomeru bcl-2, který je kratší než 14 dní, je v rozmezí od 2 do 13 dní, s výhodou je v rozmezí od 3 do 9 dní, 4 až 7 dní nebo od 5 do 6 dní.

V souladu s vynálezem dávka nesmyslného oligomeru bcl-2 vhodná pro aplikaci v krátkém časovém úseku je od 0,01 do 50 mg/kg/den, s výhodou 4 až 9 mg/kg/den a nejvýhodnější je dávka 5 až 7 mg/kg/den.

• · · •4 4444

Vynález dále popisuje farmaceutický prostředek obsahující účinné množství jednoho nebo více nesmyslných oligomerů bcl-2 vhodných pro aplikaci v souladu s vynálezem. Uvedené farmaceutické prostředky zahrnují dávku nesmyslného olígomeru bcl-2 v rozsahu 0,01 až 50 mg/kg/den, s výhodou 4 až 9 mg/kg/den a nejvýhodněji v dávce 5 až 7 mg/kg/den v kombinaci s farmaceuticky přijatelným nosičem. V jiném provedení vynálezu farmaceutické prostředky podle vynálezu také zahrnují jeden nebo více dalších protinádorových prostředků. Uvedené farmaceutické prostředky jsou vhodné pro zavedení kontinuální infúzí nebo aplikací v jedné nebo více velkých dávkách nebo v jedné nebo více aplikacích během léčebného protokolu.

V souladu s vynálezem farmaceutické prostředky obsahující nesmyslný oligomer bcl-2 se mohou aplikovat odděleně od farmaceutických prostředků obsahujících terapeutická činidla vhodná pro zhoubné bujení.

Termín „porucha spojená s genem bcl-2 znamená onemocnění, které zahrnuje regulaci genu bcl-2, a dále zahrnuje, ale není omezeno na onemocnění zahrnující buňky exprimující gen bcl-2. Taková porucha zahrnuje onemocnění spojené s buňkou nebo tkání, které exprimují gen bcl-2 nebo jemu příbuzné geny nebo onemocnění zahrnující buňky nebo tkáně, které už neexprimují gen bcl-2, ale v normálním případě ho exprimují. Poruchy spojené s genem bcl-2 zahrnují, ale nejsou omezeny, na poruchy proliferace buněk a patologii buněk nebo tkáně, které jsou ovlivněny buňkami exprimujícími gen bcl-2 nebo příbuzné geny.

Termín „zhoubné bujení popisuje stádium onemocnění, ve kterém karcinogenní činidla nebo činidla způsobující transformaci zdravé buňky na abnormální buňku, po níž následuje invaze uvedených abnormálních buněk do přilehlých tkání a pak následuje rozšíření uvedených buněk lymfatickými

4 44 4 4 ·· ···· ··· 4 4 4 · · · · MM 4 4 4 · · · 4 ₉ y · · *······· • · 4 · 4 4 4 44 44 44 cestami a krví do místních lymfatických uzlin a/nebo do odlehlých míst za vzniku metastáz.

Termín „nádor nebo „růst znamená nárůst tkáně, která obsahuje větší množství buněk, jako výsledek rychlejšího dělení buněk a/nebo zpomalení odumírání buněk. Nádory mohou být maligní nebo benigní karcinomy.

Termín „léčba zhoubného bujení znamená inhibici replikace buněk zhoubného bujení, inhibice rozšíření zhoubného bujení, inhibice zvětšení nádoru, snížení počtu karcinogenních buněk v lidském těle nebo snížení symptomů onemocnění způsobené zhoubným bujením. Ošetření se považuje za léčbu, jestliže dojde ke snížení mortality a/nebo morbidity nebo ke snížení zatížení vyvolané onemocněním, což se projevuje snížením počtu maligních buněk v těle jedince.

Termín „prevence zhoubného bujení znamená zabránění výskytu nebo opětného výskytu stádia onemocnění klasifikovaného jako zhoubné bujení. Léčba, která brání, inhibuje nebo interferuje s tvorbou metastáz, s růstem nádoru nebo proliferací karcinogenních buněk vykazuje preventivní aktivitu.

Termín „nesmyslný oligomer znamená nesmyslný oligonukleotid nebo jeho analog nebo derivát a zahrnuje chemoterapeutické sloučeniny, které rozeznávají polynukleotidové cílové sekvence prostřednictvím vodíkových vazebných interakcích podle Watsona a Cricka s bázemi nukleotidů cílových sekvencí. Cílové sekvence mohou být RNA nebo DNA a mohou být jednořetězcové nebo dvouřetězcové. Cílové molekuly zahrnují, ale nejsou omezeny na pre-mRNA, mRNA a DNA.

• · · ·· ΦΦΦ·

Termín „exprese genu bcl-2 znamená transkripci genu bcl2, která produkuje pre-mRNA bcl-2, mRNA bcl-2 a/nebo protein bcl-2.

Termín „deriváty znamenají libovolný farmaceuticky přijatelný homolog, analog nebo fragment odpovídající farmaceutickému prostředku podle vynálezu.

Termín „terapeutické činidlo znamená libovolné molekuly, sloučeniny a léčebné prostředky, které napomáhají léčbě onemocnění. Terapeutické činidlo zhoubného bujení je molekula, sloučenina nebo postup léčby, který se podílí na léčbě nádorů nebo zhoubného bujení. Postup léčby zahrnuje, ale není omezen na ozáření, terapii založenou na určitých potravinách, fyzikální terapii a psychologickou terapii.

Termín chemoterapeutické činidlo nebo „činidlo působící proti zhoubnému bujení nebo „protinádorové činidlo nebo „terapeutické činidlo vhodné pro léčbu zhoubného bujení zahrnuje libovolnou molekulu nebo léčebný postup, který se podílí na léčbě nádoru nebo zhoubného bujení.

Termín „nízká dávka nebo „snížená dávka znamená dávku, která se aplikuje v rozmezí nižším než je normální rozmezí aplikované dávky, jak se udává v publikaci Physicians' Desk Reference, 54^th Edítion (2000) nebo podobně. Taková dávka může být dostatečná k inhibici buněčné proliferace nebo demonstruje pozitivní účinky při léčbě lidí nebo dokáže tlumit nežádoucích vedlejší účinky ve srovnání se standardní léčbou zhoubného bujení. Rozmezí normální dávky používané u určitých terapeutických činidel a standardních léčebných prostředků používaných při léčbě specifického onemocnění se uvádí v publikaci Physicians Desk Reference, 54^th Edition (2000) nebo v Cancer: Principles and Practice of Oncology, DeVita,

··»· φφ ··»« • · · φ * ···· · · • ΦΦΦ

Jr., Hellman and Rosenberg (eds.) 2^nd edition, Philadelphie, PA: J.B.Lippincott Co., 1985.

Termín „snížená toxicita znamená zeslabení vedlejších účinků a toxicity pozorované ve spojení s aplikací nesmyslných oligonukleotídů a terapeutických činidel, která probíhá po kratší časový úsek nebo/a v nižších dávkách ve srovnání s jinými léčebnými protokoly a dávkami, které zahrnují standardní léčebné protokoly a dávky popsané v publikaci Physicians' Desk Reference, 54^th Edition (2000) nebo v Cancer: Principles and Practice of Oncology, DeVita, Jr., Hellman and Rosenberg (eds.) 2^nd edition, Philadelphia, PA: J.B.Lippincott Co., 1985.

Termín „léčebný cyklus nebo „cyklus znamená časový úsek, během kterého se aplikuje jediné terapeutické činidlo nebo část terapeutického činidla. V jednom provedení vynálezu se popisuje použití vysoké dávky nesmyslného oligomerů bcl-2 v kombinaci se standardní dávkou terapeutického činidla vhodného pro zhoubné bujení, přičemž preferovaná délka jednoho léčebného cyklu je méně než 14 dní. Vynález popisuje alespoň jeden léčebny cyklus, v obecném případě je výhodné aplikovat více než jeden cyklus léčby.

Za určitých okolností je dostatečný jeden léčebný cyklus a to například v případě, kdy se po jednom léčebném cyklu dostaví dostatečný léčebný účinek.

Termín „farmaceuticky přijatelný nosič znamená nosič, který neinterferuje s účinností biologické aktivity aktivní složky. Takový nosič je v podtstatě chemoterapeuticky inertní a netoxický.

·· · ♦ · 9

9 9

9999 • ·

9999 9 ** 9*99

9 ·

9 9

9 9 a ♦ 9 9 9

99

9 99 9

9 9

9 9 9 • · · • « · a

Termín „farmaceuticky přijatelný znamená, že je schválený komisí federální nebo státní vlády nebo je uveden na seznamu U.S. Pharmacopeia nebo jde o jiné obecně známé pharmacopeia určená pro zvířata nebo zvláště vhodná pro aplikaci lidem.

Termín „nosič znamená ředidlo, adjuvans, ekcipient nebo agents, které se aplikuje spolu s terapeutickým prostředkem. Takovým nosičem mohou být sterilní roztoky, jako je fyziologický roztok ve vodě nebo oleje, které zahrnují oleje živočišného, rostlinného nebo syntetického původu, jako je arašídový olej, sojový olej, minerální olej, sezamový olej a podobně. Fyziologický roztok je výhodný nosič v případě, že se farmaceutické prostředky aplikují intravenózně. Fyziologické roztoky a vodné roztoky dextrózy a glycerolu se mohou také použít jako kapalné nosiče, zvláště v případě roztoků vhodných pro zavedení injekcí. Vhodná farmaceutická plnidla zahrnují škrob, glukózu, laktózu, sacharózu, želatinu, slad, rýži, mouku, křídu, silikagel, stearát sodný, glycerolmonostearát, talek, chlorid sodný, sušené nízkotučné mléko, glycerol, propylen, glykol, vodu, etanol a podobně. Nosič, je-li to nutné může také obsahovat malé množství zvlhčujících nebo emulgačních činidel nebo činidel, která upravují hodnotu pH. Tyto sloučeniny mohou také tvořit roztoky, suspenze, emulze, tablety, pilulky, kapsule, prášek a stále se uvolňující prostředky a podobně. Prostředek se může připravit ve formě čípků, které obsahují tradiční plnidla a nosiče, jako je triglycerid. Příklady vhodných farmaceutických nosičů se popisují v publikaci Remington's Pharmaceutical Sciences, E.W. Martin. Příklady vhodných farmaceutických nosičů jsou různé kationické lipidy, které zahrnují, ale nejsou omezeny na chlorid N-(1(2,3-dioleyloxy)propyl) -N,N,N-trimetylamonia (DOTMA) a diolesylfosfotidyletanolamin (DOPE). Vhodnými nosiči pro nesmyslné oligomery podle vynálezu jsou také lipozómy. Takové prostředky by měly obsahovat terapeuticky účinné φφ φ φφφ φ « · φφφ · φ » • 9··· ΦΦΦ · • · ΦΦΦ·

ΦΦΦΦ < ΦΦ »Φ

ΦΦ ΦΦΦΦ

Φ Φ ·

Φ Φ Φ ΦΦΦ φ • Φ Φ Φ ΦΦ ΦΦ množství sloučeniny spolu s vhodným množstvím nosiče, přičemž vzniká forma, která je vhodná pro aplikaci. Pro určitý přípravek by se měla vybrat určitá forma aplikace.

Termín „farmaceuticky přijatelné sole zahnruje sole připravené z farmaceuticky přijatelných v podstatě netoxických kyselin a zásad, které zahrnují anorganické a organické kyseliny a zásady. Farmaceuticky přijatelné sole zahrnují ty, které jsou tvořeny s volnou aminoskupinou, jako jsou ty odvozené z kyseliny chlorovodíkové, fosforečné, octové, oxalové, vinné atd. a ty tvořené s volnou karboxylovou skupinou. Jsou to ty odvozené z hydroxidu sodného, draselného, amonného, vápenatého, železitého, isopropylaminu, trietylaminu, 2-etylaminoetanolu, histidinu, prokainu atd..

Popisují se prostředky nesmyslného oligomeru bcl-2 a způsoby vhodné pro použití při prevenci a léčbě poruch spojených s bcl-2 zvláště u zhoubného bujení. Vynález dále popisuje farmaceutické prostředky obsahující nesmyslný oligomer bcl-2, stejně jako způsoby pro jejich použití při profylaktické a léčebné aplikaci, které zahrnují zavedení léčebných prostředků a terapeutické režimy.

Vynález je zčásti založen na zjištění, že krátké léčebné cykly nesmyslného oligomeru bcl-2, a to samotného nebo ve spojení s jiným léčebným prostředkem, vykazuje neočekávaně silné zeslabující účinky u pacientů trpících uvedeným onemocněním. Tento krátký léčebný režim ukazuje další výhody v případě aplikaci lidem. Jsou to zeslabení fyzického traumatu a vyšší pravděpodobnost dodržení léčebného protokolu. Další zjištění zahrnují (1) krátké léčebné cykly a snížené dávky terapeutického činidla, když se používají v. kombinaci s nesmyslným oligomerem bcl-2, (2) zjednodušené mody zavedení farmaceutických prostředků, které obsahují alesoň jeden • · · ·

·» · • · · • · · • · · · · · · ·

-j- ** · · · · · nesmyslný oligomer bcl-2 s terapeutickým činidlem nebo bez něho a (3) klinicky podstatné léčebné režimy pro mnoho typů zhoubného bujení. Tak se zjistilo, že nesmyslný oligomer bcl-2 může vykazovat podstatné terapeutické odezvy u pacientů trpících poruchou spojenou s bcl-2, pokud se aplikují v krátkém léčebném cyklu a tak je možné připravit použitelné farmaceutické prostředky, průběhy léčby a způsoby aplikace.

Vynález je dále založen na zjištění, že vysoké dávky nesmyslného oligomeru bcl-2 samotné nebo v kombinaci s jiným terapeutickým činidlem snižují toxicitu, způsobují neočekávaně pouze několik vedlejších účinků ve srovnání se standardními způsoby léčby zhoubného bujení a vykazují zlepšující účinky u pacientů trpících onemocněním. Léčebný režim, který obsahuje vysokou dávku nesmyslného oligomeru bcl-2 vykazuje další výhody při aplikaci člověku v krátkém léčebném cyklu nebo zlepšenou účinnost.

V jednom provedení vynálezu se nesmyslný oligomer aplikoval člověku v krátkém cyklu léčby za účelem prevence nebo léčby poruch spojených s bcl-2. V jiném provedení vynálezu se nesmyslný oligomer bcl-2 aplikoval člověku ve vysokých dávkách za účelem prevence nebo léčby poruch spojených s bcl-2. Za účelem ovlivnit nemocnou tkáň může nesmyslný oligomer chránit nebo léčit normální tkáně, které zahrnují tkáně obsahující buňky, které normálně exprimují gen bcl-2. Nesmyslný oligomer bcl-2 navíc může chránit nebo léčit normální tkáně, které, ačkoliv neexprimují gen bcl-2, jsou vytlačovány nemocnou tkání.

Ve specifickém provedení vynálezu se dále popisuje použití kombinované terapie za účelem prevence nebo léčby poruch spojených s bcl-2. Taková terapie zahrnuje použití jednoho nebo více molekul, sloučenin nebo léčebných prostředků, které •· · ·« ···· ··· · · · ··· ·· · ·· ·

- - · ···· ··· ···· · * · · · · · ····

J·'-’ ···· · ·· ·· _β· _ee se podílejí na prevenci nebo léčbě onemocnění. Příklady terapeutických činidel zahrnují biologické, chemoterapeutické činidla a terapeutické ošetření (například léčba ozářením).

V jiném provedení vynálezu se popisuje nesmyslný oligomer bcl-2, který se aplikuje člověku v kombinaci s jedním nebo více terapeutických činidel vhodných pro zhoubné bujení za účelem prevence nebo léčby zhoubného bujení. Taková terapeutická činidla určená pro zhoubné bujení zahrnují jednu nebo více molekul, sloučenin nebo prostředků vhodných pro léčbu, které vykazují anti-karcinogenní aktivitu. Příklady uvazovaných léčebných prostředků vhodných pro zhoubné bujení zahrnují biologická a chemoterapeutická činidla a terapeutické postupy (například ozáření).

V jiném provedení vynálezu se popisuje nesmyslný oligomer bcl-2, který se aplikuje člověku v kombinaci s jedním nebo více terapeutických činidel ve snížených dávkách vhodných pro zhoubné bujení za účelem prevence nebo léčby zhoubného bujení. Takový léčebný postup zahrnuje aplikaci jednoho nebo více nesmyslného oligomerů bcl-2 ve vysoké, standardní nebo nízké dávce, přičemž léčebný cyklus může být dlouhý nebo krátký. Ve specifickém provedení vynálezu se popisuje zvláště vysoká dávka nesmyslného oligomerů bcl-2, která se aplikuje člověku v kombinaci s jedním z terapeutických činidel určených pro zhoubné bujení ve vysoce redukovaných dávkách ve zkráceném léčebném cyklu za účelem prevence nebo léčby zhoubného bujení.

Nesmyslný oligomer bcl-2

Vynález popisuje použití jednoho nebo více nesmyslných oligomerů bcl-2 nebo jeho derivátů, analogů, fragmentů, hybridů, napodobenin a obdob. Termín „derivát znamená farmaceuticky přijatelná homolog, analog nebo fragment • · · · odpovídající farmaceutickému prostředku podle vynálezu. Nesmyslné oligomery vhodné pro použití podle vynálezu zahrnují nukleotidové oligomery, jejichž velikost je v rozmezí 5 až 10, 10 až 20, 20 až 50, 50 až 75 nebo 75 až 100 baží. Upřednostňuje se velikost 10 až 40 baží, výhodnější je velikost 15 až 25 baží, nejvýhodnější je velikost 18 baží. Cílové sekvence mohou být RNA nebo DNA a mohou být jednořetězcové nebo víceřetězcové. Cílové molekuly zahrnují, ale nejsou omezeny na pre-mRNA, mRNA a DNA. V jednom provedení vynálezu je cílovou molekulou pre-mRNA bcl-2 nebo mRNA bcl-2. Ve specifickém provedení nesmyslné oligomery hybridizují s částí libovolně dlouhé pre-mRNA bcl-2 nebo mRNA. Nesmyslné oligomery se vybraly z těch oligomerů, které hybridizují s počátečním místem translace, donorovým místem sestřihu, akceptorovým místem sestřihu, místy určenými pro transport nebo místy určenými pro degradaci pre-mRNA bcl-2 nebo mRNA.

Několik nesmyslných oligomerů bcl-2 se posuzovalo už dříve, aniž se dospělo k jednotným výsledkům (popisuje se například v americkém patentovém dokumentu č. 5 831 066, sekvence SEQ ID NO: 1 až 17) . Příklady nesmyslných oligomerů bcl-2, které se mohou použít v souladu s vynálezem se popisují v amerických patentových dokumentech č. 08/217 082 (patentový dokument č. 5 734 033),. v americkém patentovém dokumentu č. 08/465 485 (patentový dokument č. 5 831 066) a v americkém patentovém dokumentu č. 09/080 285 (patentový dokument č. 6 040 181).

V jednom provedení vynálezu nesmyslný oligomer bcl-2 je v podstatě komplementární s částí pre-mRNA bcl-2 nebo mRNA nebo s částí pre-mRNA nebo mRNA, která je příbuzná bcl-2. V preferovaném provedení vynálezu nesmyslný oligomer bcl-2 hybridizuje s částí počátečního místa translace řetězce kódujícího pre-mRNA. Ve výhodném provedení vynálezu nesmyslný ·· · ·· • · · · · • ·····« · • · · · · • · · · · ·· · · oligomer bcl-2 hybridizuje s částí řetězce kódujícího premRNA, který zahrnuje počáteční místo translace lidského genu bcl-2. Výhodnější je, když nesmyslný oligomer bcl-2 obsahuje sekvenci TAG, která je komplementární s iniciační sekvencí AUG pre-mRNA nebo mRNA bcl-2.

V jednom provedení vynálezu se nesmyslný oligomer bcl-2 hybridizuje s částí místa donorového sestřihu řetězce kódujícího pre-mRNA v případě lidského genu bcl-2. Tento nukleotid s výhodou obsahuje sekvenci CA, která je komplementární se sekvencí GT sestřihu donora genu bcl-2 a s výhodou dále obsahuje lemující části 5 až 50 baží, výhodnější je 10 až 20 baží, které hybridizují z částmi řetězce kódujícího gen bcl-2, který lemuje uvedené místo sestřihu donora.

V jiném provedení vynálezu nesmyslný oligomer bcl-2 hybridizuje s částí místa sestřihu akceptora řetězce kódujícího pre-mRNA v případě lidského genu bcl-2. Tento nukleotid s výhodou obsahuje sekvenci TC, která je komplementární se sekvencí sestřihu akceptora AG genu bcl-2 a přednostně dále obsahuje lemující části 5 až 50 baží, výhodněji přibližně 10 až 20 baží, které hybridizují s částmi řetězce kódujícího gen bcl-2, který lemuje uvedené akceptorové místo sestřihu. V jiném provedení vynálezu nesmyslný oligomer bcl-2 hybridizuje s částmi pre-mRNA nebo mRNA, které se podílejí na sestřihu, transportu nebo degradaci.

Odborníkovi je zřejmé, nesmyslné oligomery vhodné pro použití podle vynálezu mohou také být podstatně komplenetární s jinými místy v pre-mRNA nebo mRNA bcl-2 a mohou tvořit hybridy. Odborníkovi je také jasné, že výhodné jsou také nesmyslné oligomery, které se hybridizují s částí pre-mRNA nebo mRNA bcl-2, jejichž sekvence se běžně nevyskytují •4 4444

4 tak se • · 4 • 4 4 4

4 4 v transkriptech vzniklých z nepříbuzných genů, zachovává specifita léčby.

Návrh sekvence nesmyslného oligomerů bcl-2 se může také stanovit empirickým testováním a hodnocením klinické účinnosti bez ohledu na sekvenční homologii nebo schopnost hybridizovat s genem bcl-2, pre-mRNA bcl-2, mRNA bcl-2 nebo nukleotidových sekvencí příbuzných bcl-2. Odborníkovi je zřejmé, že nesmyslné oligomery bcl-2 vykazují například nižší sekvenční homologii, vyšší nebo nižší počet upravených nukleotidů nebo jsou delší nebo kratší ve srovnání s těmi, které se popisují ve výhodných provedeních vynálezu, ale které stejně vykazují odezvy při klinické léčbě.

Nesmyslné oligomery mohou být RNA nebo DNA nebo jejich deriváty. Určitá forma nesmyslného oligomerů může ovlivnit farmakokinetické parametry oligomerů, jako je biologická dostupnost, metabolizmus, poločas rozpadu atd.. Vynález popisuje deriváty nesmyslných oligomerů, které mají vlastnosti zlepšující pohlcení do buněk, zesilují rezistenci vůči nukleázám, zlepšují navázání na cílovou sekvenci nebo zesilují štěpení nebo degradaci cílové sekvence. Nesmyslné oligomery mohou obsahovat báze obsahující například fosforothioáty nebo metylfosfonáty. Nesmyslné oligomery mohou být smíchané s oligomery obsahujícími mezi jinými kombinace fosfodiesterů, fosforothioátových a/nebo metylfosfonátových nukleotidů. Takové oligomery mohou mít úpravy, které zahrnují, ale nejsou omezeny, na úpravy cukerné složky 2-0'-alkylem nebo 2-0'haloskupinou, úpravy kostry (například metylfosfonátové, fosforodithioátové, fosfordithioátové, formacetalové, 3'thioformacetalové, sulfonové, sulfamátové, nitroxidové kostry, morfolinových derivátů a derivátů peptidových jaderných kyselin (PNA)) nebo deriváty, kde se upraví báze (popisuje se v publikaci Egholm, et al., 1992, Peptide nucleic acids (PNA)19 • Φ · • · • · · φ φφφφφ oligonucleodite analogues with an achiral peptide backbone).

V jiném provedení vynálezu konjugáty oligonukleotidů a nesmyslné oligomery obsahují jejich derivátů (popisuje se v publikaci Goodchild, 1990, Conjugates of oligonucleotides and modified oligonucleotides: a review of their synthesis and properties. Bioconjug. Chem. 1(3): 165-87).

V případě použití in vivo se preferuje použití fosforothioátového derivátu nesmyslného oligomeru bcl-2, protože vykazuje lepší rezistenci vůči rozkladu. V jednom provedení vynálezu nesmyslný oligomer bcl-2 je hybridní oligomer obsahující fosforothioátové 'báze. V jiném provedení vynálezu nesmyslný oligomer bcl-2 obsahuje alespoň jednu fosforothioátovou vazbu. V jiném provedení vynálezu nesmyslný oligomer bcl-2 obsahuje alespoň tři fosforthioátové vazby. V dalším provedení vynálezu nesmyslný oligomer bcl-2 obsahuje alespoň tři konsekutivní fosforothioátové vazby. V jiném provedení vynálezu nesmyslný oligomer bcl-2 je obsažen zcela ve fosforothioátových vazbách. Způsoby přípravy oligonukleotidových derivátů jsou známy v oboru (popisuje se v publikaci Stein et al., 1988, Nucl. Acids res., 16: 3209-21 (fosforothioát), Blake et al., 1985, Biochemistry 24: 6132-38 (metylfosfonát), Morvan et al., 1986, Nucl. Acids res. 14: 5019-32 (alfa-deoxynukleotidy), Monia et al., 1993, Evaluation of 2'-modified oligonucleotides containíng 2'deocy gaps as antisense inhibitors of gene expression. J. Biol. Chem. 268: 14514-22 (2'-O-metylribonukleotidy), Asseline et al. , 1984,

Proč. Nati. Acad. Sci. USA 81: 3297-3301 (akridin), Knorre et al., 1985, Biochemie 67: 783-9, Vlassov et al., 1986, Nucl.

Acid. Res. 14: 4065-76 (N-2-chlorocetylamin a fenazin), Webb et al., 1986, Nucl. Acids Res. 14: 7661-74 (5-metyl-N⁴-N⁴etanocytosin), Boutorin et al., 1984, FEBS Letters 172: 43-6 (Fe-etylendiamintetraoctová kyselina (EDTA) a analogy), ChiHong et al., 1986, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 83: 7147-51 (520 ·· ·

9 9 • · ·

9 9 9 9

9 • 9 9 · «

9 «9 glycylamido-1,10-o-fenantrolin) a Nati. Acad. Sci. USA dietylentriaminpentaoctové kyseliny

Chu et al. , 1985, Proč.

82: 963-7 (deriváty (DTPA).

Účinná dávka nesmyslného oligomerů bcl-2 aplikovaná během léčebného cyklu je přibližně 0,01 až 0,1, 0,1 až 1 nebo 1 až 10 mg/kg/den. Dávka nesmyslného oligomerů bcl-2 může být závislá na způsobu aplikace. Při intravenózní aplikaci nesmyslného oligomerů bcl-2 se bude musat pr vděpodobně aplikovat podstatně vyšší dávka než v případě aplikace lokálního implantátu, který obsahuje farmaceutický prostřdek zahrnující nesmyslný oligomer bcl-2. V jednom provedení vynálezu se nesmyslný oligomer bcl-2 aplikoval subkutánně v dávce 0,01 až 10 mg/kg/den. Výhodnější je dávka 4 až 9 mg/kg/den, nej výhodnější je dávka 5 až 7 mg/kg/den. V jiném provedení vynálezu se nesmyslný oligomer aplikoval intravenózně v dávce 0,01 až 10 mg/kg/den. Výhodnější dávka je až 9 mg/kg/den a nejvýhodnější dávka je 5 až 7 mg/kg/den. V jiném provedení vynálezu se nesmyslný oligomer bcl-2 aplikoval lokálně v dávce 0,01 až 10 mg/kg/den. Výhodnější je dávka 0,01 až 0,1 mg/kg/den a nej výhodněj ší je dávka 1 až 5 mg/kg/den. Odborníkovi je jasné, že při lokální aplikace se používají nižší dávky. Například způsoby lokální aplikace, jako jsou aplikace přímo do nádoru, nitrooční injekce nebo aplikace implantátu mohou produkovat lokálně vysoké koncentrace nesmyslného oligomerů bcl-2, ale reprezentují relativně nízkou dávku s ohledem na celkovou tělesnou hmotnost. V takových případech lokální aplikace nesmyslného oligomerů bcl-2 vede k celkové tělesné dávce přibližně 0,01 až mg/kg/den.

V jiném provedení vynálezu se během léčebného cyklu aplikuje zvláště vysoká dávka nesmyslného oligomerů bcl-2.

····

Tato dávka se pohybuje v rozmezí přibližně 10 až 20, 20 až 30 nebo 30 až 50 mg/kg/den.

Účinná dávka určitého nesmyslného oligomeru bcl-2 může záviset na dalších faktorech, které zahrnují typ zhoubného bujení, stádiu onemocnění, toxicitu oligomeru, rychlost pohlcení oligomeru do buňky zhoubného bujení, stejně jako hmotnost, věk a zdravotní stav jedince, kterému se nesmyslný oligomer aplikuje. Protože existuje řada faktorů in vivo, které mohou interferovat s působením nesmyslného oligomeru bcl-2 nebo s jeho biologickou aktivitou, odborníkovi je zřejmé, že účinné množství nesmyslného oligomeru bcl-2 může kolísat v závislosti na jedinci, kterému se aplikuje.

V jiném provedení vynálezu nesmyslný oligomer bcl-2 se vyskytuje v dávce, která zajišťuje koncentrace nesmyslného oligomeru bcl-2 v plazmě alespoň 30 nM. Odborníkovi je zřejmé, že nižší a vyšší koncentrace nesmyslného oligomeru bcl-2 v plazmě mohou být výhodné v závislosti na způsobu aplikace. Koncentrace nesmyslného oligomeru bcl-2 v plazmě pohybující se okolo 30 nM může být vhodná ve spojení s intravenózním, subkutánním, intramuskulárním orálním způsobem aplikace nebo s řízeným uvolňováním. V jiném příkladu provedení vynálezu se popisuje požadavek relativně nízké koncentrace nesmyslného oligomeru bcl-2 v plazmě avšak, když se použije lokální způsob aplikace, jako je například aplikace přímo do nádoru, nitrooční aplikace nebo implantace, může se produkovat lokálně vysoká klinicky účinná koncentrace nesmyslných oligomeru bcl2.

V jednom provedení vynálezu koncentrace nesmyslného oligomeru bcl-2 v cirkulující plazmě je alespoň 30 nM. Této koncentrace se dosáhne po 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, nebo 10 hodin po aplikaci nesmyslného oligomeru bcl-2. V dalším • · · · provedení vynálezu koncentrace nesmyslného oligomeru bcl-2 v cirkulující plazmě je alespoň 30 nM. Této koncentrace se dosáhne přibližně během 36 až 48 hodin, přednostně 24 až 35 hodin, výhodněji během 12 až 24 hodin, nejvýhodněji během méně než 12 hodin.

Ve specifickém provedení vynálezu dávka nesmyslného oligomeru bcl-2 je vysoká dávka. V jednom provedení vynálezu koncentrace nesmyslného oligomeru bcl-2 v cirkulující plazmě je přibližně 30 nM. V jiném provedení vynálezu cirkulující množství nesmyslného oligomeru bcl-2 je 1 až 10 μΜ. V jiném preferovaném provedení vynálezu je cirkulující množství nesmyslného oligomeru bcl-2 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 nebo 10 μΜ. V jiném provedení vynálezu je cirkulující množství nesmyslného oligomeru bcl-2 1 až 10 μΜ dosaženo během přibližně 3ž až 48 hodin, s výhodou během 24 až 35 hodin, výhodněji během 12 až 24 hodin a nejvýhodněji během 12 hodin.

Vysoké dávky se může dosáhnout několika násobnou aplikací v jednom cyklu. V jiném případě se může vysoká dávka aplikovat v jediné aplikaci. Jediná aplikace vysoké dávky může vést k množství nesmyslného oligomeru bcl-2, které jsou dočasně daleko vyšší než 30 nM. Avšak jediná aplikace zvláště vysoké dávky nesmyslného oligomeru bcl-2 může vést k dosažení koncentrace nesmyslného oligomeru bcl-2 v cirkulující plazmě 1 až 10 μΜ během méně než 12 hodin, dokonce během méně než jedné hodiny.

Navíc dávka nesmyslného oligomeru bcl-2 může kolísat podle toho, který nesmyslný oligomer bcl-2 se použije. Použitá dávka

se volí tak, aby se	vyvážily	některé	faktory.	Jsou to
stabilita,	lokalizace,	pohlcení	buňkou a	toxicita	určitého
nesmyslného	oligomeru	bcl-2.	Například	určité	chemicky

upravené nesmyslné oligomery bcl-2 mohou vykazovat vyšší • to ·«·· ·· ·to· · ♦ ♦ ♦ ···· » • ·· · · ·· · ·· ·· ·· ·· rezistenci vůči rozkladu nebo mohou vykazovat vyšší afinitu pro cílovou nukleovou kyselinu nebo mohou být lépe pohlcovány do buňky nebo do jádra buňky. Tyto skutečnosti V dalším příkladu určité chemicky upravené nesmyslné oligomery bcl-2 mohou vykazovat nižší toxicitu ve srovnání s ostatními nesmyslnými oligomery a proto se mohou aplikovat ve vyšších dávkách. Pak v případě nesmyslného oligomerů bcl-2 může být vhodná dávka relativně vysoká nebo relativně nízká. Vynález dále popisuje hodnocení optimálního léčebného postupu v případě určitého druhu nesmyslných oligomerů bcl-2.

Další faktory, které se zvažují při stanovení účinné dávky nesmyslného oligomerů bcl-2 zahrnují skutečnost, zda oligomer se bude aplikovat v kombinaci s jiným léčebným prostředkem. V takovém případě relativní toxicita druhého terapeutického činidla může indikovat použití nesmyslného oligomerů bcl-2 v nízké dávce. V jiném případě léčba vysokou dávkou nesmyslného oligomerů bcl-2 může vést v kombinované terapii s omezenou dávkou terapeutických činidel. Ve specifickém provedení léčba vynálezu léčba určitou vysokou dávkou nesmyslného oligomerů bcl-2 může vést v kombinovanou terapii s vysoce redukovanými dávkami terapeutických činidel vhodných pro zhoubné bujení. Například léčba pacienta dávkou 10, 20, 30, 40 nebo 50 mg/kg/den nesmyslného oligomerů bcl-2 může dále zvýšit citlivost subjektu vůči terapeutickým činidlům zhoubného bujení. V takových případech zvláště vysoká dávka nesmyslného oligomerů bcl-2 se kombinuje například se zkráceným léčebným postupem ozářením. V jiném příkladu určitá vysoká dávka nesmyslného oligomerů bcl-2 produkuje podstatné zesílení účinku terapeutických činidel vhodných pro zhoubné bujení.

Zvláště vysoké dávky nesmyslného- oligomerů bcl-2 mohou dále zkracovat období aplikace terapeuticky účinného množství «»·«

4 * 4 4 « « • 4 · « ·

4444 44 4 • 4 4 4 « •••4 4 « • 4 4444 nesmyslného oligomeru bcl-2 vhodného pro zhoubné bujení, daleko kratší než 14 dní.

a/nebo terapeutického činidla Délka léčebného cyklu je pak

V jednom provedení vynálezu fosforothioátový nesmyslný oligomer bcl-2 obsahující 18 baží se sekvencí 5'-TCTCCCAGCGTGCGCCAT-3', který je komplementární s prvními šesti kodony mRNA bcl-2 a hybridizuje s bázemi cílové RNA se aplikuje v krátkém léčebném cyklu, který je kratší než dva týdny.

V jednom provedení vynálezu se G3139 aplikuje po dobu 2 až 13 dní v dávce 0,01 až 10 mg/kg/den. Ve specifickém provedení vynálezu se G3139 aplikuje po dobu 2 až 3 dní, 4 až 5 dní, 6 až 7 dní, 8 až 9 dní, 10 až 11 dní nebo 12 až 13 dní v dávce 0,01 až 1, 1 až 2, 3 až 4, 5 až 6, 6 až 7, 7 až 8 nebo 9 až 10 mg/kg/den. Výhodnější je dávka 4 až 9 mg/kg/den a nejvýhodnější je dávka 5 až 7 mg/kg/den. V jiném provedení se G3139 aplikuje v uvedené dávce 3 až 9 dní. V dalším provedení vynálezu se G3139 aplikuje v uvedené dávce po dobu 4 až 7 dní. Ve výhodném provedení se G3139 aplikuje v uvedené dávce po dobu 5 až 6 dní. V nejvýhodnějším provedení se G3139 aplikuje v dávce 5 až 7 mg/kg/den po dobu 5 až 6 dní. Vynález dále popisuje léčebné postupy závisející na určitém používaném nesmyslném oligomeru bcl-2 nebo na určitém způsobu aplikace nebo na skutečnosti, zda se nesmyslný oligomer aplikuje jako část kombinované terapie, například v kombinaci s terapeutickým činidlem zhoubného bujení. Denní dávka se může aplikovat při jednom nebo více léčebných postupech.

V jiném provedení vynálezu se G3139 aplikuje ve zvláště vysoké dávce 10 až 50 mg/kg/den. Ve specifickém provedení vynálezu se G3139 aplikuje ve zvláště vysoké dávce 10 až 15, 16 až 20, 21 až 25. 26 až 30, 31 až 35, 36 až 40, 41 až 45 nebo 46 až 50 mg/kg/den. V jiném provedení vynálezu se G3139 aplikuje v uvedené dávce po dobu jendoho až deseti dní.

ΦΦ φ • φ φ

ΦΦΦ φ ΦΦΦΦ φ φ

Ιφφφ Φ φφ ΦΦΦΦ •· ΦΦΦΦ

V jiném provedení vynálezu se G3139 aplikuje v uvedené dávce po dobu 2 až 7 dní. V jiném provedení se G3139 aplikuje v uvedené dávce po dobu 3 až 4 dní. Ve výhodném provedení vynálezu se G3139 aplikuje v dávce 26 až 30, 31 až 35, 36 až 40, 41 až 45 nebo 46 až 50 mg/kg/den po minimální počet dní 1 den. Vynález dále popisuje výhodné léčebné postupy závisející na určitém použitém nesmyslném oligomeru bcl-2 nebo určitém způsobu aplikace nebo na skutečnosti, zda nesmyslný oligomer bcl-2 se aplikuje jako část kombinované terapie, například v kombinaci s terapeutickým činidlem určeným pro zhoubné bujení. Denní dávka se pak může aplikovat při jednom nebo více léčebných postupech.

Léčebné postupy vhodné pro léčbu zhoubného bujení

Vynález popisuje způsob prevence nebo léčby zhoubného bujení, který zahrnuje terapeuticky účinné množství nesmyslného oligomeru bcl-2, přičemž se aplikují vysoké dávky oligomeru jedinci, který tuto léčbu potřebuje. Vynález dále popisuje použití krátké doby aplikace nesmyslného oligomeru bcl-2. Normální nekarcinogenní buňky se dělí ve frekvenci charakteristické pro určitý typ buňky. Když se buňka transformovala do stádia zhoubného bujení, výsledkem je nekontrolovaná buněčná proliferace a snížení odumírání buněk a proto hlavním znakem karcinogenního typu buněk je nekontrolovatelné dělení nebo růst buněk. Příklady typů buněk zhoubného bujení zahrnují, ale nejsou omezeny na lymfom, který není Hodgkinův lymfom, Hodkinův lymfom, leukemie (například akutní leukemie, jako je akutní lymfocytická leukemie, akutní myelocytická leukemie, chronická myeloidní leukemie, chronická lymfocytická leukemie, mnohotný myelom) , karcinom tlustého střeva, rektální karcinom, karcinom pankreasu, karcinom prsu, karcinom vaječníků, karcinom prostaty, karcinom renálních buněk, hepatom, karcinom žlučníku, choriokarcinom, karcinom ·· 4444 • 4 444 ·

4 ' ! ! · · 4 4 4 4 • · 4 44 4 4 4a .· ··:· · ϊ :

* · 4444 4441 ’··· · ♦· ·· .♦ ».

děložního čípku, karcinom varlat, karcinom plic, karcinom močového měchýře, melanom, karcinom hlavy a krku, karcinom mozku, karcinom neznámého místa původu, neoplazma, karcinom periferního nervového systému, karcinom centrálního nervového systému, nádory (například fibrosarkom, myxosarkom, liposarkom, chondrosarkom, osteogenní sarkom, chordom, angiosarkom, endoteliosarkom, lymfangiosarkom, lymfangioendoteliosarkom, synoviom, mesoteliom, Ewingův nádor, leiomyosarkom, rhabdomyosarkom, karcinom dlaždicových buněk, karcinom bazálních buněk, adenokarcinom, karcinom potní žlázy, karcinom tukových žláz, papilární karcinom, papilární adenokarcinom, cystadenokarcinom, medulární karcinom, bronchogenní karcinom, seminom, embryonální karcinom, Wilmův nádor, karcinom malých plicních buněk, epiteliální karcinom, gliom, astrocytom, meduloblastom, kraniofaryngiom, ependymom, pinealom, hemangioblastom, karcinom sluchového nervu, oligodendrogliom, meningiom, neuroblastom a retinoblastom) , onemocnění spojené s těžkým řetězcem, metastázy nebo libovolné onemocnění nebo porucha charakterizovaná neřízeným nebo abnormálním buněčným růstem.

Ve výhodném provedení vynálezu se dále popisuje použití kombinované terapie za účelem prevence nebo léčby zhoubného bujení. Například karcinom prostaty se může léčit farmaceutickým prostředkem, který obsahuje nesmyslný oligomer bcl-2 v kombinaci mitoxantron a/nebo s prostředkem paklitaxel, doketaxel, antagonistou androgenového receptoru (například flutamid). V jiném příkladu se karcinom prsu léčí farmaceutickým prostředkem, který obsahuje nesmyslný oligomer bcl-2 v kombinaci s doketaxelem, paklitaxelem, cis-platinou, 5-fluorouracilem, doxorubicinem a/nebo VP-16. Leukemie se může také léčit farmaceutickým prostředkem, v kombinaci který obsahuje s terapeutickým nesmyslný oligomer bcl-2 prostředkem fludarabin, cytosinarabinosid, gemtuzumab ·* ·*·· :: . : : .· : : ;

ί.. ί ··♦· · ·« , ··· · ·· ·· ·. ..

(MYLOTARG), daunorubicin, metotrexát, vinkristin, 6merkaptoputin, idarubicin, mitoxantron, etoposid, asparagináza, prednison a/nebo cyklofosfamid. Mylom se může léčit farmaceutickým prostředkem, který obsahuje nesmyslný oligomer bcl-2 v kombinaci s dexametasonem. Melanom se může léčit farmaceutickým prostředkem, který obsahuje nesmyslný oligomer v kombinaci s dakarbazinem. Kolorektální karcinom se může léčit farmaceutickým prostředkem, který obsahuje nesmyslný oligomer v kombinaci s irinotekanem. Karcinom plic se může léčit farmaceutickým prostředkem, který obsahuje nesmyslný oligomer v kombinaci s paklitaxelem, doketaxelem, etoposidem a/nebo cis-platinou. Lymfom, který není lymfom Hodkinova typu se může léčit farmaceutickým prostředkem, který obsahuje nesmyslný oligomer v kombinaci s cyklofosfamidem, bleomycinem, mitoxantronem a/nebo cisžaludku se může léčit farmaceutickým

CHOP, etoposidem, platinou. Karcinom prostředkem, který obsahuje nesmyslný oligomer v kombinaci s cis-platinou.

Karcinom pankreasu se muže léčit farmaceutickým prostředkem, který obsahuje nesmyslný oligomer v kombinaci s gemcitabinem. Tyto kombinované terapie se mohou také použít při prevenci zhoubného bujení nebo pří opětném výskytu zhoubného bujení.

Kombinovaná terapie také zahrnuje aplikaci nesmyslného oligonukleotidu bcl-2, použití jedné nebo více molekul, sloučenin nebo terapeutických činidel, které vedou k prevenci nebo léčbě zhoubného bujení. Molekuly, sloučeniny nebo způsoby léčby zahrnují, ale nejsou omezeny na chemoterapeutická činidla, imunoterapeutická činidla, vakcinační prostředky určená pro zhoubné bujení, anti-angiogenní činidla, cytokiny, hormonální terapie, genová terapie a radioterapie.

Jedno nebo více chemoterapeutických činidel vedle nesmyslného oligomeru bcl-2 se aplikuje za účelem léčby

4 » ♦ · 4 4 » 4444 4 4

4444 z krevních aldesleukin, busulfan, kapecitabin, pacienta trpícího karcinomem. Příklady chemoterapeutického činidla zahrnují, ale nejsou omezeny na cytosinový arabinosid, taxoid (například paklitaxel, doketaxel) , antitubulinová činidla (například pyclitaxel, doketaxel, Epothilone B nebo jejich analogy), cis-platina, karboplatina, adriamycin, tenoposid,. mitozantron, 2-chlorodeoxyadenosin, alkylační činidla (například cyklofosfamid, mechloretamin, thioepa, chlorambucil, elfalan, karmustin (BSNU), lomustin (CCNU), cyklofosfamid, busulfan, dibromomanitol, streptozotocin, mitomycin C a cis-diamin-dichloroplatnatý komplex (DDP), cisplatinou, thio-tepa), antibiotika (například daktínomycin (aktinomycin), bleomycin, mithramycin, anthramycin), antimetabolity (například methotrexát, 6-merkaptopurin, 6thioguanin, cytarabin, 5-fluoruracil, fludarabin, gemcitabin, dakarbazin, temozolamid), asparagináza, Bacillus calmette a Guerin, toxin difterie, hexametylmelamin, hydroxyurea, LYSODREN®, analogy nukleosidu, rostlinné alkaoidy (například taxol, paklitaxel, kamptotecin, topotecan, irinotekan (CAMPTOSAR, CPT-11), vincristin, vinkové alkaloidy, jako je vinblastin), podofylotoxin (zahrnující deriváty, jako je epipodofyltoxin, VP-16 (etoposid), VM-26 (teniposid)), cytochalasin B, gramicidin D, etidiumbromid, emetin, mitomycin, prokarbazin, mechloretamin, antracykline (například daunorubucin (daunomycin), doxorubicin, lipozomální doxorubicin), dihydroxyantracindion, mitoxantron, mitramycin, aktinomycin D, prokain, tetrakain, lídokain, propranolol, puromycin, anti-mitotické činidlo, abrin, ricin A, exotocin pseudomonas, nervový růstový faktor, růstový faktor získaný destiček, aktivátor tkáňového plasminogenu, anastrozle, bikalutamid, biamycin, karboplain, chlorabusil, kladribin, cylarabin, daklinomycin, estramusin, floxuridhe, gamcitabin, gosereine, idarubicin, itosfamid, lauprolidacetát, levamisol, lomusline, mechlorethamin, magestrol, acetát, merkaptopurin, alutamin,

mesna, mitolank, pegaspergáza, pentoslatin, pikamycin, riuxlman, kampat-1, straplozocin, thioguanin, tretinoin, vinorelbin nebo libovolné fragmenty, členové rodiny nebo jeho deriváty, zahrnující jejich farmaceuticky přijatelné sole. Vynález také popisuje prostředky obsahující jeden nebo více chemoterapeutických činidel (například FLAG, CHOP). FLAG obsahuje fludarabin, cytosinarabinosid (Ara-C) a G-CSF. CHOP obsahuje cyklofosfamid, vinkristin, doxorubicin a prednison.

V jednom provedení vynálezu je chemoterapeutické činidlo dakarbazin a aplikuje se v dávkovém rozmezí 200 až 4 000 mg/m²v jednom cyklu. Ve výhodném provedení vynálezu jsou uvedené dávky rozmezí 700 až 1 000 mg/m² v jednom cyklu. V jiném provedení vynálezu je uvedené chemoterapeutické činidlo fludarabin a aplikuje se v dávce 25 až 50 mg/m² v jednom cyklu.

V jednom provedení vynálezu je uvedené chemoterapeutické činidlo cytosinarabinosid (ARA-C) v dávce v rozmezí 200 až 2 000 mg/m² v jednom cyklu. V jiném provedení vynálezu je uvedené chemoterapeutické činidlo doketaxel v dávce v rozmezí 1,5 až

7,5 mg/kg v jednom cyklu. V uvedeném provedení vynálezu je chemoterapeutické činidlo paklitaxel v dávkovém rozmezí 5 až 15 mg/kg v jednom cyklu. V jiném provedení vynálezu uvedené chemoterapeutické činidlo je cis-platina v dávce, která je v rozmezí 5 až 20 mg/kg v jednom cyklu. V jiném provedení vynálezu uvedené chemoterapeutické činidlo je 5-fluorouracil v dávce v rozmezí 5 až 20 mg/kg v jednom cyklu. V jiném provedení vynálezu uvedené chemoterapeutické činidlo je doxorubicin v dávce v rozmezí 2 až 8 mg/kg v jednom cyklu.

V jiném provedení vynálezu uvedené chemoterapeutické činidlo je epipodofylotoxin v dávce v rozmezí 40 až 160 mg/kg v jednom cyklu. V ještě dalším provedení vynálezu je uvedené chemoterapeutické činidlo cyklofosfamid v dávkovém rozmezí 50 až 200 mg/kg v jednom cyklu. V jiném provedení vynálezu uvedené chemoterapeutické činidlo je irinotecan v dávce *· « 4« · ·· · • · 4 * · 4 • ··«· • · ·♦· · « ·· ··*♦

9 9 • · · 9 • 9 9 9 ·· 99 • 9 9

9 9 •9 9 9 • ♦ · 9

99 v rozmezí 50 až 75, 75 až 100, 100 až 125 nebo 125 až 150 mg/m²v jednom cyklu. V ještě dalším provedení vynálezu uvedené chemoterapeutické činidlo je vínblastin a aplikuje se v dávkovém rozmezí 3,7 až 5,4, 5,5 až 7,4 , 7,5 až 11 nebo 11 až 18,5 mg/m² v jednom cyklu. V jiném provedení vynálezu je uvedené chemoterapeutické činidlo metotrexát v dávce v rozmezí

3,3 až 5, 5 až 10, 10 až 100 nebo 100 až 1 000 mg/m² v jednom cyklu.

Ve výhodném provedení vynálezu se popisuje použití nízkých dávek chemoterapeutického činidla, když se aplikuje jako část léčebného postupu za použití nesmyslného oligomerů bcl-2. Počáteční léčba pomocí nesmyslného oligomerů bcl-2 zvyšuje citlivost nádoru vůči následné aplikaci chemoterapie, přičemž je možné aplikovat dávku, která odpovídá nebo je nižší než minimální hranice rozmezí dávky, když se chemoterapeutické činidlo aplikuje bez nesmyslného oligomerů bcl-2. V jednom provedení vynálezu se pacientovi trpícímu zhoubným bujení aplikuje nesmyslný oligomer bcl-2 a nízká dávka (například 6 až 60 mg/m² za den nebo nižší) doketaxelu. V jiném provedení vynálezu se pacientovi trpícímu zhoubným bujením aplikuje nesmyslný oligomer bcl-2 a nízká dávka (například 10 až 135 mg/m² za den nebo méně) paklitaxelu. V jiném provedení vynálezu se pacientovi trpícímu zhoubným bujením aplikuje nesmyslný oligomer bcl-2 a nízká dávka (například 2,5 až 25 mg/m² za den nebo méně) fludarabinu. V jiném provedení vynálezu se pacientovi trpícímu zhoubným bujením aplikuje nesmyslný oligomer bcl-2 a nízká dávka (například 0,5 až 1,5 g/m² za den nebo méně) cytosinarabinosidu (Ara-C).

V jednom provedení vynálezu se popisuje použití jednoho nebo více nesmyslných oligonukleotidů bcl-2, který se aplikuje před, následně nebo společně s nízkou dávkou léčby ·· * * · « * ·Φ4« • *

ΦΦ« · « »* ···· ♦ · • · • φ « · «« »♦ ♦ *·· • · · • · · φ • · « • · » >

·* ΦΦ chemoterapeutického činidla za zhoubného bujení.

účelem prevence nebo

V jednom provedení vynálezu je uvedené chemoterapeutické činidlo cis-platina, například přípravek PLATINOL nebo PLATINOL-AQ (od firmy Bristol Myers) a aplikuje se v dávce v rozmezí 5 až 10, 10 až 20, 20 až 40 nebo 40 až 75 mg/m²v jednom cyklu. V jiném provedení vynálezu se pacientovi aplikuje dávka cis-platiny v rozmezí 7,5 až 75 mg/m² v jednom cyklu, který trpí zhoubným bujením vaječníků. V jiném provedení vynálezu se dávka cis-platiny pohybuje v rozmezí 5 až 50 mg/m² v jednom cyklu a aplikovala se pacientovi trpícímu karcinomem močového měchýře.

V jiném provedení vynálezu je chemoterapeutickým činidlem karboplatina, například přípravek PARAPLATIN (od firmy Bristol Myers) a aplikuje se v rozmezí dávky 2 až 4, 4 až 8, 8 až 16, 16 až 35 nebo 35 až 75 mg/m² v jednom cyklu. V jiném provedení vynálezu se pacientovi trpícímu zhoubným bujením vaječníků aplikuje karboplatina v rozmezí 7,5 až 75 mg/m² v jednom cyklu. V jiném provedení vynálezu se pacientovi trpícímu karcinomem močového měchýře aplikuje karboplatina v rozmezí 5 až 50 mg/m²v jednom cyklu. V jiném provedení vynálezu se pacientovi trpícímu zhoubným bujením varlat aplikuje karboplatina v rozmezí 2 až 20 mg/m² v jednom cyklu.

V jiném provedení vynálezu je chemoterapeutickým činidlem cyklofosfamid, například přípravek CYTOXAN (od firmy Bristol Myers Squibb) a aplikuje se v rozmezí dávky 0,25 až 0,5, 0,5 až 1, 1 až 2, 2 až 5 nebo 5 až 10, 10 až 20, 20 až 40 mg/m²v jednom cyklu. V jiném provedení vynálezu se pacientovi trpícímu maligním karcinomem aplikuje cyklofosfamid v rozmezí 4 až 40 mg/m² v jednom cyklu. V jiném provedení vynálezu se

ΦΦ φ φ · φ φφφ φ ΦΦΦΦ • φ

ΦΦΦΦ « ·· ΦΦΦΦ φ φ φ φφφ φ φ φ φ φ φ φ • · « φ · φ φ · φ φ φ φφ φφ ·· ΦΦΦΦ pacientovi trpícímu nemaligním karcinomem aplikuje cyklofosfamíd v rozmezí 0,25 až 2,5 mg/m² v jednom cyklu.

V jiném provedení vynálezu je chemoterapeutickým činidlem cytarabin, například přípravek CYTOSAR-U (od firmy Pharmacia and Upjohn) a aplikuje se v rozmezí dávky 0,5 až 1, 1 až 4, 4 až 10 nebo 10 až 25, 25 až 50 nebo 50 až 100 mg/m² v jednom cyklu. V jiném provedení vynálezu se pacientovi trpícímu akutní leukémií aplikuje cytarabin v rozmezí 10 až 100 mg/m²v jednom cyklu. V jiném provedení vynálezu se pacientovi trpícímu meningiální leukémií aplikuje cytarabin v rozmezí 0,5 až 5 mg/m² v jednom cyklu. V jiném provedení vynálezu se pacientovi trpícímu zhoubným bujením aplikuje dávka lipozomálního cytarabinu, například přípravek DEPOCYT (od firmy Chiron Corp.) v rozmezí 5 až 50 mg/m² v jednom cyklu.

V jednom provedení vynálezu je uvedené chemoterapeutické činidlo dakarbazin, například přípravek DTIC nebo DTIC-DOME (od firmy Bayer Corp.) a aplikuje se v dávkovém rozmezí 15 až 250 mg/m² v jednom cyklu nebo v rozmezí 0,2 až 2 mg/kg v jednom cyklu. V jiném provedení vynálezu se pacientovi trpícímu Hodkinovou nemocí aplikuje dakarbazin v rozmezí 15 až 150 mg/m²v jednom cyklu. V jiném provedení vynálezu se pacientovi trpícímu maligním melanomem aplikuje dakarbazin v rozmezí 0,2 až 2 mg/m² v jednom cyklu.

V jednom provedení vynálezu je uvedené chemoterapeutické činidlo topotekan, například přípravek HYCAMTIN (od firmy SmithKline Beecham) a aplikuje se v dávkovém rozmezí 0,1 až 0,2, 0,2 až 0,4, 0,4 až 0,8 nebo 0,8 až 1,5 mg/m² v jednom cyklu.

V jednom provedení vynálezu je uvedené chemoterapeutické činidlo irinotekan, například přípravek CAMPTOSAR (od firmy • · ··· ·· · * · · oo · ···· ··· ···· .

.· · ···. ·.·.

···· · ·· ·· ·· ··

Pharmacia and Upjohn) a aplikuje se v dávkovém rozmezí 5 až 10, 10 až 25, nebo 25 až 50 mg/m² v jednom cyklu.

V jednom provedení vynálezu je uvedené chemoterapeutické činidlo fludarabin, například přípravek FLUDARABA (od firmy Berlex Laboratories) a aplikuje se v dávkovém rozmezí 2,5 až 5, 5 až 10, 10 až 15 nebo 15 až 25 mg/m² v jednom cyklu.

V jednom provedení vynálezu je uvedené chemoterapeutické činidlo cytozinarabinozid (Ara-C) a aplikuje se v dávkovém rozmezí 200 až 2 000 mg/m² v jednom cyklu.

V jednom provedení vynálezu je uvedené chemoterapeutické činidlo doketaxel, například přípravek TAXOTERE (od firmy Rhone Poulenc Rorer), a aplikuje se v dávkovém rozmezí 6 až 10, 10 až 30 nebo 30 až 60 mg/m² v jednom cyklu.

V jednom provedení vynálezu je uvedené chemoterapeutické činidlo paklitaxel, například přípravek TAXOL (od firmy Bristol Myers Squibb) a aplikuje se v dávkovém rozmezí 10 až 20, 20 až 40, 40 až 70 nebo 70 až 135 mg/m² v jednom cyklu.

V jednom provedení vynálezu je uvedené chemoterapeutické činidlo 5-fluorouracil a aplikuje se v dávkovém rozmezí 0,5 až 5 mg/m² v jednom cyklu.

V jednom provedení vynálezu je uvedené chemoterapeutické činidlo doxorubicin (například přípravek ADRIAMYCIN (od firmy Pharmacia and Upjohn), DOXIL (OD FIRMY Alza) a RUBEX (od firmy Bristol Myers Squibb), a aplikují se v dávkovém rozmezí 2 až 4, 4 až 8, 8 až 15, 15 až 30 nebo 30 až 60 mg/m² v jednom cyklu.

V jednom provedení vynálezu je uvedené chemoterapeutické činidlo etoposid, například přípravek VEPESID (od firmy Pharmacia and Upjohn) a aplikuje se v dávkovém rozmezí 3,5 až 7, 7 až 15, 15 až 25 nebo 25 až 50 mg/m² v jednom cyklu.

V jiném provedení vynálezu se pacientovi trpícímu karcinomem varlat aplikuje etopozid v dávce 5 až 50 mg/m² v jednom cyklu.

V jiném provedení vynálezu se pacientovi trpícímu karcinomem malých plicních buněk aplikuje etopozid v dávce 3,5 až 35 mg/m²v jednom cyklu.

V jednom provedení vynálezu je uvedené chemoterapeutické činidlo vinblastin, například přípravek VELBAN (od firmy Eli Lilly) a aplikuje se v dávkovém rozmezí 0,3 až 0,5, 0,5 až 1, laž 2, 2 až 3 nebo 3 až 3,7 mg/m² v jednom cyklu.

V jednom provedení vynálezu je uvedené chemoterapeutické činidlo vinkristin, například přípravek ONCOVIN (od firmy Eli Lilly) a aplikuje se v dávkovém rozmezí 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6 nebo 0,7 mg/m² v jednom cyklu.

V jednom provedení vynálezu je uvedené chemoterapeutické činidlo metotrexát a aplikuje se v dávkovém rozmezí 0,2 až 0,9, 1 až 5, 5 až 10, 10 až 20 mg/m² v jednom cyklu.

V jiném provedení vynálezu se nesmyslný oligomer bcl-2 aplikuje v kombinaci s jedním nebo více imunoterapeutickými činidly, jako jsou protilátky a imunomodulátory, které zahrnují, ale nejsou omezeny na rituxan, rituximab, kampat-1, gemtuzumab nebo trastuzumab.

V jiném provedení vynálezu se nesmyslný oligomer bcl-2 aplikuje v kombinaci s jedním nebo více antiangiogenními činidly, které zahrnují, ale nejsou omezeny na angiostatin, talidomid, kringle 5, endostatin, Serpin (inhibitor serinové • · · · ··· ·· ··· · ········· or ·····♦♦ · · · · * «

O J * · · · · · · · · · • · · · · ·· ·· · · ·« proteázy), anti-trombin, N-terminální proteolyticky fragment fibronektinu o molekulové hmotnosti 29 000 a C-terminální proteolytický fragment fibronektinu o molekulové hmotnosti 40 0000, proteolytický fragment prolaktinu o molekulové hmotnosti 16 000, proteolytický fragment faktoru-4 krevních destiček o molekulové hmotnosti 7 800, peptid obsahující 13 aminokyselin odpovídající fragmentu faktoru-4 krevních destiček (popisuje se v publikaci Maione et al., 1990, Cancer Res. 51: 20772083), peptid obsahující 14 aminokyselin odpovídající fragmentu kolagen I (popisuje se v publikaci Tolma et al., 1993, J. Cell. Biol. 122:497-511), peptid obsahující 19 aminokyselin odpovídající fragmentu trombospondinu I (popisuje se v publikaci Tolsma et al., 1993, J. Cell Biol. 122: 497511), peptid obsahující 20 aminokyselin a odpovídající fragmentu SPARC (popisuje se v publikaci Sage et al., 1995, J. Cell. Biochem. 57: 1329-1334) nebo libovolné fragmenty, členy rodiny nebo jejich deriváty zahrnující jejich farmaceuticky přijatelné sole.

Popisují se také jiné peptidy, které inhibují angiogenezí a odpovídají fragmentům lamininu, fibronektinu, prokolagenu a EGE (popisuje se v publikaci Cao, 1998, Prog. Mol. Subcell. Biol. 20: 161-176). Monoklonální protilátky a cyklické pentapeptidy, které blokují jisté integriny, které se váží na proteiny RGD (to znamená, že mají peptidový motiv Arg-Gly-Asp) a vykazují anti-vaskularizační aktivity (popisuje se v publikaci Brooks et al., 1994, Science 264: 569-571, Hammes et al., 1996, nátuře Medicine 2: 529-533). Inhibice receptoru aktivátoru urokinázového plasminogenu pomocí receptorového antagonisty inhibuje angiogenezí, růst nádoru a metastáze (popisuje se v publikaci Min et al., 1996, Cancer res. 56: 2428-33, Crowley et al., 1993, proč. Nati. Acad. sci. USA 90: 5021-25). Vynález také popisuje použití takových antiangiogenních činidel podle vynálezu.

• · · • · · · • · • · « · ·

V jiném provedení vynálezu se nesmyslný oligomer bcl-2 aplikuje v kombinaci s ozářením.

V jiném provedení vynálezu se nesmyslný oligomer bcl-2 aplikoval v kombinaci s jedním nebo více cytokinů, které zahrnují lymfokiny, faktory nekrózy nádoru, cytokiny podobné faktoru nekrózy nádoru, lymfotoxin-α, lymfotoxin-β, interferona, interferon-β, makrofágové zánětlivé proteiny, faktor stimulující kolonie granulocytových monocytů, interleukiny (zahrnují, ale nejsou omezeny na interleukin-1, interleukin-2, interleukin-6, interleukin 12, interleukin 15, interleukin 18), ligandy 0X40, CD27, CD30, CD40 nebo CD137, ligand FasFas, 4-1BBL, protein aktivující endoteliální monocyty nebo libovolné fragmenty, členy rodiny nebo jejich deriváty zahrnující jejich farmaceuticky přijatelné sole.

V jiném provedení vynálezu se nesmyslný oligomer bcl-2 aplikoval v kombinaci s vakcínou určenou proti zhoubnému bujení. Příklady vakcín určených pro zhoubné bujení zahrnují, ale nejsou omezeny na autologní buňky nebo tkáně, neautologní buňky nebo tkáně, karcinoembryonní antigen, alfa-fetoprotein, lidský chorionní gonadotropin, živou vakcínu BCG, proteiny linie, melanocytů (například gplOO, MART-l/MelanA, TRP-1 (gp75), tyrosináza, antigeny specifické pro široce rozšířené nádory (například BAGE, GAGE-1, GAGE-2, MAGE-1, MAGE-3, Nacetylglukozaminyltranferáza-V, pl5), mutované antigeny, které jsou specifické pro nádor (beta-katenin, MUM-1, CDK4), antigeny, které nepocházejí z melanomu (například HER-2/neu (karcinom prsu a vaječníků) , E6, E7 z lidských papilomavirů (karcinom děložního čípku), MUC-1 (karcinom prsu, vaječníků a pankreasu)). V publikaci Robbins end Kawakami, 1996, Curr. Opin. Immunol. 8: 628-36 se popisují nádorové antigeny, které • to · · · · • toto toto to ······· · · • · β · · · ···· · ·· ·· toto·· • to rozeznávají buňky T. Vakcíny určené proti zhoubnému bujení mohou být čisté přípravky.

V jiném provedení se aplikuje nesmyslný oligomer bcl-2 ve spojení s hormonální prostředky zahrnují terapií. Hormonální terapeutické hormonální agonisty, hormonální antagonisty (například flutamid, tamoxifen, acetát leuproidu (LUPRON) a steroidy (například dexametyzon, retinoidy, betametazon, kortizol, kortizon, prednizon, dehydrotestosteron, glukokortikoidy, mineralokortikoidy, estrogen, testosteron, progestiny).

V jiném provedení vynálezu se při léčbě zhoubného bujení aplikuje nesmyslný oligomer bcl-2 ve spojení s genovou terapií.

V jednom provedení vynálezu se nesmyslný oligomer bcl-2 aplikuje pacientovi trpícímu zhoubným bujením v kombinaci s alespoň jedním terapeutickým činidlem určeným pro zhoubné bujení po dobu krátkého léčebného cyklu za účelem léčby karcinomu. V jednom provedení vynálezu uvedený léčebný cyklus trvá 2 až 13 dní. V jiném provedení uvedený léčebný cyklus trvá 4 až 7 dní. V jiném provedení vynálezu trvá léčebný cyklus 5 až 6 dní. Trvání léčby terapeutickým činidlem určeným pro zhoubné bujení může kolísat podle druhu použitého terapeutického činidla. Vynález také popisuje přerušovanou aplikaci nebo rozdělení denní dávky do několika částečných aplikací. Pro odborníka je výhodné stanovit vhodný čas léčby pro určité terapeutické činidlo určené pro zhoubné bujení a vynález dále popisuje hodnocení optimálního léčebného rozvrhu pro každé terapeutické činidlo určené pro zhoubné bujení.

Vynález předpokládá alespoň jeden léčebný cyklus, výhodnější je více jak jeden cyklus, během kterého se aplikuje « · • · · · • · • · · · jediné terapeutické činidlo nebo sekvence terapeutických činidel. V preferovaném provedeni vynálezu je léčebný cyklus kratší než 14 dní. V jednom provedení vynálezu je délka jednoho léčebného cyklu 10 až 13 dní. Ve výhodném provedení vynálezu je délka jednoho cyklu 5 až 6 dní. Pro odborníka je výhodné znát vhodný časový úsek jednoho cyklu, stejně jako počet cyklů a interval mezi jednotlivými léčebnými cykly. Vynález také odhaduje optimální rozvrh léčby v případě každého nesmyslného oligomerů a terapeutického činidla vhodného pro zhoubné bujení.

Farmaceutické prostředky

Vynález dále popisuje farmaceutický prostředek, který obsahuje nesmyslný oligomer bcl-2 a farmaceuticky přijatelný nosič. Vhodné farmaceuticky přijatelné nosiče zahrnují v podstatě chemoterapeutické inertní a netoxické prostředky, které neinterferují s účinností biologické aktivity farmaceutického prostředku. Příklady vhodných farmaceutických nosičů zahrnují, ale nejsou omezeny na fyziologické roztoky, roztoky glycerolu, etanol, N-(1 (2,3-dileyloxy)propyl)-Ν,Ν,Νtrimetylamonium chlorid (DOTMA), diolesylfosfotidyletanolamin (DOPE) a lipozomy. Takové prostředky by měly obsahovat terapeuticky účinné množství sloučeniny spolu s vhodným množstvím nosiče tak, že se nacházejí ve formě, která je vhodná pro aplikaci pacientovi. Prostředek by měl být vhodný pro určitý způsob aplikace. Orální aplikace například vyžaduje enterosolventní potahy, aby se chránily nesmyslné oligomery před rozkladem v gastrointestinálním traktu. V dalším příkladu se nesmyslný oligomer bcl-2 může aplikovat v lipozomálním přípravku, kde je nesmyslný oligomer chráněn před působením degradačních enzymů, napomáhá transportu do oběhového systému a je zaručen účinnější průchod buněčnou membránou do nitra buňky.

• · · · · · • · · · · • · · · · · • ··«··· « • · · · · ·· · · · «· · *

V jednom provedení vynálezu farmaceutický prostředek obsahuje nesmyslný oligomer bcl-2 a jeden nebo více terapeutických činidel a farmaceuticky přijatelný nosič. V určitém provedení vynálezu farmaceutický prostředek obsahuje nesmyslný oligomer bcl-2 a jeden nebo více terapeutických činidel určených pro zhoubné bujení a farmaceuticky přijatelný nosič.

V jednom provedení vynálezu farmaceutický prostředek obsahující nesmyslný oligomer bcl-2 s terapeutickým činidlem nebo bez něj a farmaceuticky přijatelný nosič a aplikuje se v účinné dávce.

V jednom provedení vynálezu farmaceuticky prostředek obsahuje nesmyslný oligomer bcl-2 v dávce přibližně 0,01 až 0,1, 0,1 až 1, 1 až 5 nebo 6 až 10 mg/kg/den. Výhodná je dávka 4 až 9 mg/kg/den, výhodnější je dávka 5 až 7 mg/kg/den a farmaceuticky přijatelný nosič. Skutečné množství libovolného určitého nesmyslného aplikovaného oligomerů závisí na několika faktorech, jako je například typ zhoubného bujení, toxicita nesmyslného oligomerů vůči normálním buňkám v těle, rychlost pohlcení nesmyslného oligomerů nádorovými buňkami, tělesná hmotnost a stáří jednotlivce, kterému se nesmyslný oligomer aplikuje. Vzhledem k řadě faktorů in vivo, které mohou interferovat s působením nebo biologickou aktivitou nesmyslného oligomerů, účinné množství nesmyslného oligomerů u každého jednice může být různé.

V dalším provedení vynálezu farmaceutické prostředky podle vynálezu obsahují nesmyslný oligomer bcl-2 v určité vysoké dávce, která se pohybuje v rozmezí přibližně 30 až 50 mg/kg/den. Ve specifickém provedení vynálezu určitá vysoká dávka nesmyslného oligomerů bcl-2 se pohybuje v rozmezí 11 až • · · • · · • ···· · • ·· 9 až 35, 36 až 40, 41 až 45 se během léčebného cvklu.

15, 16 až 20, 21 až 25, 26 až 30, nebo 46 až 50 mg/kg/den a aplikuje

Výběr výhodné účinné dávky se může stanovit (například prostřednictvím klinických studií) na základě zvažování několika faktorů, které jsou odborníkovi zřejmé. Takové faktory zahrnují určitou formu nesmyslného oligomeru, farmakokinetické faktory oligomeru, jako je biologická dostupnost, metabolizmus, poločas rozpadu atd.. Tyto faktory se zjišťují během postupu vývoje a v typickém případě se používají pro získání zdokonaleného farmaceutického prostředku. Další faktory, které je nutné zvažovat při stanovení dávky, jsou typ léčeného onemocnění, cíle, které chceme léčbou dosáhnout, tělesná hmotnost pacienta, imunitní status pacienta, způsob aplikace, zda aplikace nesmyslného oligomeru nebo kombinace s terapeutickým činidlem je akutní nebo chronická, současně aplikované způsoby léčby a jiné faktory, které jsou dobře známy v oboru a ovlivňují účinnost aplikovaného farmaceutického činidla.

Prostředek podle vynálezu se může vytvořit v neutrální formě nebo ve formě sole. Farmaceuticky přijatelné sole zahrnují ty formy s volnými aminoskupinami, které se získaly z kyseliny chlorovodíkové, fosforečné, octové, šťavelové, vinné atd. a ty vytvořené s volnými karboxylovými skupinami, jako jsou ty získané z hydroxidu sodného, draselného, amonného, vápenatého, železitého, isopropylaminu, trietylaminu, 2-etylaminoetanolu, histidinu, prokainu atd..

Ve výhodném provedení vynálezu se prostředek vytvořil v souladu s rutinními postupy, jako farmaceutický prostředek určený pro aplikaci podkožní injekcí nebo intravenózní aplikaci člověku. V typickém případě prostředky určené pro podkožní nebo intravenózní aplikaci jsou roztoky ve sterilním • · • · · · « · · · · · • · · φ φ · φ · ··«··· φ ·«· · φ • · · φ · φ · φ φ • * · φφ Φ· · · izotonickém vodném pufru. Když je to nezbytné, prostředek může také zahrnovat rozpouštěcí činidla a 'lokální anestetika, jako je lidokain, aby se zmírnila bolest v místě aplikace injekce. V obecném případě se jednotlivé složky aplikují buď odděleně nebo ve formě směsi ve formě jednotkové dávky, například jako lyofilizovaný prášek nebo bezvodý koncentrát v hermeticky uzavřeném kontejneru, jako je ampule nebo tableta, kde se uvádí množství aktivního činidla. Když se prostředek aplikuje infúzí, může se rozpustit v infúzní nádobě, sáčku nebo v jiné přijatelné nádobě pomocí sterilní vody, která svou čistotou odpovídá farmaceutickému použití, fyziologickým roztokem nebo jiným přijatelným rozpouštědlem. Když se prostředek aplikuje injekcí, může se k sadě přidat ampule se sterilní vodou nebo fyziologickým roztokem a tak se může injekce připravit přímo před aplikací.

Způsoby aplikace

Aplikace farmaceutického prostředku podle vynálezu zahrnuje, ale není omezena na orální aplikaci, intravenózní infuzi, subkutánní injekci, intramuskulární injekci, povrchovou aplikaci, depotní injekci, implantát, uvolňování v určitém čase, zavedení do tělních dutin, intranazální aplikaci, inhalování, zavedení přímo do nádoru, nitrooční a řízené uvolňování. Farmaceutické prostředky podle vynálezu se mohou zavést parenterálně, průchodem sliznic (například orálně), nazálně, rektálně, intravaginálně, subligválně, submukozálně nebo transdermálně. Aplikace je s výhodou parenterální, to znamená z využitím zažívacího traktu, ale více se preferují ostatní způsoby. Jsou to například intravenózní, subkutánní, intramuskulární, intraperitoneální, intraorbitální, intrakapsulární, . intraspinální, intrasternální, intraarteriální nebo intradermální aplikace. Odborník zvažuje při vybírání způsobu aplikace specifické φ φ φ ·· φφφ · «φφφ popisuje způsoby aplikací, může například aplikovat

Φ φφφφ φ φ výhody a Nesmyslný nevýhody. Vynález oligomer bcl-2 se subkutánní injekcí, zatímco kombinovaná terapeutická činidla se aplikují intravenózní infúzí. Aplikace jednoho nebo více druhů nesmyslného oligomeru bcl-2 s jinými terapeutickými činidly nebo bez nich se může provést současně (ko-aplikace) nebo postupně. Například nesmyslný oligomer bcl-2 se aplikuje jako první, za účelem zvýšit citlivost nádoru vůči následné aplikaci terapeutického činidla určenému pro zhoubné bujení nebo vůči ozáření. V jiném výhodném provedení vynálezu se mohou časové úseky aplikace jednoho nebo více druhů nesmyslného oligomeru bcl-2 s jedním terapeutickým činidlem (nebo bez něj ) překrývat. Nesmyslný oligomer bcl-2 se aplikuje po dobu 7 dní a druhé terapeutické činidlo se začíná podávat pátý den léčby nesmyslným oligomerem bcl-2 a pokračuje i po skončení léčby nesmyslným oligomerem.

Mohou se připravit farmaceutické prostředky upravené pro orální aplikaci například ve formě kapsulí nebo tablet, jako prášek nebo granule, jako roztoky, syrup nebo suspenze (ve vodných nebo nevodných roztocích), jako poživatelné pěny nebo šlehačka nebo jako emulze. Tablety nebo tvrdé želatinové kapsule mohou zahrnovat například laktózu, škrob nebo jejich deriváty, stearát hořečnatý, sacharin, celulózu, uhličitan vápenatý, kyselinu stearovou nebo její sole. Měkké želatinové kapsule mohou obsahovat například rostlinný olej, vosky, tuky, semi-pevné nebo kapalné polyoly atd.. Roztoky a syrupy mohou obsahovat například vodu, polyoly a cukry.

Aktivní činidlo určené potáhnout nebo smísit glycerylmonostearátem nebo oddaluje desintegraci nebo činidla v zažívacím ústrojí.

pro orální aplikaci se může s materiálem (například glyceryldistearátem) , který ovlivňuje absorpcí aktivního Pak se například může dosáhnout • · • 4 *·♦· • · • 4 · · postupného uvolnění aktivního činidla po dobu několika hodin a jestliže je to nutné, aktivní činidlo může být chráněno před rozkladem v prostředí zažívacího ústrojí. Farmaceutické prostředky se mohou upravit tak, aby se využila hodnota pH a enzymatické podmínky v zažívacím ústrojí při uvolňování aktivního činidla v určitém místě zažívacího ústrojí.

Farmaceutické prostředky upravené pro parenterální aplikaci zahrnují ale nejsou omezeny na vodné a nevodné sterilní ínjektovatelné roztoky nebo suspenze, které mohou obsahovat antioxidanty, pufry, bakteriostaty, rozpouštědla, které udržují prostředky podstatně izotonické s krví recipienta. Další složky, které se mohou vyskytovat v takových prostředcích mohou být voda, alkoholy, polyoly, glycerin a rostlinné oleje. Prostředky určené pro parenterální aplikaci mohou být přítomny v jednotkové dávce nebo v nádobkách obsahujících více dávek. Jsou to například vybrané ampule a lékovky a mohou se uchovávat v lyofilizovaném stavu. K lyofilizovaným produktům stačí přidat těsně před aplikací pouze sterilní kapalný nosič, což může být například sterilní fyzilogický roztok vhodný pro injekce. Injekční roztoky a suspenze připravené v čase potřeby se mohou připravit ze sterilních prášků, granulí a tablet. Takové prostředky by měly obsahovat terapeuticky účinné množství nesmyslného oligomeru bcl-2 nebo jiného terapeutického činidla spolu s vhodným množstvím nosiče, přičemž vzniká forma vhodná pro aplikaci pacientovi. Takový prostředek by měl vyhovovat způsobu aplikace.

Farmaceutické prostředky upravené pro transdermální aplikaci se mohou připravit ve formě diskrétních náplastí, které jsou v těsném kontaktu s pokožkou a používají se pro prodloužení doby aplikace farmaceutického prostředku. Farmaceutické prostředky upravené pro povrchovou aplikace se • 444

» * 44 4 4

4 4 • 44*4 4

4

44 4 4 mohou vyskytovat ve formě mastí, krémů, suspenzí, roztoků, prášků, mléka, past, gelů, sprejů, aerosolů nebo olejů. Povrchové masti nebo krémy se mohou s výhodou použít pro povrchovou aplikaci na kůži, ústa, oči nebo jiné vnější tkáně. Když se připraví ve formě mastí, může se aktivní složka vyskytovat ve formě parafinového základu mastí nebo s vodou mísitelného základu mastí. V jiném případě se aktivní složka může připravit ve formě krému, jehož základem je olej ve vodě nebo voda v oleji.

Farmaceutické prostředky upravené pro povrchovou aplikaci do očí zahrnují například oční kapky nebo injektovatelné prostředky. V těchto prostředcích je možné aktivní složku rozpustit nebo resuspendovat ve vhodném nosiči, který zahrnuje například vodné rozpouštědlo s karboxymetylcelulózou nebo bez ní. Farmaceutické prostředky upravené pro povrchovou aplikaci v ústech zahrnují například pastilky, tablety a ústní vody.

Farmaceutické prostředky upravené pro nazální aplikaci obsahují pevné nosiče, jako je prášek (velikost částic se s výhodou pohybuje v rozmezí 20 až 500 mikronů). Prášek se může aplikovat šňupáním, to znamená rychlým vdechnutím prášku nosem z nádobky, která je přidržována v blízkosti nosu. Vjiném případě může prostředek upravený pro nazální aplikaci obsahovat kapalné nosiče a vyskytuje se ve formě nosních kapek nebo sprejů. Aktivní složka může být obsažena ve formě vodného nebo olejového roztoku. Prostředky vhodné pro aplikaci inhalací se připravují do speciálně upravených nádobek, které zahrnují, ale nejsou omezeny na tlakované aerosoly, rozprašovače nebo insuflátory, které se mohou zkonstruovat tak, že se aplikují předem definované dávky aktivní složky.

Farmaceutické prostředky upravené pro rektální aplikaci se mohou vyskytovat ve formě čípků nebo střevního nálevu.

Farmaceutické prostředky upravené pro vaginální aplikaci se mohou vyskytovat ve formě pesaru, tamponů, krémů, gelů, past, pěn nebo sprejů.

4

4444 • 4

444*

9994 • 4 4

4 4

9 4 4

4 9 4 • 4 44

4444

4 4

V jednom provedení vynálezu se farmaceutické prostředky podle vynálezu mohou zavést pomocí systému pro řízené uvolňování. Farmaceutický prostředek se může například aplikovat použitím intravenózní infúze, implantovaného osmotického čerpadla, transdermálních náplastí, lipozomů nebo jiných druhů aplikace. V jiném provedení vynálezu se může použít čerpadlo (popisuje se například v publikaci Langer, 1990, Science 249: 1527-33, Sefton, 1987, CRC Crit. Ref.

Biomed. Eng. 14: 201, Buchwald et al., 1980, Surgery 88: 507,

Saudek et al., 1989, N. Engl. J. Med. 321: 574). V jiném provedení vynálezu se aktivní látka zavede v určitém vesiklu, kterým může zvláště být lipozom (popisuje se například v publikaci Langer, Science 249: 1527-33 (1990), Treat et al., Liposomes in the therapy of infectious disease and cancer, Lopez-Berestein and Fidler (eds.), Liss, New York, pp. 353-65, Lopez-Berestein, ibid., pp. 317-27, mezinárodní patentová přihláška č. WO 91/04014, americký patentový dokument č. 4 704 355) . V jiném provedení vynálezu se mohou použít polymerní materiály (popisuje se například v publikaci Medical application of control release, langer and Wise (eds.), CRC Press: Boča Raton, Florida, 1974, Controlled drug bioavability, Drug product design and performance, Smolen and

Balí (eds.),	Wiley:	: New	Zork (1984), Ranger	and Peppas, 1953,
J. Macromol.	Sci.	rev.	Macromol. Chem. 23:	61, Levý et al.,
1985, Science	228:	190,	During et al·., 1989,	Ann. Neurol. 25:
351, Howard et al.,	1989	, J. Neurosurg. 71: 105).
V jiném	provedení	vynálezu se může	systém řízeného
uvolňování zavést	do	těsné blízkosti	cíle. Například
mikročerpadlo	může	zavést řízené dávky přímo	do mozku, čímž se

aplikuje pouze potřebná dávka, dávky (popisuje se například

Medical applications of controlled release, vol. 2, pp. 115

138).

9 99 99 ·· ♦ 99 9999 ·9 9991

9 9 9 9 9 9 9 <

9 9 9 9 9 9 9 9

9999 9 9 9 999 9 « * · 449« ··*· 4 94 44 ·· »· která tvoří část systémové v publikaci Goodson, 1984,

V jednom provedení vynálezu může být nutné aplikovat farmaceutický prostředek podle vynálezu lokálně do oblasti, kde je potřeba léčba. To může být dosaženo například a bez omezení lokální infúzí během chirurgického zákroku, povrchovou aplikací (například nanesením prostředku na obvazy rány po chirurgickém zákroku), injekcí, katetrem, čípky nebo implantátem. Implantát může být porézní, neporézní nebo želatinový materiál, který zahrnuje membrány, jako jsou sialastické membrány nebo vlákna.

Čípky v obecném případě obsahují aktivní složky v rozmezí 0,5 % až 10 % hmotnosti. Aktivní složka u orálních prostředků tvoří 10 až 95 % hmotnosti.

Nesmyslný oligomer bcl-2 se může aplikovat před, během a/nebo po aplikaci jednoho nebo více terapeutických činidel. V jednom provedení podle vynálezu se nesmyslný oligomer může nejdříve aplikovat, aby snížil expresi bcl-2, který snižuje citlivost nádoru vůči následné imunizaci terapeutickým činidlem určeným pro zhoubné bujení. V jiném provedení vynálezu nesmyslný oligomer bcl-2 se může aplikovat po aplikaci terapeutického činidla určeného pro zhoubné bujení za účelem snížení exprese bcl-2 v nádoru, který může způsobit rezistenci nádoru a tak snižuje účinky terapeutického činidla určeného pro zhoubné bujení. V jiném provedení vynálezu se může doba mezi jednotlivými aplikacemi nesmyslného oligomerů bcl-2 a jednoho nebo více terapeutických činidle překrývat.

·· 9999 • to · • to · • toto·· • to toto to to · • · · • · · ♦ «· to to ·* « ·> ·>

Vynález dále popisuje farmaceutickou sadu obsahující účinné množství oligomerů bcl-2 v kombinaci s terapeutickým činidlem určeným pro zhoubné bujení, za účelem chránit před poruchami spojenými s bcl-2 a nebo tyto poruchy léčit. V jednom provedení vynálezu se účinné množství oligomerů bcl-2 a farmaceuticky přijatelný nosič mohou balit do lékovky nebo jiných nádob obsahující jedinou dávku. Ve specifickém provedení vynálezu oligomer bcl-2 obsahuje G3139 (SEQ ID NO: 17) . Sada může obsahovat jeden nebo více nádob naplněných jednou nebo více složkami farmaceutického prostředku podle vynálezu. Ve spojení s uvedenými složkami je nutné poznamenat, že výběr nádoby může být předem určen vládní komisí regulující výrobu, použití nebo prodej farmaceutických nebo biologických produktů, zvláště v případě prostředků určených pro aplikaci lidem.

Přehled obrázků na výkrese

Na obrázku č. 1 je zobrazena negativní regulace genu bcl-2 po pěti dnech léčby nesmyslným oligomerem bcl-2 v biopsii melanomu u pacienta č. 2.

Na obrázku č. 2 je znázorněno barvení biopsie pacienta č. 12 podle Tunela (pravá noha) před léčbou (a), po léčbě nesmyslným oligomerem bcl-2 (b) a po kombinované léčbě nesmyslným oligomerem bcl-2 a DTIC.

Na obrázku č. 3 jsou zobrazeny kožní metastáze (a) a CT zobrazení pánevní oblasti (b) pacienta č. 12 před a po léčbě nesmyslným oligomerem bcl-2 a společnou aplikací DTIC v dávce

6,5 mg/kg/den ve třech cyklech.

Příklady provedení vynálezu

	48	·· · * · · • ♦ · • ··*· · • · ♦ »·· ·	·· ···· » · · · · • · · · » • · · · · » • ♦ · · · * ·· ·« ·♦	• ·· · • 9 9 • 9 9 9
Příklad 1: Terapie	nesmyslným	oligomerem	bcl-2 za	účelem
zvýšení	citlivosti	maligního	melanomu	vůči

chemoterapii

Tento příklad popisuje úspěšné použití nesmyslného oligomerů bcl-2 pří léčbě pacientů trpících pokročilým stavem maligního melanomu. V této studii se šesti pacientům systémově aplikoval nesmyslný oligomer bcl-2 po dobu sedmi dní v dávce

5,3 nebo 6,5 mg/kg/den v kombinaci s chemoterapeutickým činidlem. Zjištění uvedené v příkladu ukazuje, že když se nesmyslný oligomer bcl-2 aplikuje ve vysokých, dávkách po krátký časový úsek, léčba vykazuje nízkou toxicitu splňující běžná kritéria toxicity, snižuje se množství Bcl-2 v nádoru, dochází k apoptóze a dochází k objektivní odezvě nádoru a prodlouží se život pacienta. Na uvedenou léčbu odpovídalo i několik pacientů s tzv. rezistentním karcinomem, u kterých se zaznamenala progrese onemocnění i během léčby standardními anti-karcinogenními činidly, a kde léčba standardními činidly, jako je aplikace samotného dakarbazinu měla minimální nebo žádný účinek. Naopak kombinovaná terapie nesmyslným oligomerem bcl-2 a dakarbazinem vedla k neočekávaným dlouhotrvajícím odezvám a prodloužila se doba přežití pacienta. Avšak při pokračování studie se zjistilo u pěti pacientů, kterým se aplikovaly vysoké dávky v kratším časovém úseku uspokojivá tolerance v případě, že se nesmyslný oligomer aplikoval systémově po dobu pěti dní v dávce 7 mg/kg/den. Výsledky ukazují, že aplikace nesmyslného oligomerů bcl-2 ve vysokých dávkách po kratší dobu je účinný a bezpečný způsob terapie melanomu. Toto zjištění je možné využít při strategií léčby jiných typů zhoubného bujení.

Materiál a způsoby φ» φφ«· • · ·

Φ 9 9

9 9

9999

9 •999 9 ·* φφφφ

9 9

9 9 9

9 9 9 • 9 99 •9 9

9 9

9 9 φ

Φ Φ Φ φ

ΦΦ ΦΦ

Čtrnáct pacientů ve IV. stádiu onemocnění melanomu tvořícího metastáze bylo vhodných pro tuto studii zvyšování dávky, jestliže pacienti vykazovali stanovitelnou míru onemocnění a kožní metastáze byly vhodné pro odběr biopsií a při westernově přenosu se dosáhlo pozitivních výsledků, kterými se charakterizuje exprese BCL-2 (uvedeno v tabulce č. 1) . Vyžadovalo se, aby pacienti renální, hepatická a hematopoietická funkce byla normální a poslední čtyři týdny se neaplikovala chemoterapie nebo imunoterapie.

Nesmyslný oligomer bcl-2 (sekvence 5'-TCTCCCAGCGTGCGCCAT3') se aplikovala jako kontinuální intravenózní infúze (CIV) po dobu 14 dní pomocí ambulantním infúzním čerpadlem (Sims Deltec lne., St. Paul, MN, USA) do centrálního žilného systému. Do odděleného periferního intravenózního systému se aplikovalo DTIC v dávce 200 mg/m²/den. Aplikace probíhala infúzí trvající jednu hodinu po dobu 5 dní v dny pět až devět ze 14 dní terapie nesmyslným oligomerem bcl-2. Léčebné cykly se opakovaly každý měsíc. Počáteční dávka byla 0,6 mg/kg/den a pokračovalo se v dávkách 1,3, 1,7, 2,1, 3,1, 4,1, 5,3 a 6,5 mg/kg/den ASO bcl-2. Bezpečnost dávky se stanovila ve skupině obsahující alespoň 3 pacienty, kterým se aplikovala daná dávka, přičemž skupině nových pacientů se. aplikovala další vyšší dávka (popisuje se v publikaci Waters, et al., 2000, J. Clin. Oncol. 18(9):1812-23). Opakování léčebného . cyklu trvajícího 28 dní a zvyšování dávky se povolilo u stabilních pacientů, kteří vykazovali pozitivní odezvu po období pozorování v délce dva týdny.

Aby se získaly zkušenosti s alternativním způsobem a postupem léčby, šesti pacientům léčených dávkou 5,3 nebo 6,5 mg/kg/den, kterým v prvním cyklu léčby byla aplikována intravenózní infúzí se v následujících cyklech nesmyslný oligomer bcl-2 aplikoval podkožně (SC). Tito pacienti léčení • 9 · · • 9999 · 9

9999 • · 9

9 9 • 9 • · · • «9 9

subkutánním způsobem obdrželi stejnou celkovou dávku aplikovanou dvakrát denně podkožní injekcí v den 1 až 7 kombinovanou s DTIC 800 mg/m², která se aplikovala jednohodinou infúzí v den 5.

Protinádorové účinky se hodnotily po každém léčebném cyklu posuvným měřidlem a provedla se detailní fotodokumentace kožních metastáz pacienta. Viscerální metastázy se dokumentovaly tomografem. Pro klasifikaci odezvy nádorů se použily kriteria WHO, která vyžadují dokumentaci trvající alespoň 4 týdny. Úplná odezva se definovala jako zmizení detekovatelných metastáz. Částečná odezva se definovala jako 50 % nebo větší zmenšení měřitelných metastáz. V případě, že pacienti vykazovaly více metastáz v jednom orgánu, dokumentovalo se pouze 5 cílených lézí. Zesílení měřitelného onemocnění o více jak 25 % nebo objevení nových metastáz se definovalo jako postupující onemocnění. Situace, kdy se poloměry metastáz zmenšily o méně než 50 %, ale více než 25 %, byly označeny za minimální odezvu. Všechny ostatní situace se označily jako stabilní stádium onemocnění. Doba přežití se hodnotila od doby první léčby tohoto protokolu.

Toxicita se hodnotila na základě běžných kritérií toxicity a monitorovala se denně během aplikace léků, pak týdně mezi jednotlivými cykly. Toxicita stupně III nebo IV spojená s léčbou, která se nezjistila během dvou týdnů mezi léčebnými cykly se považovala za toxicitu limitující dávku. Vzorky plazmy sloužící pro stanovení farmakokinetiky nesmyslného oligomerů bcl-2 se shromáždily v den 0 před aplikací léčby a pak v den 2, 3, 5, 6, 10 a 14 u pacientů, kterým se aplikovala dvoutýdenní intravenózní infúze BCL-2 ASO. 12-ti hodinové farmakokinetické profily se stanovily u pacientů, kterým se aplikoval nesmyslný oligomer bcl-2 podkožní injekcí jedné velké dávky do místa na břiše. Množství nesmyslného oligomerů

4 4 ·’' ·

4 «

4 4

444

4* 4444 ·« 4 44 4 bcl-2 v plazmě se stanovilo testem Pharmanalyt, Baden,

Rakousko za použití HPLC (popisuje se v publikaci Chen et al.,

1997, J. Chromatogr. B. Biomed. Sci. Appl. 692: 43-51).

Exprese BCL-2 a rychlost apoptózy u metastáz melanomu se hodnotila westernovým přenosem a způsobem TUNEL (popisuje se v publikaci Jansen et al., 1998, Nat. Med. 4(2): 232-4). Snížení množství BCL-2 o méně než 20 % ve srovnání se základní hodnotou se nepovažuje za podstatné vzhledem k omezení metody měření. Nádory pro odběr biopsií se vybraly na základě velikosti, místě výskytu a klinickým rysům, které jsou podobné jako cílové léze používané pro stanovení odezvy. Odebrání biopsie metastáz kožního melanomu se provedlo v den 0 a pátý den každé aplikace dávky nesmyslného oligomeru bcl-2 před aplikací DTIC. Další biopsie se odebíraly až do 14. dne cyklu za účelem dokumentace účinků kombinované léčby nesmyslným oligomerem BCL-2 a DTIC. Celkem se zkoumaly 2 až 4 biopsie od jednoho pacienta v případě jedné dávky. Část biopsií, které se použily pro test westernová přenosu, se také hodnotila rutinním histopatologickým vyšetřením, aby se potvrdil konzistentní obsah nádorových buněk a hodnotil se účinek na normální buňky biopsie.

Výsledky

Celkem 14 pacientů se léčily nesmyslným oligomerem BCL-2 (v dávce 0,6 až 6,5 mg/kg/den) v kombinaci s DTIC podle dvou postupů léčby (i.v. nebo s.c., jak se popisuje shora v textu).

Množství nesmyslného oligomeru BCL-2 v plazmě se pozorovalo po prvním dnu kontinuální intravenózní infúze a zvyšovalo se lineárně s aplikovanou dávkou. Dávky nesmyslného oligomerů BCL-2 vyšší než 1,7 mg/kg/den vedly ke stejnému množství oligomeru v plazmě 1,7 μς/μΐ.. Množství oligomerů

4

0 4 • 4 4

0000

0

004 0 4

0040 * 0

0 4

0

0 0 «4

000« určené v plazmě bylo aktivní ve zvířecích modelech (popisuje se v publikaci Raynaud et al., 1997, J. Pharmacol. Exp. Ther. 281: 420-7). Při dávce 6,5 mg/kg/den se dosáhlo průměrného množství 6,47 pg/ml ± SD = 2,5 pg/ml v plazmě během 24 hodin. Křivka množství nesmyslného oligomeru BCL-2 v plazmě po aplikaci velké dávky podkožní injekcí dvakrát denně dosáhla zvonovitého tvaru po 12 hodinách. Maximální koncentrace 8,6 gg/ml ± SD = 1,26 gg/ml se pozorovala tři až čtyři hodiny po podkožní injekci dávky 3,25 mg/kg aplikované ve dvanáctihodinových intervalech. Ve více jak 90 % časového úseku 12 hodin mezi aplikací podkožních injekcí množství oligomeru v plazmě přesáhlo cílovou hodnotu 1 mg/ml, která je spojena s biologickou aktivitou. U pacientů, kterým se aplikovala terapie ve více cyklech se nepozorovaly žádné změny farmakokinetických vlastností. Léčba DTIC neovlivnila množství nesmyslného oligomeru BCL-2 v plazmě.

Exprese proteinu BCL-2 v metastázách kožního melanomu (popisuje se v publikaci Selzer et al., 1989, 8(3): 197-203, Cerroni et al., 1995, Am. J. Dermatopathol., 17: 7-11) se potvrdila westernovým přenosem u všech 14 pacientů, kteří byli zařazeni do studie. Biopsie prorovnatelných lézí demonstrovaly snížení množství proteinu BCL-2 během aplikace nesmyslného oligomeru BCL-2 (tabulka č. 2). U pacienta č. 10 nebylo možné hodnotit tkáň biopsie westernovým přenosem, protože se v biopsii nenašly buňky melanomu. Maximální snížení množství proteinu BCL-2 u pacientů ošetřených 14 denní kontinuální difúzí nesmyslného oligomeru BCL-2 se v typickém případě pozorovalo během pěti dní, aniž došlo k dalšímu snížení v den

14. 83 % pacientů, kteří vykazují koncentraci nesmyslného oligomeru BCL-2 v plazmě přesahující 1 gg/ml (10 z 12 pacientů) demonstrovala jasné snížení exprese proteinu BCL-2 (tabulka č. 1) . Léčebný cyklus nesmyslným oligomerem BCL-2 v dávce vyšší ·· 9 « * · • · ·

999* <r »

9* ··» ·

999 • ·

999« 9 9 · • · · O než 1,7 mg/kg/den ukazuje mírné snížení množství proteinu BCL2 o 40 % během 5 dní.

Zvýšení počtu odumírajících buněk v nádoru po 5-ti dnech léčby nesmyslným oligomerem BCL-2 se pozorovalo barvením TUNEL (zvýšení ve srovnání se základní hodnotou je 0,85 % + SD = 0,47 % až 3,1 ± SD = 1,16 %) (zobrazeno na obrázku č. 2B) . V biopsiích odebraných po aplikaci apoptického stimulu (DTIC) došlo k dramatickému odumírání buněk (zobrazeno na obrázku č. 2C, 19,4 % ± SD =4,2 %). Kombinovaná terapie nesmyslného oligomeru BCL-2 a DTIC je dobře tolerovaná a nesmyslný oligomer BCL-2 se může aplikovat v koncentraci 6,5 mg/kg/den, aniž je toxicita limitující (tabulka č. 2).

Hematologické abnormality byly nevýrazné (stupeň I až III) , uvedeno v tabulce č. 2) a sledovaly patern nadirových hodnot mezi léčebnými cykly typickými pro jediné činidlo DTIC. Žádný z pacientů netrpí fibrilní neutropenií nebo jiným znakem klinické hematologické toxicity. Během studie se u dvou pacientů pozorovala anémie II. až III. stupně vyžadující transfúzi, přičemž u těchto pacientů se pozorovala anémie už před započetím léčby a byly pravděpodobně způsobena předchozí léčbou. Běžně se pozorovala lymfopenie II. až III. stupně bez klinických následků, jako je neobvyklá virová nebo plísňová infekce nebo jiné klinický projev imunosuprese, navzdory opakovaným cyklům léčby, které trvají u některých pacientů více než jeden rok.

V tabulce č. 2 se neuvádějí žádné nehamatologické nežádoucí projevy. U většiny pacientů jsou dávky nesmyslného oligomeru vyšší než 4,1 mg/kg/den spojeny s dočasnou horečkou. Horečka během 2. až 3. dne léčby běžně dosahuje teploty 38 °C a buď spontánně pomyjí nebo se aplikoval acetaminofen a pokračovala aplikace nesmyslného oligomeru. U čtyř pacientů,

4· · * 4 · • · 4 • ···· • · ··»· · ·· ··«· ·· ···· • · · 9 · 4

4 4 · · · • · · · · · ·

4 4 4 4 4 4 4 ·« ·· ·· 44 kterým se aplikovala dávka 4,1 až 6,5 mg/kg/den došlo k dočasnému zvýšení hodnot transaminázy a/nebo bilirubinu. U těchto všech pacientů však nedošlo k prokázání spojení s aplikací nesmyslného oligomerů BCL-2, protože dva pacienti trpěli hepatitidou a alkoholizmem a pozorovaly se dočasné změny funkce jater po aplikaci DTIC, což může také vést k uvedeným laboratorním změnám. Abnormální funkce jater se obvykle vyřešily během jednoho týdne léčby a nepovažují se za klinicky podstatné nebo omezující dávku. Při léčbě došlo k nežádoucí kožní reakci, jako je dočasná vyrážka a kopřivka stupně I. U jednoho pacienta došlo k projevu kopřivky stupně II. Tyto kožní reakce odpovídají na antihistaminy a nebrání pokračování léčby. Nepozorovala se kumulativní toxicita. U některých pacientů se léčba aplikovala v 10 cyklech, aniž byly nutné úpravy plánovaného postupu léčby.

Toxicita byla hlavním limitujícím prvkem studie zvyšující se dávky. Protinádorová aktivita se jasně projevila u šesti ze 14 pacientů (to znamená 43 %, uvedeno v tabulce č. 4), kteří trpí melanomem ve stádiu IV. Mezi tyto pacienty patří i 12 pacientů, kteří vstoupily do studie po selhání systémové terapie. Zaznamenalo se 1 CR, 2 PR a 2 MR s prodloučenou stabilizaci onemocnění trvající více jak jeden rok (uvedeno v tabulce č. 1). Klinická protinádorová aktivita se také jasně pozorovala u dvou dalších pacientů se stabilizací onemocnění, které bylo jasně v progresivní fázi před tím, než vstoupili do studie. Pacient č. 12, který měl na začátku léčby metastázu v pánevních lymfatických uzlinách měřící přes 5 cm, vykazoval rychlou odezvu po 2 cyklech léčby a úplnou odezvu po 4 cyklech léčby (uvedeno v tabulce č. 1, a zobrazeno na obrázku č. 3) . Po 4 cyklech terapie biopsie kožní oblasti, která dříve vykazovala nádor, nyní obsahovala pouze fibrózu bez melanomu (patologická úplná odezva). Pacienti č, 2 a 3 demonstrovali částečnou odezvu v cílových lézích tím, že se zastavil postup onemocnění více jak na jeden rok. Na začátku studie se u pacientů 2 a 3 navzdory předchozí léčbě karboplatinou s interferonem (pacient č. 2) a DTIC s IL-2 (pacient č. 3) projevily progresivní metastáze. Pacienti 5 a 9 vstoupily do studie s projevy progresivního metastázujícího onemocnění přetrvávající po předchozí systémové léčbě DTIC a interferonem nebo samotným interferonem a po léčbě nesmyslným oligonukleotidem BCL-2 a DTIC došlo ke slabé odezvě. Odhad střední hodnoty prodloužení života se u všech pacientů odhaduje na více jak jeden rok.

Závěr karcinomem.

tolerovaná,

Prokázala se bezpečnost a proveditelnost léčby nesmyslným oligomerem kombinované s chemoterapií u pacientů trpících Léčba nesmyslným oligomerem BCL-2 je dobře redukuje množství proteinu v cíleném nádoru, umožňuje odumírání buněk a vede objektivním odezvám nádoru. Také se prodloužil život pacientů, kteří vstoupili do studie v okamžiku, kdy selhaly jiné léčby (tabulka č. 1).

Primární úlohou studie bylo stanovení toxicity nesmyslného oligomeru BCL-2, když se kombinuje s léčbou DTIC. V případě vedlejších účinků, které nejsou hematologické (tabulka č. 2) se neprokázaly v případě dávky až 3,1 mg/kg/den žádné jiné vedlejší účinky mimo těch, které se zaznamenaly v případě terapie samotným činidlem DTIC. V případě dávky nesmyslného oligomeru BCL-2 4,1 mg/kg/den a vyšší v kombinaci s DTIC se pozorovalo dočasné zvýšení transaminázy a/nebo bilirubinu na V této studii nejsou abnormality funkce pro výšku dávky a nejsou spojeny s nežádoucími klinickými následky. Při denní dávce nesmyslného oligomeru BCL-2 5,3 mg/kg a vyšší se nezaznamenaly žádné dávku limitující změny aPTT.

stupeň II. až III jater limitující • · ·· · · • · · ·· * · · · r £ ······· · ··· · ·

JO · · · · · · ···· ···· · ·· ·· ·· ·*

V této studii nej častěji pozorovaným hematologickým vedlejším účinkem byla lymfopenie. Lymfopenie není klinicky podstatná a u pacientů, kterým se aplikovala cyklická léčba trvající déle jak rok, se neobjevily žádné neobvyklé infekce. V případě aplikace více fosforothioátových nesmyslných léků se objevila trombocytopenie různých stupňů a tato toxicita limituje dávku nesmyslných oligomerů BCL-2 pacientům trpících NHL dávku (popisuje se v publikaci Waters et al., 2000, J. Clin. Oncol. 18(9):1812-23). V této studie se spolu s aplikaci nesmyslného oligomerů BCL-2 aplikovala chemoterapie vedoucí k myelosupresi po aplikaci DTIC. Při zjištěném množství nesmyslného oligomerů BCL-2 nebyla pozorována dávka limitující trombocytopenie. U pacientů této populace se při aplikaci nesmyslného oligomerů BCL-2 a DTIC se neprojevila kumulovaná nebo překrývající se toxicita limitující dávku.

Data ukazují, že biologicky relevantní množství v plazmě (vyšší než 1 gg/ml) je možné snadno dosáhnout aplikací dávky nesmyslného oligomerů BCL-2 přibližně 2 mg/kg/den a maximální tolerované dávky se však nedosáhlo v kombinací s chemoterapií za použití DTIC.

V této studii se demonstrovala dostatečná tolerance léčby, když se nesmyslný oligomer BCL-2 aplikoval intravenózně infúzí (7 mg/kg/den) po dobu 5 dní skupině pěti pacientů následovanou aplikací DTIC v dávce 1 000 mg/m² v každém cyklu po dobu 21 dní.

Výsledky proto ukazují, že nesmyslný oligomer BCL-2 se může bezpečně aplikovat v kombinaci s farmaceutickými prostředky určenými proti zhoubnému bujení. Výsledky se liší od dříve publikovaných dat, která vykazují biologickou aktivitu a klinické odezvy na čtrnáctidenní ínfúzi zavedenou pouze kontinuální podkožní infúzí (popisuje se v publikaci • ·

Waters et al., 2000, J. Clin. Oncol. 18(9):1812-23), protože zde uvedené výsledky demonstrují, že více cest aplikace (intravenózní infúze, více denních dávek aplikovaných podkožními injekcemi) a kratší rozvrh aplikace 5 až 7 dní může také vykazovat biologickou aktivitu G3139 a klinické odezvy. Odezvy u pacientů počáteční protinádorová aktivita se projeví už ve druhém až třetím cyklu. Většina pacientů vstupovaly do studie s progresivním metastázujícím onemocněním po selhání léčby zahrnující aplikaci DTIC nebo po aplikaci jiné standardní léčby metastázujícího melanomu. Protinádorové odezvy se zaznamenaly u šesti ze čtrnácti pacientů (43 %) a u dvou dalších pacientů se onemocnění stabilizovalo. Tyto počáteční výsledky se porovnávají s rychlostí odezvy a střední dobou přežití přibližně čtyři až pět měsíců u pacientů trpících rozvinutým stádiem melanomu po selhání systémové léčby první volby.

• · • ·

00 *

-J

(Ti

On

>c.

3*

M *

I-¹

0<

pacient

CTi

(T

cn

CT

on

<T

4^

4U

3

<

o

I-¹

(T

co

NO

kO

J—¹

kD

I—¹

φ<

\

OJ

3

N<

3

Ní

3

NC

N<

<

\

P'

Ό

O 1

co

on

CO

t—¹

on

CT

CO

00

ct

Ct

\

P-

OJ

kO

CD

00

cd

CD

OJ

rt

On

-J

ΟΊ

ΙΌ

00

4S

On

on

cQ

3 3

0'

N

Ό

><

3

<1

3

P'

3

UJ.

Ό

3

Ό

3

N

3

3°

OJ'

H

3°

3

3·

3»

3

3»

3

3°

2

Φ

Pí

Φ

N<

rt

P'

Ní

P'

N<

3

N<

2

N<

2

3

rt

Φ

3

O

Φ

O

Φ

>

Φ

>

Φ

>

0)

OJ

Φ

3

ω

>

O

rt

3

OJ'

3

1

1—1

H

1—1

H

3

cn

<

OJ'

rt

Ct

OJ'

O

Ct

3

P-

3

H

σ

Π

π

Π

Q

o

3

O

3

σ

rt

Ό

TI

H

i-3

3

J-3

3

H

3

TJ

3

Φ

3<

3

H

1

H

>

H

3

Φ

1

n

O

n

O

o

OJ

Ct

3

·>

ω

>

2

H

2

>

Ό

0

>

3

H

3

M

P-

3

nj.

H

3

2

3

H

Φ

0

2

o

T)

3

1

3

N

H

i-3

3

2

1

S

P'

1

>

S

on

4^

on

co

4^

co

kU

o

cr

o

cr

o

Ct

2

>

s

>

*

>

Φ

3

O

on

CO

I—¹

co

Η¹

I—¹

P¹

CT

On

cr

On

cr

CT

3

c3

3

\

1

0>

OJ

3

ΓΌ

N<

\

> M

O

<Ti

M

CT

l\J

CO

4^

o

co

TS

s

O

o

On

o

O

OJ

3

X

1

1—¹

•

Ní

Φ

o\o

cn

3

T

S

s

T

TJ

o

rt

σ

3

σ

Ct

OJ

Φ

σ

N

P-

<1

Η

OJ

3

Η'

Η⁴

-J

[Ό

On

I-¹

[Ό

N>

CT

Ό

ct

On

·>

co

CO

O

3

3<

o

·>

J_1

4^

H-¹

CT

φ<

Φ

3

ου

00

On

cn

N<

OJ

+

P'

P-

o

rt

Φ

P'

Tabulka č. 1: Stručný přehled studie

ΟΊ • · · ·· · · • · · « +

Ό

Ο σ

μ

Φ ο<

ο <

Φ'

Β

Μ'

Ό

Ο

Ν

Ο μ

ο <1

Φ'

Β

Η'

Μ-	*	>	Μ
Β		b	b
rt	ι-Ο	t—¹	2
Κ	φ	Μ-	1
Φ	ο	σ	52
<1	Η-	ο
Φ	Φ	<1	II
Β	Β	φ
θ'	σ	I—¹	Η-
Ν	Η-	ο	Β
Β			rt
Η'		ω	Φ
	σ	φ	Μ
1--¹	σ		Μι
Φ'	φ	Ω	Φ
Ο<	κ	φ	Μ
σ	*<'	Η⁴	Ο
φ<	3	σ	Β
•		ο	1
	ω	<J	52
	φ		*,
	σ	Ό	2
	Φ σ	0 Ω<	>
	φ' φ	φ σ	II Β
	b		' Φ
	I—¹ Η-		Φ b
	σ	Ω	1—¹
	ο	<	Η-
	<	σ	σ
	φ	Η	ο
	ι-·	Β°	Φ'
	00	03	Β
	Ω	Ω	Ο
	σ ι	σ	>
	Μ b	I Μ >	2 η3
	Ο σ σ	ω ο	II Μ
	0	b	Φ
	Ν<	Η	σ
	Β	Β	Μ·
	Φ<	Μ	Ο σ
	<!	σ Η	φ Μ
	σ	Η	φ
	Φ'	Ω	b
	< ο φ cn ω Φ Cti ·> cn 3 cb σ iQ σ φ Β b 0 b Ο ο< φ' σ φ ο< Β Η'		Η- Φ

Ο

ΤΙ π

CU κ

σ ο

Ό

Η

Φ

Γ+

ΜΒ

Φ

Ω

Η

Μ

II

Ο

Ηω ι

’ϋ

I—¹Φ Γ+ ΗΒ 0)

Μι

Ο rt

Φ £

ω rt

ΜΒ

Β*

Ό

Φ

Μ ct

Φ

Μ

Μ«

Ο σ

Φ·

Φ

IX

ΜΜ

Φ'

Β

Η'

Ό

Φ

Μ

Μΐ £'

Ν

Φ • · · · • ·

14	13*	12*	11	10	10 *
<Γι 3	Cti -u 3^	kO o N<	Cti GJ	4^ N<	Cn N<
4/99	6/96	7/94	4/07	4/86 1	6/98
plíce, kůže	plíce, kůže	LNN, kůže	plíce, kůže	LNN, kůže	LNN, kůže
IV	IV	IV	IV	IV	IV
IFN-α	žádná	žádná	Ω H H 2 ω 2 1 52 Ω b >	H b 2 1 52	IFN-a
ΟΊ Cn	cti > cn	Cn	ΟΊ cn	<T) cn	Cti Cjl cn co Φ N<
* 4^ Ο	o	70	o	2 >	09
stabilní	ro σ	Ω 2)	b σ	b σ	S
-j co	\|_4 H¹	12,5+	μ¹ N> (Ji +	f-¹ 4^ 4^ +	15, 3 +

ίη

U3 • · · • · ttf

9 9

9 9 9 9 9 9 9

9999 9 9 9 999 9 9 • · 9 · · 9 9 9 9 • · · ·· 9 9 9 9

Tabulka č. 2: Nežádoucí účinky během léčby

Běžná kritérie toxicity č. pacintů
	0	1	2	3	4
hematologické účinky
anemie	12			2
leukopenie	7	2	3	2
neutropenie	10	2	2
lymfopenie	1	1	7	5
trombocytopenie	8	4	2
koagulace	3	8	2	1
ostatní účinky
kardiovsakulární	14
pulmonární	14
renální	14
gastrointestinální	9	5
játra (SGOT, bilirubin)	1	7	2	4
neurologické (bolesti hlavy)	11	3
dermatologické	9	4	1
horečka	7	1	6

Nežádoucí účinky jsou uvedeny v kauzálním vztahu s terapií BCL-2 ASO

4·· ······ • 4 4 4 4 4

4 4 4 4 4 £-1 4 444444 4 44

4 · 4444

4949 4 44 44

Příklad 2: Fáze I. Farmakokinetická a biologická korelativní studie G3139 (nesmyslný oligonukleotid bcl-2) a doketaxalu u pacientů trpících karcinomem prostaty, který je rezistentní vůči hormonální terapii.

V tomto příkladu se popisuje úspěšné použití nesmyslného oligomerů bcl-2 při léčbě pacientů trpících karcinomem prostata, který je rezistentní vůči hormonální terapii zvláště vůči androgenové ablační terapii a cytotoxické chemoterapii. Nesmyslný oligomer bcl-2 se systémově aplikoval v dávce 5 až 7 mg/kg/den po dobu pěti dní v kombinaci s chemoterapeutickým činidlem. Studie ukazuje, že dva pacienti léčení nesmyslným oligomerem bcl-2 a chemoterapeutickým činidlem odpovídají na léčbu. Zjištění uvedené v tomto příkladu ukazuje, že když se nesmyslný oligomer bcl-2 aplikuje ve vysoké dávce po krátké časové úseky, pak léčba vykazuje nízkou toxicitu, zatímco se projevují objektivní klinické odezvy. Přístup léčby popsaný tímto vynálezem poskytuje strategii léčby různých typů zhoubného bujení.

Materiál a metody

Při této studii se G3139 aplikoval kontinuální intravenózní infúzí po dobu pěti dní léčebného cyklu, přičemž jeden léčebný cyklus trvá 1 až 6 dní. Šestý den následovala intravenózní aplikace doketaxelu. Průběhy se opakovaly každých 21 dní. Jedenácti pacientům trpících karcinomem prostaty rezistentním vůči hormonální léčbě se aplikovala léčba ve třech dávkových rozmezích 5 mg/kg/den G3139 a 60 mg/m²doketaxelu až 7 mg/kg/den G3139 následnou aplikací 75 mg/m²doketaxelu.

Výsledky toto • to to to • to ···· • · • · to » tototo· • · · · ·· to * · • · · · · ·· ··

Hlavní projevy toxicity byly podobné jako při aplikaci samotného doketaxelu. Jeden pacient po silné léčbě trpěl oddálenou (více než pět dní) nekomplikovanou neutropenií IV. stupně. Další projevy toxicity zahrnují u tří pacientů stomatitidu I.stupně a u jednoho pacienta se objevila fibrilní neutropenii II. stupně. Předchozí farmakokinetícké výsledky (HPLC) ukazují průměrnou koncentraci G3139 v plazmě 3,09 pg/ml při dávce 5 mg/kg/den. Předchozí průtoková cytometrická analýza a analýza westernovým přenosem ukazuje více jak 50 % negativní regulaci proteinu BCL-2 během šesti dní v jednojaderných buňkách periferní krve dříve než se aplikovala léčba doketaxelem. U dvou ze tří pacientů, kteří se nepodrobili léčbě taxanem se sledoval antigen specifický pro karcinom prostaty a symptomatická odezva. Zjistila se devítinásobné snížení množství antigenu specifického pro karcinom prostaty, které přetrvávalo déle než je doba léčebných cyklů.

Závěr

G3139 se může bezpečně aplikovat v kombinaci s doketaxelem a tato kombinace demonstruje podstatné terapeutické účinky při léčbě zhoubného bujení. Výsledky se liší od předchozích publikovaných dat, která ukazují biologickou aktivitu a klinické odezvy pouze při léčbě aplikované 14-ti denní podkožní infúzí (popisuje se v publikaci Waters et al., 2000, J. Clin. Oncl. 18(9):1812-23). Zde uvedené výsledky ukazují, že kratší rozvrh léčby (5 dní) aplikovaný alternativním způsobem (intravenózně) může také vést k biologické aktivitě G3139 a klinické odezvě. Léčba pomocí G3139 je biologicky aktivní během pěti dní aplikace. Projevuje se účinnou negativní regulací obsahu proteinu Bcl-2 v jednojaderných buňkách periferní krve a vykazuje protinádorovou aktivitu u

44 4 4 • 4 ·· ·· · 4 4444 · 4 · 4 4

4 4 «44

4 4 4 4 4

44 4 ·44·

44 44 44 pacientů trpících karcinomem prostaty s rezistencí vůči hormonální léčbě.

Příklad 3: Fáze I. Studium prostředku Genasense™ (G3139), nesmyslného BCL-2 při rezistentní nebo recidivující akutní leukémii.

Tento příklad ukazuje úspěšné použití nesmyslného oligomeru bcl-2 při léčbě pacientů s akutní leukémií. Nesmyslný oligomer se systémově aplikoval v dávce 4 mg/kg/den po dobu deseti dní v kombinaci se dvěmi chemoterapeutickými činidly. Tato studie ukazuje, že pět z deseti pacientů, kteří se léčili nesmyslným oligomerem bcl-2 a chemoterapeutickým činidlem vykazovalo odezvy na léčbu. Odezvy se také zaznamenaly u pacientů, kterým se aplikoval fludarabin a cytosinarabinosid v dávce nižší, než je normálně používaná standardní dávka při léčbě leukemie nebo jiných typů zhoubného bujení. Zjištění popsaná v tomto příkladu ukazují, že jestliže se nesmyslný oligomer bcl-2 aplikuje po krátký časový úsek je možné dosáhnout objektivní klinické odezvy.

Materiály a metody

G3139 v dávce 4 mg/kg/den se aplikoval pacientům (celekm deseti pacientům) v den 1 až 10, zatímco ve dnech 6 až 10 léčebného cyklu se aplikovaly fludarabun (začínající sníženou dávkou 15 mg/m²) , cytosinarabinosid (Ara-C) (začínající redukovanou dávkou 1 000 g/m²) a G-CSF (FLAG) a jejich dávka se zvyšuje. Normální kombinovaný postup FLAG zahrnuje dvounásobně vyšší dávku fludarabinu a Ara-C ve srovnání s dávkou používanou v této studii.

Φφ ΦΦΦΦ φφ ΦΦΦΦ

ΦΦΦ Φ· ΦΦΦ ·

ΦΦΦ φφ φ φφ φ φφφφφφφ φ ΦΦΦ φ φ φ · ΦΦΦΦ ΦΦΦΦ

ΦΦΦΦ φ φφ φφ φφ φφ

pacient věk/ pohlaví	Dx a status Pre- G3139	čas REL (m)¹	předch. režim	předch. HDAC²	odezva	status onemocnění (d)³
69/ž	primární REF ALL	NA⁴	1	ne	CR⁵	NED⁸(53)
55/ž	primární REF ALL	NA	3	ano	CR	REL (142)
57/ž	2. REL AML	12	2	ano	CR	NED(111)
23/m	1. REL AML	3	1	ano	PR⁶	REL(83)
61/ž	1. REL AML	7	1	ne	PR	NED (76)
54/m	primární REF AML	NA	1	ne	NR⁷	REF
61/ž	1. REL AML	6	2	ne	NR	REF
73/ž	2. REL AML	8	2	ano	NR	REF
3 9/m	2. REL AML	3	2	ano	NR	REF
55/ž	2. REL AML	6	3	ano	NR	REF

¹ (m) měsíce od CR, ² vysoká dávka Ara-C, ³(d) dny od počátku G3139, ⁴NA, neaplikováno, ⁵CR, úplná adezva, ⁶PR částečná odezva, ⁷NR bez odezvy, ⁸NED bez důkazu onemocnění, REF rezistentní, REL recidiva

Výsledky •4 4··4 •4 4444

444444

4

4 4

Horečka, nevolnost, zvracení, hypokalcemie, hypofosfatémie a zadržování tekutin spojené s terapií nejsou pro dávku limitující. Hematologická toxicita se projevila podle očekávání. Množství G3139 v plazmě dosáhlo relevantní hodnoty 1 μρ/ml po 24 hodinách. Tři pacienti dosáhly úplné odezvy a aplikoval se jim druhý průběh terapie. U dvou pacientů se v den 53 a 111 neprojevovaly žádné symptomy onemocnění. U dvou pacientů nepřetrvávaly symptomy onemocnění, ale přetrvávala neutropenie/trombocytopenie v den 52 a 55. U jednoho pacienta se neprojevovaly symptomy onemocnění v den 76. Třem z pěti pacientů se předem aplikovala vysoká dávka Ara-C a proto se neočekávalo zaznamenání hlavní odezvy na jiný kombinovaný program ARA-C popsaný v této studii, zvláště při použití nižší dávky než je používaná dávka v postupech předchozí léčby.

Závěr

Výsledky ukazují, že G3139 je vhodný pro začlenění do léčebného cyklu u akutní leukémii, který při této studii demonstruje 50 % odezvu. Tato odezva zahrnuje pacienty s odolnou akutní leukémií a předchozí léčbu vysokou dávkou Ara-C. Hlavní odezvy se také pozorovaly při použití fludarabinu a Ara-C v nižší dávce než je normální dávka v kombinaci s léčebným postupem bcl-2.

J l KOREJZOVÁ

ADVOKATKA »· 9999 •9 9999

999 99 999 9

999 99 9 99 9

9999 999 9999 9 • 9 9999 9999

9999 · 99 99 99 99

Seznam sekvencí (2) Informace o SEQ ID NO: 1:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 20 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednořetězcová (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: DNA (ví) PŮVODNÍ ZDROJ:

(A) ORGANIZMUS: Homo sapiens (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 1:

cagcgtgcgc catccttccc (2) Informace o SEQ ID NO: 2:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

	(A)	DÉLKA: 35 párů baží
	(B)	TYP: nukleová kyselina
	(C)	DRUH ŘETĚZCE: jednořetězcová
	(D)	TOPOLOGIE: lineární
(ii)	DRUH	MOLEKULY: DNA
(vi)	PŮVODNÍ ZDROJ:
	(A)	ORGANIZMUS: Homo sapiens
(xi)	Popis sekvence: SEQ ID NO: 2:
cttttcctct	gggaaggatg gcgcacgctg ggaga

2)	Informace o	SEQ ID NO: 3:
•	(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
	(A)	DÉLKA: 20 párů baží
	(B)	TYP: nukleová kyselina
	(C)	DRUH ŘETĚZCE: jednořet

9999 · 99 99

9 9 9 9 9 9 9 9

9 9 9 9 9 9 9 9 £Ί 9 9999 9 9 9 9 9 9 9 9

Ό I 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9

9999 9 99 99 99 99 (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: DNA (vi) PŮVODNÍ ZDROJ:

(A) ORGANIZMUS: Homo sapiens (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 3:

gatgcaccta cccagcctcc (2) Informace o SEQ ID NO: 4:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

	(A)	DÉLKA: 33 párů baží
	(B)	TYP: nukleová kyselina
	(C)	DRUH ŘETĚZCE: jednořetěz
	(D)	TOPOLOGIE: lineární
(ii)	DRUH	MOLEKULY: DNA
(vi)	PŮVODNÍ ZDROJ:
	(A)	ORGANIZMUS: Homo sapiens

(xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 4:

acggggtacg gaggctgggt aggtgcatct ggt 33 (2) Informace o SEQ ID NO: 5:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A)	DÉLKA: 20 párů	baží
(B)	TYP: nukleová	kyselina
(C)	DRUH ŘETĚZCE:	j ednořetězcová
(D)	TOPOLOGIE: lineární
DRUH	MOLEKULY: DNA

(vi) PŮVODNÍ ZDROJ:

(A) ORGANIZMUS: Homo sapiens (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 5:

acaaaggcat cctgcagttg 20

0000

0« 0400 .· ··:· ·: 0000 « 0 (2} Informace o SEQ ID NO: 6:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 36 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednořetězcová (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: DNA (vi) PŮVODNÍ ZDROJ:

(A) ORGANIZMUS: Homo sapiens (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 6:

cccccaactg caggatgcct ttgtggaact gtacgg (2) Informace o SEQ ID NO: 7:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 20 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednořetězcová (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: DNA (vi) PŮVODNÍ ZDROJ:

(A) ORGANIZMUS: Homo sapiens (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 7:

gggaaggatg gcgcacgctg (2) Informace o SEQ ID NO: 8:

(i)	CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A)	DÉLKA: 17 párů baží
	(B)	TYP: nukleová kyselina
	(C)	DRUH ŘETĚZCE: jednořet
	(D)	TOPOLOGIE: lineární
(ii)	DRUH	MOLEKULY: DNA

(vi) PŮVODNÍ ZDROJ:

«4 *·44

4

444 44 444 4

444 44 4 »4 4

4444444 4 444 4 4 • 4 4 4 4 « 4444

4444 4 44 44 44 4« (A) ORGANIZMUS: Homo sapiens (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 8:

cgcgfcgcgac cctcttg

(.2) Informace o SEQ ID NO: 9:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 17 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednořetězcová (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: DNA (vi) PŮVODNÍ ZDROJ:

(A) ORGANIZMUS: Homo sapiens (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 9:

taccgcgtgc gaccctc (2) Informace o SEQ ID NO: 10:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A)	DÉLKA: 17 párů baží
(B)	TYP: nukleová kyselina
(C)	DRUH ŘETĚZCE: jednořetě
(D)	TOPOLOGIE: lineární
DRUH	MOLEKULY: DNA

(vi) PŮVODNÍ ZDROJ:

(A) ORGANIZMUS: Homo sapiens (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 10:

tcctaccgcg tgcgacc (2) Informace o SEQ ID NO: 11:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 17 párů baží • 0 «

0*0 » 0 · « 0 0

0 0 ·« 0 0 · · * ♦»·» 0 0» 0000 0 · 0·«0 0000

0000 0 00 0« 00 00 ·* 000«

0000

(B)	TYP: nukleová	kyselina
(C)	DRUH ŘETĚZCE:	jednořetězcová
(D)	TOPOLOGIE: lineární
DRUH	MOLEKULY: DNA

(vi) PŮVODNÍ ZDROJ:

(A) ORGANIZMUS: Homo sapiens (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 11:

ccttcctacc gcgtgcg (2) Informace o SEQ ID NO: 12:

(vi) PŮVODNÍ ZDROJ:

(A) ORGANIZMUS: Homo sapiens (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 12:

gacccttcct accgcgt (2) Informace o SEQ ID NO: 13:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

	(A)	DÉLKA: 17 párů baží
	(B)	TYP: nukleová kyselina
	(C)	DRUH ŘETĚZCE: jednořetěz
	(D)	TOPOLOGIE: lineární
ii)	DRUH	MOLEKULY: DNA
(vi)	PŮVODNÍ ZDROJ:
	(A)	ORGANIZMUS: Homo sapiens

(xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 13:

ggagaccctt cctaccg ·» 4444

4444

4 • 44 44 4 « 4 4

444 44 4 4 · 4 • <·44 444 4444 ·

4 4444 4444

4444 · ·· 44 44 44 (2) Informace o SEQ ID NO: 14:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A)	DÉLKA: 15 párů baží
	(B)	TYP: nukleová kyselina
	(C)	DRUH ŘETĚZCE: jednořetězcová
	(D)	TOPOLOGIE: lineární
(ii)	DRUH	MOLEKULY: DNA

(vi) PŮVODNÍ ZDROJ:

(A) ORGANIZMUS: Homo sapiens (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 14:

gcggcggcag cgcgg 15

Informace o SEQ ID NO: 15:
(i)	CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
	(A)	DÉLKA: 15 párů baží
	(B)	TYP: nukleová kyselina
	(C)	DRUH ŘETĚZCE: jednořetězcová
	(D)	TOPOLOGIE: lineární
(ii)	DRUH	MOLEKULY: DNA
(vi)	PŮVODNÍ ZDROJ:
	(A)	ORGANIZMUS: Homo sapiens

(xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 15:

•cggcggggcg acgga (2) Informace o SEQ ID NO: 16:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 16 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednořetězcová (D) TOPOLOGIE: lineární • · ·· · · (ii) DRUH MOLEKULY: DNA (vi) PŮVODNÍ ZDROJ:

(A) ORGANIZMUS: Homo sapiens (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 16:

cgsgagcgcg gcgggc (2) Informace o SEQ ID NO: 17:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A)	DÉLKA: 18 párů	baží
(B)	TYP: nukleová	kyselina
(C)	DRUH ŘETĚZCE:	j ednořetězcová
(D)	TOPOLOGIE: lineární
DRUH	MOLEKULY: DNA

(vi) PŮVODNÍ ZDROJ:

(A) ORGANIZMUS: Homo sapiens (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 17:

tctcccagcg tgcgccat (2) Informace o SEQ ID NO: 18:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

	(A)	DÉLKA: 18 párů baží
	(B)	TYP: nukleová kyselina
	(O	DRUH ŘETĚZCE: jednořetěz
	(D)	TOPOLOGIE: lineární
(ii)	DRUH	MOLEKULY: DNA
(vi)	PŮVODNÍ ZDROJ:
	(A)	ORGANIZMUS: Homo sapiens

(xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 18:

tgcactcacg ctcggccfc

Informace o	* · · · · ♦ ···« ···· · ·· ·· ,, _M SEQ ID NO: 19;
(i)	CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
	(A)	DÉLKA: 5086 párů baží
	(B)	TYP: nukleová kyselina
	(C)	DRUH ŘETĚZCE: jednořetězcová
	(D)	TOPOLOGIE: lineární
(ií)	DRUH	MOLEKULY: DNA

(vi) PŮVODNÍ ZDROJ:

(A) ORGANIZMUS: Homo sapiens (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 19:

gcgcccgccc ctccgcgccg cctgcccgcc cgcccgccgc gctcccgccc gccgctctcc	60
gtggccccgc cgcgctgccg ccgccgccgc tgccagcgaa ggtgccgggg ctccgggccc	120
tccctgccgg cggccgtcag cgctcggagc gaactgcgcg acgggaggtc cgggaggcga	180
ccgtagtcgc gccgccgcgc aggaccagaa ggaggagaaa gggtgcgcag cccggaggcg	240
gggtgcgccg gtggggtgca gcggaagaag gggtccaggg gggagaactt cgtagcagtc	300
atccttttta ggaaaagagg gaaaaaataa aaccctcccc caccacctcc ttctccccac	360
ccctcgccgc accacacaca gcgcgggctt ctagcgctcg gcaccggcgg gccaggcgcg	420
tcctgccttc atttatccag cagcttttcg gaaaatgcat ttgctgttcg gagtttaatc	480
agaagacgat tcctgcctcc gtccccggct ccttcatcgt cccatctccc ctgtctctct	540
cctggggagg cgtgaagcqg tcccgtggat agagattcat gcctgtgtcc gcgcgtgtgt	600
gcgcgcgtat aaattgccga gaaggggaaa acatcacagg acttctgcga ataccggact	660
gaaaattgta attcatctgc cgccgccgct gccaaaaaaa aactcgagct cttgagatct	720
ccggttggga ttcctgcgga ttgacatttc tgtgaagcag aagtctggga atcgatctgg	780
aaafccctcct aatttttact ccctctcccc ccgactcctg attcattggg aagtttcaaa	840
fccagctataa ctggagagtg ctgaagattg atgggatcgt tgccttatgc atttgttttg	900
gttttacaaa aaggaaacfct gacagaggat catgctgtac ttaaaaaata caagtaagtc	960
tcgcacagga aattggttta atgtaactfct caatggaaac ctttgagatt ttttacttaa	1020
agtgcattcg agtaaattta atttccaggc agcttaatac attgttttta gccgtgttac	1080
ttgtagtgtg tatgccctgc tttcactcag tgtgtacagg gaaacgcacc tgatttttta	1140
cttattagtt tgttttttct ttaacctttc agcatcacag aggaagtaga ctgatattaa	1200
caatacttac taataataac gtgcctcatg aaataaagat ccgaaaggaa ttggaataaa	1260

			74	·· · • * · • · · • · · · 1 • · ·· · · ·	• · · · · · • · · • · « • · · · · · • · · · ·· ··	• · · · · • · • · · • · • · · • · «·
aatttcctgc	gtctcatgcc	aagagggaaa	caccagaafcc	aagtgfctccg	cgtgattgaa	1320
gacaccccct	cgtccaagaa	tgcaaagcac	atccaataaa	atagctggat	tataactcct	1380
cttcttfcctc	tgggggccgt	ggggtgggag	ctggggcgag	aggtgccgtt	ggcccccgtt	1440
gcttttcctc	tgggaaggat	ggcgcacgct	gggagaacgg	ggtacgacaa	ccgggagata	1500
gtgatgaagt	acatccatta	taagctgtcg	cagaggggct	acgagtggga	tgcgggagat	1560
gtgggcgccg	cgcccccggg	ggccgccccc	gcaccgggca	tcttctcctc	ccagcccggg	1620
cacacgcccc	atccagccgc	atcccgcgac	ccggtcgcca	ggacctcgcc	gctgcagacc	1680
ccggctgccc	ccggcgccgc	cgcggggcct	gcgctcagcc	cggtgccacc	tgtggtccac	1740
ctggccctcc	gccaagccgg	cgacgacttc	tcccgccgct	accgcggcga	cttcgccgag	1800
atgtccagcc	agctgcacct	gacgcccttc	accgcgcggg	gacgcttfcgc	cacggtggtg	1860
gaggagctct	tcagggacgg	ggtgaactgg	gggaggattg	tggccttctt	tgagttcggt	1920
ggggtcatgt	gtgtggagag	cgtcaaccgg	gagatgtcgc	ccctggtgga	caacatcgcc	1980
ctgtggatga	ctgagtacct	gaaccggcac	ctgcacacct	ggatccagga	taacggaggc	2040
tgggatgcct	ttgtggaact	gtacggcccc	agcatgcggc	ctctgtttga	tttctcctgg	2100
ctgtctctga	agactcfcgcfc	cagtttggcc	ctggtgggag	cttgcatcac	cctgggtgcc	2160
tatctgagcc	acaagtgaag	tcaacatgcc	tgccccaaac	aaatatgcaa	aaggttcact	2220
aaagcagtag	aaataatatg	cattgtcagt	gatgtaccat	gaaacaaagc	tgcaggctgt	2280
ttaagaaaaa	ataacacaca	tataaacatc	acacacacag	acagacacac	acacacacaa	2340
caattaacag	tcttcaggca	aaacgtcgaa	tcagctattt	actgccaaag	ggaaatatca	2400
tttatttttt	acattattaa	gaaaaaagat	ttatttattt	aagacagtcc	catcaaaact	2460
ccgtctttgg	aaatccgacc	actaattgcc	aaacaccgct	tcgtgtggct	ccacctggat	2520
gttctgtgcc	tgtaaacata	gattcgcttt	ccatgttgtt	ggccggatca	ccatctgaag	2580
agcagacgga	tggaaaaagg	acctgatcat	tggggaagct	ggctttctgg	ctgctggagg	2640
ctggggagaa	ggfcgttcatt	cacttgcatt	tctttgccct	gggggcgtga	tattaacaga	2700
gggagggttc	ccgtgggggg	aagtccatgc	ctccctggcc	tgaagaagag	actctttgca	2760
tatgactcac	atgatgcata	cctggtggga	ggaaaagagt	tgggaactfcc	agatggacct	2820
agtacccact	gagatttcca	cgccgaagga	cagcgatggg	aaaaafcgccc	ttaaatcata	2880
ggaaagtatt	tttttaagct	accaattgtg	ccgagaaaag	cattttagca	atttatacaa	2940

tatcatccag taccttaaac cctgattgtg tatattcata tattttggat acgcaccccc 3000

4 4 4 • · · · · 4 9 · ·

4 4 4 4 4 4 4 4 ······· 4 444 4 4

4 9444 9944

4444 4 44 ·9 44 44

caactcccaa	tactggctct	gtctgagtaa	gaaacagaat	cctctggaac	ttgaggaagt	3060
gaacatttcg	gtgacttccg	atcaggaagg	ctagagttac	ccagagcatc	aggccgccac	3120
aagtgcctgc	ttttaggaga	ccgaagtccg	cagaacccac'	ctgtgtccca	gcttggaggc	3180
ctggtcctgg	aactgagccg	ggccctcact	ggcctcctcc	agggatgatc	aacagggtag	3240
tgtggtctcc	gaatgtctgg	aagctgatgg	atggagctca	gaattccact	gtcaagaaag	3300
agcagtagag	gggtgtggct	gggcctgtca	ccctggggcc	ctccaggtag	gcccgttttc	3360
acgtggagca	taggagccac	gacccttctt	aagacatgta	tcactgtaga	gggaaggaac	3420
agaggccctg	ggccttccta	tcagaaggac	atggtgaagg	ctgggaacgt	gaggagaggc	3480
aatggccacg	gcccattttg	gctgtagcac	atggcacgtt	ggctgtgtgg	ccttggccac	3540
ctgtgagttt	aaagcaaggc	tttaaatgac	tttggagagg	gtcacaaatc	ctaaaagaag	3600
cattgaagtg	aggtgtcatg	gattaattga	cccctgtcta	tggaattaca	tgtaaaacat	3660
tatcttgtca	ctgtagtttg	gttttatttg	aaaacctgac	aaaaaaaaag	ttccaggtgt	3720
ggaatatggg	ggttatctgt	acatcctggg	gcattaaaaa	aaaatcaatg	gtgsrggaact	3780
ataaagaagt	aacaaaagaa	gtgacatctt	cagcaaataa	actaggaaat	ttttttttct	3840
tccagtttag	aatcagcctt	gaaacattga	tggaataact	ctgtggcatt	g,ttgcattat	3900
ataccattta	tctgtattaa	ctttggaatg	tactctgttc	aatgtttaat	gctgtggttg	3960
atatttcgaa	agctgcttta	aaaaaataca	tgcatctcag	cgtttttttg	tttttaattg	4020
tatttagfcta	tggcctatac	actatttgtg	agcaaaggtg	atcgttttct	gttfcgagatt	4080
tttatctctt	gattcttcaa	aagcattctg	agaaggtgag	ataagccctg	agtctcagct	4140
acctaagaaa	aacctggatg	tcactggcca	ctgaggagct	ttgttfccaac	caagtcatgt	4200
gcatttccac	gtcaacagaa	ttgtttattg	tgacagttat	atctgttgtc	cctttgacct	4260
tgtttcttga	aggtttcctc	gtccctgggc	aattccgcat	ttaattcatg	gtattcagga	4320
ttacatgcat	gtttggttaa	acccatgaga	ttcattcagt	taaaaatcca	gatggcgaat	4380
gaccagcaga	ttcaaatcta	tggtggtttg	acctttagag	agttgcttta	cgtggcctgt	4440
ttcaacacag	acccacccag	agccctcctg	ccctccttcc	gcgggggctt	tctcatggct	4500
gtccttcagg	gtcttcctga	aatgcagtgg	tcgttacgct	ccaccaagaa	agcaggaaac	4560
ctgtggtatg	aagccagacc	tccccggcgg	gccfccaggga	acagaatgat	cagaccttfcg	4620
aatgattcta	atttttaagc	aaaatattat	tttatgaaag	gtttacattg	tcaaagtgat	4680

gaatatggaa tatccaatcc tgtgctgcta tcctgccaaa atcattttaa tggagtcagt 4740 ·· ·«· · • · · « * ···««· ttgcagtatg ctccacgtgg taagatcctc caagctgctt tagaagtaac aatgaagaac 4800 gtggacgttt ttaatafcaaa gcctgttttg tcttttgttg ttgttcaaac gggattcaca 4860 gagtatttga aaaafcgtata tatattaaga ggtcacgggg gctaattgct agctggctgc 4920 cttttgctgt ggggttttgt tacctggttt taataacagt aaatgtgccc agcctcttgg 4980 ccccagaact gtacagtatt gtggctgcac ttgctctaag agtagttgat gttgcatttt 5040 ccttattgtt aaaaacatgt tagaagcaat gaatgtatat aaaagc 5086 (2) Informace o SEQ ID NO: 20:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

	(A)	DÉLKA: 717 párů baží
	(B)	TYP: nukleová kyselina
	(C)	DRUH ŘETĚZCE: jednořetěz
	(D)	TOPOLOGIE: lineární
ii)	DRUH	MOLEKULY: DNA
(Vi)	PŮVODNÍ ZDROJ:
	(A)	ORGANIZMUS: Homo sapiens

(xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 20:

atggcgcacg	ctgggagaac	ggggtacgac	aaccgggaga	tagtgatgaa	gtacatccat	60
tataagctgt	cgcagagggg	ctacgagtgg	gatgcgggag	atgtgggcgc	cgcgcccccg	120
ggggccgccc	ccgcaccggg	catcttctcc	tcccagcccg	ggcacacgcc	ccatccagcc	180
gcatcccgcg	acccggtcgc	caggacctcg	ccgctgcaga	ccccggctgc	ccccggcgcc	240
gccgcggggc	ctgcgctcag	cccggtgcca	cctgtggtcc	acctggccct	ccgccaagcc	300
ggcgacgact	tctcccgccg	ctaccgcggc	gacttcgccg	agatgtccag	ccagctgcac	360
ctgacgccct	tcaccgcgcg	gggacgcttt	gccacggtgg	tggaggagct	cttcagggac	420
ssggtgaact	gggggaggat	tgtggccttc	tttgagttcg	gtggggtcat	gtgtgtggag	480
agcgtcaacc	gggagatgtc	gcccctggtg	gacaacatcg	ccctgtggat	gactgagtac	540
ctgaaccggc	acctgcacac	ctggatccag	gataacggag	gctgggatgc	ctttgtggaa	600
ctgtacggcc	ccagcatgcg	gcctctgttt	gatttctcct	ggctgtctct	gaagactctg	660

ctcagtttgg ccctggtggg agcttgcatc accctgggfcg cctatctgag ccacaag

717 • · · · • · · ·

	77	··« ·· ··· · • · · · · · · · · ······· · · · · · · • · ···· · · · · ···· · ·· ·· ·· ··
Informace o	SEQ ID NO: 21:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A)	DÉLKA: 239 zbytků
(B)	TYP: aminokyselina
(C)	DRUH ŘETĚZCE:
(D)	TOPOLOGIE: lineární
(ii) DRUH	MOLEKULY: protein

(vi) PŮVODNÍ ZDROJ:

	(A)	ORGANIZMUS:	Homo sapiens
(xí)	Popis sekvence:	SEQ ID NO: 21:
Met Ala 1	His	Ala Gly Arg Thr 5	Gly Tyr Asp Asn Arg Glu Ile Val Met 10 15
Lys-Tyr	Ile	His Tyr Lys Leu 20	Ser Gin Arg Gly Tyr Glu Trp Asp Ala 25 30
Gly Asp	Val 35	Gly Ala Ala Pro	Pro Gly Ala Ala Pro Ala Pro Gly Ile 40 45
Phe Ser SO	Ser	Gin Pro Gly His 55	Thr Pro His Pro Ala Ala Ser Arg Asp 60
Pro Val 65	Ala	Arg Thr Ser Pro 70	Leu Gin Thr Pro Ala Ala Pro Gly Ala 75 80
Ala Ala	Gly	Pro Ala Leu Ser 85	Pro Val Pro Pro Val Val His Leu Ala 90 95
Leu Arg	Gin	Ala Gly Asp Asp 100	Phe Ser Arg Arg Tyr Arg Gly Asp Phe 105 110
Ala Glu	Met 115	Ser Ser Gin Leu	His Leu Thr Pro Phe Thr Ala Arg Gly 120 125
Arg Phe 130	Ala	Thr Val Val Glu 13 5	Glu Leu Phe Arg Asp Gly Val Asn Trp 140
Gly Arg 145	Ile	Val Ala Phe Phe 150	Glu Phe Gly Gly Val Met Cys Val Glu 155 160
Ser Val	Asn	Arg Glu Met Ser 165	Pro Leu Val Asp Asn Ile Ala Leu Trp 170 175
Met Thr	Glu	Tyr Leu Asn Arg 180	His Leu His Thr Trp Ile Gin Asp Asn 185 190
Gly Gly	Trp 195	Asp Ala Phe Val	Glu Leu Tyr Gly Pro Ser Met Arg Pro 200 205
Leu Phe 210	Asp	Phe Ser Trp Leu 215	Ser Leu Lys Thr Leu Leu Ser Leu Ala 220
Leu Val 225	Gly	Ala Cys Ile Thr 230	Leu Gly Ala Tyr Leu Ser His Lys 235

(2) Informace o SEQ ID NO: 22:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 615 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednořetězcová (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: DNA (vi) PŮVODNÍ ZDROJ:

(A) ORGANIZMUS: Homo sapiens (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 22:

atggcgcacg cfcgggagaac ggggtacgac aaccgggaga tagtgatgaa gtacatccat tataagctgt cgcagagggg ctacgagtgg gatgcgggag afcgtgggcgc cgcgcccccg ggggccgccc ccgcaccggg catcttctcc tcccagcccg ggcacacgcc ccatccagcc gcatcccgcg .acccggtcgc caggacctcg ccgctgcaga ccccggctgc ccccggcgcc gccgcggggc ctgcgctcag cccggtgcca cctgtggtcc acctggccct ccgccaagcc ggcgacgact tctcccgccg ctaccgcggc gacttcgccg agatgtccag ccagctgcac ctgacgccct tcaccgcgcg gggacgcttt gccacggtgg tggaggagct cttcagggac ggggtgaact gggggaggat tgtggccttc tttgagttcg gtggggtcat gtgtgtggag agcgtcaacc gggagatgtc gcccctggtg gacaacatcg ccctgtggat gactgagtac ctgaaccggc acctgcacac ctggatccag gataacggag gctgggtagg tgcatctggt gatgtgagtc tgggc (2) Informace o SEQ ID NO: 23:

120

180

240

300

360

420

480

540

600

615

(i)	CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
	(A)	DÉLKA: 205 zbytků
	(B)	TYP: aminokyselina
	'(C)	DRUH ŘETĚZCE:
	(D)	TOPOLOGIE: lineární
(ii)	DRUH	MOLEKULY: protein
(vi)	PŮVODNÍ ZDROJ:
	(A)	ORGANIZMUS: Homo sapiens

• 9 » 9 • · • · 9 ► 9 9 9 9

	(xi)		Popis	sekvence: SEQ	ID	NO:	23:
Met	Ala	His	Ala Gly	Arg Thr Gly Tyr	Asp	Asn	Arg	Glu	Ile	Val	Met
1			5		10					15
Lys	Tyr	Ile	His Tyr	Lys Leu Ser Gin	Arg	Gly	Tyr	Glu	Trp	Asp	Ala
			20	25					30
Gly	Asp	Val	Gly Ala	Ala Pro Pro Gly	Ala	Ala	Pro	Ala	Pro	Gly	Ile
		35		40				45
Phe	Ser	Ser	Gin Pro	Gly His Thr Pro	His	Pro	Ala	Ala	Ser	Arg	Asp
	50			55			60
Pro	Val	Ala	Arg Thr	Ser Pro Leu Gin	Thr	Pro	Ala	Ala	Pro	Gly	Ala
65				70		75					80
Ala	Ala	Gly	Pro Ala	Leu Ser Pro Val	Pro	Pro	Val	Val	His	Leu	Ala
			85		90					95
Leu	Arg	Gin	Ala Gly Asp Asp Phe Ser	Arg	Arg	Tyr	Arg	Gly	Asp	Phe
			100	105					110
Ala	Glu	Met	Ser Ser	Gin Leu His Leu	Thr	Pro	Phe	Thr	Ala	Arg	Gly
		¹¹⁵		120				125
Arg	Phe	Ala	Thr Val	Val Glu Glu Leu	Phe	Arg	Asp	Gly	Val	Asn	Trp
	13 0			135			140
Gly	Arg	Ile	Val Ala	Phe Phe Glu Phe	Gly	Gly	Val	Met	Cys	Val	Glu
145				150		155					160
Ser	Val	Asn	Arg Glu	Met Ser Pro Leu	Val	Asp	Asn	Ile	Ala	Leu	Trp
			165		170					175
Met	Thr	Glu	Tyr Leu	Asn Arg His Leu	His	Thr	Trp	Ile	Gin	Asp	Asn
			180	185					190
Gly	Gly	Trp	Val Gly	Ala Ser Gly Asp	Val	Ser	Leu	Gly
		195		200				205

(2) Informace o SEQ ID NO: 24:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

	(A)	DÉLKA: 18 párů baží
	(B)	TYP: nukleová kyselina
	(C)	DRUH ŘETĚZCE: jednořetěz
	(D)	TOPOLOGIE: lineární
(ii)	DRUH	MOLEKULY: DNA
(vi)	PŮVODNÍ ZDROJ:
	(A)	ORGANIZMUS: Homo sapiens

• · (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 24:

tctcccagcg tgcgccat (3) Informace o SEQ ID NO: 25:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

	(A)	DÉLKA: 26 párů baží
	(B)	TYP: nukleová kyselina
	(C)	DRUH ŘETĚZCE: jednořetězcová
	(D)	TOPOLOGIE: lineární
(ii)	DRUH	MOLEKULY: DNA
(vi)	PŮVODNÍ ZDROJ:
	(A)	ORGANIZMUS: Homo sapiens
(xi)	Popis sekvence: SEQ ID NO: 25:
tgcactcacc tcggcct

Informace o	SEQ ID NO: 26:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A)	DÉLKA: 20 párů baží
(B)	TYP: nukleová kyselina
(C)	DRUH ŘETĚZCE: jednořetězcová
(D)	TOPOLOGIE: lineární
(ii) DRUH	MOLEKULY: DNA

(vi) PŮVODNÍ ZDROJ:

(A) ORGANIZMUS: Homo sapiens (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 26:

gcgcggcggg cgggcgggca (2) Informace o SEQ ID NO: 27:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 20 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina • · · · ·· ···«

	(C)	DRUH ŘETĚZCE: jednořetězcová
	(D)	TOPOLOGIE: lineární
ii)	DRUH	MOLEKULY: DNA
(Vi)	PŮVODNÍ ZDROJ:
	(A)	ORGANIZMUS: Homo sapiens

(xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 27:

gggcggaggc cggccggcgg t (2) Informace o SEQ ID NO: 28:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A)	DÉLKA: 29 párů	baží
(B)	TYP: nukleová	kyselina
(C)	DRUH ŘETĚZCE:	jednořetě
(D)	TOPOLOGIE: lineární
DRUH	MOLEKULY: DNA

(vi) PŮVODNÍ ZDROJ:

(A) ORGANIZMUS: Homo sapiens (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 28:

agcggcggcg gcggcagcgc (2) Informace o SEQ ID NO: 29:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

	(A)	DÉLKA: 20 párů baží
	(B)	TYP: nukleová kyselina
	(C)	DRUH ŘETĚZCE: jednořetěz
	(D)	TOPOLOGIE: lineární
(ii)	DRUH	MOLEKULY: DNA
(vi)	PŮVODNÍ ZDROJ:
	(A)	ORGANIZMUS: Homo sapiens

(xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 29:

gggccgggaa gggcgcccgc ·· ···· • ·«·· 99 99

9 9 9 9 9 9 9 · • 999 9 9 99 999

999 99 999 9 9

9 9 9 9 9 9 9 9 9

999 999 99 99 99 99

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Použití nesmyslného oligonukleotidů bcl-2 v dávce 0,01 až 50 mg/kg/den po dobu 2 až 13 dní pro výrobu farmaceutického prostředku pro léčení nebo prevenci zhoubných nádorů v jednom nebo větším počtu cyklů.
2. Použití podle nároku 1, při němž nesmyslný oligonukleotid bcl-2 se aplikuje po dobu 3 až 9 dní.
3. Použití podle nároku 1, při němž nesmyslný oligonukleotid bcl-2 se aplikuje po dobu 4 až 7 dní.
4. Použití podle nároku 1 až 3, při němž prostředek obsahuje nesmyslný oligonukleotid bcl-2 v dávce 4 až 9 mg/kg/den.
5. Použití podle nároku 1 až 3, při němž prostředek obsahuje nesmyslný oligonukleotid bcl-2 v dávce 5 až 7 mg/kg/den.
6. Použití podle nároku 1, při němž prostředek obsahuje ještě jedno nebo více dalších terapeutických činidel pro zhoubné buj ení.
7. Použití podle nároku 6, při němž aplikace terapeutického činidla pro zhoubné bujení následuje po aplikaci nesmyslného oligonukleotidů bcl-2.
8. Použití podle nároku 6, při němž aplikace terapeutického činidla pro zhoubné bujení předchází aplikaci nesmyslnéo oligonukleotidů bcl-2.

4 4 · *· 4 • 4444 44 44 • •4 4 4 · 4 4« 4 • 444 4 · 44 444

4 44* 44 444 4 *

4 4 4 44 4 4 44 4

444 444 44 44 44 44
9. Použiti podle nároku 6, při němž terapeutické činidlo pro zhoubné bujení se aplikuje současně s nesmyslným oligonukleotidem bcl-2.
10. Použití podle nároku 6, při němž uvedené terapeutické činidlo pro zhoubné bujení je chemoterapeutické činidlo, radioterapeutické činidlo, imunoterapeutické činidlo, vakcína pro zhoubné bujení, anti-angiogenní činidlo, cytokin, prostředek pro genovou terapii nebo hormonální činidlo.
11. Použití podle nároku 10, při němž uvedené terapeutické činidlo pro zhoubné bujení je chemoterapeutické činidlo, kterým je dakarbazin, doketaxel, paklitaxel, cis-platina, 5-fluorouracil, doxorubicin, etoposid, cyklofosfamid, fludarabin, irinotekan nebo cytosinarabinosid (Ara-C).
12. Použití podle nároku 6 nebo 10, při němž uvedené terapeutické činidlo pro zhoubné bujení se aplikuje ve snížené dávce.
13. Použití podle libovolného z nároků 1 až 3 nebo 6, při němž uvedená aplikace probíhá orálně, intravenózní infúzí, subkutánní injekcí, intramuskulární injekcí, povrchově, depotní injekcí, zavedením implantátu, uvolňováním v čase, intrakavitárně, intranazálně, inhalací, přímo do národu nebo nitrooční aplikací.

ř—
14. Použití podle libovolného z nároků 1 až 3 nebo 6, při němž uvedené zhoubné bujení je karcinom krvetvorného systému, kůže, kostní nebo měkké tkáně, rozmnožovacího

99 9«r99

9 9999 99 99 «99 9 9 9 9 · < 9 • 999 · · 9« · · * • «·>·«*··» 9

9 · 9··· · β · · «•«999 9» 99 99 99 systému, genitourinárního systému, prsu, endokrinologického systému, mozku, centrálního nervového systému, periferního nervového systému, ledvin, plic, dýchacího ústrojí, toraxu, trávicího a zažívacího ústrojí, lymfatických uzlin, pankreasu, hepatobiliárního systému nebo karcinom, jehož primární místo není známé.

Použití podle libovolného z nároků 1 až 3 nebo 6, při němž uvedené zhoubné bujení je lymfom, který není Hodgkinův lymfom, Hodkinův lymfom, leukemie, karcinom tlustého střeva, rektální karcinom, karcinom pankreasu, karcinom prsu, karcinom vaječníků, karcinom prostaty, karcinom renálních buněk, hepatom, karcinom žlučníku, choriokarcinom, karcinom děložního čípku, karcinom varlat, karcinom plic, karcinom močového měchýře, melanom, karcinom hlavové a krční oblasti nebo karcinom mozku.

Použiti podle libovolného z nároků 1 až 3 nebo 6, při němž nesmyslný oligonukleotid zahrnuje 10 až 35 bázi a je komplementární s genem bcl-2 kódujícím pre-mRNA nebo mRNA

Použití podle nároku 16, při oligonukleotid zahrnuje alespoň dvě vazby.

němž nesmyslný fosforothioátové

Použití podle nároku oligonukleotid zahrnuje (SEQ ID NO: 17).
17, při němž nesmyslný sekvenci TCTCCCAGCGTGCGCCAT
18 .

44 4444 • · · · • 4 44
19. Použití jednoho nebo většího počtu chemoterapeutických činidel a nesmyslného oligonukleotidu bcl-2 v dávce 0,01 až 50 mg/kg/den pro výrobu farmaceutického prostředku pro léčbu nebo prevenci zhoubného bujení u člověka, při němž chemoterapeutickým činidlem je dakarbazin, doketaxel, paklitaxel, cis-platina, 5-fluorouracil, doxorubicin, etoposid, cyklofosfamid, fludarabun, irinotekan nebo cytosinarabinosid (Ara-C), přičemž chemoterapeutické činidlo se aplikuje ve snížené dávce v jednom nebo více cyklech.
20. Použití podle nároku 19, při němž uvedené terapeutické činidlo pro zhoubné bujení je paklitaxel a uvedená dávka je 10 až 13 5 mg/m² v jednom cyklu.
21. Použití podle nároku 19, při němž terapeutické činidlo pro zhoubné bujení je doketaxel a uvedená dávka je 6 až 60 mg/ml v jednom cyklu.
22. Použití podle nároku 19, při němž uvedené terapeutické činidlo pro zhoubné bujení je fludarabin a uvedená dávka je 2,5 až 25 mg/kg v jednom cyklu.
23. Použití podle nároku 19, při němž uvedené terapeutické činidlo pro zhoubné bujení je irinotekan a uvedená dávka je 5 až 50 mg/kg v jednom cyklu.
24. Farmaceutický prostředek, vyznačující se tím, že zahrnuje nesmyslný oligonukleotid bcl-2 •β ©Φ·© ©♦ © ·· · aktin

Bcl-2

1/3 ·· • · ©

© • · « · « · ·*·*