CZ20021837A3

CZ20021837A3 - 3-Methylensteroidové deriváty

Info

Publication number: CZ20021837A3
Application number: CZ20021837A
Authority: CZ
Inventors: Ralf Plate; Wilhelmina Maria Bagchus
Original assignee: Akzo Nobel N. V.
Priority date: 1999-11-29
Filing date: 2000-11-23
Publication date: 2002-08-14
Also published as: AR033503A1; AU2508701A; SK7272002A3; HUP0203596A3; PL355968A1; EP1240179A2; PT1240179E; US20040043972A1; DE60026608D1; IL149412A0; KR20030024656A; SK285398B6; NO20022521L; CY1106088T1; NZ518756A; WO2001040253A2; BR0015950A; HK1047595B; TWI265167B; HK1047595A1

Description

Oblast techniky

Vynález se týká nových 3-methylensteroidových derivátů s léčebnými účinky a výroby farmaceutických prostředků, obsahujících 3-alkylidenový steroid.

Dosavadní stav techniky

Steroidy s methylenovými substituenty v poloze 3 steroidní kostry a s dvojitými vazbami v polohách 1-2 nebo 4-5 jsou známé a nárokované jako látky vhodné pro terapeutické použití (BE 696 235 a BE 654 772). Předpokládané léčebné použití je důsledkem anabolického, estrogeního a progestogeního působením. Žádná z těchto sloučenin nesplnila předpoklady takového použití a žádný předpoklad se také netýká jejich použitelnosti jako léčiv v jiných oblastech, ačkoliv mnoho onemocnění stále zůstává neuspokojivě léčených léky, který jsou v současnosti dostupné. Zejména onemocnění imunitního systému, jako revmatoidní arthritida a autoimunitní onemocnění, potřebují lepší léčiva. K léčbě takových onemocnění lze částečně použít kortikosteroidová činidla, ale zlepšení, týkající se jak účinnosti, tak i četnosti nebo závažnosti vedlejších účinků, jsou potřebná.

Podstata vynálezu

Tento vynález poskytuje 3-methylensteroidové deriváty a jejich prekursory, přičemž steroidní deriváty mají obecný vzorec 1

- 2 ·· · · · « ···· • · ··»·· «· ·

kde R¹ je H nebo společně s R³ vytváří β-epoxid nebo R¹ je nepřítomen, pokud zde existuje dvojitá vazba v poloze 5-10 nebo 4-5;

R² je C, až C₅ alkyl nebo CF₃;

R³ je βΗ, βΟΗ₃ nebo společně s R¹ vytváří β-epoxid nebo R³ je nepřítomen, pokud zde existuje dvojitá vazba v poloze 5-10;

R⁴ je H, nižší alkyl;

Y je [Η, H] [OH, H], =0, [OH, nižší alkyl], [OH, CH₂ až C₅ alkenyl], [OH, C₂ až C₅ alkynyl] nebo C, až C₆ alkyliden, přičemž uvedený alkyl, alkenyl, alkynyl a alkyliden je volitelně halogenovaný; nebo =NOR⁵, přičemž R⁵ je H, nižší alkyl.

Čárkovaně nakreslené přímky představují volitelnou dvojnou vazbu.

Upřednostňovanými sloučeninami podle vynálezu jsou ty, kde R⁴je H a Y je [OH, H], =0, [OH, nižší alkyl], [OH, CH₂ až C₅ alkenyl], [OH, C₂ až C₅ alkynyl] nebo C₁ až C₆ alkyliden, přičemž uvedený alkyl, alkenyl, alkynyl a alkyliden mohou být volitelně halogenovány.

V tomto popisu vynálezu mají použité výrazy následující význam:

Nižší alkyl je rozvětvená nebo nerozvětvená alkylová skupina, mající s výhodou 1 až 6 atomů uhlíku, jako hexyl, izobutyl, terciární butyl, propyl, izopropyl, ethyl a methyl. Nejupřednostňovanější jsou alkylové skupiny mající 1 až 3 atomy uhlíku.

- 3 C₁ až C₅ alkyl je rozvětvená nebo nerozvětvená alkylová skupina, mající 1 až 5 atomů uhlíku, například methyl, ethyl, izopropyl, butyl, sekundární butyl, terciární butyl a podobně; upřednostňované jsou alkylové skupiny mající 1 až 3 atomy uhlíku.

C₂ až C₅ alkenyl je rozvětvená nebo nerozvětvená alkenylová skupina, mající 2 až 5 atomů uhlíku, jako ethenyl, 2-butenyl a podobně. Přednost se dává alkenylovým skupinám, majícím 2 až 3 atomy uhlíku.

C₂ až C₅ alkynyl je rozvětvená nebo nerozvětvená alkynylová skupina, mající 2 až 5 atomů uhlíku, jako ethynyl a propynyl a podobně. Přednost se dává alkynylovým skupinám, majícím 2 až 3 atomy uhlíku.

C₁ až C₅ alkyliden je rozvětvená nebo nerozvětvená alkylidenová skupina, mající 1 až 5 atomů uhlíku, jako methenyl, butyliden a podobně. Přednost se dává alkylidenovým skupinám, majícím 2 až 3 atomy uhlíku.

Halogenem je fluor, chlor, brom a jod.

Prekursory jsou sloučeniny, které jsou upraveny do formy sloučeniny podle vynálezu v těle příjemce léčení. Obecně takové prekursory mohou být estery nebo ethery s hydroxylovou funkční skupinou v poloze 17.

Upřednostňovaným ztělesněním tohoto vynálezu je sloučenina jak byla popsána výše, mající dvojnou vazbu v poloze 5-10. Nejupřednostňovanější je sloučenina (7a,17a)-7-methyl-3-methylen-19norpregn-5(10)-en-20-yn-17-ol. Z tohoto vynálezu jsou vyloučeny sloučeniny: (7a, 17p)-7a-methyl-3-methylen-4-estren-17-ol, (7a,17a)-7—methy l-3-methylen-19-norpregn-4-en-17-ol, (7a,17a)-7-methyl-3-methylen-19,21-dinorpregn-4-en-17-ol, (7a)-17-keto-7-methyl-3-methylen-4-estren,

- 4 (7α, 17a)-7-methyl-3-methylen-19-norpregn-4-en-20-yn-17-ol,

17p-hydroxy-7a-methyl-3-methylen-17a-propen-2-yl-4-estren a

17p-hydroxy-7a-methyl-3-methylen-17a-buten-2-yl-4-estren.

Disclaimer se týká objevů uvedených v BE 696 235.

Epoxidové sloučeniny (R¹ a R³ společně vytvářejí β-Ο-) podle tohoto vynálezu mohou být vyrobeny oxidací sloučeniny o vzorci 2, kde uvedené symboly mají stejný význam, jak bylo definováno dříve, s kyselinou metachlorperoxibenzoovou

3-methylenová skupina může být u sloučeniny podle vynálezu získána provedením Wittigovy reakce za použití bromidu methyltrifenylfosfonia a t-butoxidu draselného s odpovídajícím 3-ketoprekursory steroidů, které jsou charakterizovány vzorcem 3, přičemž Y²je stejný jako Y, jak bylo definováno výše, s tou výjimkou, že není =0 a ostatní symboly mají stejné významy, jak byly definovány dříve.

(3)

17-alkylidenové sloučeniny podle vynálezu mohou být vyrobeny Wittigovou reakcí 3-ketalového derivátu 17-ketoderivátu podle vzorce 4,

- 5 kde použité symboly mají stejný význam jak bylo definováno dříve, s bromidem alkyltrifenylfosfonia a následnou hydrolýzou 3-ketalové funkce. Sloučeniny, mající Y = Η, H v poloze 17 (vzorec 2) podle vynálezu mohou být vyrobeny Wolff-Kishnerovou redukcí 17-ketočástice 3-ketalové sloučeniny o vzorci 4, přičemž symboly mají stejný význam, jak bylo definováno dříve. 17-oximové deriváty podle vynálezu mohou být vyrobeny kondenzací 17-ketofunkční skupiny (vzorec 4) s hydroxylaminovými deriváty. 16-alkylová sloučenina podle vynálezu může být vyrobena alkylací polohy 16 odpovídající 17-ketosloučeniny (Y =0 vzorec 4).

(4)

Výše uvedené reagencie pro přeměnu výchozích sloučenin a způsoby reakce se sloučeninami jsou v oboru známé, ale dosud nebyly aplikovány na skupinu sloučenin, které jsou připraveny k získání sloučenin podle vynálezu. Výchozí materiály je možné získat metodami popsanými v literatuře. Zvláště aktuální reference je práce Van Vlieta a spoluautorů, Reci. Trav. Chim. Pays-Bas, EN; 105 (4), 111-115, 1986; jejíž obsah je začleněn do tohoto popisu jako reference. Jmenovitě je zde popsáno, že 17-alkyl-3-ketoderiváty podle vzorce 3, kde Y² je [OH, nižší alkyl] a ostatní symboly mají stejný význam, jaký byl definován dříve, je možné získat katalytickou hydrogenaci sloučeniny podle vzorce 3, kde Y² je [OH, nižší alkenyl] nebo [OH, alkynyl] a ostatní symboly mají stejný význam, jaký byl definován dříve, například za použití katalyzátoru PtO₂/H₂ .

- 6 Deriváty podle vzorce 5 je možné získat čištěním směsi sloučenin formovaných po Birchově redukci 4-en-3-on-derivátu podle vzorce 6, přičemž jak ve vzorci 5, tak i ve vzorci 6 mají symboly stejný význam jaký byl definován dříve.

(5)

4-en-3-onový derivát podle vzorce 6, kde R³ je H a ostatní symboly mají stejný význam jaký byl definován dříve, může být získán ze sloučeniny podle vzorce 7 izomerizací na dvojné vazbě (podle postupů, popsaných Van Vlietem a spoluautory, 1986).

(7)

4-en-3-onový derivát podle vzorce 6, kde R³ je methyl a ostatní symboly mají stejný význam jak byl definován dříve může být získán podle postupů, popsaných v práci Grunwella a spoluautorů, Steroids 27, 759-771, 1976, která je zde začleněna jako reference.

• « • · · · • · • · ·

- 7 Další způsoby pro získání sloučenin podle vzorce 7 jako výchozího materiálu mohou být prováděny tak, jak je popsáno Van Vlietem a spoluautory, 1986.

Sloučeniny, jak byly definovány vzorcem 1, lze použít k imunomodulaci u savců. Sloučenina podle tohoto vynálezu může být zvláště použita v léčbě arthritických onemocnění, jako revmatoidní arthritis (RA) a autoimunitních onemocnění ( AIDs), jako je Sjógrenův syndrom a systémový lupus erythematodes (SLE). Rovněž může být použita k profylaxi takových onemocnění. Nadto může být sloučenina podle tohoto vynálezu použita k přípravě léčiv, obsahujících sloučeninu podle tohoto vynálezu jako aktivní složku.

Předkládaný vynález se také týká farmaceutického prostředku, obsahujícího steroidní sloučeninu podle vynálezu, smíšenou s jedním nebo více z farmaceuticky přijatelných přídavných látek, jak je popsáno ve standardním odkazu Gennara a spoluautorů, Remmington's Pharmaceutical Sciences (18. vydání, Mack publishing Company, 1990, viz zejména část 8: Pharmaceutical Preparations and Their Manufacture). Směs jedné nebo více ze steroidních sloučenin podle vynálezu a jedné či více z farmaceuticky přijatelných přídavných látek může být lisována do pevných jednotek dávkování, jako jsou pilule či tablety, nebo může být zpracována do tobolek nebo čípků. Prostřednictvím farmaceuticky vhodných kapalin mohou být sloučeniny také podávány jako injekční přípravek ve formě roztoku, suspenze, emulze, nebo ve formě spreje, například nosního spreje. Pro výrobu dávkovačích jednotek, například tablet, se předpokládá použití běžných přídavných látek, jako jsou plniva, barviva, polymerní pojivá a podobně. Obecně je možné použít kteroukoli farmaceuticky přijatelnou přídavnou látku, která není na překážku funkci aktivních sloučenin (neinterferuje s ní). Steroidní sloučeniny podle vynálezu mohou být začleněny také jako

- 8 implantát, náplast, gel a jakýkoliv jiný přípravek pro prodloužené uvolňování.

Vhodné nosiče, s nimiž mohou být podávány prostředky podle vynálezu, zahrnují laktózu, škrob, celulózové deriváty a podobně, nebo směsi takových látek použitých ve vhodných množstvích.

V jiném aspektu se vynález týká použití steroidní sloučeniny podle vynálezu k výrobě léčiva pro modulaci imunitního systému savců. Konkrétněji se vynález týká použití steroidní sloučeniny podle vynálezu pro výrobu léčiva k léčbě arthritických onemocnění jako revmatoidní arthritis (RA) a autoimunitních onemocnění (AIDs), jako je Sjógrenův syndrom a systémový lupus erythematodes (SLE). Taková léčiva mohou být také připravena k profylaktickému použití v případě těchto onemocnění. Léčivo je s výhodou vyrobeno tak, zejména pro humánní léčbu, aby vyhovělo požadavkům zdravotnických autorit v různých zemích. Použití 3-methylenových steroidních derivátů (7a, 17p)-7a-methyl-3-methylen-4-estrenu-17-olu, (7a, 17a)-7-methyl-3-methylen-19-norpregn-4-enu-17-olu, (7a, 17a)-7-methyl-3-methylen-19,21-dinorpregn-4-enu-17-olu, (7a)-17-keto-7-methyl-3-methylen-4-estrenu, (7a, 17a)-7-methyl-3-methylen-19-norpregn-4-en-20-yn-17-olu,

17p-hydroxy-7a-methyl-3-methylen-17a-propen-2-yl-4-estrenu a

17p-hydroxy-7a-methyl-3-methylen-17a-buten-2-yl-4-estrenu je mimo rozsah předkládaného vynálezu.

Nadto se vynález týká léčby arthritických onemocnění jako revmatoidní arthritis (RA) a autoimunitních onemocnění (AIDs), jako je Sjógrenův syndrom a systémový lupus erythematodes (SLE), zahrnující podávání sloučeniny, jak byla popsána dříve (ve vhodné farmaceutické dávkovači formě), pacientům.

• ft ·»·· ·· ·»·· ·· ·· ·· · ··* · · · ft • · ··*·· ·· · • · • ftftft ·

Dávkovači množství předkládaných steroidů budou v rozmezí od 0,001 do 100 mg na jedno podání subjektu, který potřebuje léčbu. V souhlasu s tím dávkovači jednotky pro praktické použití sloučeniny podle vynálezu mohou obsahovat množství aktivní přísady v rozmezí od 0,001 do 100 mg.

Imunomodulační schopnosti sloučeniny podle tohoto vynálezu mohou být doloženy a použity v následujících pochodech.

Pokud se týká přecitlivělosti (hypersenzitivity) opožděného typu (delayed type hypersensitivity, DTH) může být účinek sloučeniny na rozvoj imunitní reakce pozorován u myší (podrobnosti v příkladu 16). Ve stručnosti, sloučenina se podává denně a zvířata jsou následně imunizována prostřednictvím antigenů v adjuvantní látce. Po uplynutí 7 dnů jsou zvířata místně stimulována, podnícena k imunitní odpovědi injikací antigenu (většinou do nohy) a následně se měří rozvoj místního otoku v odpovědi na aplikaci antigenu. Stupeň otoku odpovídá rozvoji imunitní odpovědi vůči antigenu, který ji vyvolal. Inhibiční působení sloučeniny podle tohoto vynálezu na rozvoj otoku je možné určit srovnáním léčené skupiny se skupinou, které bylo podáváno placebo. Jako srovnávací léčba může být použito podávání glukokortikoidů.

Účinek sloučeniny podle tohoto vynálezu byl testován také u arthritických myší. V tomto postupu byly myši imunizovány kolagenem typu 2, většinou z hovězí chrupavky, v adjuvantní látce. Po 3 týdnech byla podána zesilující dávka stejného antigenu. Přibližně pod 7 až 10 dnech od podání zesilující dávky lze pozorovat jako reakci otok kloubů (zvláště na zadních a předních nohách). Tento otok se rychle zvětšuje, začíná rudnout a vede k zánětu a deformaci normálního fungování. Během rentgenové analýzy je možné pozorovat zhroucení normální architektury kloubu. Při histologickém testování těchto kloubů, je možné pozorovat těžký zánět, vedoucí ke zhroucení architektury normální

- 10 t v · • · ·»·» chrupavky. Stupeň pozorovaných změn může narůstat a nadto může vzrůstat i stupeň histologických změn.

Kromě toho může být účinek sloučeniny podle tohoto vynálezu pozorován u nikoli obézních diabetických (NOD, non-obese diabetic) myší. Při tomto postupu se u myší spontánně a stupňovaně rozvíjí autoimunitní onemocnění s příznaky, které připomínají příznaky lidského, na inzulínu závislého diabetes mellitus (IDDM) a Sjógrenova syndromu. Sjogrenův syndrom je charakterizován vývojem infiltrátů ve slinné a slzné žláze. U NOD myší je zejména slinná žláza charakterizována stupňujícím se vývojem infiltrátů. Sloučenina podle tohoto vynálezu inhibuje dávkově závislým způsobem vývoj těchto infiltrátů v podčelistních žlázách.

IDDM je charakterizováno vývojem infiltrátů ve slinivce, vedoucích k destrukci Langerhansových ostrůvků, produkujících inzulín. Po rostoucí destrukci veškerých těchto ostrůvků k produkci inzulínu dále nedochází, což vede k rozvoji IDDM.

Vynález bude ozřejměn v následujících příkladech.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

Výroba (7a, 17a)-7-methyl-3-methylen-19-norpregn-5(10)-en-20yn-17-olu

K míchanému roztoku t-butoxidu draselného (7,9 g, 70,4 mmol) v 130 ml vysušeného tetrahydrofuranu byl pod dusíkovou atmosférou přidán bromid methyltrifenylfosfonia (26,4 g, 73,9 mmol). Žlutá suspenze byla míchána 45 minut při teplotě místnosti. Poté byl k

- 11 • 0 * · 0 · suspenzi rychle přidán (přibližně během 30 sekund) roztok 20 g, 64 mmol tibolonu v 200 ml vysušeného tetrahydrofuranu, výsledkem čehož byla slabě exotermní reakce (od 20 °C do 30 °C). Žlutá reakční směs byla míchána 30 minut při teplotě místnosti, vlita do ledové vody (700 ml) a extrahována ethylacetátem (700 ml). Organická vrstva byla promyta vodou (300 ml), vysušena pomocí síranu sodného a odpařena do sucha k poskytnutí 41,8 g žlutého oleje. Sloupcová chromatografie za použití soustavy toluen/ethylacetát (95/5, % obj./obj.) jako eluentu poskytla 19,5 g bezbarvého oleje, obsahujícího přibližně 90% (7a, 17a)-7-methyl-3-methylen-19-norpreg n-5( 10)-en-20-y n-17-olu a

10% izomerní Δ⁴ derivát. Trojnásobná rekrystalizace, využívající soustavu heptan/petrolether jako rozpouštědlo, poskytla sloučeninu uvedenou v nadpisu (6,44 g, 32% výtěžek) jako bílou pevnou látku o teplotě tání 91,6 °C.

Příklad 2

Výroba (7a,173)-7-methyl-3-methylenestr-5(10)-en-17-olu

K míchanému roztoku t-butoxidu draselného (1,26 g, 11,2 mmol) v 20 ml vysušeného tetrahydrofuranu byl pod dusíkovou atmosférou přidán bromid methyltrifenylfosfonia (4,21 g, 11,8 mmol). Žlutá suspenze byla míchána 45 minut při teplotě místnosti. Poté byl k suspenzi rychle přidán roztok (7a,17p)-7-methyl-3-ketoestr-5(10)-en-17-olu (3,4 g, 11,8 mmol) v 25 ml vysušeného tetrahydrofuranu. Žlutá reakční směs byla míchána 30 minut při teplotě místnosti, vlita do ledové vody a extrahována ethylacetátem. Organická vrstva byla promyta vodou, vysušena síranem sodným a odpařena do sucha k poskytnutí 5,3 g v nadpisu uvedené sloučeniny jako žlutého oleje. Sloupcová chromatografie za použití soustavy toluen/ethylacetát (95/5, % obj./obj.) jako eluentu poskytla 2,3 g bezbarvého oleje. Krystalizace za použití soustavy heptan/petroether poskytla • 00 0 «0 • ♦ * * • t » ί ·0 · • 0 · 0 « * a 0 0 · • 00 0 « «0 ·»· * » ·· 0000 (7a,17p)-7-methyl-3-methyl-enestr-5(10)-en-17-ol (1,47 g, 44% výtěžek) jako bílou pevnou látku o teplotě tání 111,8 °C.

Příklad 3

Výroba(5p,7a,17a)-5,10-epoxy-7-methyl-3-methylen-19-norpregn-20-yn-17-olu

Sloučenina (7a,17a)-7-methyl-3-methylen-19-norpregn-5(10)-en-20-yn-17-ol (390 mg, 1,26 mmol), získaná podle příkladu 1, byla míchána v 15 ml vysušeného dichlormethanu pod dusíkovou atmosférou. Roztok byl ochlazen na 0 °C a přidána byla meta-chlorperoxybenzoová kyselina (1,26 mmol, 310 mg této 70% kyseliny). Reakční směs byla míchána 2 hodiny při 0 °C, promyta nasyceným roztokem thiosulfátu sodného, nasyceným roztokem hydrogenuhličitanu sodného a nasyceným roztokem chloridu sodného, vysušena pomocí síranu sodného a odpařena do sucha k poskytnutí 450 mg surového (5β,7α, 17α)-5,10-epoxy-7-methyl-3-methylen-19-norpregn20-yn-17-olu. Sloupcová chromatografie za použití soustavy heptan/ethylacetát (95/5, % obj./obj.) jako eluentu poskytla vyčištěnou sloučeninu uvedenou v nadpisu (150 mg, 37% výtěžek) v podobě pěny.

Příklad 4

Výroba (5β,7α,17β)-5,10-epoxy-7-methyl-3-methylenestran-17-olu

Sloučenina (7a.,173)-7-methyl-3-methylenestr-5(10)-en-17-ol (350 mg, 1,22 mmol), získaná podle příkladu 2, byla míchána pod dusíkovou atmosférou v 15 ml vysušeného dichlormethanu. Roztok byl ochlazen na 0 °C a poté byla přidána kyselina meta-chlorperoxybenzoová (1,22 mmol, 301 mg této 70% kyseliny). Reakční směs byla míchána 75 minut • · · · · * ·· ··· · · · · · · při O °C, promyta nasyceným roztokem thiosulfátu sodného, nasyceným roztokem hydrogenuhličitanu sodného a nasyceným roztokem chloridu sodného, vysušena síranem sodným a odpařena do sucha k poskytnutí 371 mg surového (5p,7a,173)-5,10-epoxy-7-methyl-3-methylen-estran-17-olu. Sloupcová chromatografie za použití soustavy heptan/ethylacetát (95/5, % obj./obj.) jako eluentu poskytla dále vyčištěnou sloučeninu uvedenou v nadpisu (230 mg, 63% výtěžek). Krystalizace za použití soustavy heptan/ethylacetát (95/5, % obj./obj.) poskytla vyčištěnou sloučeninu uvedenou v nadpisu (120 mg, 33% výtěžek) jako bílou pevnou látku o teplotě tání 125 °C.

Příklad 5

Výroba (5α,7α,17a)-7-methyl-3-methylen-19-norpregn-20-en-17-olu

K míchanému roztoku t-butoxidu draselného (196 mg, 1,75 mmol) v 2 ml vysušeného tetrahydrofuranu byl pod dusíkovou atmosférou přidán bromid methyltrifenylfosfonia (688 mg, 1,93 mmol). Žlutá suspenze byla míchána 45 minut při teplotě místnosti. K této suspenzi byl rychle přidán roztok (5a,7a,17a)-7-methyl-3-keto-19-norpregn-20-en-17-olu (220 mg, 0,7 mmol) ve 3 ml vysušeného tetrahydrofuranu. Žlutá reakční směs byla míchána 2,5 hodiny při teplotě místnosti, vlita do ledové vody a extrahována ethylacetátem. Organická vrstva byla promyta vodou, vysušena síranem sodným a odpařena do sucha k poskytnutí 500 mg oleje. Sloupcová chromatografie za použití soustavy heptan/ethylacetát (95/5, % obj./obj.) jako eluentu poskytla 200 mg surového (5α,7α,17a)-7-methyl-3-methylen-19-norpregn-20-en-17-olu. Krystalizace z heptanu poskytla vyčištěnou sloučeninu uvedenou v nadpisu (120 mg, 55% výtěžek) jako bílou pevnou látku o teplotě tání 105 °C.

• · · · • · « · ·

- 14 • · · ·

Příklad 6

Výroba (5ct,7ct,17α)-7-methyl-3-methylen-19-norpregn-20-yn-17-olu

K míchanému roztoku t-butoxidu draselného (527 mg, 4,7 mmol) v 4 ml vysušeného tetrahydrofuranu byl pod dusíkovou atmosférou přidán bromid methyltrifenylfosfonia (1,85 g, 5,18 mmol). Žlutá suspenze byla míchána 45 minut při teplotě místnosti. K této suspenzi byl rychle přidán roztok (5α,7α,17a)-7-methyl-3-keto-19-norpreg n-20-yn-17-olu (590 mg, 1,88 mmol) ve 8 ml vysušeného tetrahydrofuranu. Žlutá reakční směs byla míchána 2,5 hodiny při teplotě místnosti, vlita do ledové vody a extrahována ethylacetátem. Organická vrstva byla promyta vodou, vysušena síranem sodným a odpařena do sucha k poskytnutí 1,8 g oleje. Sloupcová chromatografie za použití soustavy heptan/ethylacetát (95/5, % obj./obj.) jako eluentu poskytla 590 mg surového (5a,7a,17a)-7-methyl-3-methylen-19-norpregn-20-yn-17-olu. Krystalizace z heptanu poskytla vyčištěnou sloučeninu uvedenou v nadpisu (290 mg, 50% výtěžek) v podobě bílé pevné látky o teplotě tání 97 °C.

Příklad 7

Výroba (5β,7α,17a)-7-methyl-3-methylen-19-norpreg na n-17-olu

K míchanému roztoku t-butoxidu draselného (1,62 g, 14,4 mmol) v 27 ml vysušeného tetrahydrofuranu byl pod dusíkovou atmosférou přidán bromid methyltrifenylfosfonia (5,4 g, 15,1 mmol). Žlutá suspenze byla míchána 40 minut při teplotě místnosti. K této suspenzi byl rychle přidán roztok (53,7a,17a)-7-methyl-3-keto-19-norpregnan-17-olu (4,56 g, 14,4 mmol) v 50 ml vysušeného tetrahydrofuranu. Žlutá reakční směs • · · ·

- 15 • · · · · byla míchána 30 minut při teplotě místnosti, vlita do ledové vody a extrahována ethylacetátem. Organická vrstva byla promyta vodou a solným roztokem, vysušena síranem sodným a odpařena do sucha k poskytnutí 8,2 g oleje. Sloupcová chromatografie za použití soustavy heptan/ethylacetát (95/5, % obj./obj.) jako eluentu poskytla (5p,7a,17a)-7-methyl-3-methylen-19-norpregnan-17-ol (3,65 g, 81% výtěžek), který ztuhl během stání, teplota tání byla 104 °C.

Příklad 8

Výroba (7a)-7-methy 1-3,17-dimethylenestr-5(10)enu

K míchanému roztoku t-butoxidu draselného (680 mg, 6 mmol) v 25 ml vysušeného tetrahydrofuranu byl pod dusíkovou atmosférou přidán bromid methyltrifenylfosfonia (2,2 g, 6 mmol). Žlutá suspenze byla míchána 30 minut při teplotě místnosti. K této suspenzi byl rychle přidán (přibližně během 30 sekund) roztok (7a)-7-methyl-3-keto-17-methylenestr-5(10)enu (850mg, 3 mmol) v 25 ml vysušeného tetrahydrofuranu, výsledkem čehož byla slabě exotermní reakce. Reakční směs byla míchána 30 minut při teplotě místnosti, vlita do ledové vody (100 ml) a extrahována ethylacetátem(100 ml). Organická vrstva byla promyta vodou (50 ml), vysušena síranem sodným a odpařena do sucha k poskytnutí (7a)-7-methyl-3,17-dimethylenestr-5(10)enu (680 mg, 80% výtěžek) jako bezbarvého oleje. [a]_D +115 °C (c 0,185 v ethanolu).

Příklad 9

Výroba (7a, 16a, 17β)-7,16-dimethyl-3-methylen-17-(1 -propynyl)estr-5(10)-en-17-olu • · · · • ·

Roztok (7a)-3,3-dimethoxy-7-methylestr-5(10)-en-17-onu (1,5 g, 4,5 mmol) a 1,3-dimethyl-3,4,5,6-tetrahydro-2(1 H)-pyrimidinonu (DMPU, 1,2 ml, 9,9 mmol) ve 30 ml destilovaného tetrahydrofuranu byl přidán v průběhu přibližně 8 minut k míchanému roztoku bis(trimethylsilyl)amidu lithia (LiHMDS, 4,96 ml, 1 mmol.I'¹ v tetrahydrofuranu) v 15 ml destilovaného THF při teplotě -40 °C a pod dusíkovou atmosférou. Reakční směs byla míchána 45 minut při teplotě -40 °C. Poté byl přidán roztok jodmethanu (730 μΙ, 11,7 mmol) v 1 ml destilovaného tetrahydrofuranu a míchán 1 hodinu, přičemž byla teplota ponechána stoupnout na 0 °C. Následně byla přidána voda a nasycený roztok chloridu amonného a byla provedena extrakce ethylacetátem. Organická vrstva byla promyta solným roztokem, vysušena síranem sodným a odpařena do sucha. Chromatografie za použití soustavy heptan/ethylacetát (95/5, % obj./obj.) jako eluentu poskytla (7α,16a )-3,3-d imethoxy-7,16-dimethylestr-5( 10)-en-17-onu (990 mg, výtěžek 65 %).

Roztokem n-butyllithia (BuLi, 9 ml, 1,6 mol.I'¹ hexanu) v 19 ml vysušeného tetrahydrofuranu byl při -70 °C probubláván propin (přibližně 4 g, 100 mmol) k poskytnutí exotermní reakce (od -70 °C do -30 °C). V průběhu přibližně 5 minut byl k bílé suspenzi přidán pod dusíkovou atmosférou roztok (7a,16a)-3,3-dimethoxy-7,16-dimethylestr-5(10)-en-17-onu (990 mg, 2,86 mmol) v 10 ml vysušeného tetrahydrofuranu. Reakční směs byla míchána 45 minut a teplota byla ponechána postupně se ohřát na teplotu místnosti. Poté byly přidány voda a nasycený roztok chloridu amonného a byla provedena extrakce ethylacetátem. Organická vrstva byla promyta solným roztokem, vysušena síranem sodným a odpařena do sucha k poskytnutí (7a,16a,17p)-3,3-dimethoxy-7,16-dímethyl-17-(1- ropynyl)estr - 5(10) -en-17-olu. K roztoku posledně uvedené sloučeniny (2,86 mmol) v 25 ml ethanolu byl přidán roztok kyseliny šťavelové (72 mg, 0,57 mmol) v 6 ml • · · · • ·

- 17 vody a reakční směs byla míchána 45 minut při teplotě místnosti. Přidán byl roztok nasyceného hydrogenuhličitanu sodného a byla provedena extrakce ethylacetátem. Organická vrstva byla promyta solným roztokem, vysušena síranem sodným a odpařena do sucha. Sloupcová chromatografie za použití soustavy heptan/ethylacetát (9/1, % obj./obj.) jako eluentu poskytla 7a,(16a-17p)-7,16-dimethyl-17-hydroxy-17-(1-propynyl)estr-5(10)-en-3-on (940 mg, 97% výtěžek).

Do suspenze terciárního butoxidu draselného (470 mg, 4,2 mmol) v 31 ml vysušeného toluenu byl pod dusíkovou atmosférou přidán bromid methyltrifenylfosfonia (1,7 g, 4,7 mmol). Reakční směs byla míchána 45 minut při teplotě refluxu (varu pod zpětným chladičem). Poté byla reakční směs ochlazena na 4 °C a v průběhu přibližně 10 minut byl přidán roztok (7a,16a-17p)-7,16-dimethyl-17-hydroxy-17-(1-propynyl)estr-5(10)-en-3-onu (940 mg, 2,76 mmol) v 39 ml vysušeného toluenu.

Reakční směs byla míchána 20 minut při teplotě 4 °C, poté byl přidán zředěný chlorid sodný a byla provedena extrakce ethylacetátem. Organická vrstva byla promyta solným roztokem, vysušena síranem sodným a odpařena do sucha. Sloupcová chromatografie za použití soustavy heptan/ethylacetát (95/5, % obj./obj.) jako eluentu poskytla (7a,,16a,17p)-7,16-dimethyl-3-methylen-17-(1-propynyl)estr -5(10) - en -17-ol (630 mg, 67% výtěžek) v podobě oleje. Produkt byl vymražen z dioxanu. [a]_D +83 ⁰ (c 0,15 v ethanolu).

Příklad 10

Syntéza (7α,16α,17β)-16-ethyl-7-methyl-3-methylen-17-(1-propynyl)estr-5(10)-en-17-olu • · · · • ·

Tato sloučenina byla vyrobena podle metod popsaných dříve za použití (7a)-3,3-dimethoxy-7-methylestr-5(10)-en-17-onu a ethyljodidu jako výchozích sloučenin; [<x]_D +54 ° (c 0,13 v ethanolu).

Příklad 11

Syntéza (7a,17p)-7-methyl-3-methylen-17-(1-propynyl)estr-5(10)-en-17-olu

Tato sloučenina byla vyrobena podle metod popsaných dříve, za použití (7a)-3,3-dimethoxy-7-methylestr-5(10)-en-17-onu jako výchozí sloučeniny; [a]_D +80 ° (c 0,14 v ethanolu).

Příklad 12

Syntéza (7α,16β,17p)-16-ethyl-7-methyl-3-methylen-19-norpregn-5(10)-en-20-yn-17-olu

Tato sloučenina byla vyrobena podle metody popsané dříve, za použití (7a)-3,3-dimethoxy-7-methylestr-5(10)-en-17-onu jako výchozí sloučeniny; [a]_D +94 ° (c 0,10 v ethanolu).

Příklad 13

Výroba (7a)-3-methylen-7-methylestr-5(10)-enu

K suspenzi (7a)-3,3-dimethoxy-7-methylestr-5(10)-en-17-onu (1 g, 3 mmol) v 17 ml diethylenglykolu byly při teplotě místnosti a pod dusíkovou atmosférou přidány hydroxid draselný (1,5 g, 27 mmol) a monohydrát hydrazinu (3 ml, 62 mmol). Reakční směs byla zahřívána 1 hodinu na 130 °C a následně 1 hodinu a 15 minut na 230 °C. K • · · · • · • ·

- 19 odstranění vody a přebytku hydrazinu byl použit Dean-Starkův lapač. Reakční směs byla ochlazena na teplotu místnosti a poté byla přidána voda a směs byla extrahována ethylacetátem. Organická vrstva byla promyta solným roztokem, vysušena síranem sodným a odpařena do sucha k poskytnutí surového produktu (7a)-3,3-dimethoxy-7-methylestr-5(10)-enu, který byl převeden na (7a,16a,17p)-7,16-dimethyl-3methylen-17-(1-propynyl)estr-5(10)-en-17-ol podle postupů popsaných výše, přičemž teplota tání byla 57 °C.

Příklad 14

Výroba O-methyloximu (7a)-3-methylen-7-methylestr-5(10)en-17-onu (7a)-3,3-dimethoxy-7-methylestr-5(10)-en-17-on (100 mg, 0,3 mmol) byl přidán k roztoku methoxylaminu.HCI (100 mg, 1,2 mmol) a octanu sodného (123 mg, 1,5 mmol) v 6 ml MeOH (methylalkoholu). Reakční směs byla míchána po dobu 3 dnů při teplotě místnosti. Poté byly přidány voda a roztok nasyceného hydrogenuhličitanu sodného a byla provedena extrakce ethylacetátem. Organická vrstva byla promyta solným roztokem, vysušena síranem sodným a odpařena do sucha k poskytnutí surového O-methyloximu (7a)-3,3-dimethoxy- 7-methylestr-5(10)-en-17-onu, který byl převeden na methyloxim (7a)-3-methylen-7-methylestr-5(10)-en-17-onu dříve popsanými způsoby; [ct]_D +149 ⁰ (c 0,11 v ethanolu).

Příklad 15

Syntéza oximu (7a)-3-methylen-7-methylestr-5(10)-en-17-onu • · · « · · · · · · · · « · · · » • · · · ♦ · ·

Tento oxim byl vyroben z (7a)-3,3-dimethoxy-7-methylestr-5(10)-en-17-onu a hydroxylaminu.HCI způsoby, které byly popsány dříve; teplota tání byla 149 °C.

Příklad 16

Reakce přecitlivělosti opožděného typu (DTH)

Použity byly skupiny 8 myších samic kmene Balb/c (Harlan, Zeist, Holandsko), ve stáří na počátku pokusu přibližně 8 týdnů. Tyto myši byly ustájeny v macrolonových klecích za standardních podmínek a před počátkem pokusu byly ponechány aklimatizovat po dobu 3 až 5 dnů. Jednotlivé skupiny obdržely buď testovanou sloučeninu nebo placebo.

Myši byly zváženy v den 1 a v poslední den aplikace. Zvířatům byla jednou denně aplikována podkožní (s.c.) injekcí do zadní strany krku nebo orální sondou od dne 1 do dne 11 testovaná sloučenina v koncentračním rozmezí 1,2; 3; 4; 6 a 12 mg/kg. Injikovaný objem činil 0,1 ml vehikula pro injekce, sestávajícího z fyziologického roztoku, který obsahoval 0,5% želatinu a 5% mannitol. Do každého pokusu byla zahrnuta skupina, která byla ovlivňována placebem (aplikováno pouze vehikulum) a skupina, která byla ovlivňována dexamethasonem v koncentraci 4 mg/kg jako srovnávací sloučeninou.

V den 2 byla zvířata imunizována 0,1 ml stálé suspenze 3,75 Lf antigenu tetanového toxoidu (TT od firmy RIVM, Zeist, Holandsko) v roztoku 1 mg/ml bromidu dimethyldioktadecylamonia (DDA) ze separační fáze, intradermálně na dvou místech v oblasti hrudi. V den 9 byla zvířata stimulována na vnitřní straně pravé [R] tlapky 0,05 ml roztoku, obsahujícího 50 Lf (flokulační jednotky) tetanového toxoidu a 1 mg hydroxidu hlinitého/ml. Levá [L] zadní noha (kontrola) byla injikována pouze vehikulem s obsahem hydroxidu hlinitého. Po uplynutí 24 a 48 hodin byly měřeny tloušťky levé a pravé zadní nohy (parametry L a R) za pomoci hustoměru v milimetrech a antigenně specifický otok zadní nohy byl vypočítán podle vzorce: [(R-L)/L] x 100 %.

Výsledky:

Sloučenina

Množství sloučeniny podávané sc.v mg/kg, vedoucí k 50% snížení reakce DTH oproti placebu

Příklad 1 Příklad 2 Příklad 3 Příklad 4 Příklad 5 Příklad 7

Příklad 17 >20

Nikoliv obézní diabetické (NOD) myši

Použité NOD myši byly bud’ chovány v domku (chovné páry původně získané od firmy Hattory, Boston, USA, v generaci 58) nebo byly získány od firmy Bomholtgard (Dánsko) ve věku 6 až 7 týdnů.

Pro stanovení účinků sloučenin na vývoj spontánní sialoadenitidy, charakterizované infiltrací leukocytů do podčelistních žláz, byly použity pouze myší samice.

Skupiny 6 až 8 myších samic byly ustájeny za standardních podmínek a ovlivňovány jednou denně (buď podkožně nebo orálně) od

- 22 • · · ·

8. týdne do 14. týdne nebo 20. týdne věku 0,1 ml sloučeniny (koncentrace 1,2; 4 nebo 12 mg/kg/den) nebo placebem (pouze vehikulum), nebo nebyly ovlivňovány vůbec. Od 12. týdne dále byly jednou týdně testovány vzhledem k přítomnosti glukózy v moči (Diabur-test 5 000, Boehringer, Mannheim).

V 8. týdnu (skupina předléčení) nebo v týdnu 14. či 20., po 6 respektive 12 týdnech ovlivňování, byla zvířata usmrcena pod etherovou anestezí; byly jim odejmuty orgány, zbaveny tuku a zváženy. Podčelistní žlázy byly fixovány v soustavě sublimát-formol po dobu 18 až 24 hodin a poté byly převedeny do 70% alkoholu. Tkáňové řezy byly zality do parafínu a obarveny standardními postupy. Hodnocení tkáňových řezů vzhledem k infiltrátům bylo provedeno mikroskopicky dvěma nezávislými hodnotícími za použití standardních metod. V tomto testu je možné prokázat aktivitu sloučenin podle předkládaného vynálezu.

Příklad 18

Kolagenní arhtritis

Myší samice DBA-1J/BOM byly získány od firmy Bomholtgárd, Dánsko. Veškerá zvířata byla ustájena za standardních podmínek a ponechána aklimatizovat po dobu alespoň 7 dní.

Ve věku 10 až 12 týdnů byla veškerá zvířata intradermálně imunizována na kořeni ocasu dávkou 100 μg emulze vyčištěného hovězího kolagenu typu II [C2] (2 mg/ml v 0,05% kyselině octové), emulgované ve stejných objemech kompletního Freundova adjuvans (CFA, obsahujícího 4 mg/ml MT H37Ra, Difco Laboratories, Detroit, USA). 21 dnů po imunizaci byla podávána intraperitoneálně (do břišní dutiny) zesilující injekce 100 μg Cil, rozpuštěného ve fyziologickém

- 23 • · · · • · • · · · · • · ♦ · · * · • · · · · · • · · · · ··· · · · ·· · roztoku. Léčba byla podávána jednou denně počínaje dnem 1 (den před imunizací) až do autopsie v den 44.

Skupiny sestávající z 9 až 10 zvířat byly léčeny buď testovanou sloučeninou (1 mg/kg/den až do dne 22, a od tohoto dne pouze 3x týdně), nebo cyklosporinem A (nejprve 100 mg/kg/den a od dne 4 dávkou 20 mg/kg), nebo dexamethasonem (2 mg/kg/den), nebo vehikulem (5% Mulfogen (EL 719, GAF) ve fyziologickém roztoku). Zahrnuta byla také neléčená kontrolní skupina.

Myši byly váženy každý týden a aktivita klinické arthritidy (vizuální vzhled arhtritidy na periferních kloubech) byla hodnocena (standardními metodami) jedním hodnotícím, který nebyl informovaný o poskytované léčbě, od dne 19 dále v intervalu dvou až tří dnů až do autopsie v den 44. Klinická arthritida se stupňovala v rozsahu 0 až 2 na tlapku a je vyjádřena jako souhrnné hodnocení arthritidy u jedné myši s maximálním hodnocením rovným 8. Na konci pokusu byly klouby kolena a kotníku izolovány a použity k rentgenové analýze jako markéry narušení kosti a následně byly ihned fixovány ve 4% formaldehydu pro histologické testování.

Rentgenogramy byly pečlivě zkoumány za použití stereomikroskopu a narušení kostí kloubu bylo hodnoceno v rozsahu 0 až 5 standardními metodami/zatříděním od žádného poškození k úplné destrukci. V tomto testu může být prokázána aktivita sloučenin podle předkládaného vynálezu.

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. 3-methylensteroidový derivát obecného vzorce 1

-R4 (1) kde

R¹ je H nebo společně s R³ vytváří β-epoxid nebo R¹ je nepřítomen, pokud zde existuje dvojitá vazba v poloze 5-10 nebo 4-5;

R² je g až C₅ alkyl nebo CF₃;

R³ je βΗ, βΟΗ₃ nebo společně s R¹ vytváří β-epoxid nebo R³ je nepřítomen, pokud zde existuje dvojitá vazba v poloze 5-10;

R⁴ je H, nižší alkyl;

Y je [Η, H] [OH, H], =O,[OH, nižší alkyl], [OH, C₂ až C₅ alkenyl], [OH, C₂až C₅ alkynyl] nebo C₁ až C₆ alkyliden, přičemž uvedený alkyl, alkenyl, alkynyl a alkyliden je volitelně halogenovaný; nebo =NOR⁵, přičemž R⁵je H, nižší alkyl;

čárkovaně nakreslené přímky představují volitelnou dvojnou vazbu; nebo prekursor takové látky, s tou výhradou, že 3-methylensteroidovým derivátem není žádný ze skupiny, zahrnující (7α,17β)-7α-ιτιβίΙ^Ι-3-ηΊβίΙ^Ιβη-4-β5ίΓθη-17-οΙ, (7α, 17a)-7-methyl-3-methylen-19-norpregn-4-en-17-ol, (7a,17a)-7-methyl-3-methylen-19,21-dinorpregn-4-en-17-ol, (7a)-17-keto-7-methyl-3-methylen-4-estren, (7a,17a)-7-methyl-3-methylen-19-norpregn-4-en-20-yn-17-ol, ^-hydroxy-7a-methyl-3-methylen-17a-propen-2-yl-4-estren a

17β-hydroxy-7α-methyl-3-methylen-17α-buten-2-yl-4-estren.

- 25 • 4 » 4
2. 3-methylensteroidový derivát podle nároku 1, který vykazuje dvojnou vazbu v polohách 5-10 a R¹ a R³ nejsou přítomné.
3. 3-methylensteroidový derivát (7a,17a)-7-methyl-3-methylen-19-norpregn-5(10)-en-20-yn-17-ol.
4. 3-methylensteroidový derivát podle kteréhokoliv z nároků 1 až 3, pro použití jako léčivo.
5. Farmaceutický prostředek vyznačující se tím, že obsahuje 3-methylensteroidový derivát podle nároků 1 až 3, nebo farmaceuticky přijatelnou sůl či solvát takové sloučeniny ve směsi s farmaceuticky přijatelnou pomocnou látkou.
6. Použití 3-methylensteroidového derivátu obecného vzorce 1 (1) kde

R¹ je H nebo společně s R³ vytváří β-epoxid nebo R¹ je nepřítomen, pokud zde existuje dvojitá vazba v poloze 5-10 nebo 4-5;

R² je C! až C₅ alkyl nebo CF₃;

R³ je βΗ, βΟΗ₃ nebo společně s R¹ vytváří β-epoxid nebo R³ je nepřítomen, pokud zde existuje dvojitá vazba v poloze 5-10;

R⁴ je H, nižší alkyl;

Y je [Η, H] [OH, H], =O,[OH, nižší alkyl], [OH, C₂ až C₅ alkenyl], [OH, C₂až C₅ alkynyl] nebo C₁ až C₆ alkyliden, přičemž uvedený alkyl, alkenyl, • · • · « · • » • · ·

- 26 alkynyl a alkyliden je volitelně halogenovaný; nebo =NOR⁵, přičemž R⁵je H, nižší alkyl;

čárkovaně nakreslené přímky představují volitelnou dvojnou vazbu; nebo prekursor takové látky, pro přípravu léčiva k léčbě a/nebo profylaxi arthritických onemocnění a/nebo autoimunitních onemocnění.
7. Způsob léčby a/nebo prevence arthritických onemocnění a/nebo autoimunitních onemocnění podáváním 3-methylensteroidového derivátu jak byl definován v nároku 6, pacientu, který potřebuje uvedenou léčbu nebo prevenci.

Zastupuje: