CZ20021697A3 - Farmaceutický přípravek obsahující aplidin pro léčení rakovinových onemocnění - Google Patents

Description

i ?/z<?0z-yw

Farmaceutický přípravek obsahující aplidin pro léčení rakovinových onemocnění

Oblast techniky

Předložený vynález se týká použití aplidinu pro přípravu farmaceutického přípravku pro léčení rakovinových onemocnění.

Dosavadní stav techniky

Rakovinové onemocnění zahrnuje skupinu maligních novotvarů, které lze rozdělit do dvou kategorií, karcinomy, které zahrnují většinu případů pozorovaných na klinikách a další, méně častá rakovinová onemocnění, která zahrnují leukémii, lymfom, nádory centrálního nervového systému a sarkom.

Karcinomy mají svůj původ v epitelových tkáních, zatímco sarkomy se vyvíjejí v pojivové tkáni a těch strukturách, jež mají původ v mezodermálních tkáních. Sarkomy mohou zachvátit například sval nebo kost a objevují se v kostech, močovém měchýři, ledvinách, játrech, plících, příušní žláze nebo slezině.

Rakovina je invazivní a má tendenci metastázovat do nových míst. Rozšiřuje se přímo do okolních tkání a také se může šířit prostřednictvím lymfatických a oběhových systémů. Na rakovinu jsou k dispozici mnohé léčebné postupy, v to zahrnujíc operační zákrok a radiační působení u lokalizovaného onemocnění a léčiva. Avšak účinnost léčebných postupů, které jsou na různé typy rakoviny k dispozici, je omezená, a tak jsou žádoucí zlepšené formy léčení, které přinášejí klinický prospěch. To je obzvláště pravdivé u těch pacientů, kteří jsou v pokročilém a/nebo metastázujícím stavu nemoci. Totéž platí pro pacienty, u kterých došlo s postupující nemocí k opětovnému zhoršení zdravotního stavu poté, co již dříve byli léčeni zavedenými terapiemi a pro které je další léčení stejnou terapií většinou

44

4 4 4

4 4

4 4

4·4 •φ 44«4

4« ·♦««

4

4 4 4

4444

4 neúčinné v důsledku získání rezistence nebo v důsledku omezení podávání léčivých látek vzhledem k jejich doprovodným toxicitám.

Chemoterapie hraje důležitou roli v léčbě rakoviny, neboť je vyžadována pro léčbu pokročilých karcinomů věštících metastázi a často napomáhá zmenšení nádoru před operací, přičemž bylo vyvinuto mnoho protirakovinových léčiv založených na různých způsobech účinku.

Dehydrodidemnin B, nyní známý jako aplidin, je předmětem WO 91/04985.

Další informace o aplidinu jsou například v pracech

Jimeno J., Využití mořských mikroorganismů a bezobratlých: Protinádorová léčiva mořského původu (Exploitation of marine microorganisms and invertebrates: Anticancer drugs from marine origin), IBC Conf Discov Drugs from Nat Novel Approaches New Sources, 8. až 9. prosince 1994, Londýn 1994,

Faircloth G. et al., Dehydrodidemnin B (DDM), nové protirakovinové činidlo mořského původu (MDA) účinné na experimentální nádorové modely (Dehydrodidemnin B (DDM) a new marine derived anticancer agent (MDA) with activity against experimental tumour models), 9. NCI-EORTC Symp New Drugs Cancer Ther, 12. až 15. března 1996, abstrakt 111, Amsterodam 1996,

Sakai R. et al., Vztah mezi strukturou a aktivitou didemninů (Structure-activity relationships of the didemnins), Journal of Medicinal Chemistry 39 (14), 2819(1996),

Urdiales J. L. et al., Antiproliferační účinek dehydrodidemninu B (DDB), depsipeptidu izolovaného z pláštěnců Středozemního moře (Antiproliferative effect of dehydrodidemnin B (DDB), a depsipeptide isolated from Mediterranean tunicates), Cancer Letters 102 (1-2), 31 (1996),

Faircloth G. et al., Preklinická charakterizace aplidinu (APD), nového protirakovinového depsipeptidu mořského původu (MADEP) (Preclinical φφ ·φφφ

I Φ · φφ φφ φ φ φ φ • φ *

ΦΦΦ • φ φ φ· «ΦΦΦ characterization of aplidine (APD), a new marine anticancer depsipeptide (MADEP)), Proč. Amer. Assoc. Cancer Res 38, 1997, abstrakt 692,

Depenbrock H. et al., In vitro aktivita aplidinu, nové protirakovinové sloučeniny mořského původu, na explantované klonogenní lidské nádorové buňky a krvetvorné prekurzorové buňky (In vitro activity of aplidine, a new marine-derived anti-cancer compound, on freshly explanted clonogenic human tumour cells and haematopoietic precursor cells), British Journal of Cancer 78 (6), 739 (1998),

Faircloth G. et al., Aplidin (aplidin) je nový depsipeptid mořského původu s protinádorovou aktivitou in vivo (Aplidine (aplidine) is a novel marine-derived depsipeptide with in vivo antitumour activity), Proč Amer Assoc Cancer Res 39, 1998, abstrakt 1551,

Faircloth G. et al., Preklinické využití aplidinu, nového činidla mořského původu, které má silný protinádorový účinek (Preclinical development of aplidine, a novel marine-derived agent with potent antitumour activity), 10. NCI-EORTC Symp New Drugs Cancer Ther (16. až 19. června 1998, Amsterodam), abstrakt 129,

Mastbergen S. C. et al., Cytotoxicita a neurocytotoxicita aplidinu, nového protirakovinového činidla mořského původu, vyhodnocená pomocí testů in vitro (Cytotoxicity and neurocytotoxicity of aplidine, a new marine anticancer agent evaluated using in vitro assays), 10. NCI-EORTC Symp New Drugs Cancer Ther (16. až 19. června 1998, Amsterodam), abstrakt 131.

Při preklinických studiích měl aplidin na dávce závislý cytotoxický účinek na dvě epitelovité buněčné linie, CT-1 a CT-2 a buněčnou linii HT-29 rakoviny trakčníku u lidí. Nejproliferativnější linie CT-2 byla na aplidin nejcitlivější. Navíc tato sloučenina snižovala omitindekarboxylázovou aktivitu u všech tří buněčných linií (Lobo C., Garcia-Pozo S. G. et al., Vliv dehydrodidemninu B na buněčné linie ···· rakoviny trakčníku u lidí (Effect of dehydrodidemnin B on human colon carcinoma cell lineš), Anticancer Research 17, 333 až 336, leden až únor 1997). V podobné studii 50 nM aplidin inhiboval růst buněčných linií u rakoviny prsu, MDA-MB231 a MCF-7, a to v uvedeném pořadí ze 17 % a 47 %. V buňkách, na něž se působilo, byl pozorován významný nárůst spermidinu a sperminu (Gomez-Fabre P. M., De Pedro E. et al., Obsahy polyaminu v lidských rakovinových buňkách při rakovině prsu, na které se působilo cytotoxickými činidly chlorfeniraminem a dehydrodidemninem B (Polyamine contents of human breast cancer cells treated with the cytotoxic agents chlorpheniramine and dehydrodidemnin B), Cancer Letters 113, 141 až 144, 26. února 1997)). Průtoková cytometrická analýza prokázala, že aplidin neindukoval žádné zřejmé perturbace buněčného cyklu (Erba E., Balconi G. et al., Perturbace fází buněčného cyklu indukované novými přírodními sloučeninami mořského původu (Cell cycle phases perturbations induced by new natural marine compounds), Annals of Oncology 7 (dodatek 1), 82 (1996)). U myší byl aplidin účinný vůči implantovanému leukemickému P388 a melanomu B16, s optimální dávkou 160 pg/kg. Na rozdíl od didemninu B byl aplidin účinný vůči subklavikulámě implantovaným lewisovským plicním karcinomům (Faircloth G., Rinehart K. et al., Dehydrodidemnin B, nové protirakovinové Činidlo mořského původu, které působí na experimentální modely nádorů (Dehydrodidemnin B a new marine derived anticancer agent with activity against experimental tumour models), Annals of Oncology 7 (dodatek 1), 34 (1996)).

Nepřetržitá expozice nízkým koncentracím aplidinu inhibovala růst mnoha nádorových buněčných linií, v to zahrnujíc nehodgkinský lymfom, melanom a rakovinu prsu, karcinomy vaječníků a nemalobuněčné plicní karcinomy. Velikost účinku byla závislá na době expozice a účinek byl dosažitelný při koncentracích, které nebyly myelotoxické. Buněčné linie nemalobuněčného plicního karcinomu, • 4 ♦ ·

444 444 »44

4 * · · · 4

4··· rakoviny prsu a melanomu byly citlivé na nepřetržitou expozici aplidinu v koncentracích větších nebo rovných 0,001 μηιοί/ΐ. Aplidin má podobnou toxicitu jako doxorubicin vůči klonogenním krvetvorným stemálním buňkám (Depenbrock H., Peter R. et al., In vitro aktivita aplidinu, nové protirakovinové sloučeniny mořského původu, na čerstvě explantované klonogenní lidské nádorové buňky a krvetvorné prekurzorové buňky (In vitro activity of aplidine, a new marine-derived anti-cancer compound, on freshly explanted clonogenic human tumour cells and haematopoietic precursor cells), British Journal of Cancer 78 (6), 739 až 744 (září 1998).

Aplidin má významný účinek na lidské rakovinové xenoimplantáty implantované myším. Při maximální tolerované dávce 2,1 mg/kg vyvolal aplidin téměř úplné vymizení projevů nemoci u některých zvířat s poměrem léčených ku kontrolním (T/C) zvířatům rovným 9 %. Při koncentraci 1,25 mg/kg byl pozorovatelný významný účinek na žaludeční nádory (T/C je 14 %) a byla také pozorována inhibice růstu nádoru prostaty (T/C je 25 %), (Faircloth G., Grant W. et al., Preklinické využití aplidinu, nového činidla mořského původu, které má silný protinádorový účinek (Preclinical development of aplidine, a novel marinederived agent with potent antitumour activity), Annals of Oncology 9 (dodatek 2), 34(1998)).

Podstata vynálezu

Předložený vynález se týká použití aplidinu pro přípravu farmaceutického přípravku pro léčení jakéhokoliv savce, zejména člověka, který je postižen rakovinovým onemocněním, přičemž farmaceutický přípravek je podán tak, aby ·4 • 4 ’

9 · ·

44««

4 ·«· 4·· bylo podáno terapeuticky účinné množství aplidinu postiženému jednotlivci.

Předložený vynález se také týká farmaceutických přípravků, které obsahují jako aktivní složku aplidin, stejně jako postupů pro jejich přípravu.

Příklady farmaceutických přípravků zahrnují kapalinu (roztoky, suspenze nebo emulze) o vhodném složení pro nitrožilní podání a tyto přípravky mohou obsahovat čistou látku nebo její kombinaci s jakýmkoliv nosičem nebo jinými farmakologicky aktivními látkami.

Podávání sloučenin nebo přípravků předloženého vynálezu je založeno na dávkovacím protokolu, s výhodou nitrožilní infuzí. Zvýhodněné je, když se použijí infuzní doby do 72 hodin, výhodněji 1 až 24 hodin, nejvýhodněji je to 1 hodina, 3 hodiny nebo 24 hodin. Zvláště žádoucí jsou krátké doby infuze, které umožňují provést působení bez pobytu v nemocnici přes noc. Avšak infuze může trvat 24 hodin nebo dokonce déle, je-li to požadováno. Infuzi lze provádět ve vhodných intervalech podle různých plánů, ilustrativně jednou týdně, dvakrát týdně nebo i častěji v týdnu, opakovaně každý týden, případně s typicky jednotýdenními přestávkami. Další návod je uveden v tomto textu dále.

Správné dávkování sloučeniny se bude různit podle konkrétního přípravku, způsobu aplikace a konkrétní polohy, léčeného hostitele a nádoru. Do úvahy budou vzaty další faktory jako věk, tělesná hmotnost, pohlaví, výživa, doba podávání, rychlost vylučování, stav hostitele, kombinace léčiv, odezvové citlivosti a závažnost onemocnění. Podávání lze provádět kontinuálně nebo periodicky s nejvyšší snesitelnou dávkou.

Sloučeninu aplidin a přípravky tohoto vynálezu lze použít s dalšími léčivy, aby byla získána kombinovaná terapie. Další léčiva mohou tvořit část stejného **·

•		·»	• 9*9		99	«9
•	99	9	•	•	9	*	9
		•	9	• 9 ·	9	9
9		•	9	9	9	9	9
	9·«	9 9	• 99		99	9ť*9

čase. Identita tohoto dalšího léčiva není konkrétně omezena a vhodní kandidáti zahrnují

a) léčiva s antimitotickými účinky, konkrétně ta, jejichž cílovým místem jsou cytoskeletální prvky, v to zahrnujíc mikrotubulámí modulátory jako taxanová léčiva (jako taxol, paclitaxel, taxotere, docetaxel), podofylotoxiny nebo Vinca alkaloidy (vincristin, vinblastin),

b) antimetabolitová léčiva (jako 5-fluorouracil, cytarabin, gemcitabin, purinové analogy jako pentostatin, methotrexat),

c) alkylační činidla nebo dusíkaté yperity (jako nitrosomočoviny, cyklofosfamid nebo ifosfamid),

d) léčiva, jejichž cílem působení je DNA, jako antracyklinová léčiva adriamycin, doxorubicin, farmorubicin nebo epirubicin,

e) léčiva, jejichž cílem působení jsou topoizomerázy, jako etoposid,

f) hormony a agonisté nebo antagonisté hormonů jako estrogeny, antiestrogeny (tamoxifen a příbuzné sloučeniny) a androgeny, flutamid, leuprorelin, goserelin, cyproteron nebo octreotid,

g) léčiva, jejichž cílem působení je přenos signálu v nádorových buňkách, v to zahrnujíc deriváty protilátek jako je herceptin,

h) alkylační činidla jako léčiva s platinou (cis-platina, karboplatina, oxaliplatina, paraplidineatin) nebo nitrosomočoviny,

i) léčiva potenciálně ovlivňující metastázu nádorů jako inhibitory matrixových metaloproteináz,

j) činidla pro genovou terapii a znecitlivující činidla,

k) protilátková terapeutika,

l) další bioaktivní látky mořského původu, zvláště kahalalid F nebo ecteinascidiny jako et-743,

m) protektory kosterního svalstva jako kamitinové doplňky, • 9 9999 • 9 9 • · 999 • · 9 • · · • 9 ··· • 9C· • · • 9 99 • 9 9 · • · 9

9·

9 9

9· 9999

9 9 ·· 999

o) další léčiva, která působí proti vedlejším účinkům aplidinu, jako jsou antiemetika,

p) obecněji léčiva, která umožňují, aby se aplidin dávkoval v doporučené dávce a která kontrolují toxicitu.

Předkladatelé dále zjistili, že aplidin mhibuje expresi genu (FLT1) kódujícího receptor vaskulámího endoteliálního růstového faktoru (VEGF). Aplidin navíc silně inhibuje produkci samotného proteinu VEGF nádorovými buňkami.

Vylučování VEGF buněčnou hmotou, konkrétně nádorovou buněčnou hmotou, způsobuje vaskularizaci de novo (angiogenezi), která vede k novým krevním cévám vytvářeným k buněčné hmotě a která utváří síť kapilár, kteráje schopna ji opatřit prokrvením pro její další proliferaci. O těchto účincích, konkrétně demonstrovaném zabránění produkce VEGF nádorovými buňkami, se předpokládá, že značně omezí schopnost nádorových buněk pokračovat v angiogenezi. Navíc VEGF je jako růstový faktor vyžadován přímo některými krvetvornými nádorovými buňkami (jako jsou lidské leukemické buňky

MOLT-4).

O aplidinu se tak předpokládá, že má inhibiční účinek na de novo vaskularizaci rostoucích primárních nádorů nebo metastáz, a proto inhibuje růst nádorů, o nichž je známo, že pro růst vyžadují vaskularizaci. Aplidin by měl být také účinný na nádory krvetvorné tkáně.

O aplidinu je navíc známo, že moduluje funkci vápníkových kanálků v buňkách.

Nádory močového měchýře jsou jedním typem nádoru, který nadměrně vylučuje receptor pro epiteliální růstový faktor (EGF), což vede ke zvyšování VEGF a receptoru VEGF. Navázání VEGF na jeho receptor vede mezi jinými mechanismy signalizace i ke stimulaci růstu buňky prostřednictvím přechodných

místních změn iontu vápníku. O látce, která inhibuje účinek VEGF se předpokládá, že inhibuje i tyto nádory.

O aplidinu bylo experimentálně zjištěno, že má v souladu s předpovědí neobyčejně vysoký vliv na rakovinu močového měchýře u člověka (za úplného vymizení u některých modelových pokusech se zvířaty).

O aplidinu se předpokládá, že má vzhledem ke svým účinkům na velké množství nádorů široké spektrum protinádorových účinků.

Účinek VEGF je důležitější, neboť zahrnuje inhibici nových krevních cév. Některé nádory navíc k účinkům na krevní cévy vyžadují VEGF přímo pro růst buňky (to je u leukémie, lymfomů, nádorům močového měchýře a nádorů vaječníků).

Proto je tak popsán způsob léčení angiogenního stavu, kterýžto způsob zahrnuje podávání aplidinu. Konkrétně je popsán způsob léčení nádoru, který je závislý na angiogenním procesu. Vynález se dále týká procesu přípravy inhibitoru angiogeneze, inhibitoru invaze rakovinou nebo rakovinových metastáz a zahrnuje smíchání účinné dávky aplidinu s farmaceuticky přijatelným nosičem.

Také je popsán způsob léčení s angiogenezí spojených nenádorových poruch jako je retinopatie.

Konkrétně se předpokládají způsoby léčení poruch angiogeneze jako je neoplazie zahrnující metastázy, oční stavy jako je odmítnutí štěpu rohovkou, oční neovaskularizace, retinální neovaskularizace, diabetická retinopatie, retrolentální fíbroplazie a neovaskulámí glaukom, vředovitá onemocnění jako je žaludeční vřed a další stavy jako jsou infantilní hemangiomy, angiofibrom nosohltanu a avaskulámí nekróza kosti a poruchy ženského reprodukčního systému jako je endometrióza.

Při klinických pokusech s aplidinem byly u pacientů s rakovinou pozorovány odezvy, které prokázaly užitečnost tohoto způsobu léčení.

• · · · • · • · • · • ·

Klinické studie fáze I a farmakokinetická analýza ukazují, že aplidin představuje pozitivní terapeutický prostředek s přijatelnou toxicitou v rozmezí dávkování požadovaného pro klinickou účinnost při léčení pacientů s rakovinou.

Způsob se skládá z podávání léčiva nitrožilni infúzí po dobu 72 hodin nebo dobu menší, s doporučenou úrovní dávky (RD) společně s nebo bez kombinace s jinými terapeutickými činidly.

Aplidin se dodává a skladuje jako sterilní, lyofílizovaný výrobek, který obsahuje aplidin a excipient v přípravku vhodném pro terapeutické použití.

Solubilizovaný aplidin podléhá za podmínek testování tepelnou a světelnou zátěží značnému rozkladu, a tak byla vyvinuta lyofílizovaná forma, viz WO 99/42125, zde zahrnutému v odkazech. V obecně zvýhodněném provedení vynálezu byla lyofílizace provedena z 500 mg/1 roztoku aplidinu ve 40% (v/v) řerc-butanolu ve vodě pro injekci (Wfl) obsahující 25 mg/ml D-mannitolu jako plnícího činidla. V klinických studiích byl jako optimální přípravek nalezen prototyp obsahující 500 mg aplidinu a 25 mg D-mannitolu jako plnícího činidla na vialku, a to stran rozpustnosti, délky lyofílizačního cyklu a požadavků na dávkování. Optimálním zjištěným rekonstitučním roztokem je 15% / 15% / 70% (v/v/v) Cremaphor EL / ethanol / Wfl (CEW). Jak rekonstituční produkt, tak jeho normálním fyziologickým roztokem zředěné formy rekonstitučního produktu (do 1 : 100, v/v) byly stálé alespoň 24 hodin po přípravě. Údaje o skladování, jež jsou dosud k dispozici, ukazují, že přípravek je stálý alespoň 1 rok, když je skladován při 4 °C v temnu.

Přípravek infuzního roztoku se také vyrobí za aseptických podmínek vytažením objemu rekonstitučního roztoku odpovídajícího dávce vypočtené pro každého pacienta a pomalým injikováním požadovaného objemu rekonstitučního roztoku do infuzního vaku nebo lahve obsahující 100 až 1000 ml 0,9% chloridu sodného, po kterém se vše pomalým ručním třepáním zhomogenizuje. Infúzní

·· ·· ♦ · · · • · · • · · • · · • · · · · · roztok s aplidinem by se měl podávat nitrožilně co nejdříve je to možné, do 48 hodin od přípravy. Zvýhodněné zásobníkové a přívodní materiály jsou infuzní systémy z PVC a polyethylenu, stejně jako z čirého skla.

Podávání se provádí v cyklech, přičemž ve zvýhodněném způsobu podávání se pacientům v prvém týdnu každého cyklu podá nitrožilní infuze aplidinu a pacienti se po zbytek cyklu ponechají zregenerovat. Zvýhodněné trvání každého cykluje buď 3 nebo 4 týdny, přičemž je-li to třeba, mohou se provádět několikeré cykly. Léčivo lze také podávat každý prvý den každého cyklu. Podle potřeby se provádějí zpoždění dávky a/nebo snížení dávky a úpravy časového plánu, a to v závislosti na toleranci jednotlivých pacientů k léčení, konkrétně jsou doporučeny redukce dávky u pacientů s vyššími než normálními sérovými hladinami jatemích transamináz nebo alkalické fosfatázy nebo bilirubinu.

Doporučená dávka (RD) je nejvyšší dávka, kterou lze bezpečně podat pacientovi a která má tolerovatelnou, zvládnutelnou a reverzibilní toxicitu podle obecného kriteria toxicity zavedeného Národním ústavem pro výzkum rakoviny (National Cancer Institute), USA, s ne více než 2 ze 6 pacientů, u kterých se objeví jakékoliv limitní toxicity dávky (DLT).

Postupy v terapii rakoviny často vyžadují podávání chemoterapeutických činidel v nejvyšší bezpečné dávce, při které je toxicita ještě zvládnutelná, aby se dosáhlo maximální účinnosti (De Vita, V. T. jr., Hellman S. a Rosenberg S. A., Rakovina: Principy a praktické postupy v onkologii (Cancer: Principles and Practice of Oncology), 3. vydání, 1989, Lipincott, Filadelfie).

DLT pro aplidin byly v klinických studiích určeny použitím tohoto způsobu léčení. Tyto studie určily doporučenou hladinu dávky pro různé druhy dávkovačích protokolů.

Aplidin lze bezpečně podávat na dávkové úrovni doporučené dávky (RD) nebo nižší než RD.

• · · · · ·

Zvýhodněným postupem je v současné době infúze, s typickými režimy, které zahrnují následující typy, hodin infúze týdně po mnoho týdnů, obvykle 3 týdny, následované jedním týdnem přestávky, hodin infúze za čtrnáct dnů, hodina infúze týdně po 3 týdny každé 4 týdny, denní infúze 1 hodinu po 5 dnů po 3 týdny a infúze 3 hodiny každý druhý týden.

Konkrétně lze nitrožilní infůzi provádět jako 24hodinovou infuzi jednou týdně po 3 týdny ze 4 týdnů. Více údajů je uvedeno v příkladech 3, 4, 11 a 12. Vhodná je doporučená dávka 3750 pg/m²/týden po 3 týdny. Tento protokol byl doplněn a pacienti budou nyní léčeni použitím různého rozpisu, který je vhodný; 3 hodiny infúze každé 2 týdny bez přestávky. Viz příklad 12. Ve studii s 24 hodinami za čtrnáct dnů se na studované pacienty působí dávkou 7000 pg/m²/2 týdny. Viz příklady 6, 14 a 18. Na pacienty zahrnuté ve studii 1 hodina/týden po 3 týdny každé 4 týdny se působí dávkami do 3600 pg/m²/týden po 3 týdny. Viz příklady 13 a 17.

V jiném postupu zahrnujícím pacienty s denní 1 hodinovou infuzi po 5 dnů každé 3 týdny se na pacienty působí dávkou 1200 pg/m²/den po 5 dní. Když se aplidin použije v kombinaci s dalšími terapeutickými činidly, může být potřeba upravit dávkování obou činidel.

Hlavní biologické odezvy dříve pozorované při podáváni aplidinu byly pozorovány na modelech se zvířaty nebo in vitro, o nichž je známo, že jsou notoricky nepřesné, a to ve vztahu k jejich použitelnosti k předpovězení odezev u lidských pacientů nebo u lidských pacientů při experimentálním uspořádání, kde nebyl k dispozici účinný a bezpečný způsob léčení (buď použité dávkování bylo v toxické dávce významně vyšší než v doporučené dávce nebo rozpis podávání nebyl vhodný).

• · · · *

• · ·

V klinických pokusech s použitím způsobu tohoto vynálezu bylo u pacientů dosaženo vhodných úrovní v plazmě při doporučené dávce a co je nejdůležitější, objektivně měřitelné odezvy poskytly důkaz klinického přínosu pro pacienty.

Definice pro toxicitu vůči pacientům byly přijaty z kritérií WHO a odezvy určeny podle kritérií pro odezvy podle WHO.

U pacientů s pokročilými a/nebo metastázujícími karcinomy, které vzdorovaly předchozím léčením, byly získány objektivní odezvy, jež zahrnovaly ty odezvy, které jsou popsány v příkladech.

Při konkrétním léčení tímto způsobem byly u pacientů s rakovinou v pokročilém a/nebo metastázujícím stavu nemoci prokázány odezvy, které vykazovalo progresivní onemocnění po předchozím léčení zavedenými terapiemi.

Zvýhodněný způsob tohoto vynálezu proto zahrnuje identifikaci pacientů s rakovinou, kteří byli na rakovinu léčeni, konkrétně pacientů, na které se působilo chemoterapeuticky a jejich léčení aplidinem.

Popis obrázků

Obrázek 1 ukazuje pokles exprese fit-1 pozorovaný pomocí techniky microarrays potvrzeného RT-PCR analýzou.

Obrázek 2 ukazuje pokles fit-1 mRNA, indukovaný aplidinem v buňkách MOLT-4.

Obrázky 3a a 3b ukazují VEGF-Flt-1 autokrinní smyčku v buňkách MOLT-4 a účinek aplidinu.

Obrázek 4 ukazuje, že aplidin blokuje vylučování VEGF z buněk MOLT-4.

Obrázek 5 ukazuje aplidinem indukovanou zábranu vylučování VEGF,

Obrázek 6 ukazuje silný pokles hladin mRNA VEGF v buňkách MOLT-4.

Obrázek 7 ukazuje, že aplidin nesnižuje aktivitu promotoru VEGF přeneseného do buněk MOLT-4.

Obrázek 8 ukazuje, že aplidin neblokuje navázání transkripčních faktorů

HIF-1 a AP-1 na jejich společné sekvence DNA, které jsou přítomné v promotoru

VEGF.

Obrázek 9 ukazuje, že aplidin neblokuje navázání transkripčního faktoru HIF-1 na jejich společné sekvence DNA, které jsou přítomné v promotoru VEGF.

Obrázky 10a a 10b ukazují, že VEGF přidaný do kultivačního média buněk MOLT-4 trochu sníží účinek nízkých koncentrací aplidinu, zatímco při vyšších koncentracích je bez účinků.

Obrázek 11 ukazuje, že aplidin je schopný snížit vylučování VEGF u linie IGROV-1 rakoviny vaječníku u lidí.

Obrázek 12 ukazuje, že aplidin snižuje hladiny mRNA VEGF také u linie IGROV-1 rakoviny vaječníku u lidí.

Obrázek 13 ukazuje, že aplidin neovlivňuje promotorovou aktivitu VEGF, měřenou pomocí reportérového genového systému luciferáza/renilla.

Obrázek 14 ukazuje vztah mezi dávkou a AUC.

Obrázky 15a a 15b ukazují účinek na medulámí karcinom štítné žlázy: hladiny CEA.

Příklady provedeni vynálezu

Příklad 1

Profil genové exprese v lidských leukemických buňkách MOLT-4, na které se působilo sloučeninou mořského původu aplidinem

Prvotní změny v genové expresi indukované aplidinem v buňkách MOLT-4 byly vyhodnoceny technikou microarrays pomocí exprese cDNA (Atlas Human Cancer, Clontech). Na buňky MOLT-4 se 1 hodinu působilo koncentracemi aplidinu, které inhibovaly růst z 50 % a veškerá RNA byla izolována v časech 0, 1,

00 • t 0 ·

0

0 0 0

0· 0000

0 0 0 ··· a 24 hodin po vymytí léčiva. Filtry byly hybridizovány stejným množstvím cDNA značené ³²P. Analýza výsledků byla provedena použitím programu ATLAS IMAGE 1.0. Jako významné změny v expresi RNA byly brány změny genové exprese větší než dvojnásobné a tyto byly následně potvrzeny pomocí PCR. Výrazné, na čase závislé snížení exprese VEGF-R1 (fit-1) bylo pozorováno a potvrzeno u hladiny RNA pomocí PCR a u proteinové hladiny pomocí Western blotting.

Příklad 2

Korelace selektivních protinádorových účinků sloučeniny mořského původu aplidinu pomocí různých modelových systémů

K získání základu pro další klinickou práci byly vyhodnoceny různé modelové systémy. Selektivní protinádorové účinky byly zřejmé vůči dvěma histologicky odlišným tvrdým nádorům, žaludečnímu a prostatovému nádoru u bdí. Silný in vitro účinek na primární žaludeční nádorové preparáty nebo žaludeční nádorové buňky Hs746T je v uvedeném pořadí evidentní na IC₅₀ hodnotách 146 a 450 pM. Proti nádorovým buňkám prostaty PC-3 byl zjištěn slabší, ale ne méně selektivní účinek IC50 při 3,4 nM. Účinky in vitro byly vyhodnoceny na holých hlodavcích použitím subkutánně implantovaných nádorových fragmentů nebo dutých vláken (HF) obsahujících nádorové buňky.

Tabulka 1 Optimální dávka a in vivo účinky aplidinu

Nádor	Linie	Režim	Subkutánní model	Zvíře	Dávka (mg/kg)	Účinek (% T/C)
Žaludeční	MRI-	qd9.ip	xenoimplantát	myš	2,1	19%
	-H254				1,05	17%
		q4dx3.ip	xenoimplantát	myš	1,25	18%
		24 hod.iv	HF	krysa	0,7	20%

• ·

		inf.
Prostaty	PC-3	qd9.ip	xenoimplantát	myš	1,25	25 %
					0,62	30%
		q4dx3.ip	xenoimplantát	myš	2,10	34%
					1,05	38%
		24 hod.iv	HF	krysa	0,70	31 %
		inf.	HF	krysa	0,70	33 %
		5 dnů, iv
		inf.

Zkratky v tabulce I. ip == intraperitoneálně, iv = nitrožilně, hod = hodina, inf = infuze, d = den, q = každý

Optimální účinky byly pozorovány u xenoimplantovaných žaludečních (17 až 20 %) a prostatových (25 až 38 %) nádorů po intraperitoneálním podávání. Následné studie si vyžádaly použití krys pro nitrožilní infuze. Rozpis s 24hodinovou nitrožilní infuzí s touto obměnou poskytl podobné účinky na žaludeční (20 %) a prostatové (31 %) nádorové buňky v dutých vláknech. Cytotoxicita byla také zjištěna při použití rozpisu s 5denní nitrožilní infuzí vůči prostatovým nádorovým buňkám (33 %) v dutých vláknech. Rozšířená in vivo hodnocení nejenom že ukazují silnou relativní korelaci s in vivo cytotoxickým profilem, ale také silnou korelaci s in vivo modely použitými k charakterizaci nádorové selektivity, která označila aplidin za kandidáta pro klinickou etapu zkoušek.

Příklad 3

Studium fáze I a fannakokinetické studium aplidinu podávaného pacientům s pokročilými tvrdými nádory jako 24hodinová infuze týdně

4·*·

• 4 4 · ·

444

In vivo studie odhalily, že účinek in vivo se zvýšil prodloužením doby trvání infuze. V této studii se působilo na 16 pacientů. Charakteristiky pacientů: medián věku byl 55 let, medián PS 1, muži/ženy = 11/5, typy nádorů byly následující: hlava a krk 5, ledvina 2, trakčník tlustého střeva 3, konečník 2, sarkom 1 a melanom 3, všechny byly předem ošetřeny chemoterapií (medián 2 kúry).

Aplidin by podáván jako 24hodinová infuze v následujících dávkových úrovních (Dis): 133 (3 pacienti), 266 (3 pacienti), 532 (3 pacienti), 1000 (3 pacienti), 2000 (3 pacienti) a 3000 (1 pacient) pg/m²/týden po 3 týdny každých 28 dnů.

Nebyly pozorovány toxicity limitující dávku (DLTs). Zaznamenány byly pouze mírné, nehematologické toxicity sestávající z nevolnosti stupně 1, vylučování hlenu stupně 1, tělesné slabosti stupně 1. Běžná byla flebitida paže s infuzí a závisela na koncentraci. Farmakokinetická analýza byla provedena u všech pacientů a tato ukázala plazmové hladiny při úrovních dávek 1000 pg/m²/týden a 2000 pg/m²/týden jako ekvivalentní koncentraci aktivní látky in vitro 1 ng/ml. Při úrovni dávky 532 pg/m²/týden bylo pozorováno klinické zlepšení u jednoho předléčeného pacienta s pokročilým melanomem.

Příklad 4

Studium fáze I a farmakokinetické (PK) studium aplidinu (APL) použitím 24hodinového týdenního rozpisu

K dnešku bylo v této studii fáze I léčeno 25 pacientů (s mediánem věku 58 let, s mediánem ECOG 1), u nichž byly v minulosti léčeny pokročilé, tvrdé nádory nebo lymfomy. Při použití aplidinového rozpisu 24 hodin týdně po 3 týdny následovaného 1 týdnem přestávky byly testovány následující dávkové hladiny: 133 (3 pacienti), 266 (3 pacienti), 532 (3 pacienti), 1000 (3 pacienti), 2000 (3 pacienti), ·· • ♦ · ♦ • · · ♦ · · ♦ · ·

4 ··4 4 ···· • · ·♦»· • · ·

4· ·

4500 (3 pacienti) a 3750 pg/m²/týden (3 pacienti). Po 60 cyklech (180 infnzích) podávání byli všichni pacienti vyšetřeni na toxicitu. Nejvyšší snesitelná dávka byla 4500 g/m²/týden po 3 týdny se stupněm (G) svalové toxicity 3 (biopsií prokázaný typ II svalové atrofíe). U 2 nebo 4 pacientů byly toxicity CPK G4 a abnormální jatemí testy G3, které limitovaly dávku. Nevolnost G2 byla pozorována u většiny pacientů a zvracení G2/3 při dávkách > 2000 pg/rn², flebitida je běžná, ale závisí na koncentraci. U všech pacientů byly provedeny odběry pro farmakokinetickou analýzu pomocí LC/MS/MS. Předběžné údaje indikují rozsáhlou distribuci do tkáně, dlouhou eliminaci s ti/₂10 až 24 hodin a plazmové hladiny > 1 ng/ml (která je účinná in vitro). U jednoho pacienta s pokročilým melanomem odolným vůči DTIC/interferonu se dosáhlo klinického zlepšení udržovaného po více než 30 týdnů. Tato studie s týdenními infuzemi ukazuje vhodnost a účinnost rozpisu se silnou dávkou aplidinu. Jak bylo očekáváno, dávku limituje neurosvalová toxicita. Jako možná doporučená dávka byla stanovena dávka 3750 pg/m²/týden po 3 týdny.

Příklad 5

Klinické farmakokinetické (PK) studie aplidinu (APL) u pacientů s tvrdými nádory a nehodgkinskými lymfomy

Hodnoceny byly čtyři nitrožilní rozpisy pro fázi I: 24 hodin infuze týdně, 24 hodin infuze za čtrnáct dnů a 1 hodina infúze po 5 následujících dnů každé 3 týdny. Koncentrace aplidinu v krvi byly analyzovány kapalinovou chromatografií ve spojení s tandemovou hmotnostní spektrometrií. Počáteční výsledky ukazují akumulaci v krevních buňkách a farmakokinetika v plazmě je charakterizována širokou distribucí (rozmezí distribuce je obvykle vyšší než 200 1/m²) a poločasy eliminace řádu 10 až 24 hodin. Otevřený dvoukompartmentový model vhodně vyhovuje většině profilů po 24 hodinách infuze. Pro infuze s 1 hodinou ve většině ♦ ♦ ♦ • · ····· · · · • φ · φ φ φφφ· * • ·· · · · φ·· ·· φ φ · φ · · · · · · φφ·· případů lépe vyhovuje trojkompartmentový model. O získaných hladinách v plazmě je známo, že jsou účinné in vitro. V současnosti probíhá vyhodnocení dalších pacientů a porovnání farmakokinetiky v krevních buňkách a plazmě.

Příklad 6

Předběžné výsledky studie fáze I a farmakokinetické studie aplidinu podávaného jako 24hodinová infuze každé 2 týdny pacientům s tvrdými nádory a nehodgkinskými lymfomy

Aplidin se podával jako 24hodinová infůze každé 2 týdny. Počáteční dávka byla 200 pg/m²/den a zvyšování dávky pokračovalo až do 400, 800, 1600 a 3200 pg/m²/den. Studie se účastnilo celkem 18 pacientů (muži/ženy = 7/11, medián věku byl 52 let, OMS 0/1 = 10/8). Dosud nebyla zaznamenána žádná dávka s mezní toxicitou. U hodnocených pacientů byla zaznamenána toxicita sestávající z nevolnosti/zvracení mírného stupně I až II, tělesná slabost stupně I až II a křeče, které se objevily během nebo vzápětí po infůzi. U hodnocených dávek nebyla zjištěna žádná neurosvalová toxicita. U jednoho pacienta s pokročilou rakovinou plic a dokumentovanou progresí nádoru se při dávce 1600 pg/m² vyvinula hemolytická anemie a trombocytopenie, které byly považovány za nepravděpodobně spojené se studovaným léčivem. Úvodní farmakokinetická analýza ukázala, že léčivo se široce distribuuje a prokázala jeho koncentrace v krvi. Otevřený dvoukompartmentový model vhodně vyhovuje většině profilů koncentrace v plazmě. Terminální poločas je obvykle řádu 10 až 24 hodin. Klinická zlepšení se projevila u pacientů s nehodgkinským lymfomem. Pokračuje nárůst ve sběru dat pro určení dávky s limitní toxicitou a dávky doporučené pro studie fáze II.

Příklad 7 • 0 90 » 9 · · ► 0 · » 0 9 » 0 9

9990 > ·0·9 * 9

9*9« ····

Profil genové exprese u lidských leukemických buněk MOLT-4, na které se působilo látkou mořského původu aplidinem

V předložené studii byly zhodnoceny prvotní změny genové exprese, které byly indukovány aplidinem v buňkách MOLT-4 použitím exprese cDNA sledované technikou microarrays (Atlas Human Cancer, Clontech). Na buňky MOLT-4 se 1 hodinu působilo koncentracemi aplidinu, které inhibovaly růst z 50 % a veškerá RNA byla izolována v časech 0,1, 6 a 24 hodin po vymytí léčiva. Filtry byly hybridizovány stejnými množstvími cDNA značené ³²P. Analýza výsledků byla provedena použitím programu ATLAS IMAGE 1.0. Jako významné změny v expresi RNA byly brány změny genové exprese větší než dvojnásobné a tyto byly následně potvrzeny pomocí PCR. Výrazné, na čase závislé snížení exprese VEGF-R1 (fit-1) bylo pozorováno a potvrzeno u hladiny RNA pomocí PCR a u hladiny proteinu pomocí Western blotting. V současnosti je předmětem zkoumání, zda omezení aktivity fit-1 se týká cytotoxického a protinádorového účinku aplidinu. V současnosti je také studována charakterizace exprese dalších genů, která se zdá být expozicí aplidinu omezována.

Kvantitativní změny genové exprese indukované aplidinem v buňkách MOLT-4

Gen	1 hodina	6 hodin	24 hodin
B-RAF	-	+2,0	+2,6
FLT-1	-1,5	1 O	-3,4
FMS	-	+2,7	+2,1
ETR	+2,7	-	-
DNA-PK	-	+3,0	+3,8
PLK-1	-	+3,0	+4,4

9999 • *· ·

9

9

999 9 9 9

9

9 · ·

9 « 9

999 9

Pokles genové exprese FLT-1, pozorované pomocí techniky microarrays, byl potvrzen RT-PCR analýzou, viz obrázek 1.

Použitím RNázového chránění byl vyčíslen pokles mRNA u Fit-1 v buňkách MOLT-4, indukovaný 20 nM aplidinu, viz obrázek 2.

Obrázky 3a a 3b znázorňují autokrinní smyčku VEGF-Flt-1 v buňkách MOLT-4 a účinek aplidinu v autokrinní smyčce VEGF-Flt-1.

Aplidin blokuje vylučování VEGF z buněk MOLT-4, viz obrázek 4. Na buňky se působilo 1 hodinu 20 nM aplidinu. V prostředí vyloučený VEGF byl změřen pomocí metody ELISA na konci působení a po 6 a 24 hodinách inkubace v prostředí bez léčiva.

Aplidinem indukovaná blokace vylučování VEGF je závislá na koncentraci a je pozorovatelná již při koncentraci 5 nM, viz obrázek 5.

Při použití RNázového chránění byl v buňkách MOLT-4 po použití 20 nM aplidinu pozorovatelný silný pokles hladin mRNA VEGF, viz obrázek 6.

Dávka aplidinu nesnižuje aktivitu promotoru VEGF přeneseného do buněk MOLT-4, viz obrázek 7. Buňky byly infikovány promotorem VEGF (v rozsahu prvních 1000 baží od výchozí polohy, navázané k luciferázovému reportérovému genu a s kontrolním plasmidem nesoucím reportéra vý gen polypu renilla). Na buňky se poté působilo různými koncentracemi aplidinu a luciferázová aktivita byla měřena po 24 hodinách a porovnána s aktivitou polypu renilla.

Aplidin neblokuje navázání transkripčních faktorů HIF-1 a AP-1 na jejich společné sekvence DNA přítomné v promotoru VEGF, viz obrázek 8. Jaderné extrakty byly 60 minut inkubovány s různými koncentracemi aplidinu a značenými oligonukleotidy. Navázání HIF-1 nebo AP-1 bylo sledováno pomocí gelové retardační analýzy.

Aplidin neblokuje navázání transkripčního faktoru HIF-1 na jejich společné sekvence DNA přítomné v promotora VEGF, viz obrázek 9. Jaderné extrakty . · · · ··· · · ’ • · * 9 9 9 · 9 · * • z · · · · · · ·

999 ·· 9·· 99 9999 získané z buněk, na které se působilo různými koncentracemi aplidinu, byly 60 minut inkubovány se značenými oligonukleotidy. Navázání HIF-1 bylo sledováno pomocí gelové retardační analýzy.

VEGF (10 ng/ml) přidaný do kultivačního média buněk MOLT-4 kultivovaných v 10% FCS trochu snížil aktivitu nízkých koncentrací aplidinu, zatímco u vysokých koncentrací nemá účinek žádný, viz obrázky 10a, 10b.

Aplidin je také schopen snížit vylučování VEGF v linii IGROV-1 rakoviny vaječníku u lidí, viz obrázek 11.

Aplidin snižuje hladiny mRNA VEGF také linie IGROV-1 rakoviny vaječníku u lidí, viz obrázek 12.

Aplidin nemá vliv na promotorovou aktivitu VEGF měřenou pomocí reportérového genového systému luciferáza/renilla, viz obrázek 13.

Příklad 8

Aplidinové zábrany vylučování VEGF a autokrinní smyčky VEGF/VEGF-R1 u linie lidské leukemické buňky

Bylo zjištěno, že aplidin indukuje silnou apoptózu lidské leukemické buněčné linie MOLT-4. V téže buněčné linii odhalila analýza technikou microarrays změny v expresi různých genů v brzkých časech po působení. Kromě toho bylo zjištěno, že působením léčiva byla snížena aktivita VEGF-R1 (flt-1) a toto snížení bylo potvrzeno pomocí analýzy Northern a Western blotting. Další studie ukázaly, že působení látky na stejný buněčný systém vyústilo do velkého snížení vylučování VEGF v tomto prostředí. Pokles vylučování VEGF byl spojen s poklesem mRNA kódující VEGF v buňkách MOLT-4, na které se působilo aplidinem. Při pokusu o osvětlení mechanismu, kterým aplidin blokuje vylučování VEGF, bylo zjištěno, že tato látka nemění poločas mRNA VEGF. Podobně při použití analýzy posunu • 0 ·0 · 0 0

0 4

0 4 4

4 0

0000

0 ·««· • 4

0 4 0

0 ·

4 • 44

4· elektromobility aplidin nezměnil schopnost dvou transkripčních faktorů HIF-1 a AP-1 vázat se na jejich odpovídající společnou sekvenci v promotoru VEGF a nesnížil transkripci VEGF, když se v krátkodobých pokusech s transfekcí použila struktura promotor VEGF-luciferáza. Snížené vylučování aplidinu bylo spojeno se zvýšenou intracelulámí akumulací VEGF, čímž bylo naznačeno, že tato látka může působit prostřednictvím blokace vylučování VEGF. Souběžné působení na buňky MOLT-4 nízkými koncentracemi aplidinu a VEGF částečně rušilo účinek aplidinu, naznačujíc tak, že toto léčivo by částečně mohlo uplatňovat svůj účinek v tomto buněčném systému blokováním autokrinní smyčky VEGF/VEGF-R1.

Příklad 9

In vitro bezpečnostní profil aplidinu, přírodního produktu mořského původu s chemoterapeutickým potenciálem

Při použití CellTiter96 (MTS, Promega) in vitro zkoušky na cytotoxicitu vykazuje aplidin nízkou toxicitu pro játra (AML-12) nebo toxicitu pro srdce (H9 c2 (2-1), LD₅o je 1 μΜ). Naopak aplidin je velmi toxický pro kosterní svalstvo (L8) a ledvinové (NRK-52E) buňky (LD50 je 0,1 nM), má střední toxicitu pro myelogenní kmenové buňky (FDC-P1, LD50 je 0,1 μΜ) v těsné shodě s klinickými údaji o toxicitě. Ve skutečnosti je limitní toxicita dávky u lidí dána atrofii kosterního svalstva.

Aplidin vykazuje neurotoxicitu při vyšších koncentracích in vitro. Při spojem fluorescenčního barviva pro živé organizmy (ethidiumhomopolymer a kalcein AM, Molecular Probes) s imunocytochemií bylo pozorováno, že přibližně 1 μΜ aplidin je toxický pro mozkové buňky (jak neurony, tak astrocyty) a motorické (pozitivní cholinacetyltransferáza) neurony v míše, ale ne pro pozitivní senzorické neurony látky P. Motorická neuronová citlivost může napomoci vysvětlení svalové atrofíe • · Φ*» • 4

ΦΦΦ* φφφφ

Φ • · ΦΦ

ΦΦ ·· • · · · • · *

Φ Φ · · ·

Φ ΦΦΦ «Φ ΦΦΦΦ typu II pozorované (jak bylo předpovězeno) u malých skupin pacientů, kde je koncentrace léčiva vyjádřená jako AUC zvýšena v důsledku sníženého vylučování.

Příklad 10

Studie fáze I aplidinu pro rozpis 5 dnů po dávce každé 3 týdny u pacientů s tvrdými nádory a lymfomy

Předměty studie bylo určení nejvyšší snesitelné dávky, dávky s limitní toxicitou (DLT), farmakokinetiky (PK) a doporučené dávky pro studie fáze II, které lze podávat v režimu 1 hodinové denní nitrožilní infúze po 5 dnů každé 3 týdny. Byli vybráni pacienti s tvrdými nádory a malým nebo středním stupněm nehodgkinských lymfomů. Počáteční denní dávka aplidinu byla 80 μg/m². Na skupiny 3 pacientů (pts) se působilo při každé hladině se zvýšením dávky podle toxicity. Na 20 pacientů se působilo 6 dávkovými hladinami v rozmezí 80 až 720 pg/m², 1 pacient je v současnosti na dávce 960 pg/m². Celkem bylo provedeno podávání ve 48 cyklech. Nehematologické toxicity byly stupně 1 a 2, přičemž většina pacientů cítila únavu. Hypersenzitivní reakce stupně 1 byla zadokumentována u 7 pacientů. Další toxické příznaky zahrnovaly nevolnost, anorexii, průjem a úzkost. Nebyly zjištěny žádné hematologické toxické příznaky. Farmakokinetická analýza byla provedena v průběhu léčebné kúry 1. Koncentrace aplidinu byly analyzovány kapalinovou chromatografií ve spojení s tandemovou hmotnostní spektrometrií. Údaje naznačují lineární farmakokinetiku dávky s vysokou variabilitou mezi pacienty. Celková tělesná clearance byla 0,38 1/min a medián ti/₂ byl 14,2 hodiny. Bylo dosaženo v

potenciálně terapeutických koncentrací v plazmě (> 1 pg/ml). Žádné nežádoucí reakce nebyly zaznamenány. Jeden pacient s rakovinou trakčníku tlustého střeva byl ve stabilním stavu po 9 měsíců a 1 pacient s rakovinou renálních buněk měl

00

0 0 0

0 ·

0 0

0·

0000 • 999· • 0 ·»♦·

0 00 0 0 0 *

0 00 smíšenou odezvu. Závěrem lze konstatovat, že nebyla zaznamenána limitní toxicita dávky. Pro přírůstek dat právě probíhá pokus s koncentrací 960 pg/m².

Příklad 11

Klinická studie fáze I a farmakokinetická studie aplidinu, nového didemninu mořského původu, podávaného jako 24hodinová infuze týdně

Pokus fáze I byl proveden pomocí 24 hodin infuze týdně po 3 týdny s následnou přestávkou 1 týden. Bylo léčeno 32 pacientů (medián věku byl 58 let, medián ECOG 1) s pokročilými, dříve léčenými tvrdými nádory. Celkem u nich proběhlo 64 léčebných kúr (medián/pacient = 2 (1 až 6)) s 8 dávkovými hladinami 133 (3 pacienti), 266 (3 pacienti), 532 (3 pacienti), 1000 (3 pacienti), 2000 (3 pacienti), 3000 (3 pacienti), 4500 (4 pacienti) a 3750 pg/m²/týden (10 pacientů). U dvou ze tří hodnocených pacientů se při DLT 4500 pg/m²/týden projevila reverzibilní neuromuskulámí toxicita stupně (G) 4 (biopsie ukázala svalovou atrofii typu II) a nárůst CK stupně 4 (1 pacient) a přechodné abnormální jatemí testy stupně 3 (1 pacient). Jiné příznaky toxicity zahrnovaly nevolnost stupně 1 až 2 (u většiny pacientů léčených dávkou > 3000 pg/m²/týden), svalové křeče, zvraceni stupně 1 až 2 (s odpovědí na antiemetika) a reakce injekčního místa (velmi běžná a závislá na koncentraci). U všech pacientů byly odebírány vzorky pro farmakokinetickou analýzu pomocí metody LC/MS/MS. Farmakokinetické průběhy jsou lineární a profily vyhovují otevřenému dvoukompartmentovému modelu.

Léčivo mělo širokou distribuci ve tkáni (Vss = 6111), vysokou clearance (0,47 1/min) a eliminaci s ti/₂ rovným 18,8 hodiny. Dosažené hladiny v plazmě > 1 ng/ml (aktivní in vitro) byly získány při dávkách > 3000 pg/m². Jeden pacient s pokročilým melanomem rezistentním k DTIC/interferonu dosáhl jednoznačného klinického zlepšení, které trvalo > 30 týdnů. Čtyři další pacienti měli slabší odezvy

99

9 9 9

9 9 • 9 9

9 9 ·· 99 9 9 ·»·· • *

9999

9 9

9 9 99

9 9

99 9

9 9

99· nebo stabilní stav nemoci > 4 měsíce. Závěrem lze shrnout, že aplidin podávaný v DLT podle rozpisu týdenní infiize vykazoval reverzibilní svalovou toxicitu a abnormální jatemí testy, které byly pozorovány při MTD rovné 4500 pg/m²/týden. Doporučená dávka pro budoucí pokusy 3750 pg/m²/týden po 3 týdny, podávaná prostřednictvím centrálního žilního katetru je vhodná a je spojena s mírnou toxicitou.

Příklad 12

Klinická studie fáze I a farmakokinetícká studie aplidinu, nového didemninu mořského původu, podávaného jako 24 hodin iníuze týdně Charakteristiky pacienta

Počet pacientů	35	Typ nádoru
Pohlaví (muži/ženy)	23/12	Kolorektální	12
Medián věku, roky	56,5 (29 až 74)	Ledvinový	6
(rozmezí)
výsledek ECOG (elektrokortikogram)	Hlava a krk	5
0	12	Melanom	4
1	18	Žaludeční	2
2	5	Prsu	1
Předchozí radioterapie		Plic	1
Předchozí chemoterapie		Sarkom měkké tkáně	1
Žádná	4	Lymfom	1
1 dávkovači schéma	9	Štítné žlázy	1
2 dávkovači schémata 12	Karcinom neznámého původu	1
3 a více dávkovačích schémat 10
Místa onemocnění

< ··*· « · « · II • · ·* ··

I 8 9 · » · · » · » » · · ·· ·♦·*

Nárůst dávek pro pacienty

Hladina dávky	Dávka (pg/m2/týden)	Počet pacientů	Počet cyklů (rozmezí)
I	133	3	9 (1 až 6)
II	266	3	9 (2 až 5)
III	532	3	10 (2 až 6)
IV	1000	3	7(1 až 4)
V	2000	3	6 (2 až 2)
VI	3000	3	4 (1 až 2)
VII	4500	4	5 (1 až 2)
VIII	3750	13	21+ (1 až 4)
Celkem		35	71+

Nejhorší toxicity u pacientů

Hladina dávky	I	II	III	IV	V	VI	VII (MTD)	VIII (RD)
Počet pacientů	3	3	3	3	3	3	4	13
Nevolnost stupně 2					1			2
Nevolnost stupně 3						1
Tělesná slabost stupně 2			1			1	1	3
Tělesná slabost stupně 3						1
Reakce injekčního místa stupně 2		1		1	1	1	1	3

ν· «ν k Φ · · » Φ · » · · » · ·

Φ· φφφφ • · · φφ ··· • ·σ· »t ·υ«· • · · • φ · · * • · · φ φ · • Φ ΦΦΦ

Myozitida stupně 3							1
Zvýšení CPK stupně 4							1
Abnormální jatemí testy stupně 3							1	2
Abnormální jatemí testy stupně 4								1
Hypersenzitivita stupně 3								1

Protinádorový účinek

Pacient 008 - (Madrid) U vysoce předléčeného neměřitelného metastázujícího melanomu bylo pozorováno klinické zlepšení a smrštění nádoru. Biopsie jednoho metastázujícího poškozeného místa neodhalila reziduální nádorovou tkáň.

Pacient 032 - (Madrid) Renální karcinom - 20% smrštění nádoru

Pacient 034 - (Madrid) Medulámí karcinom štítné žlázy. Klinické zlepšení a sklerodermie u plicní lymfangoitidy. Snížení u CEA markéru.

Farmakokinetická měření

Koncentrace aplidinu v plazmě byla stanovena kapalinovou chromatografií ve spojení s tandemovou hmotnostní spektrometrií s mezí stanovitelnosti 0,25 ng/ml a širokým lineárním rozsahem do 16,00 ng/ml.

Celkem bylo odebráno 15 vzorků do 24 hodin po ukončení infuze.

Farmakokinetické výsledky byly lineární podle dávky

Vysoký medián clearance ((kvartily) 0,47 (0,40 až 0,56) 1/min) a vysoká variabilita mezi pacienty (variační koeficient pro clearance byl 45 %)

Střední až dlouhý poločas (ti/2) (medián (kvartily) 18,8 (15,3 až 25,4) hodin)

Široká distribuce se suprafyziologickou mírou rozšíření (Vss) (medián (kvartily 611 (434 až 733) 1)

Akumulace v krevních buňkách (2 až 8násobná ve srovnání s plazmou) • ·

Profily vyhovují otevřenému dvoukompartmentovému modelu

Obrázek 14 ukazuje vztah dávka versus AUC.

Závěry

DLT aplidinu podávaného podle tohoto rozpisu byly reverzibilní svalová toxicita a abnormální jatemí testy pozorované u MTD 4500 gg/m²/týden po 3 týdny.

Doporučená dávka pro budoucí pokusy 3750 pg/m²/týden po 3 týdny je vhodná a je spojena s mírnou toxicitou (hlavně mírnou tělesnou slabostí).

Běžná byla flebitida na paži s infuzí, závisela na koncentraci a bylo možné se jí vyhnout podáváním prostřednictvím centrálního žilního katetru

Nebyla pozorována žádná hematologická toxicita

Farmakokinetika je charakterizována dávkovou linearitou, relativně prodlouženým pobytem látky v těle a širokou distribucí. Potenciálně účinných hladin v plazmě bylo dosaženo od 2000 μg/m².

V současnosti probíhá další studie fáze I zkoumající 3 hodiny nitrožilni infuze podávané každý druhý týden. Počáteční dávka je 3000 μg/m² každé 2 týdny.

Příklad 13

Studie fáze I aplidinu podávaného jako 1 hodina nitrožilni infuze týdně pacientům s pokročilými tvrdými nádory a lymfomem

Do úvahy byli vzati dospělí pacienti s pokročilým onemocněním, PS<3, a vhodné orgánové funkce, pacienti dostávali aplidin týden po 3 týdny/každé 4 týdny. Studováno bylo 24 pacientů s tvrdými nádory - medián (m) věku byl 55 let, medián ECOG =1,15/24 pacientů bylo léčeno > 2 léčebnými cykly. Bylo zhodnoceno sedm úrovní dávky (DL) od 133 pg/m²/týden do 2700 pg/m²/týden, u 102 infuzí byla vyhodnocena toxicita (tox). Nebyla zaznamenána žádná hematologická

toxicita, zvracení vyžadující profylaxi bylo pozorováno od 800 pg/m²/týden. U dávky 2700 pg/m²/týden (4 pacienti) měl 1 pacient hyperbilirubinemii stupně 3, která byla považována za limitující dávku, a proto úroveň dávky 2700 pg/m²/týden je hraniční. Všichni pacienti byli vzorkováni pro farmakokinetickou analýzu (LC-ESI-MS/MS), kinetika je lineární, medián Vss = 308 1/m², medián clearance je vysoký a roven 0,60 1/min a medián poločasu eliminace = 14,2 h. Hladiny v plazmě > 1 ng/ml 24 hodin po infuzi jsou dosažitelné od 1800 pg/m²/týden. První známky aktivity byly zaznamenány u rakoviny žaludku (1 pacient při 1200 pg/m²). Pacient s pokročilou renální rakovinou rezistentní vůči VBL-IFN měl průběžnou objektivní odezvu (PR plicní ch metastáz a SD u peritoneálního onemocněni) při úrovni dávky 2700 pg/m²/týden. Aplidin je klinicky vhodný při farmakologicky vhodných úrovních dávky.

Příklad 14

Studie fáze I a farmakokinetická studie aplidinu podávaného pacientům s tvrdým nádorem a lymfomem jako 24 hodin nepřetržité infuze každý druhý týden (q2w)

Aplidin se podával 35 pacientům s tvrdým nádorem/nehodgkinským lymfomem jako 24 hodin infuze/q2w (medián věku = 51/ECOG = 1), a to s tvrdým nádorem (32 pacientů) nebo nehodgkinským lymfomem (3 pacienti). 23 z 35 pacientů bylo předem vystaveno > 3 předchozím kúrám chemoterapie. Bylo podáno devět dávkových hladin (200 až 7000 pg/m²/týden/q2w) a 65 cyklů (120 infuzi). Nebyla zaznamenána žádná hematologická toxicita. Toxicita sestávala z tělesné slabosti stupně 2 u 9 pacientů a stupně 3 u 2 pacientů a zvracení stupně 2 u 12 pacientů a stupně 3 u 1 pacienta. Nevolnost/zvracení stupně 3 (> 5000 pg/m²) byla účinně léčena a poté jí bylo předcházeno režimy 4HT3. Pro srdce nebyla • · · · • · zaznamenána žádná toxicita. Při dávce 5000 pg/m²/týden/q2w měli 2 pacienti přechodné svalové křeče s reverzibilními zvýšeními CPK-MM stupně 3. Mezi 9 pacienty léčenými dávkou 6000 pg/m²/týden zaznamenali 3 pacienti po třetí injekci aplidinu nárůst CPK-MM a aldolázy. Zvýšení CPK byly stupně 1 až 2 a u 2 pacientů byly nesymptomatické, ale u jednoho pacienta bylo zaznamenáno zvýšení CPK stupně 3 se svalovou bolestí stupně 3 a ztrátou síly svalu (DLT). Toto bylo reverzibilní a bez následků. Biopsie svalu neodhalila významnou nekrózu myocytů. Podstruktumí elektronová mikroskopie neindikovala žádné morfologické změny mitochondrií, ale ztrátu v síle myosinových vláken. Dávku 7000 pg/m²/q2w dostali 4 pacienti. Farmakokinetická analýza (LC-ESI/MS/MS) ukázala, že nárůst AUC je lineární s velkou Vss = 539 1/m², vysokou clearance (332 ml/min/m²) a dlouhým terminálním poločasem (15 až 35 hodin). Koncentrace v plazmě po 24 hodinách po ukončení infuze s dávkami > 3000 pg/m²/q2w jsou srovnatelné s účinnými koncentracemi in vitro (< 1 ng/ml). Účinek byl pozorován u nehodgkinského lymfomu (1/3 pacientů), molekulové rakoviny štítné žlázy (2/2 pacientů), renální rakoviny (1/5 pacientů) a neuroendokrinní rakoviny (1 pacient). V současnosti se vyhodnocují mechanistická hypotéza a preventivní strategie proti svalové toxicitě.

Příklad 15

Zkouška technikou microarray

K těmto pokusům byla použita lidská leukemická buněčná linie MOLT-4, přičemž na buňky MOLT-4 se působilo 1 hodinu 20 nM aplidinu. Veškerá RNA byla extrahována na konci působení a 6 hodin a 24 hodin po regeneraci v prostředí bez léčiva.

pg absolutní RNA bylo přepsáno na cDNA v přítomnosti ³²P-dATP. Stejná množství radioaktivních sond byla hybridizována na membráně Atlas Human ·· · ·

Cancer Microarrays (Clontech). Po promytí byl filtr vyvolán a výsledky byly zanalyzovány pomocí programu Atlas Image. Do úvahy byl vzat pouze ten rozdíl v expresi genu, který byl větší než dvojnásobný, a to mezi buňkami, na které se působilo a nepůsobilo. Byly provedeny RT-PCR a Northern blotting analýzy, aby se potvrdily změny v expresi genu nalezené metodou microarrays.

Výsledky

Působení aplidinem způsobilo významné změny v expresi genu již 1 hodinu po působení. Po 6 a 24 hodinách regenerace v prostředí bez léčiva byla pozorována exprese zvýšeného počtu genů..

Na konci působení byly nejvýznamnější změny v expresi pozorovány u brzy reagujícího genu ETR, a to zvýšení exprese a u genu VEGF-Rl/flt-1, kde byla tímto působením exprese zmenšena.

Hladiny ETR se vrátily na normální úroveň po 6 hodinách a 24 hodinách, zatímco hladiny flt-1 se po 6 a 24 hodinách dále snížily,

Aplidin indukoval také vzrůst hladin B-RAF a Fms, který byl jasně pozorovatelný 6 hodin po regeneraci v prostředí bez léčiva.

Změny pozorované v těchto genech byly potvrzeny buď RT-PCR nebo metodou Northern blotting.

Z analýzy technikou microarrays byly pozorovatelné změny v expresi genu (ještě nepotvrzeno pomocí RT-PCR) i u dalších genů jako PLK-1.

Příklad 16

Studie fáze I aplidinu při 1 hodině infúze denně po 5 dnů každé 3 týdny u pacientů s tvrdými nádory a nízkým a středním stupněm nehodgkinských lymfomů Výsledky

Účastnilo se pacientů 27

Vyhodnoceno na toxicitu Vedlejší studie Progresivní onemocnění Progrese symptomů Smrt

Jiné (rozhodnutí doktora)

Demografie pacientů (N = 23)

Medián věku		54 (18 až 73)
Pohlaví	Zena: Muž	10: 13
PS	0:1:2	5:13:5
Malignost	Kolorektální	7
	Prs	2
	Hlava a krk	2
	Renální	3
	Jiný	9
Předchozí režimy	0:1:2:3:4+	5:0:6:6:6
Předchozí terapie	Pomocná CT	4
	Metastatická CT	19
	RT	12

Vstupní/dávkové hladiny pacienta

DL	Dávka (pg/m2)	N	počet cyklů	Zhodnotitelní na toxicitu
1	80	3	5 (1 až 2)	3
2	120	3	15 (2 až 11)	3
3	240	3	9 (2 až 4)	3

99·

4	360	4	6 (1 až 2)	4
5	540	3	7 (2 až 3)	3
6	720	4	4(1)	4
7	960	4	4(1)	4
8	1200	2	2(1)	2

Nehematologická toxicita

DL	Horečka	Únava	Průjem	Nevolnost
Stupeň	1	2	3	4	1	2	3	4	1	2	3	4	1	2	3	4
1	1	1			1	2			1				2
2					3				2				1
3					1	1	1			2			2	1
4	1					3			1				1		1
5		1				2	1		2				2		1
6	1				1			1	1				3
7						2							1	1

Nehematologická toxicita - pokračování

DL	Hypersenzitivita	Motorická	Senzorická	Myalgie/ slabost
neuropal	je	neuropal	tie
Stupeň	1	2	3	4	1	2	3	4	1	2	3	4	1	2	3	4
1	1	1			3	2			2	1				1
2	1								2
3									1				1
4	1	1			1				1	1
5	1				1	1			2	1			1
6			1				1		1							1

»♦ 000«

0

0 0*

0·00 • ·

• 0

7

1

Hematologická toxicita

DL	Hemoglobin	Granulocyty	Lymfocyty	Krevní destičky
Stupeň	1	2	3	4	1	2	3	4	1	2	3	4	1	2	3	4
1	1	2							3
2	2								1	2			1
3	1	1								2	1		2
4	2	2							1	2	1
5	1	1								2	1
6		2							2	2
7		2								1	1

Biochemická toxicita

DL	Kreatinin	SGOT	Bilirubin	CPK
Stupeň	1	2	3	4	1	2	3	4	1	2	3	4	1	2	3	4
1					1				1
2					1
3	2				2											1
4	1				2
5					2								1
6					2				1				1
7

Farmakokinetika

Farmakokinetika je charakterizována dávkovou linearitou ···· • · * 9 9 9 ·* · ·· • » » • · · · ·

Vysoká variabilita mezi pacienty

Vysoká plazmová clearance (medián 0,38 1/min)

Střední až dlouhý ti/₂, medián 14,2 hodiny

Bylo dosaženo terapeutických koncentrací v plazmě (> 1 pg/ml)

Závěry

Do současnosti nebyla zdokumentována dávka s limitní toxicitou

Mírné toxické projevy spojené s léčivem zahrnují únavu a nevolnost (snadno kontrolované antiemetiky)

Občasná HSR nezávislá na předběžném působení Žádný jasný důkaz neuropatie nebo myopatie

Nebyly zdokumentovány žádné objektivní odezvy, i když některé důkazy možné protinádorové aktivity zahrnují

- dva pacienty se silně předléěeným kolorektálním karcinomem, přičemž jeden měl stabilní stav nemoci 6+ měsíců (celkem 13 cyklů) a druhý měl 40% zmenšení velikosti nádoru.

-jednoho pacienta s rakovinou renálních buněk ajatemími metastázemi se smíšenými odezvami (10% zmenšení součtu měření nádorů)

Další studie pokračuje, v současnosti s dávkou 1200 pg/m².

Příklad 17

Studie fáze I aplidinu, podávaného jako 1 hodina nitrožilní iníuze týdně pacientům s pokročilými tvrdými nádory a nehodgkinským lymfomem Podávání léčiva

Aplidin byl podáván jako 1 hodina iníuze týdně po 3 týdny každé 4 týdny Charakteristiky pacientů

Počet pacientů	30	Typ nádoru
Medián věku, roky (rozmezí)	53,5 (36 až 75)	Kolorektální	8
Stav provedeného ECOG		Plicní	5
0	2	v Žaludeční	4
1	21	Renální	3
2	5	Hlavy a krku	3
Předcházející radioterapie	10	Melanom	2
Předcházející chemoterapie (počet režimů)	Vaječníků	2
1	10	Žlučových cest	1
2	10	Jícnu	1
>3	8	Slinivky břišní	1

Soubor pacientů a zvyšováni dávky

Hladina dávky	Dávka (pg/m2/týden)	Počet pacientů	Počet cyklů (rozmezí)
I	133	3	5 (1 až 2)
II	266	3	5 (1 až 2)
III	532	3	5 (1 až 2)
IV	800	3	6 (2 až 2)
V	1200	4	7 (1 až 2)
VI	1800	4	7 (1 až 2)
VII	2700	8	12(1 až 2+)
VIII	3600	2	3 (1 až 2+)
Celkem

* definice 1 cyklu = 3 následné infuze ve 3 týdnech s jedním týdnem přestávky

Nejhorší toxicity pro jednotlivé pacienty

Úroveň dávky (týdně x 3)	133	266	532	800	1200	1800	2700	3600
Počet pacientů	3	3	3	3	4	4	8	2
Nevolnost/zvracení G2	-	-	-	3	-	3	2	-
Reakce místa vpichu G2	-	1	-	1	1	1	3	-
Tělesná slabost G2 (G3)	-	-	1	1(1)	3	2	1(1)	-
Myalgie G2 (G3)	-	-	-	-	(1)	-	-	1
Zvýšení CPK G1	-	-	-	1	-	-	-	1
Abnormální jatemí testy G2 (G3)	1		(1)	1		1	1(4)(1>
Bilirubin G3	-	-	-	-	-	-	1<1)(2>	-
Alkalická fosfatáza G2 (G3)		(1)				1	1(1)(2)
Vysoký tlak G1 (G3)	(1)	-	-	1	-	-	-	-

G = stupeň,jeden pacient s hepatitidou C, dva případy reverzibilní ke dni 8 a 1 DLT,⁽²⁾ DLT

Charakterizace udané limitní toxicity dávky

Pacient 28 - (Edinburgh) s adenokarcinomem jícnu (žádné jatemí metastázy) léčený dávkou 2700 pg/m² týdně měl zpožděnou regeneraci nárůstu jatemí ch enzymů (AST G3, bilirubin G3, ALP G3) znemožňující týdenní podávání dalších dávek. Známky účinku

Pacient 16 (Edinburg) s žaludečním adenokarcinomem primárně rezistentním vůči FAM. Malé zlepšení hlavních částí mízních uzlin kolem spodní křivky žaludku, osy břišní dutiny a pánve s dávkou aplidinu 1200 pg/m² týdne (3600 pg/m²).

····

ΦΦ φφφ· • φ · φ φφφφ

9 · • · ·

ΦΦ ··· • Φ ·· • · · · • · * • · · • « 4

ΦΦ ΦΦΦΦ

Pacient 23 (Barcelona) s ledvinovým nádorem a plicními uzly jako hlavním místem nemoci, primárně rezistentní vůči VBL + otIFN a lipozomálnímu doxorubicinu. Částečná remise plicních uzlů a klinické zlepšení s vymizením dušnosti po 2 iníůzích aplidinu s 2700 pg/m² týdně (8100 pg/m²).

Pacient 29 (Barcelona) s rakovinou ledvin. Klinické zlepšení při hodnocení supraklavikulámí adepopatie po 3 infuzích. Probíhající hodnocení je v druhém cyklu.

Farmakokinetické údaje

Farmakokinetika je lineární do současné dávkové hladiny 2700 pg/m². Významná variabilita mezi pacienty - variační koeficient clearance je 33 %. Relativně vysoká plazmová clearance s mediánem (kvartily) 329 (288 až 407 ml/min/m²)

Střední ti/₂ s mediánem (kvartily) 15,8 (13,3 až 19,5) hodin.

Rozsáhlá distribuce s mediánem (kvartily) Vss, 345 (220 až 398) 1/m²

Předběžná kompartmentová analýza ukázala, že profily nejlépe vyhovují trojkompartmentovému modelu prvého řádu s velmi rychlou počáteční fází (medián poločasu 0,04 h) následovanou střední fází (medián poločasu 1,4 h) a delší terminální fází (medián poločasu 20,7 h).

Závěry

Tato probíhající studie naznačuje, že aplidin podávaný jako 1 hodina infúze týdně s jedním týdnem přestávky je klinicky vhodná do dávky 3600 pg/m² každý týden. Toxicita ke kostní dřeni nebyla zaznamenána. Zvracení bylo zvládnutelné proíylaktickými antiemetiky. Svalová toxicita sestávala ze svalové slabosti a zvýšení kreatinkinázy u jednoho pacienta léčeného dávkou 3600 pg/m². U několika pacientů léčených nejvyšší studovanou úrovní dávky byla zaznamenána jatemí toxicita, i když DLT byla u 1 pacienta. Farmakokinetické informace naznačují, že

00··

0

0 0

0

0

0 » 000 0 • · potenciálně terapeutické úrovně jsou v plazmě dosažitelné u pacientů léčených dávkou od 1200 pg/m².

V současnosti je studována vhodnost dávky 3600 pg/m² každý týden (úroveň dávky VIII).

Příklad 18

Studium fáze I a farmakokinetické studium aplidinu, podávaného jako 24 hodin nepřetržitá infuze každý druhý týden pacientům s tvrdými nádory a nehodgkinským lymfomem

Charakteristiky pacientů

Počet pacientů	43	Typ nádoru
Medián věku, roky (rozmezí) Stav provedeného ECOG	52 (18 až 71)	Plicní Kolorektální
0	19	Ledvinový
1	21	Prsu
2	2	Slinivky břišní
Předcházející radioterapie	27	Lymfom
Předcházející chemoterapie (počet režimů)	Vaječníků
1	7	v Štítné žlázy
2	5	Kostní
>3	29	Melanom Prostaty Dělohy Mezoteliální v Žaludku Jiný

«9

9 9 «

9

9 «99«

9999 • 9 • 9

9« ··*♦

9 «994

9

9« 9 • 9

999

Soubor pacientů a zvyšování dávky

Hladina dávky	Dávka (pg/m2/2 týdny)	Počet pacientů	Počet cyklů (rozmezí)
I	200	3	5 (1 až 3)
II	400	3	6 (2 až 2)
III	800	3	9 (2 až 4)
IV	1600	6	ll(laž2)
V	3200	3	5 (1 až 2)
VI	4000	3	8 (2 až 4)
VII	5000	3	6 (2 až 2)
VIII	6000	12	26 (1 až 6+)
IX	7000	7	12(1 až 4+)
Celkem

* definice cyklu = 2 infuze po dvou týdnech

Nejhorší toxicity pro jednotlivé pacienty

Úroveň dávky	200	400	800	1600	3200	4000	5000	6000	7000
Počet pacientů	3	3	3	6	3	3	3	12	7
Ne volnost/zvracení G2	2	1		4	0)	2	1	2	1
Krevní návaly G1	-	-	1	-	1	1	-	-	1
Tělesná slabost G2 (G3)		2		2(1)	1	1	(1)	6	2
Svalové křeče G1+G2			2	1	2	2	2	1
Svalová bolest G1	-	-	-	-	O)	2	1	1(2)	1

• v»· • 4 v* 4444 » · * • · · · 4 · ·

4*4

4444

(G2)
Svalová slabost G1 (G2)							1	1(1)
Zvýšení CPK G2 (G3) [G4]							(1) [1]	1 (1)	1
Abnormální jatemí testy G2 (G3)	1			(1)			1		1
Hypertenze G2	-	1	-	-	-	-	-	-	-
Neutrofenie G4	-	-	-	-	-	-	-	-	1
Bolest při centrálním katetru G2						2

G = stupeň

Charakterizace svalové toxicity (DLT)

Pacient 27 - mužský pacient s medulámím karcinomem štítné žlázy léčený dávkou 6000 pg/m² týdne měl symptomy CPK stupně 3 se svalovou bolestí stupně

2. Toxické příznaky vymizely do tří týdnů po přerušení léčení.

Tři pacienti (5000 a 6000 pg/m²) měli menší zvýšení CPK (> stupně 2) sestávající z CPK MM (sval) nárůstu s nevýznamným nárůstem CPK MB (srdce). Bylo pozorováno paralelní zvýšení aldolázové hladiny. Při použití kamitinových doplňků jako protektorů kosterních svalů byla zaznamenána zlepšení. U dvou pacientů byly provedeny svalové biopsie, E/M - částečné vymizení silných vláken myozinu.

Farmakokinetické údaje

Aplidin má dávkově lineární farmakokinetický profil (s omezeními danými malou velikostí vzorku) • * · ·

Relativně vysoká plazmová clearance s hodnotou mediánu (kvartilů) 252 (192 až 415 ml/min/m²)

Vysoká variabilita clearance mezi pacienty (variační koeficient clearance 62 %) Střední až dlouhý ti/2 s hodnotou mediánu (kvartilů) 23,8 (15,7 až 35,0 hodin) Široká distribuce Vss s mediánem (kvartily) 413 (274 až 638 1/m²)

Předběžná kompartmentová analýza ukázala, že plazmové profily nejlépe vyhovují dvoukompartmentovému modelu prvního řádu s rychlou počáteční (medián poločasu 0,64 hodiny) a delší terminální fází (medián poločasu 25,8 hodiny).

Vztah myotoxicity aplidinu a farmakokinetiky

Svalová toxicita se objevila pouze u vysokých dávek a expozicích po 24 hodinách infuze.

Maximální hodnoty koncentrace po 1 hodině infuze jsou již vyšší než ty po 24 hodinách infuze. Proto může být vyloučen vztah k maximální koncentraci.

Hodnoty AUC u pacientů s myotoxicitou jsou vysoké, ale ne maximální.

Myotoxicita se týkala pacientů s vysokými přetrvávajícími koncentracemi aplidinu. U 3 pacientů s jasnou svalovou toxicitou byl tj/2 větší než 44 hodin ve srovnám s mediánem tj/2 = 25,8 hodiny po 24 hodinách infuze.

Obrázky 15a a 15b ukazují účinek u medulámího karcinomu štítné žlázy, a to hladiny CEA Závěry

Léčivo indukovalo svalové změny (pravděpodobně při dávce s limitní toxicitou), zaznamenané od dávkové hladiny III dále (1800 pg/m² až 5000 pg/m²). Dávka s limitní toxicitou je 6000 pg/m² (1/9 pacientů). Protinádorový účinek byl také zaznamenán u pacientů s nehodgkinským lymfomem a renálním karcinomem.

V současnosti probíhá studie na vhodnost dávek 6000 až 7000 pg/m² každý druhý týden s použitím kamitinových doplňků jako protektorů kosterního svalstva.

4 · * · · ·

444 444 ··· ··· ·* ····

TV ZflťU-

Claims (6)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Použití aplidinu pro přípravu farmaceutického přípravku pro léčení rakoviny u pacienta, kterému se ve farmaceutickém přípravku podává aplidin až do doporučené dávky, která je v souladu s údaji o toxicitě limitující dávku.
2. 2. Použití aplidinu pro přípravu farmaceutického přípravku pro léčení rakoviny u pacienta, přičemž tento farmaceutický přípravek obsahující aplidin se podává podle jednoho z následujících režimů zahrnujících 24 hodin infuze týdně po tři týdny, následované přestávkou 1 týdne, 24 hodin infuze jednou za čtrnáct dnů, 1 hodinu infuze týdně po tři týdny každé čtyři týdny, denní infůzi 1 hodinu po 5 dnů každé tři týdny a 3 hodiny infuze každý druhý týden.
3. 3. Použití aplidinu pro přípravu farmaceutického přípravku pro léčení rakoviny u pacienta, přičemž tento farmaceutický přípravek obsahující aplidin blokuje vylučování VEGF a autokrinní smyčku VEGF/VEGF.
4. 4. Použití aplidinu pro přípravu farmaceutického přípravku pro léčení rakoviny u pacienta, přičemž tento farmaceutický přípravek obsahující aplidin se podává jako součást kombinované terapie.
5. 5. Použití aplidinu pro přípravu farmaceutického přípravku pro léčení rakoviny u pacienta, přičemž tento farmaceutický přípravek obsahující aplidin se podává ve spojení s protektorem kosterního svalstva.
6. 6. Použití aplidinu pro přípravu farmaceutického přípravku pro léčení rakoviny u pacienta, kdy tento farmaceutický přípravek obsahující aplidin je podán pacientovi/pacientce, který/která již podstoupil/a standardní léčbu svého rakovinového onemocnění a nádor neustupuje.

   Pokles exprese flt-1, pozorovaný použitím potvrzený metodou RT-PCR

   0 0,5 1 6 flt1 techniky microarrays,

   Fig.1 aktin Použitím chránění RNázou byl kvantitativně vyhodnocen pokles flt-1 mRNA, indukovaný 20 nM aplidinu v buňkách MOLT-4

   Flt-1 mRNA EXPRESE % z kontrolních vzorků

   Fig.2 φφφφ φ φφ φφφφ • φφ φ φ · φφ φφ • φ φ φ φ φ φ φφ φφφφ

   VEGF-Flt-1 AUTOKRINNI SMYČKA