NO330719B1 - Anvendelse av aplidin ved fremstilling av et farmasoytisk preparat for behandling av kreft i en human pasient - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse gjelder Anvendelse av aplidin ved fremstilling av et farmasøytisk preparat for behandling av kreft i en human pasient.

Oppfinnelsens bakgrunn

Kreft omfatter en gruppe av ondartede neoplasier som kan inndeles i to grupper: karsinomer, som omfatter hovedmengden av tilfeller som observeres i klinikkene, og andre mindre hyppig forekommende kreftformer som omfatter leukemi, lymfom, tumorer i sentralnervesystemet og sarkom. Karsinomer har sitt opphav i epitelvev, mens sarkomer utvikles fra bindevev og strukturer som har sitt opphav i mesodermalt vev. Sarkomer kan f.eks. ramme muskel eller ben og opptrer i ben, blære, nyre, lever, lunge, spyttkjertel eller milt.

Kreft er en invasiv sykdom og har en tendens til å meta-stasere til nye seter. Kreft spres direkte inn i omliggende vev og kan også dissemineres via lymfesystemet og sirkulasjonen. Mange behandlingsformer er tilgjengelige for kreft, innbefattet kirurgi og strålebehandling for lokalisert sykdom, og medikamenter. Effektiviteten av tilgjengelige behandlingsformer er imidlertid begrenset for mange krefttyper, og det er behov for nye, forbedrede behandlingsformer som viser kliniske fordeler. Dette gjelder særlig for pasienter med langt fremskreden og/eller metastatisk sykdom. Det gjelder også for pasienter med tilbakefall til progressiv sykdom etter tidligere behandling med etablerte behandlingsformer, for hvilke videre behandling med samme behandlingsform stort sett er uten virkning grunnet ervervelse av resistens eller grunnet begrensninger når det gjelder tilførsel av behandlingsformene grunnet forbundet toksisitet.

Kjemoterapi spiller en signifikant rolle i kreftbehandling, siden kjemoterapi er nødvendig for behandling av langt utviklede cancere med fjerntliggende metastaser og ofte er av nytte for reduksjon av tumorstørrelsen før kirurgisk behandling, og mange antikreftmedikamenter er blitt utviklet basert på forskjellige virkningsmekanismer.

Dehydrodidemnin B, nå kjent som aplidin, omfattes av WO 91/04985.

Ytterligere informasjon vedrørende aplidin kan f.eks. finnes i: Jimeno, J., "Exploitation of marine microorganisms and invertebrates: Anticancer drugs from marine origin", IBC Conf Discov Drugs from Nat Novel Approaches New Sources (8.-9. des., London) 1994, 1994

Faircloth, G. et al., "Dehydrodidemnin B (DDM) a new marine derived anticancer agent (MDA) with activity against experimental tumor models", 9th NCI-EORTC Symp New Drugs Cancer Ther (12.-15. mars, Amsterdam) 1996, Abst 111

Sakai, R. et al., "Structure-activity relationships of the didemnins", Journal of Medicinal Chemistry 1996, 39 (14): 2819

Urdiales, J.L. et al., "Antiproliferative effect of dehydrodidemnin B (DDB), a depsipeptide isolated from Mediterranean tunicates", Cancer Letters 1996, 102 (1-2): 31

Faircloth, G. et al., "Preclinical characterization of aplidine (APD), a new marine anticancer depsipeptide (MADEP)", Proe Amer Assoc Cancer Res 1997, 38: Abst 692

Depenbrock, H. et al., "In vitro activity af aplidine, a new marine-derived anti-cancer compound, on freshly explanted clonogenic human tumour cells and haematopoietic precursor cells", British Journal of Cancer 1998, 78(6): 739

Faircloth, G. et al., "Aplidine (aplidine) is a novel marine-derived depsipeptide with in vivo antitumour activity", Proe Amer Assoc Cancer Res 1998, 39: Abst 1551

Faircloth, G. et al., "Preclinical development of aplidine, a novel marine-derived agent with potent antitumour activity", 10thNCI-EORTC Symp New drugs Cancer Ther (6.-19. juni, Amsterdam) 1998, Abst 129

Mastbergen, S.C. et al., "Cytotoxicity and neurocytoxicity of aplidine, a new marine anticancer agent evaluated using in vitro assays", 10th NCI-EORTC Symp New Drugs Cancer Ther (16.-19.

juni, Amsterdam) 1998, Abst 131

I prekliniske undersøkelser hadde aplidin en doseavhengig cytotoksisk aktivitet mot de to epitellignende cellelinjene, CT-1 og CT-2, samt den humane colonkreftcellelinje HT-29. Den mest proliferative linjen, CT-2, var mest følsom overfor aplidin. I tillegg reduserte forbindelsen ornitindekarboksylaseaktiviteten i alle tre cellelinjer (Lobo C, Garcia-Pozo SG, et al., Effeet of dehydrodidemnin B on human colon carcinoma cell lines. Anticancer Research. 17: 333-336, jan.-feb. 1997). I en lignende undersøkelse inhiberte 50 nmol/1 aplidin veksten av brystkreft-cellelinjene MDA-MB231 og MCF-7 med 17 hhv. 47%.

En signifikant økning av konsentrasjonen av spermidin og spermin ble observert i de behandlede celler (Gomez-Fabre PM, De Pedro, et al). Polyamine contents of human breast cancer cells treated with the cytotoxic agents chlorpheniramine and dehydrodidemnin B. Cancer Letters, 113: 141-144, 26. feb 1997). "Flow"-cytometrisk analyse viste at aplidin ikke induserer åpenbare cellesyklusforstyrrelser (Erba E, Balconi G, et al., Cell cycle phases pertubations induced by new natural marine compounds. Annals of Oncology. 7 (Suppl. 1): 82, 1996). I mus var aplidin virksomt mot implantert P388-leukemi og B 16-melanom, med en optimal dose på 160[Jg/kg. I motsetning til didemnin B var aplidin aktivt mot subkutant implanterte Lewis-lungekarsinomer (Faircloth G, Rinehart K, et al., Dehydrodidemnin B a new marine derived anticancer agent with activity against experimental tumour models. Annals of Oncology. 7 (Suppl. 1): 34, 1996).

Kontinuerlig eksponering overfor lave konsentrasjoner av aplidin inhiberte vekst av en rekke tumorcellelinjer, innbefattet ikke-Hodgkins lymfom, melanom og brystkreft, melanom, ovariekreft og "non-small cell"-lungekreft. Virkningsgraden var avhengig av behandlingstiden og kunne tilsynelatende oppnås ved ikke-myelotoksiske konsentrasjoner. "Non-small cell"-lungekreft, brystkreft og melanomcellelinjer var følsomme overfor kontinuerlig behandling med aplidin i konsentrasjoner på >= 0,001[Jmol/1. Aplidin hadde tilsvarende toksisitet som doksorubicin overfor klonogene hematopoietiske stamceller (Depenbrock H, Peter R, et al., In vitro activity of aplidine, a new marine-derived anti-cancer compound, on freshly explanted clonogenic human tumour cells and haematopoietic precursor cells. British Journal of Cancer. 78: 739-744, nr. 6, sep. 1998).

Aplidin hadde signifikant aktivitet på mus som bar humane kreftxenotransplantater. I en maksimal tolererbar dose på

2,1 mg/kg ga aplidin nesten fullstendig remisjon i noen dyr med

et forhold mellom tumorer i den behandlede gruppe og kontroll-gruppen (T/C) på 9%. I en konsentrasjon på 1,25 mg/kg ble signifikant aktivitet observert mot magekreft (T/C 14%), og vekstinhibering av prostatatumor ble også observert (T/C 25%)

(Faircloth G, Grant W, et al., Preclinical development of aplidine, a novel marine-derived agent with potent antitumour activity. Annals of Oncology. 9 (Suppl. 2): 34, 1998).

Oppsummering av oppfinnelsen

Foreliggende oppfinnelse omfatter anvendelse av aplidin ved fremstilling av et farmasøytisk preparat for behandling av kreft i en human pasient, hvori det farmasøytiske preparat er formulert for å være egnet til intravenøs infusjon av aplidin i overensstemmelse med én av følgende fremgangsmåter: a. 24 timers infusjon ukentlig i tre uker, fulgt av én ukes hvile, av en anbefalt dose på ikke mer enn 3750 ug/m<2>/uke, b. 24 timers infusjon annenhver uke, av en anbefalt dose på ikke mer enn 7000 ug/m<2>/2 uker, eller c. 1 times infusjon ukentlig i tre uker hver fjerde uke, av en anbefalt dose på ikke mer enn 3600 ug/m<2>/uke.

Utførelsesformer av oppfinnelsen

Det beskrives således en fremgangsmåte for behandling av ethvert pattedyr, fortrinnsvis et menneske, som lider av kreft, som omfatter tilførsel til det rammede individ av en terapeutisk effektiv mengde av aplidin eller et farmasøytisk preparat av aplidin.

Det beskrives også farmasøytiske preparater som inneholder som aktiv bestanddel aplidin, så vel som fremgangsmåter for fremstilling av disse.

Eksempler på farmasøytiske preparater omfatter væsker (løsninger, suspensjoner eller emulsjoner) med en sammensetning som er egnet for intravenøs tilførsel, og de kan inneholde den rene forbindelse eller denne i kombinasjon med ethvert bærerstoff eller andre farmakologisk aktive forbindelser.

Tilførsel av forbindelsene eller preparatene som beskrevet heri er basert på en doseringsfremgangsmåte som fortrinnsvis omfatter intravenøs infusjon. Vi foretrekker benyttelse av infusjonstider på opp til 72 timer, mer foretrukket fra 1 til 24 timer, hvor tilnærmet 1, tilnærmet 3 eller tilnærmet 24 timer f oretrekk.es mest. Korte inf us jons tider som tillater at behandlingen utføres uten at pasienten må tilbringe natten i sykehuset, er spesielt ønskelige. Infusjonen kan imidlertid være på rundt 24 timer eller lenger om nødvendig. Infusjonen kan utføres med egnede mellomrom med forskjellige mønstre, f.eks. én gang ukentlig, to ganger ukentlig eller oftere pr. uke, gjentatt hver uke, om ønskelig med opphold på typisk én uke. Ytterligere retningslinjer gis senere i den foreliggende beskrivelse.

Den korrekte dose av forbindelsen vil variere ut fra det preparat som benyttes, tilførselsveien og setet, verten og tumoren som skal behandles. Andre faktorer som alder, kropps-vekt, kjønn, kosthold, tilførselstidspunkt, utskillelses-hastighet, pasientens tilstand, medikamentkombinasjoner, reak-sjonssensitivitet og sykdommens omfang skal også tas i betrakt-ning. Tilførselen kan utføres kontinuerlig eller periodevis innenfor den maksimalt tolererbare dose.

Forbindelsen aplidin og preparater som beskrevet heri kan anvendes sammen med andre medikamenter, slik at man får en kombinasjonsbehandling. De andre medikamentene kan utgjøre en del av samme preparat eller tilveiebringes som separate preparater for tilførsel samtidig eller på forskjellige tidspunkt. Det andre medikaments identitet er ikke spesielt begrenset, og egnede kandidater omfatter: a) medikamenter med antimitotiske virkninger, fortrinnsvis medikamenter rettet mot cytoskjelettbestanddeler, innbefattet mikrotubulusmodulatorer som taxanmedikamenter (f.eks. taxol, paclitaxel, taxotere, docetaxel), podofylo-toksiner eller vinka-alkaloider (vinkristin, vinblastin); b) antimetabolittmedikamenter (f.eks. 5-fluoruracil, cytarabin, gemcitabin, purinanaloger som pentostatin, metotreksat); c) alkyleringsmidler eller sennepsgasser (f.eks. nitroso-ureaforbindelser, syklofosfamid eller ifosfamid); d) medikamenter rettet mot DNA, f.eks. antiasyklin-medikamentene adriamycin, doxorubicin, farmorubicin eller epirubicin; e) medikamenter rettet mot topoisomeraser, f.eks. etoposid; f) hormoner og hormonagonister eller -antagonister, f.eks. østrogener, antiøstrogener (tamoxifen og beslektede forbindelser) og androgener, flutamid, leuprorelin, goserelin, cyprotron eller octreotid; g) medikamenter rettet mot signaloverføringen i tumorceller, innbefattet antistoffderivater som herceptin; h) alkyleringsmidler som platinamedikamenter (cis-platin, karbonplatin, oksaliplatin, paraplidineatin) eller nitrosourea-forbindelser; i) medikamenter med mulig virkning på tumormetastase, f.eks. matriksmetalloproteinaseinhibitorer; j) genterapi og "antisense"-midler; k) terapeutiske antistoffpreparater; 1) andre bioaktive forbindelser med opphav i marine organismer, fortrinnsvis kahalalid F eller ekteinascidiner som et-743;

m) skjelettmuskelbeskyttende midler som karnitintilset-ninger;

o) andre medikamenter som motvirker bivirkningene til aplidin, f.eks. antiemetiske midler;

p) mer generelt medikamenter som tillater dosering av aplidin i den anbefalte dose og som motvirker toksisiteten.

Vi har videre funnet at aplidin inhiberer ekspresjon av genet (FLT1) som koder for reseptoren for vaskulær endotel vekstfaktor (VEGF).

I tillegg er aplidin blitt vist å gi en kraftig inhibering av tumorcellenes produksjon av VEGF-proteinet selv.

Utskillelse av VEGF fra en cellemasse, nærmere bestemt en tumorcellemasse, forårsaker de novo-vaskularisering (angiogenese) som fører til at nye blodkar dannes mot cellemassen og etablerer et nettverk av kapillærer som kan forsyne massen med blodtilførsel for vedvarende proliferasjon. Disse virkningene, særlig det påviste opphør av dannelse av VEGF av tumorceller, forventes i stor grad å inhibere tumorcellenes evne til å forårsake angiogenese. I tillegg kreves VEGF direkte av noen hematopoietiske tumorceller (f.eks. de humane leukemicellene M0LT4) som vekstfaktor.

Således kan aplidin forventes å ha inhiberende virkning på de novo-vaskularisering av voksende primærtumorer eller meta staser og derved inhibere vekst av tumorene, som vites å kreve vaskularisering for vekst. Aplidin kan også ha aktivitet på hematopoietiske tumorer.

I tillegg vites aplidin å modulere kalsiumkanalfunksjonen i celler.

Urinblæretumorer er én type tumorer som overuttrykker reseptoren for epitelvekstfaktor (EGF), noe som fører til opp-regulering av VEGF og VEGF-reseptoren. Binding av VEGF til reseptoren antas å føre til cellevekststimulering ved hjelp av forbigående, lokale kalsiumionendringer, blant andre signal-mekanismer. En forbindelse som inhiberer virkningen av VEGF, forventes å være inhiberende overfor slike tumorer.

Eksperimentelt er aplidin blitt funnet å ha ekstremt høy aktivitet på human urinblærekreft (og gir fullstendig remisjon i noen dyremodeller) i samsvar med forventningene.

Aplidin kan forventes å ha bredspektret antitumoraktivitet grunnet virkningene på et stort antall tumorer.

Virkningen av VEGF er mer relevant, siden denne omfatter inhibering av nye blodkar. I tillegg til virkninger på blodkar krever visse tumorer VEGF direkte for cellevekst (dvs. leukemi, lymfomer, urinblæretumorer og ovarietumorer).

Følgelig tilveiebringer vi en fremgangsmåte for behandling av en angiogen tilstand som omfatter tilførsel av aplidin. Nærmere bestemt tilveiebringer vi en fremgangsmåte for behandling av en tumor som avhenger av den angiogene prosess. Oppfinnelsen tilveiebringer videre en fremgangsmåte for fremstilling av en inhibitor av angiogenese, cancerinvasjon eller cancerraeta-stase som omfatter å blande en effektiv dose av aplidin med et farmasøytisk aksepterbart bærerstoff.

Vi tilveiebringer også en fremgangsmåte for behandling av ikke-tumorforbundne angiogeneserelaterte forstyrrelser, f.eks. retinopati.

Nærmere bestemt ser vi for oss fremgangsmåter for behandling av angiogeneseforstyrrelser, f.eks. neoplasi, innbefattet metastase, oftalmiske tilstander som rejeksjon av hornhinne-transplantat, okular neovaskularisering, retinal neovaskularisering, diabetisk retinopati, retrolental fibroplasi og neo-vaskulært glaukom, ulcerative sykdommer som magesår og andre tilstander, f.eks. infantile hemangiomer, angiofibrom i naso- farynx og avaskulær nekrose av ben, og forstyrrelser i det kvinnelige kjønnssystem, f.eks. endometriose.

Responser hos kreftpasienter er blitt observert i kliniske forsøk med aplidin, noe som viser anvendbarheten av behandlings-fremgangsmåten.

Fase I kliniske undersøkelser og farmakokinetisk analyse viser at aplidin presenterer et positivt terapeutisk vindu med kontrollerbar toksisitet i det doseringsområde som er nødvendig for klinisk virkning ved behandling av kreftpasienter.

Fremgangsmåten består av tilførsel av medikament ved intravenøs fusjon over et tidsrom på 72 timer eller mindre i det anbefalte dosenivå (RD), med eller uten kombinasjon med andre terapeutiske midler.

Aplidin leveres og lagres som et sterilt frysetørket produkt som består av aplidin og eksipiens i et preparat som er egnet for terapeutisk anvendelse.

Solubilisert aplidin viser omfattende degradering under analyseforbindelser med varme- og lysbelastning, og en fryse-tørket doseringform ble utviklet, se WO 99/42125, som inkor-poreres heri ved referanse. I en for tiden foretrukket utfør-elsesform ble frysetørkingen utført fra en 500 mg/ml løsning av aplidin i 40% (vol/vol) tert.-butanol i injeksjonsvann (Wfl) inneholdende 25 mg/ml D-mannitol som massegivende middel. Proto-typen, som inneholdt 500 mg aplidin og 25 mg D-mannitol som massegivende middel per ampulle, ble funnet å være det optimale preparat ut fra løselighet, frysetørkingssyklusens lengde og doseringskravene i de kliniske undersøkelser. Den optimale rekonstitueringsløsning ble funnet å være 15/15/70%

(vol/vol/vol) Cremaphor EL/etanol/WfI (CEW). Både rekonstituert produkt og fortynninger (opp til 1:100 vol/vol) av det rekonstituerte produkt med normalt saltvann så ut til å være stabilt i minst 24 timer etter fremstillingen. Resultatene vedrørende lagringstid som er tilgjengelige til nå, viser at preparatet er stabilt i minst 1 år ved lagring ved 4 °C i mørke.

Fremstilling av infusjonsløsningen utføres også under aseptiske betingelser ved å ta ut det rekonstituerte løsnings-volum som tilsvarer dosen som er beregnet for hver pasient, og langsomt injisere det nødvendige volum av rekonstituert løsning inn i en infusjonspose eller -flaske som inneholder mellom 100 og 1000 ml 0,9% natriumklorid, hvoretter hele løsningen homo-geniseres ved langsom manuell risting. Aplidininfusjonsløsningen bør tilføres intravenøst så hurtig som mulig, innen 48 timer etter fremstillingen. PVC- og polyetyleninfusjonssystemer er foretrukne materialer for beholdere og tilførselsrør, likeså klart glass.

Tilførselen utføres i sykluser, i den foretrukne til-førselsfremgangsmåte gis en intravenøs infusjon av aplidin til pasientene i den første uke i hver syklus, og pasientene får gjenvinne seg i resten av syklusen. Den foretrukne varighet av hver syklus er enten 3 eller 4 uker, flere sykluser kan gis etter behov. Medikamentet kan også tilføres hver av de første dagene i hver syklus. Utsatt dosering og/eller dosereduksjoner og justeringer av tilførselsskjemaet utføres etter behov, avhengig av den enkelte pasients toleranse av behandlingen, særlig anbefales dosereduksjoner for pasienter med høyere enn normalt serumnivå av levertransaminaser, alkalisk fosfatase eller bilirubin.

Den anbefalte dose (RD) er den høyeste dose som trygt kan tilføres til en pasient og som gir tolererbar, håndterbar og reversibel toksisitet ifølge de vanlige toksisitetskriterier som er etablert av National Cancer Institute, (USA), hvor ikke mer enn 2 av 6 pasienter viser dosebegrensende toksisitet (DLT).

Retningslinjer for kreftbehandling anbefaler ofte tilførsel av kjemoterapeutiske midler i den høyeste trygge dose hvorved toksisiteten kan håndteres for å oppnå maksimal virkning (DeVita, V.T. Jr., Hellman, S. og Rosenberg, S.A., Cancer: Principles and Practice of Oncology, 3. utgave, 1989, Lipincott, Philadelphia).

DLT for aplidin ved anvendelse av denne behandlingsfrem-gangsmåten ble bestemt i kliniske undersøkelser. Disse under-søkelsene etablerte et anbefalt dosenivå for forskjellige typer doseringsfremgangsmåter.

Aplidin kan trygt tilføres i et dosenivå ved eller under den anbefalte dose (RD).

Infusjon er for tiden den foretrukne fremgangsmåte, hvor typiske tilførselsskjemaer omfatter følgende: 24 timers infusjon ukentlig i et antall uker, f.eks. tre uker, fulgt av én ukes hvile,

24 timers infusjon to ganger ukentlig,

1 times infusjon ukentlig i 3 uker hver 4. uke,

daglig infusjon over f.eks. 1 time x 5 dager hver 3. uke, og

infusjon over f.eks. 3 timer annenhver uke.

Nærmere bestemt kan intravenøs infusjon utføres som en

24 timers infusjon én gang ukentlig i 3 uker av 4. Flere data gis i eksemplene 3, 4, 11 og 12. En anbefalt dose på

3750 ug/m<2>/uke x 3 ser ut til å være egnet. Denne fremgangsmåten er nå blitt modifisert, og pasienter vil nå behandles ved anvendelse av et annet doseringsskjema som ser passende ut:

3 timers infusjon annenhver uke uten hvileopphold. Se eksempel 12. I undersøkelsen med 24 timers infusjon 2 ganger ukentlig behandles pasienter med 7000 ug/m<2>/2 uker. Se eksemplene 6, 14 og 18. Pasienter som inngår i undersøkelsen 1 time/uke x 3 hver 4. uke, behandles med doser opp til 3600 ug/m<2>/uke x 3 uker. Se eksemplene 13 og 17. En annen fremgangsmåte som omfatter pasienter med 1 times daglig infusjon x 5 dager hver 3. uke, be-handler pasientene med en dose på 1200 ug/m<2>/dag x 5 dager. Dersom aplidin anvendes i kombinasjon med andre terapeutiske midler, kan det være nødvendig å justere dosene av begge midler.

Tidligere har de viktigste biologiske responser rapportert for tilførsel av aplidin, blitt observert i dyr eller in vitro-modeller, som vites å være notorisk unøyaktige når det gjelder anvendbarhet for å forutsi responser i mennesker, eller i humane pasienter i eksperimentell sammenheng hvor en effektiv, sikker behandlingsfremgangsmåte var utilgjengelig (enten var den anvendte dose en toksisk dose, signifikant høyere enn den anbefalte dose, eller så var tilførselsskjemaet ikke egnet).

I kliniske forsøk ved benyttelse av fremgangsmåten ifølge foreliggende oppfinnelse ble egnede plasmanivåer oppnådd i pasienter ved RD, og av større viktighet viste objektivt målbare responser tegn på kliniske fordeler for pasientene.

Definisjoner for pasienttoksisitet er hentet fra kriteriene til WHO og responsene bestemt ved å følge responskriteriene til

WHO.

Objektive responser ble erholdt i pasienter med langt utviklet og/eller metastatisk kreft som var refraktorisk overfor tidligere behandlinger, innbefattet dem beskrevet i eksemplene.

Nærmere bestemt har behandling ved denne fremgangsmåte vist responser hos kreftpasienter med langt utviklet og/eller metastatisk sykdom som viste progressiv sykdom etter tidligere behandling med etablerte behandlingsformer.

En foretrukket fremgangsmåte ifølge foreliggende oppfinnelse omfatter derfor påvisning av kreftpasienter som er blitt behandlet for kreft, fortrinnsvis pasienter som er blitt gitt kjemoterapi, og behandling av disse med aplidin.

Beskrivelse av figurene

Figur 1 viser reduksjonen i flt-l-ekspresjon observert ved anvendelse av mikromatriser, bekreftet ved RT-PCR-analyse. Figur 2 viser reduksjonen i flt-1-mRNA indusert med aplidin i M0LT-4-celler. Figurene 3a og 3b viser den autokrine VEGF-Flt-l-syklus i M0LT-4-celler og virkningen av aplidin. Figur 4 viser at aplidin blokkerer VEGF-utskillelse fra M0LT-4-celler. Figur 5 viser at aplidin induserte blokkering av utskillelsen av VEGF. Figur 6 viser en kraftig reduksjon i nivåene av VEGF-mRNA i M0LT-4-celler Figur 7 viser at aplidindosen ikke reduserte aktiviteten av VEGF-promoteren transfektert inn i M0LT-4-celler. Figur 8 viser at aplidin ikke blokkerer binding av transkripsjonsfaktorene HIF-1 og AP-1 til konsensus-DNA-sekvenser som foreligger i VEGF-promoteren. Figur 9 viser at aplidin ikke blokkerer binding av transkripsjonsfaktoren HIF-1 til konsensus-DNA-sekvenser som foreligger i VEGF-promoteren. Figurene 10a og 10b viser at VEGF tilsatt til dyrkningsmediet for MOLT-4-celler, ga en svak reduksjon av aktiviteten ved lave aplidinkonsentrasjoner, men er uten virkning ved høye konsentrasj oner. Figur 11 viser at aplidin kan redusere utskillelsen av VEGF fra den humane ovariecancerlinje IGROV-1. Figur 12 viser at aplidin også reduserer VEGF-mRNA-nivået i den humane ovariecancerlinje IGROV-1. Figur 13 viser at aplidin ikke påvirker VEGF-promoteraktiviteten målt ved anvendelse av luciferase/renilla-rapportørgen-systemet.

Figur 14 viser et dose-AUC-forhold.

Figurene 15a og 15b viser aktivitet ved medullær tyreoidea-cancer: CEA-nivåer.

Eksempler på oppfinnelsen

Eksempel 1

Genekspresjonsprofil i humane, leukogene M0LT-4-celler behandlet med den marine forbindelse aplidin

Tidlige endringer i genekspresjonen indusert av aplidin i M0LT-4-celler, ble evaluert ved anvendelse av cDNA-ekspresjonsmatriser (Atlas Human Cancer, Clontech). M0LT-4-celler ble behandlet i 1 time med aplidinkonsentrasjoner som inhiberer veksten med 50%, og total-RNA ble isolert 0, 1, 6 og 24 timer etter utvasking av medikamentet. Filtrene ble hybridisert med en lik mengde<32>P-merket cDNA. Analyse av resultatene ble utført ved anvendelse av programvaren ATLAS IMAGE 1.0. Endringer i genekspresjon på mer enn 2 ganger ble ansett som signifikante endringer i RNA-ekspresjonen og deretter bekreftet ved PCR. En markant tidsavhengig reduksjon i ekspresjonen av VEGF-R1 (flt-1) ble observert og bekreftet på RNA-nivå ved PCR og på proteinnivå ved Western-blotting.

Eksempel 2

Korrelasjon mellom selektive antitumoraktiviteter av den marint avledede forbindelse aplidin ved anvendelse av forskjellige modellsystemer

Forskjellige modellsystemer ble evaluert for å danne grunn-lag for ytterligere klinisk arbeid. Selektive antitumoraktiviteter ble observert mot to histologisk forskjellige faste tumorer: humant magekarsinom og prostatakarsinom. Kraftig in vitro-aktivitet overfor primære magetumortyper og magetumor-cellene Hs746T er åpenbar, med IC50-verdier på 146 hhv. 450 pM. En mindre kraftig, men ikke mindre selektiv ID5o-aktivitet på 3,4 nM ble observert mot prostatatumorcellene PC-3. In vitro-aktiviteten ble evaluert i nakne mus ved anvendelse av subkutant implanterte tumorfragmenter eller hule fibrer (HF) som inneholdt tumorceller.

Optimal aktivitet ble observert i xenotransplanterte mage-tumorer (17-20%) og prostatatumorer (25-38%) etter intraperi-toneal tilførsel. Oppfølgingsstudier gjorde det nødvendig å benytte rotter for intravenøse infusjoner. Med denne variant ga et tilførselsskjema med 24 timers intravenøs infusjon tilsvarende aktivitet mot HF magetumorceller (20%) og HF prostatatumorceller (31%). Cytotoksisitet ble også observert ved anvendelse av et tilførselsskjema med 5 dagers intravenøs infusjon mot HF prostatatumorceller (33%) . Disse utvidede in vivo-evalueringene viser ikke bare at det er en kraftig relativ korrelasjon med den cytotoksiske profil in vitro, men også en sterk korrelasjon med in vivo-modellene som ble benyttet for å karakterisere tumor-selektiviteten som identifiserte aplidin som en kandidat for klinisk utvikling.

Eksempel 3

En fase I-undersøkelse og farmakokinetisk undersøkelse av aplidin gitt som en ukentlig 24 timers infusjon i pasienter med langt utviklede faste tumorer

In vivo-undersøkelser viste at in vivo-aktiviteten økte med forlenget infusjonsvarighet. I denne undersøkelsen ble 16 pasienter behandlet. Pasientegenskaper: gjennomsnittsalder: 55 år, gjennomsnittlig PS: 1, menn/kvinner: 11/5, tumortyper som følger: hode og hals: 5, nyre: 2, colon: 3, rektum: 2, sarkom: 1 og melanom: 3, alle tidligere behandlet med kjemoterapi (gjennomsnittlig 2 linjer).

Aplidin ble tilført som en 24 timers infusjon i følgende dosenivåer (Dl): 133 (3 pasienter), 266 (3 pasienter), 532

(3 pasienter), 1000 (3 pasienter), 2000 (3 pasienter) og 3000

(1 pasient) |Jg/m<2>/uke x 3 hver 28. dag.

Ingen dosebegrensende toksisitet (DLT) ble observert. Bare mild, ikke-hematologisk toksisitet som omfattet kvalme av grad 1, mukositt av grad 1, asteni av grad 1, ble rapportert. Flebitt i infusjonsarmen forekom hyppig og var konsentrasjonsavhengig. Farmakokinetisk analyse ble utført i alle pasienter og viste plasmanivåer ved DL 1000 |Jg/m2/uke og 2000 |Jg/m2/uke tilsvarende den aktive in vi tro-konsentras jon (1 ng/ml) . Ved DL 532 |Jg/m<2>/uke ble klinisk forbedring observert hos 1 tidligere behandlet pasient med langt utviklet melanom.

Eksempel 4

Fase I-undersøkelse og farmakokinetisk (PK) undersøkelse av aplidin (APL) ved anvendelse av et 24 timers ukentlig til-førselsskjema

Til nå er 25 pasienter (gjennomsnittsalder 58 år, gjennomsnittlig ECOG 1) med langt utviklede, tidligere behandlede, faste tumorer og lymfomer blitt behandlet i denne fase I-under-søkelsen. Ved anvendelse av et tilførselsskjema som omfattet APL 24 timer ukentlig x 3 fulgt av 1 ukes hvile, er følgende doser-ingsnivåer blitt analysert: 133 (3 pasienter), 266 (3), 532 (3), 1000 (3), 2000 (3), 4500 (3) og 3750Ug/m<2>/uke (3). Med 60 til-førte sykluser (180 infusjoner) kan alle pasienter evalueres for toksisitet. Den maksimale tolererte dose var 4500 |Jg/m<2>/uke x 3 med grad (G) 3 muskulær toksisitet (biopsibekreftet type II muskulær atrofi). G4 CPK og G3 transaminitt er de dosebegrensende toksisiteter i 2 hhv. 4 pasienter. G2 kvalme ble observert i de fleste pasienter, og G2/3 emesis ved ^ 2000 Mg/m<2>flebitt er vanlig, men konsentrasjonsavhengig. Alle pasienter er blitt analysert for PK ved LC/MS/MS. Foreløpige resultater tyder på omfattende vevsfordeling, en lang elimineringstid med t^på 10-24 timer og et plasmanivå >1 ng/ml (som er aktivt in vitro) . Én pasient med langt utviklet melanom som var resistent overfor DTIC/interferon, hadde en klinisk forbedring som varte i

>30 uker. Denne undersøkelsen med ukentlige infusjoner viste anvendbarhet og aktivitet av et dosetett APL-skjema. Som forventet, er neuromuskulær toksisitet dosebegrensende. Den mulige anbefalte dose på 3750 |Jg/m<2>/uke x 3 er i ferd med å evalueres.

Eksempel 5

Klinisk farmakokinetikk (PK) for aplidin (APL) i pasienter med faste tumorer og non-Hodgkins lymfomer

Fire intravenøse tilførselsskjemaer er under fase I-evaluering: ukentlige 24 timers infusjoner, 24 timers infusjon to ganger ukentlig og 1 times infusjon over 5 på hverandre følgende dager hver 3. uke. APL-konsentrasjoner i blod ana-lyseres ved væskekromatografi-tandem massespektrometri. Innledende resultater viser akkumulering i blodceller og en plasma-PK som særpreges ved en omfattende fordeling (fordelingsvolum vanligvis over 200 L/m2) og halveringstider for eliminasjon i størrelsen 10 til 24 timer. En åpen modell med to avdelinger gir brukbar tilpasning til de fleste profiler etter 24 timers infusjon. For én times infusjoner gir en modell med tre avdelinger bedre tilpasning i de fleste tilfeller. De erholdte plasmanivåer vites å være aktive in vitro. Evaluering av ytterligere pasienter og en sammenligning av blodceller og plasma-PK er i gang.

Eksempel 6

Foreløpige resultater fra en fase I-undersøkelse og farmakokinetisk undersøkelse av aplidin gitt som en 24 timers infusjon annenhver uke i pasienter med faste tumorer og non-Hodgkins lymfomer

Aplidin gis som en 24 timers infusjon annenhver uke. Utgangsdosen var 200 |Jg/m<2>/dag, og doseøkningen omfatter til nå 400, 800, 1600 og 3200Ug/m<2>/dag. I alt 18 pasienter

(menn/kvinner: 7/11, gjennomsnittsalder 52, OMS 0/1: 10/8)

inngår i undersøkelsen. Hittil er ingen dosebegrensende toksisitet blitt observert. Blant evaluerbare pasienter besto toksisiteten av mild grad I-II kvalme/oppkast, grad I-II asteni og forekomst av krampe under eller umiddelbart etter infusjon. Ingen neuromuskulær toksisitet ble rapportert ved de evaluerte doser. Én pasient med langt fremskreden lungekreft og dokumentert tumorprogresjon ved en dose på 1600 |Jg/m2 utviklet en hemolytisk anemi og trombocytopeni som det ble ansett usann-synlig at skyldtes undersøkelsesmedikamentet. Innledende farmakokinetisk analyse viste at medikamentet har en omfattende fordeling og høy konsentrasjon i blod. En åpen modell med to avdelinger gir brukbar tilpasning til de fleste plasmakonsen-trasjonsprofiler. Den terminale halveringstid er vanligvis i størrelsesordenen 10-24 timer. Klinisk forbedring ble observert i en pasient med non-Hodgkins lymfom. Oppsamlingen av resultater fortsetter for å bestemme den dosebegrensende toksisitet og dosen som skal anbefales for fase II-undersøkelse.

Eksempel 7

Genekspresjonsprofil i humane leukemiske MOLT-4-celler behandlet med den marine forbindelse aplidin

I den foreliggende undersøkelse har vi evaluert tidligere endringer i genekspresjonen indusert med aplidin i MOLT-4-celler ved anvendelse av cDNA-ekspresjonsmatriser (Atlas Human Cancer, Clontech). MOLT-4-celler ble behandlet i 1 time med konsentrasjoner av aplidin som inhiberer veksten med 50%, og total-RNA ble isolert 0, 1, 6 og 24 timer etter utvasking av medikamentet. Filtrene ble hybridisert med like mengder<32>P-merket cDNA. Analyse av resultatene ble utført ved anvendelse av programvaren ATLAS IMAGE 1.0. Endringer i genekspresjonen på mer enn 2 ganger ble ansett som signifikante endringer av RNA-ekspresjonen og deretter bekreftet ved PCR. En markant tidsavhengig reduksjon av ekspresjonen av VEGF-R1 (flt-1) ble observert og bekreftet på RNA-nivå ved PCR og på proteinnivå ved Western-blotting. Hvor-vidt nedreguleringen av flt-1 spiller en rolle i den cytotoksiske virkning og antitumorvirkningen av aplidin, er for tiden under undersøkelse. Videre er karakterisering av ekspre sjonen av andre gener som ser ut til å nedreguleres etter behandling med aplidin, for tiden i gang.

Kvantitative endringer i genekspresjon indusert med aplidin i M0LT-4-celler

Reduksjonen i flt-l-ekspresjon som ble observert ved anvendelse av mikromatriser, ble bekreftet ved RT-PCR-analyse, se figur 1.

Ved anvendelse av Rnase-beskyttelse kvantifiserte vi reduksjonen i flt-1-mRNA indusert med 20 nM aplidin i MOLT-4-celler, se figur 2.

Figurene 3a og 3b viser den autokrine VEGF-Flt-l-syklus i MOLT-4-celler og virkningen av aplidin i den autokrine VEGF-Flt-l-syklus .

Aplidin blokkerer VEGF-utskillelsen fra MOLT-4-celler, se figur 4. Cellene ble behandlet i 1 time med 20 nM aplidin. VEGF utskilt i mediet, ble målt ved ELISA etter avsluttet behandling og etter 6 og 24 timers inkubering i medikamentfritt medium.

Den aplidininduserte blokkering av VEGF-utskillelsen er konsentrasjonsavhengig og observeres allerede ved 5 nm, se figur 5.

Ved anvendelse av Rnase-beskyttelse kunne en kraftig reduksjon av VEGF-mRNA-nivået i M0LT-4-celler observeres etter 20 nM aplidin, se figur 6.

Aplidindosen reduserer ikke aktiviteten av VEGF-promoteren transfektert inn i M0LT-4-celler, se figur 7. Cellene ble transfektert med VEGF-promoteren (omfattende de første 1000 baser oppstrøms for startsetet) koblet til luciferase- rapportørgenet og med et kontrollplasmid som inneholdt renilla-rapportørgenet. Cellene ble så behandlet med forskjellige konsentrasjoner av aplidin, og luciferaseaktiviteten ble målt etter 24 timer og sammenlignet med renilla-aktiviteten.

Aplidin blokkerer ikke binding av transkripsjonsfaktorene HIF-1 og AP-1 til konsensus-DNA-sekvenser som foreligger i VEGF-promoteren, se figur 8. Kjerneekstrakter ble inkubert med forskjellige aplidinkonsentrasjoner og merkede oligonukleotider i 60 minutter. Ved anvendelse av gelretardasjonsanalyse er bindingen av HIF-1 og AP-1 blitt målt.

Aplidin blokkerer ikke binding av transkripsjonsfaktoren HIV-1 til konsensus-DNA-sekvenser som foreligger i VEGF-promoteren, se figur 9. Kjerneekstrakter erholdt fra celler behandlet med forskjellige aplidinkonsentrasjoner, ble inkubert med merkede oligonukleotider i 60 minutter. Ved anvendelse av gelretardasjonsanalyse er binding av HIF-1 blitt målt.

VEGF (10 ng/ml) tilsatt til dyrkningsmediet til MOLT-4-celler dyrket i 10% FCS, ga en svak reduksjon av aktiviteten av lave konsentrasjoner av aplidin, men er uten virkning ved høye konsentrasjoner, se figurene 10a og 10b.

Aplidin kan også redusere utskillelsen av VEGF fra den humane ovariecancerlinje IGROV-1, se figur 11.

Aplidin reduserer også VEGF-mRNA-nivået i den humane ovariecancerlinje IGROV-1, se figur 12.

Aplidin påvirker ikke promoteraktiviteten til VEGF målt ved anvendelse av luciferase/renilla-rapportørgensystemet, se figur 13.

Eksempel 8

Aplidin blokkerer VEGF-utskillelse og den autokrine VEGF/VEGF-Rl-syklus i en human leukemicellelinje

Aplidin ble funnet å indusere kraftig apoptose i den humane leukemicellelinje MOLT-4. I samme cellelinje viste mikromatriseanalyse endringer i ekspresjonen av forskjellige gener kort tid etter behandling. Blant disse fant vi at VEGF-R1 (flt-1) ble nedregulert ved medikamentbehandlingen, og nedreguleringen ble bekreftet ved northern og western blot-analyse. Videre under-søkelser viste at behandling av det samme cellesystem med forbindelsen førte til en kraftig reduksjon av utskillelsen av VEGF til mediet. Reduksjonen i VEGF-utskillelse var forbundet med en redusert mengde mRNA som koder for VEGF i M0LT-4-celler behandlet med aplidin. Ved forsøk på å utlede mekanismen som aplidin blokkerer VEGF-sekresjonen med, fant vi at forbindelsen ikke endrer halveringstiden for VEGF-mRNA. På tilsvarende måte og ved anvendelse av elektromobilitetsforskyvningsanalyse fant vi at aplidin ikke endrer evnen til to transkripsjonsfaktorer, HIV-1 og AP-1, til å bindes til sine konsensussekvenser som foreligger i VEGF-promoteren, og ikke ga reduksjon av transkripsjonen av VEGF dersom en VEGF-promoter-luciferasekonstruksjon ble anvendt i eksperimenter med forbigående transfeksjon. Den reduserte utskillelse av aplidin var forbundet med forhøyet intracellulær akkumulering av VEGF, noe som i stor grad tyder på at forbindelsen kan virke via en blokkering av utskillelsen av VEGF. Samtidig behandling av MOLT-4 med lave konsentrasjoner av aplidin og VEGF gir en delvis fjerning av aktiviteten til aplidin, noe som tyder på at medikamentet delvis kan utøve sin aktivitet i dette cellesystem ved å blokkere den autokrine VEGF/VEGF-R1-syklus.

Eksempel 9

In vitro-sikkerhetsprofil for aplidin, et marint naturprodukt med kjemoterapeutisk potensial

Ved anvendelse av CellTiter96 (MTS, Promega) in vitro cytotoksisitetsanalyse viser aplidin liten levertoksisitet (AML-12) eller hjertetoksisitet (H9 c2 (2-1) ; LD501 . I motsetning til dette er aplidin svært toksisk for skjelettmuskel (L8), og nyre (NRK-52E)-celler (LD500,1 nM), med intermediær toksisitet for myelogene stamceller (FDC-P1, LD5o0,1 [JM) i nært samsvar med kliniske toksisitetsresultater. Faktisk er den dosebegrensende toksisitet hos mennesker skjelettmuskelatrofi.

Aplidin viser neurotoksisitet ved høyere in vitro-konsentrasjoner. Ved anvendelse av en fluorescerende viabilitets-farging (etidiumhomodimer og calcein AM, Molecular Probes) koblet med immuncytokjemisk analyse, observerte vi at tilnærmet 1 |JM aplidin er toksisk for hjerneceller (både neuroner og astrocytter) og motoriske neuroner (kolinacetyltransferase-positive) i ryggmarg, men ikke for substans P-positive sensor-iske neuroner. Motorneuronsensitiviteten kan bidra til å for- klare den observerte type II muskelatrofi (som forventet) i en liten pasientgruppe hvor AUC-konsentrasjonen av medikamentet er forhøyet grunnet redusert utskillelse.

Eksempel 10

Fase I-undersøkelse av aplidin med 5 dagers bolusinjeksjon hver 3. uke hos pasienter med faste tumorer og lymfomer

Formålene er å bestemme den maksimale tolererte dose, den dosebegrensende toksisitet (DLT), farmakokinetikk (PK) og den anbefalte dose for fase 2-undersøkelser som kan gis ved en daglig 1-times intravenøs injeksjon x 5 dager hver 3. uke. Pasienter med faste tumorer og non-Hodgkins lymfom av lav og intermediær grad inngikk i undersøkelsen. Den daglige utgangsdose av aplidin var 80 |Jg/m<2>. Grupper av 3 pasienter behandles ved hvert doseringsnivå med doseøkning ut fra toksisitet, 20 pasienter ble behandlet ved 6 dosenivåer i området fra 80 |Jg til 720 |Jg/m<2>,

1 pasient behandles for tiden med en dose på 960[Jg/m<2>. I alt

48 sykluser ble tilført. Ikke-hematologisk toksisitet var grad 1 og 2 med tretthet rapportert hos de fleste pasienter. Grad 1 hypersensitivitetsreaksjoner ble dokumentert hos 7 pasienter. Annen toksisitet omfattet kvalme, anoreksi, diaré og uro. Det var ingen hematologisk toksisitet. PK-analyse ble utført i behandlingssyklus 1. Aplidinkonsentrasjonene ble analysert ved LC-tandemmassespektrometri. Resultatene tyder på en doselineær PK med høy variabilitet mellom pasienter. Den totale hastighet for fjerning fra kroppen var 0,38 l/min og den midlere ti/2var 14,2 timer. Mulig terapeutiske plasmakonsentrasjoner (>1 fjg/ml) ble oppnådd. Ingen objektive responser ble dokumentert. 1 pasient med colonkreft var stabil i 9 måneder, og 1 pasient med nyrecellekreft hadde en blandet respons. Som konklusjon er ingen DLT blitt dokumentet. Oppsamlingen av resultater fortsetter ved 960 Mg/m<2>.

Eksempel 11

Fase I klinisk undersøkelse og farmakokinetisk undersøkelse av aplidin, et nytt marint didemnin, tilført som en 24 timers infusjon ukentlig

En fase I-undersøkelse ble utført ved anvendelse av

24 timers infusjon ukentlig x 3 fulgt av 1 ukes hvile. 32 pasi enter (gjennomsnittsalder 58 år, gjennomsnittlig ECOG 1) med langt fremskredne, tidligere behandlede, faste tumorer er blitt behandlet. De er blitt gitt 64 behandlinger (middelverdi/- pasienter: 2 (1-6)) over 8 dosenivåer: 133 (3 pasienter), 266

(3 pasienter), 532 (3 pasienter), 1000 (3 pasienter), 2000

(3 pasienter), 3000 (3 pasienter), 4500 (4 pasienter) og 3750 |Jg/m<2>/uke (10 pasienter) . 2 av 3 evaluerbare pasienter hadde DLT ved 4500 |Jg/m<2>/uke, grad (G) 4 reversibel neuromuskulær toksisitet (biopsi utelukker type II muskulær atrofi) og G4 CK-økning (1 pasient) og forbigående G3 transaminitt (1 pasient). Andre former for toksisitet omfattet G 1-2 utilpasshet (de fleste pasienter behandlet med £3000 |Jg/m<2>/uke), muskelkramper, G 1-2 emesis (responderende på antiemetika) og injeksjonssete-reaksjon (svært hyppig og konsentrasjonsavhengig). Alle pasienter er blitt benyttet for PK-analyse ved en LC/MS/MS-fremgangsmåte. Farmakokinetikken er lineær, og profilene stemmer med en åpen 2 avdelings modell. Medikamentet har omfattende vevsfordeling (Vss = 611 1), høy clearance (0,47 l/min) og en ti/2for fjerning på 18,8 timer. Et vedvarende plasmanivå >1 ng/ml (aktivt in vitro) ble erholdt ved doser £3000 |Jg/m<2>. Én pasient med langt utviklet melanom som var resistent overfor DTIC/inter-feron, hadde en åpenbar klinisk forbedring som ble opprettholdt i >30 uker. Ytterligere fire pasienter hadde mindre responser eller stabil sykdom i £4 måneder. Som konklusjon var DLT for aplidin tilført ved et skjema som omfattet ukentlige infusjoner, reversibel muskeltoksisitet og transaminitt, som ble observertMTDpå 4500 |Jg/M<2>/uke. Den anbefalte dose for fremtidige forsøk, 3750 |Jg/m<2>/uke x 3, tilført gjennom et sentralt venekateter, er anvendbar og forbundet med mild toksisitet.

Eksempel 12

Fase I klinisk undersøkelse og farmakokinetisk undersøkelse av aplidin, et nytt marint didemnin, tilført som en 24 timers infusjon ukentlig.

Pasientegenskaper

Pasientmålinger Høyeste toksisitet pr. pasient

Antitumoraktivitet

Pasient nr. 008 - (Madrid) omfattende tidligere behandling, ikke målbart metastatisk melanom, klinisk forbedring og krymping av tumoren ble observert. En biopsi av én av de metastatiske lesjoner viste ingen tegn på gjenværende tumorvev.

Pasient nr. 032 - (Madrid) Nyrekarsinom: 20% tumorkrymping.

Pasient nr. 034 - (Madrid) Medullært tyreoideakarsinom. Klinisk forbedring og SD ved lungelymfangitt. Reduksjon av CEA-markør.

Farmakokinetikk

Aplidinkonsentrasjonene i plasma ble bestemt ved væskekromatografi/tandem massespektrometri med en kvantifiseringsgrense på 0,25 ng/ml og et bredt, lineært område opp til 16,00 ng/ml I alt 15 prøver ble uttatt opp til 24 timer etter avsluttet infusj on

Doselineær farmakokinetikk

Høy Cl-median ((kvartiler) 0,47 (0,40-0,56) l/min) og variabilitet mellom pasienter (variasjonskoeffisient for clearance (Cl), 45%)

Intermediær til lang halveringstid (ti/2) (middelverdi (kvartiler) 18,8 (15,3-25,4) timer)

Omfattende fordeling med superfysiologisk distribusjonsvolum (Vss) (middelverdi (kvartiler) 611 (434-733) 1)

Akkumulering i blodceller (2-8 ganger sammenlignet med plasma) Profilene kan tilpasses en åpen modell med 2 avdelinger

Figur 14 viser dose-AUC-forholdet.

Konklusjoner

DLT for aplidin tilført ved anvendelse av dette tilførsels-skjema, var reversibel muskeltoksisitet og transaminitt observert ved MTD på 4500 |Jg/m<2>/uke x 3

Anbefalt dose for fremtidige forsøk, 3750 |Jg/m<2>/uke x 3 er mulig og forbundet med mild toksisitet (hovedsakelig mild asteni) Flebitt i infusjonsarmen var vanlig, konsentrasjonsavhengig og kunne unngås ved tilførsel via et sentralt venekateter Ingen hematologisk toksisitet ble observert

PK særpreges ved doselinearitet, relativt forlenget nærvær i kroppen av forbindelsen og omfattende fordeling. Potensielt aktivt plasmanivå nås fra 2000 |Jg/m<2>

Ytterligere en fase I-undersøkelse som omfatter en intravenøs

3 timers infusjon gitt annenhver uke pågår. Utgangsdose 3000 [Jg/m2 annenhver uke.

Eksempel 13

Fase I-undersøkelse av aplidin gitt som en 1 times intravenøs ukentlig infusjon i pasienter med langt fremskredne faste tumorer og lymfom

Voksne pasienter med langt utviklet sykdom, PS<3, og egnet organfunksjon anses anvendbare i undersøkelsen, pasientene gis aplidin tre ganger ukentlig hver fjerde uke. 24 pasienter med faste tumorer inngår i undersøkelsen. Gjennomsnittsalder 55 år, gjennomsnittlig ECOG = 1, 15/24 pasienter behandlet med £2 be-handlingssykluser. 7 dosenivåer (DL) fra 133Mg/m<2>/uke til 2700 Mg/m<2>/uke er blitt analysert: 102 infusjoner kan evalueres for toksisitet. Ingen hematologisk toksisitet er blitt rapportert, oppkast som krever profylakse, ble observert fra 800[Jg/m<2>/uke. Ved 2700Ug/m<2>/uke (4 pasienter) hadde én G3 hyperbilirubinemi som anses som dosebegrensende, og derfor utvides dosenivået 2700 |Jg/m<2>/uke. Alle pasienter anvendes for PK-analyse (LC-ESI-MS/MS), kinetikken er lineær, gjennomsnittlig Vss=308 l/m<2>, CL er høy, middelverdi = 0,60 l/min og gjennomsnittlig halveringstid for fjerning er 14,2 timer. Plasmanivåer

>1 ng/ml 24 timer etter infusjonen kan nås fra 1800 |Jg/m<2>/uke. Tidlige tegn på aktivitet mot magekreft er blitt bemerket

(1 pasient ved 1200 fjg/m2) . En pasient med langt utviklet nyrekreft som var resistent overfor VBL-IFN, hadde en vedvarende objektiv respons (PR lungemetastaser og SD i peritoneal sykdom) ved 2700 |Jg/m<2>/uke DL. Aplidin ser ut til å være klinisk anvend-bart i farmakologisk egnede dosenivåer.

Eksempel 14

En fase I-undersøkelse og farmakokinetisk undersøkelse av aplidin gitt som en 24 timers kontinuerlig infusjon annenhver uke til pasienter med faste tumorer og lymfom

Aplidin ble gitt til pasienter med faste tumorer/NHL som en 24 timers infusjon annenhver uke til 35 pasienter (gjennomsnittsalder = 51, gjennomsnittlig ECOG = 1) med faste tumorer (32 pasienter) eller NHL (3 pasienter). 23 av 35 pasienter var tidligere behandlet med £3 tidligere kjemoterapeutiske behandlinger. 9 dosenivåer (200-7000 |Jg/m<2>/uke/annenhver uke) og 65 sykluser (120 infusjoner) ble gitt. Ingen hematologisk toksisitet ble rapportert. Toksisiteten omfatter G2-3 asteni og emesis hos 9-2 pasienter hhv. 12-1 pasienter. G3 kvaIme/oppkast (£5000 \ ig/ m2) ble effektivt behandlet og forhindret med 4HT3-behandling. Ingen hjertetoksisitet ble rapportert. Ved en dose på 5000 |Jg/m<2>/uke/annenhver uke opplevde 2 pasienter forbigående muskelkramper med reversibel G3 forhøyelse av CPK-MM. Av 9 pasienter behandlet med 6000 |Jg/m<2>/uke, opplevde 3 pasienter forhøyet CPK-MM og aldolase etter tredje aplidininjeksjon. CPK-økninger var Gl-2 og ikke symptomatisk hos 2 pasienter, men en G3 CPK-økning med G3 muskelsmerter og tap av muskelstyrke (DLT) ble rapportert for 1 pasient. Dette var reversibelt uten varige virkninger. Muskelbiopsi viste ingen signifikant nekrose av mykocytter. Ultrastrukturen elektronmikroskopi viste ingen morfologisk endring av mitokondrier, men tap av tykke myosinfilamenter. Ved 7000 |Jg/m<2>/annenhver uke inngår 4 pasienter. Farmakokinetisk analyse (LC-ESI/MS/MS) viste at AUC-økningen er lineær med en stor Vss = 5391/m<2>, høy clearance (332 ml/mm.m<2>) og lang terminal halveringstid (15-35 timer). Plasmakonsentrasjoner 24 timer etter avsluttet infusjon ved doser £3000 |Jg/m<2>/annenhver uke kan sammenlignes med effektive in vitro-konsentrasjoner (<1 ng/ml). Aktivitet ble observert ved NHL (1/3 pasienter), medullært tyreoideakarsinom (2/2 pasienter), nyrekreft (1/5 pasienter) og neuroendokrin kreft (1 pasient). Mekanistiske hypoteser og forebyggende strategier mot muskeltoksisitet er under evaluering.

Eksempel 15

Mikromatriseanalyse

Den humane leukemicellelinje MOLT-4 ble anvendt i disse eksperimenter. MOLT-4-celler ble behandlet i 1 time med 20 nM aplidin. Total-RNA ble ekstrahert etter avsluttet behandling og 6 og 24 timer etter gjenvinning i medikamentfritt medium. 5 pg total-RNA ble retrotranskribert til cDNA i nærvær av<32>P-dATP. Like mengder av radioaktiv probe ble hybridisert til Atlas Human Cancer Microarrays (Clontech). Etter vask ble filtrene eksponert og resultatene analysert ved anvendelse av programvaren Atlas Image. Bare genekspresjonsforskjeller på mer enn 2 ganger mellom behandlede og ubehandlede celler ble analysert videre. RT-PCR og northern-analyse er blitt utført for å bekrefte endringene i genekspresjon observert med mikro-matrisene.

Resultater

Aplidinbehandling ga signifikante endringer i genekspresjonen allerede 1 time etter behandling. Etter 6 og 24 timers gjenvinning i medikamentfritt medium er ekspresjon av et for-høyet antall gener blitt observert.

Etter avsluttet behandling ble de mest signifikante endringer observert i ekspresjonen av det tidlige responsgen ETR og i VEGF-RI/flt-l-genet, hvor ekspresjonen økte hhv. ble redusert ved behandlingen.

ETR-nivået vendte tilbake til normalt nivå etter 6 og

24 timer, mens nivået av flt-1 var ytterligere redusert etter

6 og 24 timer.

Aplidin induserte også økt nivå av B-RAF og Fms som klart kunne observeres 6 timer etter gjenvinning i medikamentfritt medium.

Endringene som ble observert i disse gener, ble bekreftet ved enten RT-PCR eller northern blot-analyse.

Fra mikromatriseanalysen ble endringer i genekspresjonen (ennå ikke bekreftet ved RT-PCR) observert for andre gener, f.eks. PLK-1.

Eksempel 16

Fase I-undersøkelse av aplidin ved 1 times daglig infusjon x 5 hver 3. uke i pasienter med faste tumorer og non-Hodgins lymfom av lav og intermediær grad

Resultater

Pasientdemografi (N=23)

Pasientinntak/dosenivå Ikke-hematologisk toksisitet

Ikke-hematologisk toksisitet, forts.

Hematologisk toksisitet Biokjemisk toksisitet

Farmakokinetikk

PKkarakterisert veddoselinearitet

Høy variabilitet mellom pasientene

Høy plasma-clearance (middelverdi 0,38 l/min)

Intermediær til lang ti/2, middelverdi 14,2 timer

Terapeutiske plasmakonsentrasjoner (>1[Jg/ml) er blitt oppnådd

Konklusj oner

Ingen DLT dokumentert til nå

Mild, medikamentforbundet toksisitet omfattende tretthet og kvalme (som lett kan kontrolleres med antiemetika)

Sporadisk HSR uavhengig av forbehandling

Ingen klare tegn på neuropati eller myopati

Ingen objektive responser dokumentert, men noen tegn på mulig antitumoraktivitet: - To pasienter med kraftig forbehandlet CRC, én hadde stabil sykdom i 6+ måneder (i alt 13 sykluser), og den andre hadde en 40% reduksjon av tumorens størrelse. - Én pasient med nyrecellekreft og levermetastaser med blandet respons (10% reduksjon i summen av tumormålingene) Doseøkningen fortsetter: nå oppsamles resultater for 1200 |Jg/m<2>

Eksempel 17

Fase I-undersøkelse av aplidin gitt som en 1 times intravenøs infusjon ukentlig i pasienter med langt fremskredne faste tumorer og non-Hodgins lymfom

Medikamenttilførsel

Aplidin ble tilført som en 1 times infusjon ukentlig x 3 hver fjerde uke.

Pasientegenskaper

Pasientmålinger og doseøkning Verste toksisiteter pr. pasient

Karakterisering av den rapporterte dosebegrensende toksisitet

Pasient nr. 28 - Edinburgh med øsofagus adenokarsinom (ingen levermetastaser) behandlet med 2700 |Jg/m<2>ukentlig hadde forsinket gjenvinning av leverenzymøkningen (G3 AST; G3 bilirubin; G3 ALP), noe som forhindret ukentlig tilførsel av ytterligere doser.

Tegn på aktivitet

Pasient nr. 16 - (Edinburgh) med mageadenokarsinom som primært var resistent overfor FAM. En svak forbedring i lymfe-knutemassene rundt den nedre del av magen, bukhuleaksen og pelvis med aplidin ved 1200Ug/m<2>ukentlig (3600 Ug/m2) .

Pasient nr. 23 - (Barcelona) med nyrekarsinom og pulmonale noduler som det viktigste sykdomssete, primært resistent overfor VBL + alFN og for liposomalt doksorubicin. Delvis remisjon i lungeknuter og klinisk forbedring med resolusjon av dyspné etter 2 infusjoner med aplidin ved 2700Ug/m<2>ukentlig (8100 Ug/m2) .

Pasient nr. 29 - (Barcelona) med nyrekarsinom. Klinisk forbedring etter 3 infusjoner ved evaluering av en supra-klavikulær adenopati. Fortsatt evaluering ved andre syklus.

Farmakokinetiske resultater

Doselineær PK opp til det nåværende dosenivå på 2700 Ug/m<2>Viktig variabilitet mellom pasientene: variasjonskoeffisient for CL, 3 3 %

Relativt høy plasma-CL: middelverdi (kvartiler) 329 (288-

407 ml/min/m<2>)

Intermediær ti/2: middelverdi (kvartiler) 15,8 (13,3-19,5) timer Omfattende fordeling: middelverdi (kvartiler) Vss, 345 (220-398) l/m<2>

Foreløpig kompartmentaliseringsanalyse: profilene tilpasses best ved en førsteordens modell med 3 avdelinger med en svært hurtig innledende fase (gjennomsnittlig halveringstid 0,04 timer), fulgt av en intermediær fase (gjennomsnittlig halveringstid 1,4 timer) og en lengre terminalfase (gjennomsnittlig halveringstid 20,7 timer)

Konklusj oner

Denne pågående undersøkelse tyder på at aplidin gitt som en 1 times infusjon ukentlig med én ukes hvile, er klinisk utførbar opp til en dose på 3600Ug/m<2>hver uke. Benmargstoksisitet er ikke blitt rapportert. Emesis kan kontrolleres ved profylaktiske antiemetika. Muskeltoksisitet bestående av muskelsvakhet og forhøyet CK, er blitt observert hos én pasient behandlet ved 3600. Levertoksisitet ved det høyeste undersøkte dosenivå er blitt rapportert hos flere pasienter, selv om dette var DLT i én pasient. Farmakokinetiske opplysninger tyder på at mulig terapeutiske nivåer kan nås i plasma hos pasienter som behandles med 1200 Mg/m<2>og høyere.

Gjennomførbarheten av 3600Ug/m<2>hver uke (dosenivå VIII) er under undersøkelse.

Eksempel 18

En fase I-undersøkelse og farmakokinetisk undersøkelse av aplidin gitt som en 24 timers kontinuerlig infusjon annenhver uke til pasienter med faste tumorer og non-Hodgkins lymfom Pasientegenskaper

Pasientmålinger og doseøkning Verste toksisiteter pr. pasient

Karakterisering av muskeltoksisitet (DLT)

Pasient nr. 27 - Mann med medullært tyreoideakarsinom behandlet med 6000 Ug/m2 ukentlig, hadde symptomatisk G3 CPK med G2 muskelsmerter. Toksisiteten reversert i løpet av 3 uker etter avbrutt behandling.

3 pasienter (5000 og 6000 Ug/m2) opplevde en mindre økning av CPK (£G2) som besto av CPK MM (muskel)-økning uten signifikant økning av CPK MB (hjerte). En parallell økning av aldolase- nivået ble observert. Tegn på forbedring ved anvendelse av carnitintilskudd som skjelettmuskelbeskyttelse rapporteres. Muskelbiopsier ble utført hos 2 pasienter, E/M: delvis fjerning av tykke myosinfilamenter.

Farmakokinetiske verdier

Aplidin ser ut til å ha en doselineær PK-profil (innen de begrensninger som det lave antall pasienter medfører)

Relativt høy plasma-CL: middelverdi (kvartiler) 252 (192-

415) ml/min/m<2>)

Høy variabilitet i clearance mellom pasienter (variasjonskoeffisient for CL 62%)

Intermediær til lang ti/2med middelverdi (kvartiler) på 23,8 (15,7-35,0) timer

Omfattende fordeling, middelverdi (kvartiler) Vss 413 (274-

638 l/m<2>)

Foreløpig kompartmentaliseringsanalyse: plasmaprofilene kan best tilpasses ved en førsteordens modell med 2 avdelinger og hurtig innledende (middelverdi for halveringstiden 0,64 timer) og en lengre terminal fase (middelverdi for halveringstiden 25,8 timer)

Sammenheng mellom aplidinmyotoksisitet og farmakokinetikk Muskeltoksisitet har kun opptrådt ved høye doser og eksponering etter 24 timers infusjon

Cmaks.-verdier etter 1 times infusjon er allerede høyere enn verdiene etter 24 timers infusjon. Således kan et Cmaks.-forhold utelukkes

AUC-verdiene hos pasienter med myotoksisitet er høye, men ikke maksimale

Toksisiteten rammet pasienter med høy, vedvarende plasmakonsen-trasjon av aplidin. De 3 pasientene med klar muskeltoksisitet hadde ti/2på mer enn 4 4 timer sammenlignet med en gjennomsnittlig ti/2på 25,8 timer etter 24 timers infusjon

Figur 15a og 15b viser aktiviteten på medullært tyreoideakarsinom: CEA-nivå

Konklusj oner

Medikamentet induserte muskelendringer (forventet å være den dosebegrensende toksisitet), rapportert fra dosenivå nr. III og oppover (fra 1800 Mg/m<2>til 5000 \ ig/ m2) er dosebegrensende toksisitet ved 6000 \ ig/ m2 (1/9 pasienter)

Antitumoraktivitet er også blitt observert hos pasienter med NHL og nyrekarsinom

Undersøkelsen studerer nå anvendbarheten av 6000-7000 \ ig/ m2 annenhver uke ved anvendelse av carnitintilskudd som skjelettmuskelbeskyttelse.

Claims (10)

1. Anvendelse av aplidin ved fremstilling av et farmasøytisk preparat for behandling av kreft i en human pasient, hvori det farmasøytiske preparat er formulert for å være egnet til intravenøs infusjon av aplidin i overensstemmelse med én av følgende fremgangsmåter: a. 24 timers infusjon ukentlig i tre uker, fulgt av én ukes hvile, av en anbefalt dose på ikke mer enn 3750 ug/m<2>/uke, b. 24 timers infusjon annenhver uke, av en anbefalt dose på ikke mer enn 7000 ug/m<2>/2 uker, eller c. 1 times infusjon ukentlig i tre uker hver fjerde uke, av en anbefalt dose på ikke mer enn 3600 ug/m<2>/uke.

2. Anvendelse av aplidin ifølge krav 1, hvori det farma-søytiske preparat formuleres for å være egnet for intravenøs infusjon av aplidin som en 24 timers infusjon ukentlig i tre uker, fulgt av én ukes hvile, med en anbefalt dose som ikke er mer enn 3750 ug/m<2>/uke.

3. Anvendelse av aplidin ifølge krav 1, hvori det farma-søytiske preparat formuleres for å være egnet for intravenøs infusjon av aplidin som en 24 timers infusjon annenhver uke med en anbefalt dose som ikke er mer enn 7000 ug/m<2>/2 uker.

4. Anvendelse av aplidin ifølge krav 3, hvori det farma-søytiske preparat formuleres for å være egnet for intravenøs infusjon av aplidin som en 24 timers infusjon annenhver uke med en dose på 5000 ug/m<2>/2 uker.

5. Anvendelse av aplidin ifølge krav 1, hvori det farma-søytiske preparat formuleres for å være egnet for intravenøs infusjon av aplidin som en 1 times infusjon ukentlig i 3 uker hver fjerde uke med en anbefalt dose som ikke er mer enn 3600 ug/m<2>/uke.

6. Anvendelse av aplidin ifølge krav 5, hvori det farma-søytiske preparat formuleres for å være egnet for intravenøs infusjon av aplidin som en 1 times infusjon ukentlig i 3 uker hver fjerde uke med en dose på 2700 ug/m<2>/uke.

7. Anvendelse av aplidin ifølge et hvert av de foregående krav, hvori det farmaøystiske preparat anvendes som del av en kombinasjonsterapi.

8. Anvendelse av aplidin ifølge et hvert av de foregående krav, hvori det farmasøytiske preparat anvendes sammen med en skjelettmuskelbeskytter.

9. Anvendelse av aplidin ifølge krav 8, hvori skjelettmuskel-beskyttelsen er karnitin.

10. Anvendelse av aplidin ifølge et hvert av de foregående krav, hvori den humane pasient allerede har mottatt standard-behandling for sin kreftsykdom, og tumoren er refraktorisk.