PL200922B1 - Zastosowanie aplidyny do wytwarzania kompozycji farmaceutycznej - Google Patents

Abstract

Wynalazek dotyczy zastosowania aplidyny do wytwarzania kompozycji farmaceutycznej do le- czenia raka u pacjenta, w którym aplidyna ma form e u zytkow a odpowiedni a do podawania do zylnego, zgodnie z jednym z nast epuj acych harmonogramów: - 24-godzinny wlew co tydzie n przez trzy tygo- dnie, a) nast epnie jeden tydzie n odpoczynku, przy zalecanej dawce nie wi ekszej ni z 3750 µg/m 2 po- wierzchni cia la pacjenta na tydzie n, b) - 24-godzinny wlew co dwa tygodnie, przy zalecanej dawce nie wi ekszej ni z 7000 µg/m 2 powierzchni cia la pacjenta na dwa tygodnie, c) - jednogodzinny wlew co ty- dzie n przez 3 tygodnie, a nast epnie jeden tydzie n odpoczynku, przy zalecanej dawce nie wi ekszej ni z 3600 µg/m 2 powierzchni cia la pacjenta na tydzie n. PL PL PL PL PL

Description

Przedmiotem wynalazku jest zastosowanie aplidyny do wytwarzania kompozycji farmaceutycznej do leczenia nowotworów rakowych.

Rak stanowi grupę złośliwych nowotworów, które można podzielić na dwie kategorie: raki, obejmujące większość przypadków obserwowanych w klinikach, oraz inne, rzadziej występujące raki, które obejmują leukemię, chłoniaka, nowotwory ośrodkowego układu nerwowego i mięsaka. Raki mają swój początek w tkankach nabłonkowych, natomiast mięsaki rozwijają się z tkanek łącznych i takie struktury mają swój początek w tkankach mezodermalnych. Mięsaki mogą atakować np. mięsień lub kość i występują w kościach, pęcherzu, nerkach, wątrobie, płucach, przyusznicy lub śledzionie.

Rak jest inwazyjny i wykazuje skłonność do przerzutów w nowe miejsca. Szerzy się on bezpośrednio w otaczających tkankach i może rozsiewać się układami chłonnymi i krążenia. Dostępne są liczne sposoby leczenia raka, w tym chirurgiczne i stosujące promieniowanie w przypadkach zlokalizowanej choroby oraz stosujące leki. Skuteczność działania dostępnych sposobów leczenia jest jednak w przypadku wielu rodzajów raka ograniczona i istnieje zapotrzebowanie na nowe, lepsze postacie leczenia, wykazujące kliniczne korzyści. Jest to szczególnie istotne dla chorych cierpiących na chorobę zaawansowaną i/lub przerzutową. Jest również istotne dla chorych z nawrotami postępującej choroby po uprzednim leczeniu ustalonymi sposobami leczenia, dla których dalsze leczenie tymi samymi sposobami jest najczęściej nieskuteczne wskutek nabycia oporności lub wskutek ograniczeń w stosowaniu tych sposobów leczenia, powstałych w związku z toksycznością.

Chemioterapia odgrywa ważną rolę w leczeniu raka, ponieważ jest niezbędna do leczenia zaawansowanych raków z odległymi przerzutami i często pomocna w zmniejszeniu guza przed zabiegiem chirurgicznym, toteż opracowano liczne leki przeciwrakowe, oparte na różnych sposobach działania.

Dehydrodidemnina B, obecnie zwana aplidyną, jest przedmiotem zgłoszenia WO91/0485.

Dalsze informacje o aplidynie można znaleźć np. w następujących źródłach:

Jimeno, J., „Exploitation of marine microorganisms and invertebrates: Anticancer drugs from marine origin”, IBC Conf. Discov. Drugs from Nat. Novel Approaches New Sources (8-9 grudnia, Londyn), 1994.

Faircloth, G., et al., „Dehydrodidemnin B (DDM) a new marine derived anticancer agent (MDA) with activity against experimental tumour models”, 9th NCI-EORTC Symp. New Drugs Cancer Ther. (12-15 marca, Amsterdam) 1996, Abst 111.

Sakai, R., et al., „Structure-activity relationships of the didemnins”, Journal of Medicinal Chemistry, 1996, 39 (14): 2819.

Urdiales, J.L., et al., „Antiproliferative effect of dehydrodidemnin B (DDB), a depsipeptide isolated from Mediterranean tunicates”, Cancer Letters, 1996, 102(1-2): 31.

Faircloth, G., et al., „Preclinical characterization of aplidine (APD), a new marine anticancer depsipeptide (MADEP)” Proc. Amer. Assoc. Cancer Res., 1997. 38: Abst 692.

Depenbrock, H., et al., „In vitro activity of aplidine, a new marine-derived anti-cancer compound, on freshly explanted clonogenic human tumour cells and haematopoietic precursor cells”, British Journal of Cancer, 1998. 78(6): 739.

Faircloth, G., et al., „Aplidine (aplidine) is a novel marine-derived depsipeptide with in vivo antitumour activity”, Proc. Amer. Assoc. Cancer Res., 1998, 39: Abst 1551.

Faircloth, G., et al., „Preclinical development of aplidine, a novel marine-derived agent with potent antitumour activity”, 10th NCI-EORTC Symp. New Drugs Cancer Ther. (16-19 czerwca, Amsterdam) 1998, Abst 129.

Mastbergen, S.C., et al., „Cytotoxicity and neurocytoxicity of aplidine, a new marine anticancer agent evaluated using in vitro assays”, 10th NCI-EORTC Symp. New Drugs Cancer Ther. (16-19 czerwca, Amsterdam) 1998, Abst 131.

W badaniach przedklinicznych aplidyna wykazała zależne od dawki działanie cytotoksyczne przeciw dwóm liniom komórek podobnych do nabłonkowych, CT-1 oraz CT-2, oraz linii komórek rakowych okrężnicy człowieka HT-29. Najbardziej rozrostowa linia CT-2 była najbardziej wrażliwa na aplidynę. Ponadto związek ten obniżał czynność dekarboksylazy ornitynowej we wszystkich trzech liniach komórek (Lobo C., Garcia-Pozo S.G. i in. Effect of dehydrodidemnin B on human colon carcinoma celi lines. (Działanie dehydrodidemniny B na linie komórek raka okrężnicy człowieka). Anticancer Research, 17, 333-336, styczeń-luty 1997). W podobnych badaniach aplidyna w stężeniu 50 nmol/dm³ powstrzymywała rozrost linii komórek raka sutka MDA-MB231 oraz MCF-7 odpowiednio o 17 i 47%.

PL 200 922 B1

W komórkach poddanych jej działaniu obserwowano znaczny wzrost spermidyny i sperminy (Gomez-Fabre P.M., De Pedro E. i in., Polyamine contents of human breast cancer treated with the cytotoxic agents chlorpheniramine and dehydrodidemnin B (Zawartość poliamin w komórkach raka sutka człowieka poddanych działaniu cytotoksycznych środków chlorofeniraminy i dehydrodidemniny B), Cancer Letters, 113, 141-144, 26 lutego 1997). Analiza liczenia komórek w przepływie (przepływowa analiza cytometryczna) wykazała, że aplidyna nie wywołuje żadnych wyraźnych zaburzeń cyklu komórkowego (Erba E., Balconi G. i in. Cell cycle phases perturbations induced by new natural marine compounds (Zaburzenia faz cyklu komórkowego wywołane nowymi naturalnymi związkami ze zwierząt morskich), Annals of Oncology, 7 (Suppl. 1), 82, 1996). U myszy aplidyna wykazywała działanie przeciw wszczepionej białaczce P388 i wszczepionemu czerniakowi B16 przy optymalnej dawce, wynoszącej 160 L9/kg. W przeciwieństwie do didemniny B, aplidyna wykazywała działanie w przypadku podskórnie wszczepionego raka płuc (Faircloth G., Rinehart K. i in., Dehydrodidemnin B a new marine derived anticancer agent with activity against experimental tumour models (Dehydrodidemnina B - nowy środek przeciwrakowy pochodzący ze zwierząt morskich, działający przeciw modelom nowotworów doświadczalnych), Annals of Oncology, 7 (Suppl. 1), 34, 1996).

Ciągłe poddawanie działaniu aplidyny w niskich stężeniach powstrzymywało rozrost licznych linii komórek nowotworowych, w tym chłoniaka nieziarnistego, czerniaka i czerniaka sutka, raka jajników i niemałych komórek raka płuc. Wielkość skutków działania zależała od czasu poddawania działaniu aplidyny i okazało się, że są one osiągalne przy stężeniach nietoksycznych dla szpiku. Linie komórek raka płuc niemałych komórek, raka sutka i czerniaka były wrażliwe na ciągłe poddawanie działaniu aplidyny w stężeniach >=0,001 Lmol/dm³. Aplidyna wykazywała toksyczność podobną jak doksorubicyna przeciw klonogenicznym krwiotwórczym komórkom macierzystym układu krwiotwórczego (Depenbrock H., Peter R. i in., In vitro activity of aplidine, a new marine-derived anticancer compound, on freshly explanted clonogenic human tumour cells and haemotopoietic precursor cells (Działanie in vitro aplidyny, nowego przeciwrakowego związku pochodzącego ze zwierząt morskich, na świeżo eksplantowane klonogeniczne komórki nowotworu człowieka i komórki prekursorów krwiotwórczych), British Journal of Cancer, 78, 739-744, nr 6, wrzesień 1998).

Aplidyna wykazała silne działanie przeciw heteroprzeszczepom raka człowieka noszonym przez myszy. Przy maksymalnie tolerowanej dawce 2,1 mg/kg aplidyna wywoływała prawie całkowitą remisję u niektórych zwierząt ze stosunkiem nowotworu u zwierząt poddawanych działaniu aplidyny i kontrolnych (T/C), wynoszącym 9%. Przy dawce 1,25 mg/kg było widoczne silne działanie przeciw nowotworom żołądka (T/C 14%) oraz powstrzymywanie rozrostu guza gruczołu krokowego (T/C 25%) (Fair G., Grant W. i in., Preclinical development of aplidine, a novel marine-derived agent with potent antitumour activity (Przedkliniczne badania aplidyny, nowego środka pochodzącego ze zwierząt morskich o silnym działaniu przeciwnowotworowym), Annals of Oncology, 9 (Suppl. 2), 34, 1998).

Zgodne z wynalazkiem jest zastosowanie aplidyny do wytwarzania kompozycji farmaceutycznej do leczenia raka u pacjenta, w którym aplidyna ma formę użytkową odpowiednią do podawania dożylnego, zgodnie z jednym z następujących harmonogramów:

a) - 24-godzinny wlew co tydzień przez trzy tygodnie, a następnie jeden tydzień odpoczynku, przy zalecanej dawce nie większej niż 3750 Lg/m² powierzchni ciała pacjenta na tydzień,

b) - 24-godzinny wlew co dwa tygodnie, przy zalecanej dawce nie większej niż 7000 Lg/m2 powierzchni ciała pacjenta na dwa tygodnie,

c) - jednogodzinny wlew co tydzień przez 3 tygodnie, a następnie jeden tydzień odpoczynku, przy zalecanej dawce nie większej niż 3600 Lg/m2 powierzchni ciała pacjenta na tydzień.

Korzystnie według wynalazku aplidyna ma formę użytkową odpowiednią do podawania dożylnego w 24-godzinnych wlewach co tydzień przez trzy tygodnie, a następnie z jednym tygodniem odpoczynku, przy zalecanej dawce nie większej niż 3750 Lg/m^ powierzchni ciała pacjenta na tydzień,

Korzystnie też według wynalazku aplidyna ma formę użytkową odpowiednią do podawania dożylnego w 24-godzinnych wlewach co dwa tygodnie, przy zalecanej dawce nie większej niż 7000 Lg/m powierzchni ciała pacjenta na dwa tygodnie, przy czym szczególnie korzystnie aplidyna ma formę użytkową odpowiednią do podawania dożylnego w 24-godzinnych wlewach co dwa tygodnie, przy zalecanej dawce nie większej niż 5000 Lg/m2 powierzchni ciała pacjenta na dwa tygodnie.

Również korzystnym według wynalazku jest zastosowanie, w którym aplidyna ma formę użytkową odpowiednią do podawania dożylnego w jednogodzinnych wlewach co tydzień przez 3 tygodnie, a następnie z jednym tygodniem odpoczynku, przy zalecanej dawce nie większej niż 3600 Lg/m2 powierzchni ciała pacjenta na tydzień, a zwłaszcza zastosowanie, w którym aplidyna ma formę użytkową odpowiednią

PL 200 922 B1 do podawania dożylnego w jednogodzinnych wlewach co tydzień przez 3 tygodnie, a następnie z jednym tygodniem odpoczynku, przy zalecanej dawce nie większej niż 2700 ug/m² powierzchni ciała pacjenta na tydzień.

Korzystnym według wynalazku jest zastosowanie, w którym aplidyna jest przygotowywana do podawania jako część leczenia skojarzonego, a w szczególności, w którym jest przygotowywana do podawania w połączeniu ze środkiem ochraniającym mięśnie szkieletowe, przy czym korzystnym środkiem ochraniającym mięśnie szkieletowe jest karnityna.

Zastosowanie według wynalazku jest szczególnie korzystne jeżeli chory otrzymywał już standardowe leczenie jego/jej choroby nowotworowej i nowotwór okazał się oporny.

Zastosowanie aplidyny według wynalazku jest korzystne w przypadkach leczenia dowolnego ssaka, w szczególności człowieka, zaatakowanego przez raka i prowadzi do klinicznego polepszenia stanu pacjenta.

Przykłady farmaceutycznych kompozycji, w których jest stosowana aplidyna obejmują ciecze (roztwory, zawiesiny lub emulsje) o odpowiednim składzie do dożylnego podawania, które mogą zawierać czysty związek albo w mieszaninie z dowolnym nośnikiem lub innymi farmakologicznie czynnymi związkami.

Aplidynę jako związek można stosować wraz z innymi lekami, wprowadzając leczenie skojarzone. Te inne leki mogą stanowić część tej samej kompozycji, albo można je dostarczać w postaci osobnej kompozycji, przeznaczonej do podawania w tym samym lub innym czasie. Tożsamość tych innych leków nie jest specjalnie ograniczona, a odpowiednimi kandydatami są:

a) leki o działaniu antymitotycznym, zwłaszcza takie, których celem są elementy struktur podporowych komórek, w tym modulatory mikrotubuli, takie jak leki taksanowe (takie jak taksol, paklitaksel, taksoter, docetaksel), podofilotoksyny lub alkaloidy barwnika (winkrystyna, winblastyna);

b) leki antymetaboliczne (takie jak 5-fluorouracyl, cytarabina, gemcytabina, analogi puryny, takie jak pentostatyna, metotreksat);

c) środki alkilujące lub iperyty azotowe (takie jak nitrozomoczniki, cyklofosfamid lub ifosfamid);

d) leki, których celem jest DNA, takie jak leki antracyklinowe, adriamycyna, doksorubicyna, farmorubicyna lub epirubicyna;

e) leki, których celem są topoizomerazy, takie jak etopozyd;

f) hormony i agoniści lub antagoniści hormonów, takie jak estrogeny, antyestrogeny (tamoksyfen i pokrewne związki) oraz androgeny, flutamid, leuprorelina, goserelina, cyprotron lub oktreotyd;

g) leki, których celem jest przetwarzanie sygnału w komórkach nowotworowych, w tym pochodne przeciwciał, takie jak herceptyna;

h) leki alkilujące, takie jak leki platynowe (cis-platyna, karboplatyna, oksaloplatyna, paraplidyneatyna) lub nitrozomoczniki;

i) leki potencjalnie zwalczające przerzuty nowotworowe, takie jak inhibitory metaloproteinaz substancji międzykomórkowej;

j) terapia genowa i środki przeciwczuciowe;

k) terapeutyka z udziałem przeciwciał;

l) inne biologicznie czynne związki, pochodzące ze zwierząt morskich, w szczególności kahalalid F lub ekteinascydyny, takie jak ET-743;

m) środki chroniące mięśnie szkieletowe, takie jak uzupełniające karnitynę;

o) inne leki, które zwalczają uboczne działanie aplidyny, takie jak środki przeciwwymiotne;

p) ogólnie biorąc leki, które umożliwiają dawkowanie aplidyny w zalecanych dawkach i tonizują toksyczność.

Odkryliśmy ponadto, że aplidyna inhibituje wyrażanie genu (FLT1) kodującego receptor czynnika wzrostu naczyniowo-śróbłonkowego (VEGF).

Ponadto odkryto, że aplidyna sama silnie inhibituje wytwarzanie białka VEGF przez komórki nowotworowe.

Uwalnianie VEGF przez masę komórkową, zwłaszcza masę komórek nowotworowych, powoduje nowe unaczynienie (rozwój naczyń), prowadzące do powstawania nowych naczyń krwionośnych, tworzących się w kierunku masy komórkowej i zakładających sieć kapilar, która jest zdolna do uzupełniania się przez irygację w celu jej nieprzerwanego rozrostu. Oczekuje się, że skutki działania, zwłaszcza wykazane zniesienie wytwarzania VEGF przez komórki nowotworowe, będzie silnie powstrzymywało zdolność komórek nowotworowych do wywoływania rozwoju naczyń. Ponadto VEGF jest niezbędny bezpośrednio niektórym

PL 200 922 B1 nowotworowym komórkom krwiotwórczym (takim jak komórki białaczki człowieka MOLT4) jako czynnik rozrostu.

Można więc przewidywać, że aplidyna będzie wykazywała działanie inhibitujące na nowe unaczynienie rozrastających się pierwotnych nowotworów lub przerzutów, powstrzymując dzięki temu rozrost nowotworów, o których wiadomo, że potrzebują unaczynienia dla rozrostu. Aplicydyna powinna też działać na nowotwory krwiotwórcze.

Wiadomo ponadto, że aplidyna moduluje działanie kanałów wapniowych w komórkach.

Nowotwory pęcherza są jednym z typów nowotworów, nadmiernie wyrażających receptory dla czynnika rozrostu nabłonkowego (EGF), co prowadzi do nadregulacji VEGF i receptorów VEGF. Uważa się, że wiązanie VEGF z jego receptorem prowadzi do pobudzenia rozrostu komórek przez przejściowe miejscowe zmiany poziomu jonów wapnia wśród innych mechanizmów sygnalizowania. Oczekuje się, że związek inhibitujący działanie VEGF będzie powstrzymywał takie nowotwory.

Stwierdzono doświadczalnie, że aplidyna wykazuje nadzwyczaj silne działanie na raka pęcherza u człowieka (powodując całkowitą remisję na niektórych modelach zwierzęcych), zgodnie z przewidywaniami.

Można przewidywać, że aplidyna będzie wykazywała szeroki wachlarz działań przeciwnowotworowych dzięki jej oddziaływaniom na bardzo liczne nowotwory.

Działanie na VEGF jest bardziej istotne, ponieważ wywołuje inhibitowanie powstawania nowych naczyń krwionośnych. Oprócz działania na naczynia krwionośne niektóre nowotwory potrzebują VEGF bezpośrednio dla rozrostu komórek (np. białaczka, chłoniaki, nowotwory pęcherza i nowotwory jajników).

W związku z tym wynalazek, który polega na określonym dawkowaniu aplidyny jest stosowany w przypadkach leczenia stanów naczyniotwórczych, takich jak zaburzenia rozwoju naczyń, w szczególności powstawanie nowotworu włącznie z przerzutami, a także w przypadkach wytwarzania inhibitora rozwoju naczyń, inwazji raka lub przerzutów raka. Aplidyna podawana jest po zmieszaniu skutecznie działającej dawki aplidyny z farmaceutycznie tolerowanym nośnikiem.

Reakcje u chorych na raka obserwowano w próbach klinicznych z aplidyną, dowodząc użyteczności zastosowania według wynalazku.

Faza l badań klinicznych i analiza farmakokinetyczna dowodzą, że aplidyna stanowi pozytywne terapeutyczne wyjście z możliwą do opanowania toksycznością w zakresie dawkowania niezbędnego do osiągnięcia klinicznej skuteczności w leczeniu chorych na raka.

Aplidynę dostarcza się i przechowuje w postaci sterylnego liofilizowanego produktu, zawierającego aplidynę i zaróbkę w preparacie nadającym się do terapeutycznego użytku.

Solubilizowana aplidyna wykazuje znaczny rozkład w warunkach testowania obciążeniem cieplnym lub świetlnym, toteż opracowano liofilizowaną postać dawkowania; patrz WO99/42125. W korzystnym obecnie rozwiązaniu prowadzono liofilizację roztworu o stężeniu 500 mg/cm³ aplidyny w 40% (obj./obj.) tert-butanolu w wodzie do zastrzyków (Wfl), zawierającym 25 mg/cm3 D-mannitu jako środka spęczniającego. Stwierdzono, że prototyp, zawierający 500 mg aplidyny i 25 mg D-mannitu jako środka spęczniającego w fiolce, jest optymalnym preparatem w sensie rozpuszczalności, długości cyklu liofilizacji i wymagań dawkowania w badaniach klinicznych. Stwierdzono też, iż optymalny powtarzalny roztwór zawiera 15/15/70% objętościowych Cremaphor EL/etanolu/Wfl (CEW). Okazało się, że zarówno ten powtarzalny produkt, jak i rozcieńczenia (do 1:100 objętościowo) tego powtarzalnego produktu w normalnym roztworze soli są trwałe przynajmniej przez 24 godziny po ich przygotowaniu. Dostępne dotychczas dane o dopuszczalnym okresie magazynowania wskazują, że preparat ten jest trwały przynajmniej przez 1 rok, jeśli przechowuje się go w 4°C w ciemności.

Wytwarzanie roztworu do wlewu prowadzi się również w aseptycznych warunkach przez pobieranie objętości tego odtwarzalnego roztworu, odpowiadającej dawkowaniu obliczonemu dla każdego chorego, i powolne wstrzykiwanie wymaganej objętości tego odtwarzalnego roztworu do worka wlewowej ^lu^{b b}ute^lkh zawⁱeraj^ąc^yc^h o^{d 100 d}o ¹⁰⁰⁰ cm^{3 0,9}% cMor^ku so^du ^po cz^ym cato^ść homo^genizuje się przez powolne ręczne wstrząsanie. Roztwór wlewowy aplidyny powinno się podawać dożylnie, jeśli to tylko możliwe, w ciągu 48 godzin po jego wytworzeniu. Korzystnymi materiałami na zbiorniki i przewody są polichlorek winylu i polietylenowe układy wlewowe, a także bezbarwne szkło.

Podawanie prowadzi się cyklicznie. W razie potrzeby dokonuje się opóźnienia i/lub zmniejszenia dawki oraz dostosowania schematu leczenia w zależności od indywidualnej tolerancji chorego na leczenie, zwłaszcza zaleca się zmniejszenie dawek w przypadku chorych o wyższych niż normalne poziomach aminotransferaz wątrobowych lub fosfastazy zasadowej albo bilirubiny w surowicy krwi.

PL 200 922 B1

Zalecana dawka (RD) oznacza najwyższą dawkę, którą można bezpiecznie podawać choremu powodując tolerowaną, możliwą do opanowania i odwracalną toksyczność według ogólnych kryteriów toksyczności, ustalonych przez National Cancer Institute (USA), przy czym nie więcej niż 2 spośród 6 chorych wykazuje jakieś toksyczności ograniczające dawkę (DLT).

Wytyczne dla leczenia raka często nawołują do podawania chemioterapeutycznych środków w najwyższej bezpiecznej dawce, przy której toksyczność jest możliwa do opanowania, w celu osiągnięcia maksymalnej skuteczności (DeVita, V. T. Jr, Hellman, S. i Rosenberg, S. A., Cancer: Principles and Practice of Oncology, 3. wydanie, 1989, Lipincott. USA).

DLT dla aplidyny oznaczano w badaniach klinicznych. Badania te doprowadziły do ustalenia zalecanego poziomu dawki dla różnych rodzajów procedur dawkowania.

Aplidynę można bezpiecznie podawać na poziomie dawkowania zalecanej dawki (RD) lub określonej poniżej.

- 24 godziny wlewu co tydzień przez kilka tygodni, np. trzy tygodnie, a następnie jeden tydzień odpoczynku;

- co 2 tygodnie wlew przez 24 godziny;

-1 godzina wlewu na tydzień przez 3 tygodnie w każdych 4 tygodniach.

W szczególności dożylny wlew można prowadzić jako wlew przez 24 godziny raz na tydzień przez 3 tygodnie w okresie 4 tygodni. Więcej danych podano w przykładach 3, 4, 10 oraz 11. Wydaje się, że odpowiednia zalecana dawka wynosi 3750 ąg/m²/tydzień x 3. Procedurę tę poprawiono i chorzy będą teraz leczeni z zastosowaniem innego schematu, który wydaje się możliwy do przeprowadzenia: 3 godziny wlewu co 2 tygodnie bez odpoczynku. Zobacz przykład 11. W badaniach 24 godz. co 2 tygodnie chorych leczy się dawką 7000 ąg/m²/2 tygodnie. Zobacz przykłady 6, 13 i 16. Chorych objętych badaniami 1 godz./tydzień przez każdy z 3 tygodni i następnie jednym tygodniem odpoczynku leczy się dawkami do 3600 ąg/m²/tydzień przez 3 tygodnie. Zobacz przykłady 12 oraz 15. Gdy aplidynę stosuje się w połączeniu z innymi terapeutycznymi środkami, to dawkowania obydwu środków mogą wymagać dostosowania.

Uprzednio opisywane podstawowe reakcje biologiczne na podawanie aplidyny obserwowano na modelach zwierzęcych lub in vitro, o których wiadomo, że są notorycznie mylące w odniesieniu do ich użyteczności w przewidywaniu reakcji chorych ludzi, albo u chorych ludzi w układach doświadczalnych, gdzie skuteczny, bezpieczny sposób leczenia był nieosiągalny (albo stosowane dawkowanie oznaczało dawkę toksyczną, znacznie przewyższającą dawkę zalecaną, albo schemat podawania był nieodpowiedni).

W próbach klinicznych, stosujących harmonogramy według wynalazku, osiągano odpowiednie poziomy w osoczu przy RD, a co najważniejsze, obiektywnie mierzalne reakcje dowiodły występowania klinicznych korzyści u chorych.

Określenia toksyczności u chorych przyjęto według kryteriów WHO (Światowej Organizacji Zdrowia), a reakcje oznaczano według kryteriów odpowiedzi WHO.

Obiektywne reakcje uzyskano u chorych z zaawansowanymi i/lub przerzutowymi rakami opornymi na poprzednie leczenia, które obejmują reakcje przedstawione w przykładach.

W konkretnym leczeniu wykazano pozytywne reakcje u chorych na raka z zaawansowaną i/lub przerzutową chorobą, którzy wykazywali postępującą chorobę po uprzednim poddaniu ich uznanym terapiom, a zatem korzystne jest rozpoznanie chorych na raka, którzy byli już leczeni na raka, zwłaszcza chorych, wobec których stosowano chemioterapię, i poddanie ich leczeniu aplidyną.

Opis rysunków

Na fig. 1 przedstawiono zmniejszenie wyrażania flt-1, obserwowane z użyciem mikroukładów, potwierdzone analizą RT-PCR.

Na fig. 2 przedstawiono zmniejszenie flt-1 mRNA wywołane aplidyną w komórkach MOLT-4.

Na fig. 3a oraz 3b przedstawiono pętlę autokrynową VEGT-Flt-1 w komórkach MOLT-4 oraz skutek działania aplidyny.

Na fig. 4 przedstawiono blokowanie aplidyną wydzielania VEGF z komórek MOLT-4.

Na fig. 5 przedstawiono wywołane aplidyną blokowanie wydzielania VEGF.

Na fig. 6 przedstawiono silne obniżenie poziomów VEGF mRNA w komórkach MOLT-4.

Na fig. 7 przedstawiono, że dawka aplidyny nie obniża aktywności promotora VEGF transfekowanego w komórkach MOLT-4.

Na fig. 8 przedstawiono brak blokowania przez aplidynę wiązania czynników transkrypcji HIF-1 i AP-1 z ich zgodnymi sekwencjami DNA, występującymi w promotorze VEGF.

PL 200 922 B1

Na fig. 9 przedstawiono brak blokowania przez aplidynę wiązania czynnika transkrypcji HIF-1 z jego zgodnymi sekwencjami DNA, występującymi w promotorze VEGF.

Na fig. 10a oraz 10b przedstawiono, że VEGF dodany do pożywki hodowlanej komórek MOLT-4 nieznacznie obniża działanie aplidyny w niskich stężeniach, natomiast w przypadku wysokich stężeń nie wywiera wpływu.

Na fig. 11 przedstawiono, że aplidyna jest zdolna do zmniejszania wydzielania VEGF z linii rakowej jajników u człowieka IGROV-1.

Na fig. 12 przedstawiono, że aplidyna obniża poziomy mRNA VEGF również w linii rakowej jajników u człowieka IGROV-1.

Na fig. 13 przedstawiono, że aplidyna nie wpływa na aktywność promotora VEGF, mierzoną z zastosowaniem układu genów dostarczającego lucyferazę/renillę.

Na fig. 14 przedstawiono zależność AUC od dawki.

Na fig. 15a oraz 15b przedstawiono działanie w przypadku rdzeniowego raka tarczycy: poziomy ACE.

P r z y k ł a d 1 (porównawczy)

Profil wyrażania genu w ludzkich komórkach białaczki MOLT-4, poddanych działaniu aplidyny, związku ze zwierząt morskich

Wczesne zmiany wyrażania genu, wywołane przez aplidynę w komórkach MOLT-4, oceniano z zastosowaniem układów wyrażania cDNA (Atlas Human Cancer, Clontech). Komórki MOLT-4 poddawano przez 1 godzinę działaniu aplidyny w stężeniach, w których powstrzymuje ona rozrost o 50% i całkowitą ilość RNA wydzielano po 0, 1,6 i 24 godzinach po wymyciu leku. Filtry krzyżowano z równą ilością cDNA znakowanego ³²P. Wyniki analizowano z użyciem oprogramowania ATLAS IMAGE 1.0. Zmiany wyrażania genu większe niż dwukrotne przyjmowano jako istotne zmiany wyrażania RNA, a następnie potwierdzano przez PGR. Obserwowano znaczne zmniejszenie wyciśnięcia VEGF-R1 (flt-1) zależne od czasu i potwierdzano poziom RNA przez PCR oraz na poziomie białka metodą Western.

P r z y k ł a d 2 (porównawczy)

Korelacja selektywnych działań przeciwnowotworowych aplidyny, w związku pochodzącego ze zwierząt morskich, z zastosowaniem różnych układów modelowych

W celu utworzenia podstawy dla dalszych prac klinicznych oceniono różne układy modelowe. Selektywne działania przeciwnowotworowe rozpatrywano dla dwóch histologicznie odmiennych litych guzów: raka żołądka i raka gruczołu krokowego u człowieka. Wykazano silne działanie in vitro na próbki pierwotnego nowotworu żołądka lub na komórki nowotworu żołądka Hs746T odpowiednio z wartościami IC50, wynoszącymi 146 i 450 pM. Nie tak silne działanie, ale niemniej selektywne, z wartością IC50 wynoszącą 3,4 nM, określono w przypadku nowotworowych komórek gruczołu krokowego PC-3. Działania in vitro oceniano u nagich gryzoni z wykorzystaniem podskórnie wszczepianych fragmentów nowotworów lub kanalikowych (pustych) włókien (HF), zawierających komórki nowotworowe.

T a b l i c a 1.

Optymalna dawka i działania in vitro aplidyny

Nowotwór	Linia	Harmonogram	Model podskórny	Zwierzę	Dawka (mg/kg)	Działanie (% T/C)
Żołądka	MRI-	Codziennie 9. ip	Heteroprzeszczep	Mysz	2,1	19%
	H254
		Codziennie 4x3. ip	Heteroprzeszczep	Mysz	1,05	17%
					1,25	18%
		24 godz. wlew	HF	Szczur	0,7	20%
		dożylny
Prostaty	PC-3	Codziennie 9. ip	Heteroprzeszczep	Mysz	1,25	25%
		Codziennie 4x3. ip	Heteroprzeszczep	Mysz	0,62	30%
					2,10	34%
		24 godz. wlew	HF	Szczur	1,05	38%
		dożylny			0,70	31%
		5 dni wlew dożylny	HF	Szczur	0,70	33%

PL 200 922 B1

Optymalne działania obserwowano w przypadku nowotworów heterowszczepianych żołądka (17-20%) i gruczołu krokowego (25-38%) po podawaniu ip. Następne badania wymagały użycia szczurów do wlewu dożylnego. W tej ich odmianie harmonogram 24 godz. wlewu dożylnego powodował podobne działania przeciw komórkom nowotworowym HF żołądka (20%) i HF gruczołu krokowego (31%). Określono również cytotoksyczność z zastosowaniem harmonogramu 5 dni wlewu dożylnego przeciw nowotworowym komórkom HF gruczołu krokowego (33%). Rozszerzone oceny in vivo nie tylko wykazywały, że występuje silna względna korelacja z profilem cytotoksycznym in vitro, ale również silna korelacja z modelami in vivo, używanymi do charakteryzowania selektywności nowotworów, która identyfikuje aplidynę jako kandydata do przeprowadzenia badań klinicznych.

P r z y k ł a d 3

Faza l i badania farmakokinetyczne aplidyny podawanej co tydzień 24-godzinnym wlewem chorym z zaawansowanymi guzami litymi

Badania in vivo ujawniły, że działanie in vivo wzrasta przy przedłużaniu czasu trwania wlewu. W badaniach tych leczono 16 chorych. Charakterystyka chorych: mediana wieku 55 lat, mediana PS 1, mężczyzna/kobieta 11/5, przy czym rodzaje nowotworów były następujące: głowy i szyi 5, nerek 2, okrężnicy 3, odbytnicy 2, mięsak 1 i czerniaki 3, wszyscy wcześniej leczeni chemioterapią (mediana 2 linie terapii).

Aplidynę podawano przez 24-godzinny wlew na następujących poziomach dawek (DL): 133 (3 chorych), 266 (3 chorych), 532 (3 chorych), 1000 (3 chorych), 2000 (3 chorych) i 1000 (1 chory) Lg/m²/tydzień trzykrotnie co 28 dni.

Nie zaobserwowano toksyczności ograniczających dawkę (DLT). Zanotowano jedynie łagodne toksyczności nie hematologiczne, obejmujące 1 mdłości, 1 zapalenie błony śluzowej, 1 osłabienie. Zwykle występowało zapalenie żyły w ramieniu z wlewem, zależne od stężenia. U wszystkich chorych wykonywano analizę farmakokinetyczną, wykazując poziomy w osoczu przy poziomach dawek 1000 ug/m²/tydzień i 2000 ąg/m²/tydzień równoważne czynnemu stężeniu in vitro (1 ng/cm³). Przy poziomie dawki DL 532 ąg/m²/tydzień zaobserwowano kliniczne polepszenie u 1 wcześniej leczonego chorego z zaawansowanym czerniakiem.

P r z y k ł a d 4

Faza l i farmakokinetyczne (PK) badania aplidyny (APL) z zastosowaniem schematu 24-godzinnego co tydzień

Dotychczas w tej fazie l badań leczono 25 chorych (mediana wieku 58 lat, mediana ECOG (elektrokardiogramów) 1) z zaawansowanymi, uprzednio leczonymi guzami litymi lub chłoniakami. Stosując schemat APL 24 godziny na tydzień trzykrotnie, a następnie z 1 tygodniem odpoczynku, badano następujące poziomy dawek: 133 (3 chorych) 266 (3), 532 (3), 1000 (3), 2000 (3), 4500 (3) i 3750 ug/m²/tydzień (3). Przy podanych 60 cyklach (180 wlewach) wszystkich chorych można było ocenić pod względem toksyczności. Maksymalna tolerowana dawka wynosiła 4500 ąg/m²/tydzień trzykrotnie ze stopniem (G) 3 toksyczności mięśniowej (biopsja wykazała zanik mięśni II typu). U 2 lub 4 chorych toksyczności ograniczające dawkę wynosiły G4 CPK oraz G3 transaminitis. U większości pacjentów obserwowano G2 złego samopoczucia i G2/3 wymiotów przy >2000 ug/m2, zapalenie żyły jest powszechne, ale zależne od stężenia. Od wszystkich chorych pobierano próbki do analizy PK przez LC/MS/MS. Wstępne dane wskazują na rozległe rozprowadzanie w tkance, długotrwałe wydalanie, t 1/2 10-24 godz., i poziomy w osoczu >1 ng/cm3 (które działają in vitro). /eden chory z zaawansowanym czerniakiem opornym na DTIC/interferon uzyskał kliniczną poprawę, utrzymującą się ponad 30 tygodni. Te badania nad cotygodniowym wlewem wykazują możliwość prowadzenia oraz działanie schematu APL o gęstej dawce. Toksyczność nerwowo-mięśniowa ograniczała dawkę, jak tego oczekiwano. /ako możliwą zalecaną dawkę ocenia się 3750 ąg/m²/tydzień stosowaną trzykrotnie.

P r z y k ł a d 5

Kliniczna farmakokinetyka (PK) aplidyny (APL) u chorych z guzami litymi i chłoniakami nieziarniczymi

W fazie l oceny występują cztery schematy dożylne: cotygodniowy wlew 24-godzinny, 24-godzinny wlew co dwa tygodnie i jednogodzinny wlew przez 5 kolejnych dni przez każde 3 tygodnie. Stężenie APL we krwi analizowano przez chromatografię cieczową sprzężoną ze spektrametrią masową. Początkowe wyniki wykazują akumulację w krwinkach i PK osocza charakteryzującą się rozległym rozprowadzeniem (objętość rozprowadzenia zwykle przekracza 200 dm3/m²) i okresem półtrwania wydalania rzędu od 10 do 24 godz. Otwarty model dwukomorowy pasuje odpowiednio do większości profili po 24-godzinnym wlewie. W większości przypadków dla jednogodzinnych wlewów trzykomorowy

PL 200 922 B1 model zapewnia lepsze dopasowanie. Wiadomo, że uzyskane poziomy w osoczu są czynne in vitro. W trakcie jest ocena pozostałych chorych oraz porównanie PK krwinek i osocza.

P r z y k ł a d 6

Wstępne wyniki fazy l i farmakokinetyczne badanie aplidyny podawanej przez 24-godzinny wlew co 2 tygodnie chorym z guzami litymi i chłoniakami nieziarniczymi.

Aplidynę podaje się przez 24-godzinny wlew co 2 tygodnie. Początkowa dawka wynosiła 200 Lg/m²/dzień i następowało podwyższanie dawki dotychczas do 400, 800, 1600 i 3200 ąg/m/dzień. Przystąpiło ogółem 18 chorych (mężczyźni/kobiety: 7/11), mediana wieku 52 lata, OMS 0/1: 10/8). Dotychczas nie zaobserwowano toksyczności ograniczającej dawkę. Wśród możliwych do oceny chorych toksyczność polegała na łagodnym stopniu l-ll nudności i wymiotów, stopniu l-ll osłabienia i kurczach, występujących podczas wlewu lub zaraz po wlewie. Nie zanotowano toksyczności nerwowo-mięśniowej przy ocenianych dawkach. Jeden z chorych z zaawansowanym rakiem płuc i dowiedzionym postępem nowotworu przy dawce 1600 ąg/m² zapadł na niedokrwistość hemolityczną i małopłytkowość, co uznano na niemożliwe do powiązania z badanym lekiem. Początkowa analiza farmakokinetyczna wykazała, że lek ten rozlegle rozprowadza się i stężenia we krwi. Otwarty model dwukomorowy pasuje odpowiednio do większości profili stężeń w osoczu. Końcowy okres półtrwania jest zwykle rzędu 10-24 godz. Kliniczną poprawę zaobserwowano u chorego z chłoniakiem nieziarniczym. Gromadzi się dane w celu określenia toksyczności ograniczającej dawkę oraz zalecanej dawki w fazie II badań.

P r z y k ł a d 7 (porównawczy)

Profil wyrażania genu w komórkach białaczkowych człowieka MOLT-4, poddanych działaniu aplidyny, związku ze zwierząt morskich

W tych badaniach ocenialiśmy wczesne zmiany wyrażania genów, wywołane przez aplidynę w komórkach MOLT-4, z zastosowaniem układów wyrażania cDNA (Atlas Human Cancer, Clontech). Komórki MOLT-4 poddawano przez 1 godzinę działania aplidyny w stężeniach, które inhibitują rozrost o 50% i wydzielano całe RNA 0, 1, 6 i 24 godziny po odmyciu leku. Filtry krzyżowano z różnymi ilościami cDNA znakowanego ³²P. Analizę wyników prowadzono z zastosowaniem oprogramowania ATLAS IMAGE 1.0. Zmiany wyrażania genu większe niż dwukrotne przyjmowano jako zmiany istotne w wyrażaniu RNA, a następnie potwierdzano przez PGR. Obserwowano znaczne zmniejszenie wyrażania VEGF-R1 (flt-1) w zależności od czasu i potwierdzano na poziomie RNA przez PCR i na poziomie białka za pomocą Western blotting. Obecnie bada się, czy obniżenie flt-1 jest powodowane cytotoksycznym i przeciwnowotworowym działaniem aplidyny. Ponadto opracowuje się teraz charakterystykę wyrażania innych genów, których obniżenie pojawia się po poddaniu działaniu aplidyny.

Ilościowe zmiany wyrażania genów, wywołane przez aplidynę w komórkach MOLT-4

Gen	1 godzina	6 godzin	24 godziny
B-RAF	-	+2,0	+2,6
FLT-1	-1,5	-5,0	-3,4
FMS	-	+2,7	+2,1
ETR	+2,7	-	-
DNA-PK	-	+3,0	+3,8
PLK-1	-	+3,0	+4,4

Obniżenie wyrażania flt-1, obserwowane z zastosowaniem mikroukładów, potwierdzono się przez analizę RT-PCR; zobacz fig. 1.

Stosując ochronę RNazą obliczaliśmy obniżenie flt-1 mRNA, wywołane przez 20 nM aplidynę w komórkach MOLT-4, zobacz fig. 2.

Na fig. 3a i fig. 3b przedstawiono pętlę autokrynową VEGF-Flt-1 w komórkach MOLT-4 oraz wpływ działania aplidyny na tę pętlę autokrynową VEGF-Flt-1.

Blokowanie przez aplidynę wydzielania VEGF z komórek MOLT-4, zobacz fig. 4. Komórki poddawano działaniu przez 1 godzinę 20 nM aplidyny. VEGF wydzielony w pożywce mierzono metodą ELISA po zakończeniu tego działania oraz po 6 i 24 godzinach inkubacji w pożywce nie zawierającej leku.

Wywołane przez aplidynę blokowanie wydzielania VEGF zależy od stężenia i można je obserwować już przy stężeniu 5 nM, zobacz fig. 5.

PL 200 922 B1

Stosując ochronę RNazą można zaobserwować silne obniżenie poziomów VEGF mRNA w komórkach MOLT-4 po poddaniu działaniu 20 nM aplidyny, zobacz fig. 6.

Aplidyna nie obniża działania promotora VEGF transfekowanego do komórek MOLT-4, zobacz fig. 7. Komórki transfekowano promotorem VEGF obejmując pierwszy 1000 podstaw w górę zaczynając od miejsca związania z genem reporterowym lucyferazy i z kontrolnym plazmidem, zawierającym gen reporterowy renilli. Następnie komórki poddawano działaniu aplidyny o różnych stężeniach i mierzono aktywność lucyferazy po 24 godzinach i porównywano z aktywnością renilli.

Aplidyna nie blokuje wiązania czynników transkrypcji HIF-1 i AP-1 z ich zgodnymi sekwencjami DNA, występującymi w promotorze VEGF, zobacz fig. 8. Ekstrakty jądrowe inkubowano z aplidyną w różnych stężeniach i znakowanymi oligonukleotydami przez 60 min. Stosując próbę żelowego opóźnienia mierzono ciągle wiązanie HIF-1 lub AP-1.

Aplidyną nie blokuje wiązania czynnika transkrypcji HIF-1 z jego zgodnymi sekwencjami DNA, występującymi w promotorze VEGF, zobacz fig. 9. Ekstrakty jądrowe, uzyskane z komórek, poddawane działaniu aplidyny o różnych stężeniach, inkubowano ze znakowanymi oligonukleotydami przez 60 min. Stosując próbę żelowego opóźnienia mierzono ciągle wiązanie HIF-1.

VEGF (10 ng/cm³), dodany do pożywki hodowlanej komórek MOLT-4, hodowanych w 10% FCS, słabo obniża działanie aplidyny o niskich stężeniach, natomiast przy wyższych jej stężeniach nie ma na nie wpływu, zobacz fig. 10a i fig. 10b.

Aplidyna jest również zdolna do zmniejszania wydzielania VEGF z linii nowotworowej jajników człowieka IGROV-1, zobacz fig. 11.

Aplidyna obniża poziomy VEGF w mRNA również w linii nowotworowej jajników człowieka IGROV-1, zobacz fig. 12.

Aplidyna nie ma wpływu na aktywność promotora VEGF, mierzoną z zastosowaniem układu genu dostarczającego lucyferazę i renillę, zobacz fig. 13.

P r z y k ł a d 8 (porównawczy)

Aplidyna blokuje wydzielanie VEGF oraz pętlę autokrynową VEGF/VEGF-R1 w linii komórek białaczkowych człowieka.

Stwierdzono, że aplidyna wywołuje silną apoptozę w linii komórek białaczkowych człowieka MOLT-4. W tej samej linii komórek analiza mikroukładowa wykazała zmiany wyrażania różnych genów w krótkich czasach po poddaniu działaniu aplidyny. Wśród nich odkryliśmy, że poziom VEGF-R1 (flt-1) obniża się pod działaniem leku i to obniżenie potwierdza analiza za pomocą Northern i Western blotting. Dalsze badania wykazały, że poddawanie tego samego układu komórkowego działaniu tego związku powodowało silne zmniejszenie wydzielania VEGF do pożywki. Obniżenie wydzielania VEGF było związane ze zmniejszeniem w mRNA kodowania VEGF w komórkach MOLT-4, poddanych działaniu aplidyny. Próbując wyjaśnić mechanizm blokowania przez aplidynę wydzielania VEGF odkryliśmy, że związek ten nie zmienia okresu półtrwania VEGF mRNA. Podobnie w oznaczeniu przesunięcia elektroruchliwości aplidyna nie zmieniała zdolności dwóch czynników transkrypcji, HIF-1 oraz AP-1, do wiązania ich odpowiednich zgodnych sekwencji występujących w promotorze VEGF i nie obniżała transkrypcji VEGF, gdy w doświadczeniach przejściowej transfekcji stosowano konstrukt promotora VEGF lucyferazy. Obniżone wydzielanie aplidyny było związane z podwyższonym wewnątrzkomórkowym nagromadzeniem się VEGF, sugerując mocno, że związek ten może działać przez blokowanie wydzielania VEGF. Równoczesne poddawanie komórek MOLT-4 działaniu aplidyny w niskich stężeniach oraz VEGF częściowo znosi działanie aplidyny, sugerując, że lek ten może częściowo wykorzystywać swoją aktywność w tym układzie komórkowym do blokowania pętli autokrynowej VEGF/VEGF-RI.

P r z y k ł a d 9 (porównawczy)

Profil bezpieczeństwa aplidyny, naturalnego produktu ze zwierząt morskich, wykazującego chemioterapeutyczny potencjał

Podczas stosowania komórek CellTiter 96 (MTS, Promega) w próbie cytotoksyczności in vitro aplidyna wykazuje słabą toksyczność wątrobową (AML-12) lub sercową (H9 c2 (2-1); (LD₅₀ wynosi 1 μΜ). Natomiast aplidyna jest bardzo toksyczna dla komórek mięśni szkieletowych (L8) i nerek (NRK-52EE) (LD₅₀ wynosi 0,1 nM) oraz średnio toksyczna dla macierzystych komórek pochodzenia szpikowego (FDC-P1, LD50 wynosi 0,1 μM), co ściśle zgadza się z danymi toksyczności klinicznej. W istocie toksycznością ograniczająca dawkę u człowieka jest zanik mięśni szkieletowych.

Aplidyna wykazuje neurotoksyczność w wyższych stężeniach in vitro. Stosując fluorescencyjny barwnik żywotności (homodimer etydyny i kalceiny AM, Molecular Probes) sprzężony z immunocytochemią zaobserwowaliśmy, że około przy 1 μM aplidyna jest toksyczna dla komórek mózgowych

PL 200 922 B1 (zarówno neuronów jak i astrocytów) i ruchowych (transferazy acetylocholinowej dodatniej) w rdzeniu kręgowym, ale nie neuronów czuciowych pozytywnych względem substancji P. Wrażliwość neuronów ruchowych może pomóc w wyjaśnieniu obserwowanego zaniku mięśni typu II (jak przewidywano) w małej grupie chorych, u których stężenie leku w AUC jest podwyższone wskutek obniżonego wydalania.

P r z y k ł a d 10

Faza l klinicznych i farmakokinetycznych badań aplidyny, nowej didemniny pochodzącej ze zwierząt morskich, podawanej przez 24-godzinny wlew raz na tydzień.

Fazę l próby wykonywano stosując 24-godzinny wlew raz na tydzień przez trzy tygodnie oraz 1 tydzień odpoczynku. Leczono 32 chorych (mediana wieku 58 lat, mediana ECOG 1) z zaawansowanymi, uprzednio leczonymi guzami litymi. Otrzymali oni 64 cykle (mediana na chorego: 2 (1-6) przy 8 poziomach dawki: 133 (3 chorych) 266 (3 chorych), 532 (3 chorych), 1000 (3 chorych), 2000 (3 chorych), 3000 (3 chorych), 4500 (4 chorych) i 3750 ąg/m/tydzień (10 chorych). Dwóch na trzech możliwych do oceny chorych wykazywało DLT wynoszącą 4500 ąg/m²/tydzień: stopień (G) 4 odwracalnej toksyczności nerwowo-mięśniowej (zanik mięśni typu II zapobiegania z biopsji) oraz G4 wzrostu CK (1 chory) i G3 przejściowej transaminitis (1 chory). Inne toksyczności obejmowały G 1-2 złego samopoczucia (większość pacjentów leczonych dawką >3000 ąg/m²/tydzień), kurcze mięśni, G 1-2 wymiotów (reagujących na środki przeciwwymiotne) oraz reakcję na miejscowe wstrzykiwanie (bardzo powszechna i zależna od stężenia). Od wszystkich chorych pobierano próbki do analizy PK metodą LC/MS/MS. Farmakokinetyki są liniowe, a profile pasują do otwartego modelu dwukomorowego. Lek wykazuje rozszerzoną dystrybucję w tkance (Vss= 611 dm³), wysoki klirens (0,47 dm³/min) i t_1/2 wydalania 18,8 godz. Utrzymujące się poziomy w osoczu >1 ng/cmr³ (czynne in vitro) uzyskiwano przy dawkach >3000 ug/m2. /eden z chorych z zaawansowanym czerniakiem, opornym na DTIC/interfero>n, wykazał wyraźną kliniczną poprawę, utrzymującą się >30 tygodni. Czterej inni chorzy wykazali mniejsze reakcje lub stabilność choroby przez >4 miesiące. W konkluzji DLT aplidyny podawanej w schemacie cotygodniowego wlewu oznaczała odwracalną toksyczność mięśni oraz transaminitis, które obserwowano przy MTD, wynoszącej 4500 ąg/m²/tydzień. Zalecana dawka dla przyszłych prób, wynosząca 3750 ąg/m²/tydzień przez 3 tygodnie, podawana cewnikiem przez żyłę środkową, jest możliwa do stosowania i związana z łagodną toksycznością.

P r z y k ł a d 11

Faza l klinicznych i farmakokinetycznych badań aplidyny, nowej didemniny pochodzącej ze zwierząt morskich, podawanej przez 24-godzinny wlew raz na tydzień

Charakterystyka chorych

Liczba chorych	35	Typ nowotworu
Płeć (męska/żeńska)	23/1 2	Okrężniczo-odbytniczy	12
Mediana wieku, lata	56,5	Nerek	6
(zakres)	(29-74)
Stan wykonanych ECOG		Głowy i szyi	5
0	12	Czerniak	4
1	18	Żołądka	2
2	5	Sutka	1
Uprzednia radioterapia		Płuc	1
Uprzednia chemioterapia		Mięsak tkanki miękkiej	1
Nie było	4	Chłoniak	1
1 harmonogram	9	Tarczycy	1
2 harmonogramy	12	Rak nieznanego pochodzenia	1
>3 harmonogramy	10
Miejsca choroby
1	14
2	12
>3	9

PL 200 922 B1

Narastanie leczenia chorych

Poziom dawki	Dawka (ug/m2/tydzień)	Liczba chorych	Liczba cykli (zakres)
l	133	3	9(1-6)
II	266	3	9(2-5)
III	532	3	10(2-6)
IV	1000	3	7(1-4)
V	2000	3	6(2-2)
VI	3000	3	4(1-2)
VII	4500	4	5(1-2)
VIII	3750	13	21+(1-4)
Ogółem		35	71 +

Najgorsze toksyczności na chorego

Poziom dawki		I	II	III	IV	V	VI	VII	VIII
								(MTD)	(RD)
Liczba chorych		3	3	3	3	3	3	4	13
Nudności	G2					1			2
	G3
Osłabienie	G2			1			1	1	3
	G3						1
R. miejscowa na zastrzyk			1		1	1	1	1	3
	G2
Zapalenie mięśni	G3							1
Podwyższenie CPK	G4							1
Transaminitis	G3							1	2
	G4								1
Nadwrażliwość	G3								1

Działanie przeciwnowotworowe

Chory #008 - (Madryt). W intensywnie uprzednio leczonym niemierzalnym przerzutowym czerniaku zaobserwowano kliniczną poprawę i skurczenie się nowotworu. Biopsja jednej z przerzutowych zmian chorobowych nie wykazała pozostałości tkanki nowotworowej.

Chory #032 - (Madryt). Rak nerek: 20% skurczenie się guza.

Chory #-34 - (Madryt). Rdzeniowy rak tarczycy. Kliniczna poprawa i SD w zapaleniu naczyń chłonnych płuc. Obniżenie znacznika ACE.

Farmakokinetyka

Stężenia aplidyny w osoczu oznaczano przez chromatografię cieczową sprzężoną ze spektrografią masową z granicą oznaczalności 0,25 ng/cm w szerokim zakresie liniowym do 16,00 ng/cm . Ogółem pobierano 15 próbek do 24 godzin po zakończeniu wlewu.

Farmakokinetyka liniowa dawki

Wysoka mediana CL ((kwartyle) 0,47 (0,40-0,56) dm³/min) i zróżnicowanie między chorymi (współczynnik zmienności klirensu (CL) 45%). Średni do długiego okres półtrwania (t 1/2) (mediana (kwartyle) 18,8 (15,3-25,4) godz.). Rozległe rozprowadzanie z nadfizjologiczną objętością rozkładu

PL 200 922 B1 (V_ss) (mediana (kwartyle) 611 (434-733) dm³). Akumulacja krwinek (2-8-krotna w porównaniu z osoczem). Profile pasują do otwartego modelu dwukomorowego.

Na fig. 14 przedstawiono zależność AUC od dawki.

Wnioski

DLT aplidyny podawanej z zastosowaniem tego schematu oznaczałoby odwracalną toksyczność mięśniową i transaminitis, obserwowane przy MTD wynoszącej 4500 ug/m²/tydzień przez 3 tygodnie.

Zalecana dawka dla przyszłych prób, wynosząca 3750 μg/m2/tydzień przez 3 tygodnie, jest możliwa do stosowania i związana z łagodną toksycznością (głownie z łagodnym osłabieniem).

Zwykle występowało zapalenie żyły w ramieniu, gdzie prowadzi się wlew, zależne od stężenia i możliwe do uniknięcia przez stosowanie cewnika do środkowej żyły.

Nie zaobserwowano hematologicznej toksyczności.

PK charakteryzuje się liniową zależnością od dawki, stosunkowo wydłużonym przebywaniem związku w ciele oraz rozległym rozprowadzaniem. Potencjalnie czynne poziomy w osoczu osiąga się od 2000 μg/m2.

Trwają dodatkowe badania fazy l, badające dożylny 3-godzinny wlew, podawany co tydzień. Wyjściowa dawka wynosi 3000 μg/m2 przez 2 tygodnie.

P r z y k ł a d 12

Faza l próby podawania aplidyny w postaci jednogodzinnego dożylnego wlewu cotygodniowego chorym z zaawansowanymi guzami litymi i chłoniakiem

Jako nadających się rozważa się dorosłych chorych z zaawansowaną chorobą, PS<3, i odpowiednią czynnością narządów; chorzy otrzymują aplidynę co tydzień trzykrotnie w ciągu 4 tygodni. Wprowadzono 24 chorych z guzem litym: mediana (m) wieku 55 lat, mediana ECOG 1, 15 z 24 chorych leczono w >2 cyklach leczenia. Oceniano siedem poziomów dawek (DL) od 133 μg/m²/tydzień do 2700 μg/m²/tydzień; 102 wlewy nadają się do oceny toksyczności (tox). Nie zanotowano hematologicznej toksyczności, a wymioty wymagające zapobiegania obserwowano od 800 μg/m²/tydzień. W przypadku 2700 μg/m²/tydzień (4 chorych) jeden z nich wykazywał G3 hiperbilirubinemii, co uznano za ograniczenie dawki i dlatego rozszerzono DL do 2700 μg/m²/tydzień. Od wszystkich chorych pobiera się próbki do analizy PK (LC-ESI-MS/MS); kinetyki są liniowe, m Vss = 308 dm /m , CL jest wysoka, m = 0,60 dm3/min, zaś m okresu półtrwania wydalania wynosi 14,2 godz. Osiągalne są poziomy w osoczu >1 ng/cm3 po upływie 24 godzin od wlewu dla 1800 μg/m²/tydzień. Zanotowano wczesne wzmianki o działaniu na raka żołądka (1 chory przy dawce 1200 μg/m²). Chory z zaawansowanym rakiem nerkowym, opornym na VBL-IFIV, wykazywał bieżącą obiektywną reakcję (PR płuc i SD w chorobie otrzewnowej) przy dawce DL, wynoszącej 2700 μg/m²/tydzień. Okazuje się, że aplidyna nadaje się do stosowania klinicznego na odpowiednich farmakologicznie poziomach dawek.

P r z y k ł a d 13

Faza l i farmakokinetyczne badania aplidyny podawanej przez 24-godzinny ciągły wlew co 2 tygodnie chorym z litym guzem i chłoniakiem

Aplidynę podawano chorym z litym guzem lub NHL przez 24-godzinny wlew co 2 tygodnie, w sumie 35 chorym (mediany: wieku 51 lat, ECOG = 1) z litym guzem (32 chorych) lub NHL (3 chorych). 23 spośród 35 chorych uprzednio poddawano >3 cyklom chemioterapii. Podawano dziewięć poziomów dawek (200-7000 μg/m²/tydzień) co 2 tygodnie i przeprowadzono 65 cykli (120 wlewów). Nie zanotowano toksyczności hematologicznej. Toksyczność obejmowała G2-3 osłabienia i wymiotów odpowiednio u 9-2 chorych i 12-1 chorych. G3 nudności lub wymiotów (>5000 μg/m²) skutecznie wyleczono następnie przez ochronę według harmonogramu 4HT3. Nie zanotowano toksyczności sercowej. Przy dawce 5000 μg/m²/tydzień co 2 tygodnie 2 chorych doznało przejściowych kurczów mięśni z odwracalnymi podwyższeniami G3 CPK-MM. Spośród 9 chorych leczonych dawką 6000 μg/m²/tydzień 3 chorych doznało wzrostu CPK-MM i aldolazy po trzecim wstrzykiwaniu aplidyny. Podwyższenia CPK były G1-2 i bezobjawowe u 2 chorych, ale u jednego chorego zanotowano podwyższenie G3 CPK z G3 bólu mięśni i utratą siły mięśni (DLT). Było to odwracalne bez żadnych następstw. Biopsja mięśni nie wykazała żadnej istotnej martwicy ani mikocytów. Ultrastrukturalna mikroskopia elektronowa nie wykazała żadnych morfologicznych zmian mitochondrii z wyjątkiem utraty grubych włókien miozyny. 4 chorych poddano działaniu dawki 7000 μg/m²/tydzień co 2 tygodnie. Farmakokinetyczna analiza (LC-ESI/MS/MS) wykazała, że wzrost AUC jest liniowy z dużą wartością Vss = 539 dmrW, wysokim klirensem (332 cm³/mm-m²) i długim końcowym okresem półtrwania (15-35 godz.). Stężenia w osoczu 24 godz. po zakończeniu wlewu przy dawkach >3000 μg/m²/tydzień co 2 tygodnie są porównywalne ze stężeniami skutecznie działającymi in vitro (<1 ng/cm³). Działanie zaobserwowano w przypadku NHL (1 z 3 chorych), raka tarczycy (2 na 2 chorych, raka nerkowego

PL 200 922 B1 (1 z 5 chorych) i raka neuroendokrynowego (1 chory). Ocenia się mechanistyczne hipotezy i zapobiegawcze strategie przeciw toksyczności mięśniowej.

P r z y k ł a d 14

Próba mikroukładowa

Do tych doświadczeń używano komórek białaczki człowieka MOLT-4. Komórki MOLT-4 poddawano działaniu 20 nM aplidyny przez 1 godzinę. Cały RNA ekstrahowano po zakończeniu tego działania oraz 6 i 24 godziny po odzysku w pożywce nie zawierającej leku.

ąg z całego RNA poddawano wstecznej transkrypcji w cDNA w obecności ³²P-dATP. Równe ilości promieniotwórczych próbników krzyżowano z Atlas Human Cancer Microarrays (Mikroukłady raka człowieka kręgu szczytowego) (Clontech). Po przemyciu eksponowano sączek i wyniki analizowano z zastosowaniem oprogramowania Atlas Image (obraz kręgu szczytowego). Pod uwagę brano wyłącznie różnice wyciśnięcia genów większe niż dwukrotne między komórkami poddawanymi obróbce i nie poddawanymi obróbce. W celu potwierdzenia zmian wyciśnięcia genów, wykrytych z użyciem mikroukładów, wykonywano analizy RT-PCR i północne.

Wyniki

Działanie aplidyny powodowało istotne zmiany w wyciśnięciu genów wcześnie, po 1 godzinie od tego działania. Po 6 oraz 24 godzinach odzyskiwania w pożywce nie zawierającej leku obserwowano wyrażanie większej liczby genów.

Po zakończeniu działania aplidyny najistotniejsze zmiany obserwowano w wyrażaniu genów wczesnej reakcji ETR oraz genów VEGF-R1/flt-1, które odpowiednio wzrastały i obniżały się wskutek tego działania.

Poziomy ETR wracały do poziomu normalnego po 6 i 24 godzinach, natomiast poziomy flt-1 dalej obniżały się w ciągu 6 i 24 godzin.

Aplidyna wywoływała również wzrost poziomów B-RAF i Frn, który można było wyraźnie obserwować 6 godzin po odzyskiwaniu w pożywce nie zawierającej leku.

Zmiany obserwowane w tych genach potwierdzono albo przez analizę RT-PCR, albo przez analizę odciskową Northern.

Z analizy mikroukładowej obserwowano różnice wyrażania genów (jeszcze nie potwierdzone przez RT-PCR) dla innych genów, takich jak PLK-1.

P r z y k ł a d 15

Faza l próby z aplidyną, podawaną przez jednogodzinny dożylny wlew cotygodniowo chorym z zaawansowanymi guzami litymi i chłoniakiem nieziarniczym

Podawanie leku

Aplidynę podawano przez jednogodzinny wlew cotygodniowo przez 3 spośród 4 tygodni.

Charakterystyka chorych

Liczba chorych	30	Rodzaj nowotworu
Mediana wieku, lata	53,5	Okrężniczo-odbytniczy	8
(zakres)	(36-75)
Stan wykonanych ECOG		Płuc	5
0	2	Żołądka	4
1	21	Nerkowy	3
2	5	Głowy i szyi	3
Uprzednia radioterapia	10	Czerniak	2
Uprzednia chemioterapia			2
(liczba harmonogramów)
1	10	Przewodu żółciowego	1
2	10	Przełyku	1
>3	8	Trzustki	1

PL 200 922 B1

Nagromadzenie u chorych i podwyższanie dawki

Poziom dawki	Dawka (pg/m^/tydzień)	Liczba chorych	Liczba cykli (zakres)
l	133	3	5(1-4)
II	466	3	5(1-4)
III	534	3	5(1-4)
IV	800	3	6(4-4)
V	1400	4	7(1-4)
VI	1800	4	7(1-4)
VII	4700	8	14(1-4+)
VIII	3600	4	3(1-4+)
Ogółem

* Określenie jednego cyklu: jednogodzinne wlewy raz na tydzień przez 3 kolejne tygodnie i następnie jeden tydzień odpoczynku.

Najgorsze toksyczności u chorego

Poziom dawki (cotygodniowa x 3)	133	466	534	800	1400	1800	4700	3600
Liczba chorych	3	3	3	3	4	4	8	4
Nudności/wymioty	-	-	-	3	-	3	4	-
Miejscowa reakcja na wstrzykiwanie G4	-	1	-	1	1	1	3	-
Osłabienie G4 (G3)	-	-	1	1(1)	3	4	1(1)	-
Ból mięśniowy G4 (G3)	-	-	-	-	(1)	-	-	1
Podwyższenie CPK G1	-	-	-	1	-	-	-	1
Transaminitis G4 (G3)	1	-	(1)	1	-	1	1(4)(1)	-
Bilirubina G3	-	-	-	-	-	-	1(1)(4)	-
Alk. fos. G4 (G3)	-	(1)	-	-	-	1	(1)(4)	-
Nadciśnienie G1 (G3)	(1)	-	-	1	-	-	-	-

Zastrzeżenia patentowe

Claims (9)

1. Zastosowanie aplidyny do wytwarzania kompozycji farmaceutycznej do leczenia raka u pacjenta, w którym aplidyna ma formę użytkową odpowiednią do podawania dożylnego, zgodnie z jednym z następujących harmonogramów:

a) - 24-ggodinny wlew cc tyydień przze trzz tyygonie, a nastęęnie jeedn tyydień oodpocznku, przz zalecanej dawce nie większej niż 3750 ąg/m powierzchni ciała pacjenta na tydzień,

b) - 44-godzinny wlew co dwa tygodnie, przy zalecanej dawce nie większej niż 7000 ąg/m² powierzchni ciała pacjenta na dwa tygodnie,

c) - jednogodzinny wlew co tydzień przez 3 tygodnie, a następnie jeden tydzień odpoczynku, przy o

zalecanej dawce nie większej niż 3600 ąg/m powierzchni ciała pacjenta na tydzień.

4. Zastosowanie według zastrz. 1, znamienne tym, że aplidyna ma formę użytkową odpowiednią do podawania dożylnego w 44-godzinnych wlewach co tydzień przez trzy tygodnie, a następnie z jednym tygodniem odpoczynku, przy zalecanej dawce nie większej niż 3750 ąg/m powierzchni ciała pacjenta na tydzień.

PL 200 922 B1

3. Zastosowanie według zastrz. 1, znam ienne tym, że aplidyna ma formę użytkową odpowiednią do oddswsnis ddyyinegd w 24-gddzinnych wlewach co dwa tygodnie, przy zalecanej dawce nie większej niż 7000 ąg/m² powierzchni ciała pacjenta na dwa tygodnie.

4. Zastosowanie według zastrz. 3, zeamieeee tym, że aoiidyna ma formę użytkową odpowiednią do podawania dożylnego w 24-godzinnych wiewach co dwa tygodnie, przy zalecanej dawce nie większej niż 5000 pgW powierzchni ciała pacjenta na dwa tygodnie.

5. Zastosowanie według zastrz. 1, zeamieeee tym, ye aplidyna ma formę użytkową odpowiednią do podawania dożylnego w jednogodzinnych wlewach co tydzień przez 3 tygodnie, a następnie z jednym tygodniem odpoczynku, przy zalecanej dawce nie większej niż 3600 Lig/rrn powierzchni ciała pacjenta na tydzień.

6. Zastosowanie według zastrz. 5, zeamieeee tym, że aplidyna ma formę użytkową odpowiednią do podawania dożylnego w jednogodzinnych wlewach co tydzień przez 3 tygodnie, a następnie z jednym tygodniem odpoczynku, przy zalecanej dawce nie większej niż 2700 Lig/im powierzchni ciała pacjenta na tydzień.

7. Zastosowanie według poprzednich zastrzeżeń, zeamieeee tym, że aplidyna jest przygotowywana do podawania jako część leczenia skojarzonego.

8. Zastosowanie według poprzednich zastrzeżeń, zeamieeee tym, że aplidyna jest przygotowywana do podawania w połączeniu ze środkiem ochraniającym mięśnie szkieletowe.

9. Zastosowanie według zastrz. 8, zeamieeee tym, że środkiem ochraniającym mięśnie szkieletowe jest karnityna.

10. Zastosowanie według poprzednich zastrzeżeń, zeamienne tym, że chory oorzymywał już standardowe leczenie jego/jej choroby nowotworowej i nowotwór okazał się oporny.