MXPA02004862A - Tratamiento de aplidina para canceres. - Google Patents

Abstract

Aplidina demuestra promesa considerable en pruebas clinicas de fase (1) para el tratamiento de tumores, y varios regimenes de dosificacion se dan. La reduccion de tumor se ha observado en varios tipos de tumor incluyendo carcinoma renal, cancer colorectal, carcinoide pulmonar; carcinomas de tiroides medular y melanoma. Tambien se ha encontrado que aplidina tiene un papel, para inhibir angiogenesis, complementado la actividad anti-tumor.

Description

i TRATAMIENTO DE APLIDlNA PARA CÁNCERES La presente invención se refiere al tratamiento de cánceres.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN El cáncer comprende un grupo de neoplasmas malignos que puede dividirse en dos categorías, carcinoma, que comprende una mayoría de los casos observados en los clínicos, y otros cánceres menos frecuentes, que incluyen, leucemia, línfoma, tumores del sistema nervioso central y sarcoma. Los carcinomas tienen su origen en tejidos epiteliales mientras que los sarcomas se desarrollan de tejidos conectivos y aquellas estructuras que tienen su origen en tejidos de mesodermo. Los sarcomas pueden afectar, por ejemplo, al músculo o hueso y ocurrir en los huesos, vejiga, ríñones, hígado, pulmón, parótida o bazo. El cáncer es invasor y tiende a la metástasis en nuevos sitios.

Se difunde directamente hacia tejidos circundantes y también pueden diseminarse a través de los sistemas, linfático y circulatorio. Muchos tratamientos se encuentran disponibles para cáncer, incluyendo cirugía y radiación para enfermedad localizada, y medicamentos. Sin embargo, la eficacia de tratamientos disponibles en muchos tipos de cáncer se limita, y nuevas formas mejoradas de tratamiento que muestran beneficio clínico son necesarias. Esto es especialmente verdadero para aquellos pacientes que presentan enfermedad metastática y/o avanzada. También es verdadero para pacientes que reinciden en la enfermedad progresiva después de haber sido tratados previamente con terapiaé establecidas s i í *H f t* las cuates el tratamiento adicional con la misma terapia es mayormente ineficaz debido a la adquisición de resistencia o a limitaciones en la administración de las terapias debido a toxicidades asociadas. La quimioterapia juega una parte significativa en tratamiento d cáncer, ya que se requiere para el tratamiento de cánceres avanzados con metástasis distante y con frecuencia útil para la reducción del tumor antes de la cirugía, y muchos medicamentos anti-cáncer se han desarrollado en base a varios modos de acción. La dehidrodidemnin B, ahora conocida como aplidina, es el 10 sujeto de WO 91/04985. Información adicional acerca de aplidina se encuentra en, por ejemplo: Jimeno, J., "Exploitation of marine microorganisms and invertebrates: Anticáncer drugs from marine origin", IBC Conf Discov Drugs 15 from Nat Novel Approaches New Sources (Dec 8-9, Londres) 1994, 1994 Farrcloth, G. eí al., "Dehydrodidemnin B (DDM) a new marine d#rived anticancer agent (MDA) with activity against experimental tumor odels", 9th NCOI-EORTC Symp New Drugs Cáncer Ther (Marzo 12-15, Amsterdam) 1996, Abst 1 1 1 0 Sakai, R. er al., "Structure-activity relationships of the didemnins", Journal of Medicinal Chemistry 1996, 39 (14):2819 Urdíales, J. L. ef al., "Antiproliferative effect of dehydrodidernnin B (DDB), a depsipeptide ¡solated from Mediterranean tunicates", Cáncer Letters 1996, 102 (1 -2):31. 5 Faircloth, G et al. , "Preclinical characterization of aplidíne (Afl)), , 4w marine anticancer depsipeptide (MADEP)", Proc Amer Assoc Cáncer Res 1997, 38: Abst 692 Depenbrock, H. et al. , "In vitro activity of aplidine, a new marine-derived anti-cancer compound, on freshly explanted clonogenic human tumour cells and haematopoictic precursor cells", Britísh Journal of Cáncer 1998, 78(6): 739 Faircloth, G. et al. , "Aplidine (aplidine) is a novel marine-derived depsipeptide with in vivo antitumour activity", Proc Amer Assoc Cáncer Res 1998, 39: Abst 1551 Faircloth, G. et al. , "Preclinical elevelopment of aplidine, a novel marine-derived agent with potent antitumour activity", 10th NCI-EORTC Symp New Drugs Cáncer Ther (Junio 16-^19, Amsterdam) 1998, Abst 129 Mastbergen, S.C. et al. , "Cytotoxicity and neurocytoxicity of aplidine, a new marine anticancer agent evaluated using in vitro assays", 10th NCI-EORTC Symp New Drugs Cáncer Ther (Junio 16-19, Amsterdam) 1998, Abst 131 . En estudios preclínicos, aplidina tuvo actividad citotóxica dependiente de dosis contra las dos estirpes como epiteliales, CT-1 y CT-2, y la estirpe de cáncer de colón humano, HT-29. La línea más proliferativa, CT-2, fue la más sensible a aplidina. Además, el compuesto redujo la actividad de decarboxilasa de ornitina en las tres estirpes (Lobo C, Garcia-Pozo SG et al). Effect of dehidrodidemnin B on human colon carcinoma cell lines. Anticancer Research, 17: 333-336, Ene-Feb, 1997). En un estudio similar, 50 nmol/L de aplidina inhibieron el crecimiento de las estírg>#$ de cáncer de mama, MDA-MB231 y MCF-7 por 17 y 47%, respectivamente. Un incremento significativo en espermidína y espermina se observa en las células tratadas (Gomez-Fabre PM, De Pedro E, eí al). Polyamine cohtents of human breast cáncer cells treated with the cytotoxic agentes chlorpheniramine and dehydrodidemnin B. Cáncer Letters. 118:141 -144, 26 de Febrero de 1997). Los análisis citométricos de flujo mostraron que la aplidina no induce ninguna perturbación del ciclo celular aparente (Erba, E, Balconi G eí al., Cell cycle phases perturbations induced by new natural marine compounds. Annals of Oncology. 7 (Suppl. 1 ): 82, 1996). En ratones, la aplidina fue activa contra leukemia P388 implantada y melanoma B16, con una dosis óptima de 160 micro/kg. Diferente a didemnin B, la aplidina fue activa en carcinomas de pulmón lewis implantado SC (Faircloth G, Rinehart K, eí al., Dehydrodídemnin B a new marine derived anticancer agent with activity against experimental tumour models. Annals of Oncology, 7 (Suppl 1 ):34, 1996). La exposición continua a bajas concentraciones de aplidina inhibieron el crecimiento de un número de estirpes de tumor, incluyendo linfoma de no Hodgkin, melanona, y cánceres de mama, melanoma, ovárico y de pulmón de célula no pequeña. La magnitud del efecto fue dependiente del tiempo de exposición y parece lograrse a concentraciones no mielotóxicas. El cáncer de pulmón de célula no pequeña, cáncer de mama y estirpes de melanoma son sensibles a una exposición continua a .aplidina en concentraciones de >=0.001 micromol/L. Aplidina tuvo una toxicidad similar a doxorubicin contra células madre hematopoiéticas clonogéncias (Depenbrock H, Peter R eí al., In vitro activíty of aplidine, a d, on freshly explanted clonogenic human tumor celias and haematopoietic precursor cells. Diario Británico de Cáncer, 78: 739-744, No. 6, Sep 1998). Aplidina tuvo actividad significativa contra ratones que llevan xettoinjertos de cáncer humano. En una dosis tolerada máxima de 2.1 mg/kg, aplidina produjo casi remisiones completas en algunos animales con una proporción de tumor tratado/control (T/C) de 9%. En 1.25 mg/kg, la actividad significativa se observa contra tumores gástricos (T/C 14%) y también se observó la inhibición del crecimiento del tumor de próstata (T/C 25%) (Faircloth, G, Grant W, et al , Preclinical developrhent of aplidine, a novel marine-derived agent with potent antrtumor activity. Annals of Oncology, 9 (Suppl. 2):34, 1998.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN Hemos desarrollado métodos parata tratar a pacientes humanos con una aplidina que conduce a mejora clínica.

MODALIDADES DE LA INVENCIÓN De esta manera, la presente invención proporciona un método para tratar a cualquier mamífero, notablemente un humano, afectado por cáncer, el cual comprende administrar al individuo afectado una cantidad terapéuticamente eficaz de aplídina, o una composición farmacéutica de ?a misma, Lá presente invención también se refiere a preparaciones farmacéuticas, que contienen como ingrediente activo aplidina, así como tam&ién a los procesos para su preparación. Ejemplos de composiciones farmacéuticas ¡ncluyen líquido (soluciones, suspensiones o emulsiones) con composición adecuada para administración intravenosa, y pueden contener el compueéto puro o en combinación con cualquier vehículo u otro compuesto farmacológicamente activo. La administración de los compuestos o composiciones de la presente invención se basa en un Procedimiento de Dosificación preferentemente por infusión intravenosa. Hemos preferido que los momentos de infusión de hasta 72 horas Se utilizan, más preferentemente 1 a 24 horas, con aproximadamente 1 , aproximadamente 3 o aproximadamente 24 horas más preferidos. Los tiempos de infusión cortos que permiten el tratamiento para llevarse a cabo sin una permanencia durante la noche en el hospital son especialmente deseables. Sin embargo, la infusión puede ser de aproximadamente 24 horas o aún más si se requiere. La infusión puede llevarse a cabo en intervalos adecuados con patrones variables, ilustrativamente una vez a la semana, dos veces a la semana, o más frecuentemente por semana, repetirse cada semana opcionalmente con espacios de típicamente una semana. La guía adicional se da más adelante en este texto. La dosis correcta del compuesto variará de acuerdo con la formulación particular, el modo de aplicación, y los lugares particulares, huésped y tumor que se tratan. Otros factores como la edad, peso corporal, sexo, dieta, tiempo de administración, velocidad de excreción, condición dei huésped, combinaciones de medicamento, sensibilidades de reaeción y severidad de la enfermedad deben tomarse en cuenta. l|3 í administración puede llevarse a cabo continua o periódicamente dentro de la dosis máxima tolerada. El compuesto de aplidina y composiciones de esta invención pueden utilizarse con otros medicamentos para proporcionar una terapia de combinación. Otros medicamentos pueden formar parte de la misma composición, o proporcionarse como una composición separada para la administración al mismo tiempo o en tiempo diferente. La identidad de otro medicamento no se limita particularmente, y los candidatos adecuados incluyen; a) medicamentos con efectos antimitóticos, especialmente aquellos con elementos citoesqueletales objetivo, incluyendo moduladores de microtúbulo tales como medicamentos de taxano (tales como taxol, paclitaxel, taxotere, docetaxel), podofilotoxinas o alcaloides vica (vincristina, vinblastina); b) medicamentos de antimetabolito (tales como 5-fluorouracil, citarabina, gemcitabina, análogos de purina tales como pentoestatin, metotrexato); c) agentes de alquilación o mostaza de nitrógeno (tales como nitrosoureas, ciclofosfamida o ifosfamida), d) medicamentos con ADN objetivo tales como los medicamentos de antraciclina, adriamicina, doxorubicina, parmorubicina o epirubicina; e) medicamentos con topoisomerasas objetivo tale como etoposido; * .~m^ áU»^d*^iu?É??»?**IÉ ?. f) hormonas y antagonistas o agonistas de hormona tales coi estrógenos, antiestrógenos (tamoxifen y compuestos relacionados) y andrógenos, flutamida, leuprorelin, goserelin, ciprotrona u octreótido; g) medicamentos con transducción de señal objetivo en células timorales incluyendo derivados de anticuerpo tal como herceptin; h) medicamentos de alquilación como medicamentos de platino (cis-platin, carbonplatin, oxaliplatin, paraplidineatin) o nitrosoureas; i) medicamentos que afectan potencialmente la metástasis de tumores tales como inhibidores de metaloproteinasa matriz; j) terapia genética y agentes antisensibles; k) terapéuticos de anticuerpo; I) otros compuestos bioactivos de origen marino, notablemente kahalalide F o ecteinascidinas tales como et-743; m) protectores del músculo esquelético tales como complementos de carnitina; o) otros medicamentos que combaten efectos secundarios de aplidina tales como antieméticos; o) más generalmente medicamentos que permiten que la aplidina se dosifique en la Dosis Recomendada y manejar la toxicidad. Hemos encontrado que la aplidina inhibe la expresión del gen (FLT1 ) que codifica el receptor del Factor de Crecimiento Endotelial Vascular (VEGF). Además, se ha encontrado que la aplidina inhibe severamente lá producción de la proteína VEGF por sí misma por células tumorales. La secreción de VEGF por una masa celular, en particular una asa de célula tum#ral, causa vascularización de novo (angiogénesis) que conduce a nuevos vasos sanguíneos que se forman hacia la masa celular y que establecen una red de capilares que es capaz de suministrarla con irrigación para su proliferación sostenida. Estos efectos, en particular ia abolición demostrada de producción de VEGF por células de tumor se espera que inhiban severamente la habilidad de las células tumorales a entrar en angiogénesis. Además, VEGF se requiere directamente por algunas células tumorales hematopoiéticas (tales como células de leucemia humana MOLT4) como un factor de crecimiento. De esta manera, puede predecirse que aplidina tiene un efecto inhibidor en la vascularización de novo de tumores principales de crecimiento o metástasis, por lo tanto inhibiendo el crecimiento de los¡ tumores, que se sabe que requieren vascularización para crecimiento. La aplidina debe también ser activa en tumores hematopoiéticos. Además, se sabe que la aplidina modula la función del canal de calcio en células. Los tumores de vejiga son un tipo de tumor que sobreexpresa el receptor al Factor de Crecimiento Epitelial (EGF), que conduce a la supraregulación de VEGF y el receptor VEGF. La unión de VEGF a su receptor se cree que conduce a la estimulación del crecimiento celular por medio de cambios de ion de calcio local, transitorio entre otros mecanismos para señalización. Un compuesto que Inhibe la acción de VÉGF se espera que sea inhibidor de tales tumores. Experimentalmente, se ha encontrado que la aplidina tienen actividad excedentemente elevada en el cáncer de vejiga humana (dando rem?s?ones completas en algunos modelos animales), de acuerdo con la predicción. La aplidina puede predecirse q e tiene una amplia actividad de antltumor de espectro debido a sus efectos en un gran número de tumores. Él efecto de VEGF es más relevante debido a que incluye una inhibición de nuevos envases sanguíneos. Además de los efectos en los vasos sanguíneos, ciertos tumores requirieron VEGF directarnente para crecimiento celular (es decir, leucemia, linfomas, tumores de vejiga y tumores ováricos). De acuerdo con lo anterior, proporcionamos un método de tratamiento de una condición angiogénica que incluye la administración de aplidiná. En particular, proporcionamos un método para tratar un tumor que es dependiente del proceso angiogénico. La invención proporciona además un proceso para preparar un inhibidor de angiogénesis, invasión de cáncer o metástasis de cáncer qué comprende mezclar una dosis eficaz de aplidina con un vehículo farmacéuticamente aceptable. También proporcionamos un método para tratar desordenes relacionados a angíogénesis sin tumor, tal como retinopatía. En particular, comprendemos métodos para tratar desordenes de angiogénesis tales como neoplasia incluyendo metástasis; condiciones oftálmicas tales como rechazo al injerto corneal, neovascularización ocular, neovascularización retinal, retinopatía diabética, fibroplasia retrolental y glaucoma neovasculár; enfermedades ulcerativas tal como úlcera gástrica; y otras condiciones tales como hemangiomas infantiles, angiofibroma de la nasofaringe y necrosis avasuclar de hueso; y d¡#S ?«l if § l sistema reproductivo de la hembra tal como endometriosis. Las respuestas en pacientes con cáncer se han observado en pruebas clínicas con aplidina, demostrando utilidad del método de tratamiento. Los estudios clínicos de la Fase I y análisis farmacocinéticos demuestran que la aplidina presenta una ventana terapéutica positiva con toxicidad manejable en el rango de dosis requerida para eficacia clínica en el tratamiento de pacientes con cáncer. El método consiste de la administración de medicamento por infusión intravenosa durante un periodo de 75 horas o menos al nivel de dosis recomendado (RD) con o sin combinación con otros agentes terapéuticos. La aplidina se suministra y almacena como un producto íiofilizado estéril, que consiste de aplidina y excipiente en una formulación adecuada para uso terapéutico. Aplidina solubilizada muestra degradación substancial bajo condiciones de prueba de tensión a la luz y calor, y una forma de dosis liofilizada se desarrolla, ver WO 99/42125 incorporada en la presente para referencia. En una modalidad actualmente preferida la liofilización se realiza de una solución de aplidina de 500 mg/mL en 40% (v/v) de tert' butanol en Agua para Inyección (Wfl) que contiene 25 mg/mL de D-manitol como agente de abultamiento. El prototipo, que contiene 500 mg de aplidina y 25 mg de D-manitol como agente de abultamiento por frasco, se encontró que es la formulación óptima en términos de solubilidad, la duración del ciclo de liofilización y requerimientos de dosis en los estudios clínicos. La solución de reconstitución óptima se encontró que es 15/15/70% (v/v/v) Cremaphor EL/etanol/Wfl (CEW). Tanto el producto reconstituido como diluciones (hasta 1 : 100 v/v) del producto reconstituido con salina normal parece ser estable por al menos 24 horas después de la pr paración. Los datos de vida en estante, disponibles hasta ahora, muestran que la formulación es estable por al menos 1 años cuando se almacena a 4°C en la obscuridad. La preparación de la solución de infusión también se realiza bajo condiciones asépticas al extraer el volumen de solución correspondiente a dosis calculada para cada paciente, e inyectar lentamente la solución reconstituida requerida en una bolsa de infusión o botella que contiene entre 100 y 1000 ml de 0.9% de cloruro de sodio. La solución de infusión de aplidina debe administrarse intravenosamente, tan pronto como sea posible, así como también se prefieren el contenedor y materiales de conducto de vidrio transparente. La administración se realiza en ciclos, en el método de aplicación preferido, una infusión intravenosa de aplidina se da a los pacientes la primer semana de cada ciclo, los pacientes de dejan recuperar el resto del ciclo. La duración preferida de cada ciclo es de ya se 3 o 4 semanas; los ciclos múltiples pueden darse según sea necesario. El medicamento también puede administrarse cada uno de los primeros días de cada ciclo. Los retrasos de dosis y/o reducciones y ajustas del programa se realizan según se necesaria dependiendo de la tolerancia del paciente individual a los pacientes, en particular las reducciones de dosis se recomiendan para pacientes con los niveles de suero más elevados que i mm ii i ^a^aüjiíüi mii los normales de taransaminasas de hígado o fosfato de alcalina, o bilirrubina. La Dosis Recomendada (RD) es la dosis más elevada que puede administrarse de manera segura a un paciente que produce tdxicidad tolerable, manejable y reversible de acuerdo a los Criterios Comunes de Toxicidad establecidos por el Instituto Nacional del Cáncer (USA), con no más de 2 fuera de 6 pacientes presentado cualquier toxicidad limitante de dosis (DLT). Las directrices de terapia de cáncer frecuentemente llaman para la administración de agentes quimioterapéutícos en la dosis segura más elevada en la cual la toxicidad se maneja con objeto de lograr la eficacia máxima (DeVita, V.T. Jr., Hellman, S, y Rosenberg, S.A. , Cáncer: Principies artd Practice of Oncology, 3era ed., 1989, Lipincott, Filadelfia, DLTs para aplidina utilizando este método de tratamiento se determinan en estudios clínicos. Estos estudios establecen un nivel de dosis recomendado para diferentes clases de procedimientos de dosificación. La aplidina puede administrarse de manera segura en un nivel de dosis o por debajo de la Dosis Recomendada (RD). La infusión es el procedimiento actualmente preferido, con regímenes típicos que incluyen: Infusión de 24 horas cada semana por un número de semanas, dichas tres semanas, seguida por una semana de descanso; Infusión 24 horas cada dos Semanas; 1 hora de infusión a la semana por 3 semanas cada 4 semanas; 1 » infusión diaria de dicha 1 hora a 5 días q de 3 semanas; e +} infusión de dichas 3 horas cada otra semana. En particular, la infusión intravenosa puede llevarse a cabo como una infusión de 24 horas una vez a la semana por 3 semanas q 4 semanas. Más datos se dan en loS ejemplos 3, 4, 11 y 12. Este procedimiento se ha enmendado y los pacientes se trataran ahora utilizando un programa diferente que parece factible: infusión de 3 horas cada 2 semanas sin descanso. Ver ejemplo 12. En el estudio de cada dos semanas de 24 hr los pacientes se tratan en 7000 µg/m2/2 semanas. Ver ejemplos 6, 14 y 18. Los pacientes incluidos en el estudio 1 h/sem x 3 cada 4 semanas se tratan en dosjs de hasta 3600 µg/m2/sem x 3 semanas. Ver ejemplos 13 y 17. Otro procedimiento incluyendo pacientes con ta infusión de 1 hora diaria x 5 días cada 3 semanas para tratar a los pacientes en una dosis de 1200 µg/m2/d x 5 d, Cuando la aplidina se utiliza en combinación con otros agente terapéuticos, puede necesitarse que las dosis de ambos agentes se ajusten. Previamente, las respuestas biológicas principales reportadas a la administración de aplidina se han observado en modelos in vitro o anímales, conocidos por ser notoriament incorrectos con respecto a su utilidad para predecir respuestas en pacientes humanos, o en pacientes humanos en establecimientos experimentales en donde un método seguro, ef caz de tratamiento no se encuentra disponible (ya sea la dosis utilizada fue una dosis tóxica significativamente elevada sobre la dosis recomendada o el programa de administración no fue apropiado).

En pruebas clínicas utilizando el método de esta invención, los niveles de plasma apropiados se logran en pacientes en RD, y más importantemente, las respuestas objetivamente medibles demostraron evidencia de beneficio clínico a los pacientes. Las definiciones de toxicidades del paciente se adoptan de Criterios WHO y las respuestas determinarse siguiendo los Criterios de Respuesta WHO. Las respuestas objetivo se obtienen en pacientes con cánceres avanzado y/o metastático refractario para tratamientos previos, que incluyen aquellos descritos en los ejemplos. En particular, el tratamiento con este método ha mostrado respuestas en pacientes con cáncer con enfermedad avanzada y/o metastática, que muestra la enfermedad progresiva después de haberse tratado previamente con terapias establecidas. Un método preferido de la invención, incluye, por lo tanto identificar pacientes con cáncer quienes se han tratado de cáncer, particularmente pacientes que hayan recibido quimioterapia, y tratarlos con aplidina.

DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS La figura 1 muestra la reducción en expresión flt-1 observada utilizando microconjuntos confirmados por análisis RT-PCR. La figura 2 muestra la reducción en mARN flt-1 inducida por aplidina en células MOLT-4 Las figuras 3a y 3b muestran el Ciclo Autocrino VEGF-Flt-1 en Células MOLT-4 y el efecto de aplidina. La Figura 4 muestra Secreción de VEGF de Bloques de Apidina de Células MOLT-4. La figura 5 muestra bloque inducido de aplidina de secreción VEGF. La figura 6 muestra una fuerte reducción en los niveles de mARN de VEGF en células MOLT-4. La figura 7 muestra que la dosis de aplidina no reduce la actividad del promotor de VEGF transfectado en células MOLT-4. La figura 8 muestra que aplidina no bloquea la unión de los factores de transcripción HIF-1 y AP-1 a sus secuencias de ADN consenso presentes en el promotor de VEGF. La figura 9 muestra que aplidina no bloquea la unión dei factor de transcripción HIF-1 a sus secuencias de ADN consenso presentes en el promotor de VEGF. Las figuras 10a y 10b muestran que VEGF agregado en el medio de cultivo de células MOLT-4 ligeramente redujo la actividad de bajas concentraciones de aplidina mientras que en concentraciones elevadas se encuentra sin efectos. La figura 1 1 muestra aplidina que es capaz de reducir la secreción de VEGF de la línea de cáncer ovárico humano IGROV-1 . La figura 12 muestra que aplidina reduce los niveles de mARN de VEGF también en la línea de cáncer ovárico humano IGROV-1 . La figura 13 muestra que aplidina no afecta la actividad del promotor de VEGF medido utilizando el sistema genético reportador de tuciferaza/renilta. La figura 14 muestra una relación AUC de dosis. Las figuras 15a y 15b muestran actividad en Cáncer de Tiroides Medular: Niveles CEA EJEMPLOS DE LA INVENCIÓN Etenriplo 1 Perfil de expresión genética en células MOLT4 leucémicas humanas tratabas con la aplidina de compuesto marino. Los cambios anteriores en la expresión genética inducida por aplidina en células MOLT-4 se evaluaron al utilizar conjuntos de expresión de cADN (Atlas Human Cáncer. Clontech). Las células MOLT-4 se tratan por 1 hora con concentraciones de aplidina que inhiben el crecimiento por 50% y ARN total se aisla en 0, 1 , 6 y 24 horas después de que el medicamento se elimine. Los filtros se híbridizaron con cantidad igual de cADN marcado 32P. El análisis de los resultados se lleva a cabo utilizando software ATLAS IMAGES 1 .0. Los cambios en la expresión genética mayores a 2 veces se toman en cambios significativos en expresión de ARN y confirman subsecuentemente por PCR. Una reducción dependiente de tiempo marcada en la expresión de VEGF-R1 (flt-1 ) se observa y confirma en nivel de ARN por PCR y en nivel de proteína por Western blottíng. Ejemplo 2 Correlación de actividades antitumorales selectivas de la aplidina de compuesto derivada de marino utilizando diferentes sistemas de modelo. Los diferentes sistemas de modelo se evalúan para proporcionar la base de trabajo clínico adicional. Las actividad s antttumorales selectivas se observan contra dos tumores sólidos histológicamente diferentes: carcinomas de próstata y gástricos humanos. La actividad in vitro potente & especímenes de tumor gástrico priiicipal de cftulas tumorales gástricas Hs746T es evidente con valores IC5o de 146 y 1§0 pM, respectivamente. Una actividad menos potente, pero no menos selectiva de IC50 de 3.4 nM se determina contra células tumorales de próstata PC-3. Las actividades in vitro se evalúan en roedores pelones utilizando fragmentos de tumor implantados sc o fibras huecas (HF) que contienen células tumorales. Tabla 1. Dosis Óptima y Actividades In Vivo de aplidina Las actividades óptimas se observan en tumores de próstata (25-38%) y gástricos xenoinjertados (17-20%) siguiendo la administración fp. Para seguir tos estudios necesarios se utilizan ratas para infusiones iv. Con esta variapió?, un programa de infusión iv de 24 hr produjo actividades similares pontra células tumorales dé próstata HF (31%) y gástricas HF (20%), La citotoxicidad también se encuentra utilizando un pr ^rama de infusión iv de 5 días contra células tumorales de próstata HF (33%). Las evaluaciones in vivo extendidas no solamente muestran que existe una fuerte correlación relativa al perfil citotóxico in vitro, pero también una fuerte correlación con modelos in vivo utilizada para caracterizar la selectividad de tumor que identifica la aplidina como un candidato para desarrollo clínico. Elemolo 3 Estudio farmacocinético y fase I de aplidina dada cómo una infusión de 24 horas semanalmente en pacientes con tumores sólidos avanzados. Los estudios in vivo revelaron que la actividad in vivo aumentó al prolongar la duración de infusión. En este estudio 16 pacientes se tratan, las características de los pacientes son: edad promedio 55 años, media PS 1 , hombre/mujer 11/5, tipos de tumores Siendo como sigue: Cabeza y cuello 5, riñon 2, colón 3, recto 2, sarcoma 1 y melanoma 3, todos pre-tratados con quimioterapia (2 líneas media). La aplidina se administra como una infusión de 24 h en los siguientes niveles de dosis (Dls): 133 (3 pts), 266 (3 pts), 532 (pts), 1000 (3 pts), 2000 (3 pts) y 3000 (1 pt) mcg/m2/sem x 3 cada 28 días. Ninguna toxicidad limitante de dosis (DLTs> Se observa. Solamente las toxicidades no hematológicas suaves que consisten de nausea 1 g, mucositis 1 g, astenia 1 g se reportan. Flebitis del brazo de t 5 «tí .--"& < *-. infusión fue común y dependiente de la concentración. El análisis farmacocinéteico se realiza en todos los pacientes, mostrando niveles de plasma en DLs 100 mcg/m2/s y 200 mcg/m2/s equivalentes a la concentración in vitro activa (1 ng/ml). En DL 532 mcg/m2/s, se observó mejora clínica en 1 paciente pre-tratado con melanoma avanzado. Estudio farmaconiético y Fase I (PK) de aplidina (ALP) utilizando un programa semanalmente, de una hora. A la fecha, 25 pts (edad promedio 58 años, ECOG 1 media) con tumores sólidos previamente tratados, avanzados o linfoma se han tratado en esta estudio de fase I. Utilizando un programa de APL de 24 hr semanalmente 3 se seguido por 1 semana de descanso, los siguientes niveles de dosis se han probado: 133 (1 -3 pts), 266 (3), 532 (3), 1000 (3), 2000 (3), 4500 (3) y 3750 µg/m /sem (3). Con 60 ciclos (180 infusiones) administrados, todos los pts se evaluaron para toxicidad. La Dosis Máxima Tolerada fue 4500 µg/m2/sem x 3 con toxicidad muscular de grado (G) 3 (atrofia muscular tipo II probada por biopsia). G3 y CPk G45 transmite las toxicidades limitantes de dosis en 2 o 4 pts. La indisposición de G2 se observa en la mayoría de los pts y G2/3 emesis en > 2000 µg/m2 flebitis es común pero dependiente de concentración. Todos los pt se han muestrádo para análisis PK por LC/MS/MS. Los datos preliminares indican distribución extensiva de tejido, una eliminación larga t Vz de 10-24 nad niveles de plasma > 1 ng/ml (que es activo in vitro). Un pt con melanoma avanzado resistente a DTIC/interferon tuvo una mejora clínica mantenida por > 30 semanas. Este estudio infusional semanalmente demuestra la factibilidad y actividad de un programa de APL denso de dosis. Como se ^^¡^¡^^¿Migá^ M espera, la toxicidad neuromuscular es limitante de dosis. La dosis recomendada posible de 3750 µg/m2/sem x 3 se valora. Ejemplo 5 Farmacocinéticas clínicas (PK) de aplidína (APL) en pacientes con tumores sólidos y no linfomas de Hodgkin. Cuatro programas intravenosos se encuentran bajo la evaluación de fase I: infusión de 24 hr semanalmente, infusión de 24 hr cada dos semanas y 5 días consecutivos en infusión de 1 h cada 3 semanas. Las concentraciones sanguíneas de APL se analizan por espectrometía de masa aleatoria-cromatografía líquida. Los resultados iniciales muestran la acumulación en células sanguíneas y un PK de plasma caracterizado por distribución extensiva na (volumen de distribución usualmente en exceso de 200 L/m2) y vidas medias de eliminación en el orden de 10 a 24 h. Un modelo de 2 compartimentos abiertos ajusta apropiadamente la mayoría de los perfiles después de la infusión de 24 h. P ra infusiones de 1 h un modelo de 3 compartimientos proporciona un mejor ajuste en la mayoría de los casos. Los niveles de plasma obtenidos se conocen por ser activos in vitro. La evaluación de pacientes adicionales, y una comparación de células sanguíneas y PK de plasma está en funcionamiento. Ejemplo 6 Resultados preliminares de un estudio farmacocinético y fase I de aplidina dada como una infusión de 24 h cada 2 semanas en pacientes con tumores sólidos y no linfomas Hodgkin La aplidina se da como una infusión de 24 hr cada 2 semanas. |_a dosis inicial fue 200 µg/m2/d en graduación de dosis procedente incluyendo hasta ahora 400, 800, 1600 y 32Q0 µg/m2/d. Un total de 18 pacientes (M/F: 7/11 , edad promedio 52, OMS 0/1 : 10/8) se han introducido. Hasta ahora, no se observa ninguna toxicidad limitante de dosis. Entre los pacientes evaluables, la toxicidad consiste de nausea/vomito grado l-ll, astenia grado 1 -11 y sujeción que ocurre durante o inmediatamente después de la infusión. Ninguna toxicidad neuromuscular se reporta en las dosis evaluadas. Un paciente con un cáncer de pulmón avanzado y progresión del tumor documentada en la dosis de 1600 µg/m2 desarrolló una anemia hemolítica y trombociotopena que se considera relacionada improbablemente al medicamento de estudio. Los análisis farmacocinéticos iniciales mostraron que el medicamento se distribuye extensivamente y concentraciones de sangre. Un modelo de 2 compartimientos abierto ajusta apropiadamente los perfiles de concentración de plasma. La vida media terminal es usualmente en el orden de 10-24 h. La mejora clínica se observa en un paciente con un linfoma de no Hodgkin. La acumulación está en funcionamiento para determinar la toxicidad limitante de dosis y la dosis a recomendarse en los estudios de fase II. Ejemplo 7 Perfil de expresión genética en células MOLT-4 leucémicas humanas tratadas con la aplídina de compuesto marino. En el presente estudio hemos evaluado los cambios anteriores en expresión genética inducida por aplidina en células MOLT-4 al utilizar los conjuntos de expresión de cADN (Atlas Human Cáncer, Clontech). Las células MOLT-4 se tratan por 1 hora con concentraciones de aplidien que inhibe el crecimiento por 50% y ARN total se aisló t 0, 1 , 6 y 24 horas después de que el medicamento se elimina. Los filtros se hibridizarQn con cantidades iguales de cADN marcado 32P. El análisis de los resultados se lleva a cabo utilizando software ATLAS IMAGE 1.0. Los cambios en la expresión genética mayores a 2 veces se tomaron como cambios significativos en expresión de ARN y confirmaron subsecuentemente por PCR. Una reducción dependiente del tiempo marcada en la expresión de VEGF-R1 (fltl ) se observa y confirma en el nivel de ARN pot PCR V en nivel de proteína por Western blotting. Ya sea que la subregulación de flt- 1 se incluya o el efecto antitumor de aplidina se encuentre bajo investigación en el momento. También, la caracterización de |a expresión de otros genes que parecen subregulares después de la exposición a aplidina se encuentran actualmente en camino . Cambios Cuantitativos en Expresión Genética Inducida por Aplidina en Células MOLT-4 La reducción en expresión de flt-1 observada utilizarfdd ! microconjuntos se confirma por análisis RT-PCR, ver figura 1. Al utilizar protección Rnasa cuantificamos la reducción en mARN de flt-1 inducida por 20 nM de aplidina en células MOLT-4, ver figura 2. Las figuras 3a y 3b muestran el Ciclo Autocrino VEGF-Flt-1 en Células MOLT-4 y el efecto de aplidina en el Ciclo Autocrino VEGF-Flt-1. Secreción de VEEGF de bloques de aplidina de células MOLT- 4, ver figura 4. Las células se trataron por 1 h con 20 nM de aplidina. VEGF secretado en el medio se mide por ELISA al final del tratamiento y después de 6 y 24 horas de incubación en medio libre de medicamento. El bloque inducido de secreción de VEGF es dependiente de concentración y es observable ya en 5 nm, ver figura 5. Al utilizar la protección Rnasa, una fuerte reducción en los niveles de mARN de VEGF en células MOLT-4 fue observable después de nM de aplídina, ver figura 6. La dosis de aplidina no reduce la actividad de promotor de VEGF transfectado en células MOLT-4, ver figura 7. Las células se transfectaron con el promotor de VEGF (sumergir las primeras 100 base aguas arriba del sitio de inicio enlazado al gen reportador de luciferaza y con un plásmido de control que contiene el gen reportador renilla. Las células se trataron entonces con diferentes concentraciones de aplidina y la actividad de luciferaza se mide después de 24 horas y compara con la actividad de renilla. La aplidina no bloquea la unión de los factores de transcripción BIF-1 y AP-1 a sus secuencias de ADN consenso presentes en el promotor VEGF, ver figura 8. Los extractos nucleares Se incuban con diferentes concentraciones de aplidina y oligonucleótidos marcados por 60 min. Utilizando análisis de retardación de gel, la unión de HIF-1 o AP-1 se ha monitoreado. La aplidina no bloquea la unión del factor de transcripción HIF-1 a sus secuencias de ADN consenso presentes en el promotor de VEGF, ver figura 9. Los extractos nucleares obtenidos de células tratadas con diferentes concentraciones de aplidina se incuban Con oligonucleótidos marcados por 60 min. Utilizando el análisis de ret rdación de gel la unión de HIF-1 se ha monitoreado. VEGF (10 ng/ml) agregado en el medio de cultivo de células MOLT-4 cultivadas en 10% de FCS redujo ligeramente la actividad de bajas concentraciones de aplidina mientras que en concentraciones elevadas se encuentra sin efectos, ver figuras 10a, 10 b. La aplidina también es capaz de reducir la secreción de VEGF de la línea de cáncer ovárico humano IGROV-1 , ver figura 11. La aplidina reduce los niveles de mARN de VEGF también en la línea de cáncer ovárico humano IGROV-1 , ver figura 12. La dosis de aplidina no afecta la actividad promotora de VEGF medida utilizando el sistema de gen reportador de luciferaza/renilla, ver figura 13. Ejemplo 8 Secreción de VEGF de bloques de aplidina y ciclo a?tocrino VEGF/VEGF-R1 en una estirpe leucémica humana.

Se encontró que la aplidina induce fuerte apóptosis en la estirpe de leucemia humana MOLT-4. En el mismo, el análisis de microconjuhto de estirpe celular reveló cambios en la expresión de diferentes genes en tiempos anteriores después del tratamiento. Entre éstos encontramos que VEGF-R1 (flt-1 ) se subregula por tratamiento del medicamento y su subregulación se confirmó por análisis de northern y western blotting. Los estudios adicionales mostraron que el tratamiento del mismo sistema celular con el compuesto resultó en una reducción fuerte de secreción de VEGF en el medio. La reducción en la secreción de VETF se asocia con una reducción en el mARN que codifica VEQF en células MOLT-4 tratadas con aplidina. Tratando de elucidar el mecanismo por el cual la secreción de bloques de aplidina, encontramos que el compuesto no cambia la vida media de mARN de VEGF. De manera similar, utilizando el análisis de cambio de electromovilidad, la aplidina no cambia la habilidad de dos factores de transcripción, HIF-1 y AP-1 p ra unir si secuencia respectiva de consenso presente en el promotor de VEGF y no reduce la transcripción de VEGF cuando una construcción de luCiferaza-promotor de VEGF se utiliza en experimentos de transfeCGión transitorios. La secreción reducida de aplidina se asocia con una acumulación intracelular incrementada de VEGF que sugiere fuertemente que el compuesto podría actuar a través de un bloque de ia secreción de VEGF. El tratamiento simultáneo de células MOLT-4 con concentraciones bajas d aplidina y VEGF parcialmente elimina la actividad de aplidina sugiriendo que el medicamento podría ejercer parcialmente su actividad en este sistema celular al bloquear el ciclo autocrino VEGF/VEGF-R1.

Eiemplo 9 Perfil de seguridad in vitro de aplidina, un producto natural marino con un potencial quimioterapeútico. Utilizando el análisis de citotoxicidad in vitro dé ConcentraciónCelular 96 (MTS, Promega), apladina muestra poca toxicidad cardiaca (HO c2 (2-1 ; LD50 de 1 µM) o al hígado (AML-12). En contraste, la apüdipa es muy tóxica al músculo esquelético (L8), y células de riñon (NRK 52DE) (LD50 de 0.1 µM) en acuerdo próximo con datos de toxicidad clínicos. De hecho, la toxicidad limitante de dosis en humanos se atrofia muscular esquelética. La aplidina muestra neurotoxicidad en concentraciones in vitro más elevadas. Utilizando un color de viabilidad fluorescente (homodímero de etidio y calcein AM, Molecular Probes) acoplada con inmunoquímica, observamos que aproximadamente 1 µM de aplidina es tóxico par células cerebrales (ambas a neuronas y astrositos) y neuronas motoras (positivas de transferasa de acetil colina) en la médula espinal, pero no neuronas sensoriales positivas P de substancia). La sensibilidad de la neurona motora puede ayudar a explicar la atrofia muscular Tipo II observada (como se predice) en un pequeño grupo de pacientes en donde la concentración AUC del medicamento se eleva debido a excreción reducida. Ejemplo 10 Estudio de Fase I de aplidína en un bolo de 5 días q 3 semanas en pacientes con tumores sólidos y linfomas. Los objetivos son determinar la Dosis Máxima Tolerada, la Toxicidad Limitante de Dosis (DLT), farmacocinéticas (PK) y la dosis recomendada para estudios de fase 2 que pueden darse en una infusión IV de 1 hora, diario x 5 días q 3 semanas. Los pacientes con tumores soplidos y bajo grado e intermedio de Linfomas no Hodgkins fueron elegibles. La dosis inicial diaria de aplidina fue 80 µg/m2. Los cohortes de 3 pacientes (pts) se tratan en cada nivel con graduación de dosis de acuerdo a la toxicidad, 20 pacientes se tratan con 6 niveles de dosis que varían de 80 µg-720 µg/m2, 1 paciente actualmente se encuentra en la dosis de 960 µg/m2. Un total de 48 ciclos se administran. Ninguna toxicidad hematológica fue de grado 1 y 2 con fatiga reportada en la mayoría de los pts. Las reacciones de hipersensibilidda de grado 1 se documentan en 7 pacientes. Otras toxicidades incluyeron nausea, anorexia, diarrea y ansiedad. No hubo toxicidades hematológicas. Los análisis PK se realizan en el curso de tratamiento 1. Las concentraciones de aplidina se analizaron por espectrografía de masa aleatoria LC. Los datos sugieren PK lineal de dosis con variabilidad de interpaciente elevada. La eliminación corporal total fue 0.38 L/min y promedio t Vz de £ de 14.2 horas. Las concentraciones de plasma potencialmente terapéuticas (>1 µg/ml) se logran. Ninguna respuesta objetiva se documenta. 1 paciente con cáncer de colon fue estable por 9 meses y 1 paciente con cáncer celular renal tuvo una respuesta mezclada. En conclusiones, ningún DLT se ha documentado. La acumulación están en funcionamiento en 960 µg/m2. Ejemplo 1 1 Estudio farmacocinético y clínico de Fase I de aplidina una nueva didemnin de marino, administrada como una infusión de 24 horas semanalmente. - 2T - Una prueba de fase I se realiza utilizando infusión de 24 horas semanalmente x 3 seguida por una 1 sem de de?canso. 32 pacientes (edad promedio 58 años, media EGOG 1 ) con tumores sólidos previamente tratados, sólidos se han tratado. Han recibido 64 cursos (media/pt: 2(1 6)) a través de 8 niveles de dosis: 133 (3 pts), 266 (3 pts), 532 (3 pts), 1000 (3 pts), 2000 (3 pts), 3000 (3 pts), 4500 (4 pts) y 3750 mcg/m2/sem (10 pts). 2 de 3 pacientes evaluados tuvieron DLT en 4500 mcg/m2/sem: toxicidad neuromUscular reversible grado (G) 4 (biopsia evita la atrofia muscular tipo II) e incremento G4 CK (1 pt), un transminitis G3 transitoria (1 pt). Otras toxicidades incluyeron indisposición G 1 -2 (la mayoría de ios pacientes tratados a > 3000 mcg/m2/sem, calambres musculares, emesis G 1-2 (responsiva a antieméticos) y reacción del sitio de inyección (muy común y dependiente de concentración). Todos los pacientes se han muestreado para análisis PK por un método LC/MS/MS. Las farmacocinéticas son lineales y el perfil ajusta un modelo abierto de 2 compartimientos. El medicamento tiene distribución extensiva de tejido (Vss=61 1 L), eliminación elevada (0.47 L/min) y una eliminación t 1/2 de 18.8 h. Los niveles de plasma mantenidos > 1 ng/ml (activo in vitro) se obtienen en dosis > 3000 mcg/m2. Un paciente con melanoma avanzada resistente a DTIC/interferon tuvo mejora clínica definitiva mantenida por * 30 semanas. Cuatro pacientes adicionales tuvieron respuestas menores o enfermedad estable por > 4 meses. En conclusión, DLTs de aplidina administrada en un programa de infusión semanal fueron toxicidad muscular reversible y tr?maminítis, que se observan MTD de 4500 mcg/m2/sem. La dosis recomendada para pruebas futirás, 3750 meg/m2/sem x 3, administrada a través del catéter de la vena central, es factible y se asocia con toxicidad suave. Eiemplo 12 Estudio farmacocinético y clínico de Fase I de aplidina una nueva didemnin marina, administrada como una infusión de 24 horas semanalmente Características del paciente Número de pacientes 35 Tipo de tumor Género (masculino/femenino) 23/12 Colorectal 12 Edad promedio, años 56.2 (29-74) Riñon 6 (rango) Estado desempeñado Cabeza y cuello Por ECOG 0 12 Melanoma 4 1 18 Gástrico 2 2 5 Mama 1 Radioterapia previa Pulmón 1 Quimioterapia Tejido suave 1 previa sarcoma Ninguno 4 Linfoma 1 régimen 9 Tiroides 2 regímenes 12 C. desconocido origen 3 > regímenes 10 Sitios de enfermedad 1 14 2 1 2 3 9 ^ dÁ Nivel de dosis Dosis (mcg/m^/sem) No. de pacientes No. de ciclos (rango) I 133 3 9(1-6) II 266 3 9(2.5) lll 532 3 10(2-6) IV 1000 3 7(1-4) V 2000 3 6(2-2) VI 3000 3 4(1-2) Vil 4500 4 5(1-2) VIII 3750 13 21+(1-4) Total 35 71 + Peores Toxicidades por Paciente Nivel de dosis I II lll IV V VI Vil VIII ( TD) (RD) No. de Pacientes 3 3 3 3 3 3 4 13 Náusea G2 G3 Astenia G2 G3 Reacción del sit de inyección G2 Miositis G3 Elevación CPK G4 Transaminitis G3 2 G4 1 Hipersensibilidad G3 1 Actividad Antitümoral Paciente #008 - (Madrid , se observa mejora clínica de melanoma metastático no medible, altamente pré-tradao y encogí ient ' í tumor. Una biopsia de una de las lesiones metastáticas no reveló evidencia de tejido de tumor residual. Paciente #032 - (Madrid) carcinoma renal: 20% de encogimiento de tumor Paciente #034 - (Madrid) Carcinoma medular de tiroides. Mejora clínica y SD en linfangitis de pulmón. Reducción en marcador CEA. Farmacocínéticas Las concentraciones de aplidina de plasma se determinaron por espectografia de cromatografía líquida/masa aleatoria con un límite de cuantificación de 0.25 ng/mL y un amplio rango lineal hasta 16.00 ng/mL. Un total de 15 muestras se extraen hasta 24 horas después del final de la infusión. FarmacóCinéticas lineales de dosis La media C1 elevada ((cuartillas) 0.47 (0.40-0.56) L/min) y variabilid d interpaciente (coeficiente de variación de eliminación (Cl), 45^o) Intermedio a vida media larga (t 14) (media(cuartillas) 18.8 (15.3-25.4 h). Distribución extensiva con volumen suprafisiológico de distribución (Vss) (media(cuartillas)611 (434-733)L) Acumulación celular en sangre (2-8 veces en comparación con el plasma) Perfiles se ajustan a un modelo abierto de 2 compartimientos. La figura 14 muestra la relación de AUC de dosis.

Conclusiones ' | i DLTs de aplidina administrada utilizando este programa fueron toxicidad muscular reversible y tranaminitis observada^ en MTD de 4500 mcg/m2/semana x 3. La Dosis Recomendada para pruebas futuras, 375Ó meg/m2/semana x 3 es factible y asociada con toxicidad suave (principalmente astenia suave). Flebitis en el brazo de infusión fue común, dependiente de concentración y evitable por administración a través de un catéter de vena central. Ninguna toxicidad hematológica se observa. PK se caracteriza por linealidad de dosis, residencia corporal relativamente prolongada del compuesto y distribución extensiva. Los niveles de plasma potencialmente activos se alcanza de 2000 mCg/m2. Un estudio de fase I adicional que investiga una infusión de 3h iv dada cada otra semana está en funcionamiento. Dosis inicial 3000 mcg/m2 q 2 semanas. Ejemplo 13 Prueba Fase I de aplidida dada como una infusión de 1 hora intravenosa, semanalmente en pacientes con tumores sólidos avanzados y linfoma Los pacientes adultos con enfermedad avanzada, PS<3 y función de órgano apropiada se consideran elegibles; pacientes reciben apiidina sem x 3/q 4 semanas. 24 pacientes tumores sólidos se han entrado: edad promedio (m) 55 años, m ECOG=1 , 15/24 pacientes tratados con => 2 ciclos de tratamiento. Siete niveles de dosis (DL) de 133 mcg/m2/sem a 2700 mcg/m2/sem se han valorado: 102 infusiones son evaluables para toxicidad (tox). Ninguna tox hematológica se ha reportado, se observó profilaxis que requiere vomito de 800 mcg/m2/sem.

L * m*_w_ á_ _, En 2700 mcg/m2/sem (4 pts), 1 tuvo hiperbilirrubinemia G3 que se ftflt considerado que es limitante de dosis y por lo tanto 2700 mcg/m /sem LD se expande. Todos los pacientes se han muestreado para análisis PK (LC- ESI-MS/MS); cinéticas son lineales, el m Vass=308 L/m2 CL es elevado m=0.60 L/mon y la eliminación m de vida media=14.2 h. Los niveles de plasma > 1 ng/ml 24 horas después de infusión son alcanzables desde 1800 mcg/m2/sem. Las sugerencias anteriores de actividad en cáncer gástrico se han notado (1 paciente en 1200 mcg/m2). Un paciente con cáncer renal avanzado resistente a VBL-IFN ha tenido una respuesta objetiva en funcionamiento (mets pulmón PR y SD en enfermedad peritoneal) en 2700 mcg/m2/sem DL. La aplidina parece ser clínicamente factible en niveles de dosis farmacológicamente apropiados. Ejemplo 14 Un estudio farmacocinético y fase I de aplidina dada como una infusión continua n24 horas cada otra semana (q2s) en pacientes con tumor sólido y linfoma La aplidina se da a pacientes con tumor sólido/NHL como una infusión de 24 hr/q2 s a 35 pacientes (edad promedio: 51/ECOG=1 ) con tumor sólido (32 pts) o NHL (3 pts). 23/35 pacientes se expusieron previamente a > 3 de líneas de cromatografía previas. Nueve niveles de dosis (200-7000 µg/m2/s/q2s) y 65 ciclos (120 infusiones) se dan. Ninguna toxicidad hematológica se reportó. La toxicidad consistió de astenia G2-3 y emesis en 9-2 pacientes y 12-1 pts, respectivamente. Nausa/vomito G3 ( > d000 µg/m2) se trató eficazmente después se evita con regímenes 4HT3. Ninguna toxicidad cardiaca se reportó. En la dosis de 5000 µg/m2/p/q2s, 2 pacientes experimentaron calambres musculares transitorias con elevaciones G3 CPK-MM reversibles. Entre 9 pacientes tratados en 6000 µg/m2/s, 3 pacientes experimentaron un incremento de CPK-MM y aldolasa después de la 3er inyección de aplidina. Las elevaciones de CPK fueron G1-2 y no sintomáticas en 2 pacientes pero una elevación G3 CPK con dolor muscular G3 y perdida de resistencia muscular (DLT) se reporta en 1 pt. Esto fue reversible con ninguna secuela. La biopsia muscular no reveló necrosis significativa de micocitos. La microscopía del electrón ultraestructural no indicaron alteración mitocondria morfológica pero una perdida de los filamentos de miosina gruesos. En 7000 µg/m2/q2s, 4 pacientes se han entrado. El análisis farmacocinético (LC-ESI/MS/ S) mostró que el incremento AUC es lineal, con VSS largo =5391/m2 una eliminación elevada (332 ml(mm.m2) y una larga vida media terminal (15-35 h). Las concentraciones de plasma 24 h después del final de la infusión en dosis > 3000 µg/m2/q2s sqn comparables con concentraciones in vitro eficientes (<1 ng/ml). La actividad se observa en NHL (1/3 pts), tiroides molecular (2/2 pts), renal (1/5 pts), y cáncer neuroendocrino (1 pf). La hipótesis mecanística y estrategias preventivas contra toxicidad muscular se encuentran bajo evaluación. Ejemplo 15 Análisis de Microconjunto La estirpe de leucemia humana MOLT-4 se utiliza para estos experimentos, las células MOLT-4 se tratan por i hora con 20 nM de apiidina. ARN total se extrae al final del tratamiento y 6 y 24 horas de pués de recuperación en medio libre de medicamento. µg de ARN total se retrotranscribe a cADN en la presencia de 52P-dATP. Las cantidades iguales de sondas radioactivas se hibridiza en Mícroconjuntos de Cáncer Humano Atlas (Clontech). Después de enjuagar, el filtro se expone y los resultados analizan utilizando el software de formación de imágenes Atlas. Solamente una diferencia de expresión genética mayor a 2 veces entre células tratadas y no tratada? se toman en cuenta. RT-PCR y análisis northern Se han realizado para confirmar los cambios en expresión genética encontrados con los microconjuntos. Resultados El tratamiento de aplidina causa cambios significativos en expresión genética tan temprano como 1 hora antes del tratamiento. Después de 6 y 24 horas de recuperación en medio libre de medicamento, la expresión de un número incrementado de genes se ha observado. Al final del tratamiento la mayoría de los cambios significativos se observan en la expresión de ET de gen de respuesta temprana, y en el gen VEGF-RI/flt-1 que se incrementaron respectivamente y redujeron por tratamiento Los niveles ETR regresaron a nivel normal después de 6 y 24 horas, mientras que los niveles de flt-1 reducen además por 6 y 24 horas. La aplidina indujo también un incremento en los niveles de B-RAF y Fms claramente observ bles 6 horas después de 1a recuperación en medio libre de medicamento. Los cambios observados en estos genes se confirman por ya ea RT-PCR o análisis northern blot.

A partir del análisis de mrcroconjunto, las diferencias en expresión genética (aún no confirmado por RT-PCR) se observaron por otros genes tales como PLK-1. Ejemplo 16 Estudio de Fase I de aplidina en una infusión diaria de 1 h x 5 q 3 semanas en pacientes con tumores sólidos y linfomas no Hodkin de bajo grado e intermedio. Resultados Pacientes entrados 27 Evaluable para toxicidad 24 Fuera de estudio 18 Enfermedad progresiva 14 Progresión sintomática 2 Muerte 1 Otro (Dr. Decisión) 1 Demografía del Paciente (N=23) Entrada del Paciente/Niveles de Dosis Sin Toxicidad Hematológica Cont de Sin Toxicidad Hematológica Toxicidad Hematológica Toxicidad bioquímica Farmacocinéticas PK caracterizada por linealidad de dosis Variabilidad interpaciente elevada Eliminación de plasma elevada (media 0.38 L/min) Intermedio a media larga t %, 14.2 horas Concentraciones de plasma terapéuticas (> 1 ug/ul) se han logrado Conclusiones Sin DLT documentada a la fecha Toxicidades relacionadas al medicamento suaves incluyen fatiga y náusea (fácilmente controlada con anti-eméticos) HSR ocasional independiente de pre-tratamiento Sin evidencia clara de neuropatía o miopatía Sin respuestas objetivas documentadas aunque alguna evidencia de actividad antitumor posible: Dos pacientes con CRC pesadamente pre-tratados, uno tuvo enfermedad estable por 6+ meses (total 13 ciclos), y el otro tuvo una reducción del 40% en el tamaño del tumor. Un paciente con cáncer renal y mets de hígado con respuestas mezcladas (10% de reducción en suma de mediciones óe tumor) Graduación continua: presente aumento en 1200 ug/m2 Ejemplo 17 Prueba de Fase I, dada como una infusión IV de 1 h semanalmente en pacientes con tumores sólidos avanzados y linfoma no Hodgkin. Administración de Medicamento Aplidina se administra como una infusión de 1 hora semanalmente x 3 cada cuatro semanas Características del paciente Número de pacientes 30 Tipo de tumor Edad promedio, años 53.5 (36-75) Colorectal 8 (rangos) Estado desempeñado Pulmón Por ECOG Gástrico 0 2 Renal 1 21 Cabeza y cuello 2 5 Radioterapia previa 10 Melanoma Quimioterapia Ovario Previa (no. de regímenes) 1 10 Tracto biliar 2 10 Esófago 3 8 Páncreas Sitios de enfermedad 4 14 5 12 6 9 Acumulación de Paciente y Graduación de Dosis Nivel de dosis Dosis (meg/m'7sem) No. de pacientes No. de ciclos (rango) I 133 3 5(1-2) II 266 3 5(1-2) lll 532 3 5(1-2) IV 800 3 6(2-2) v 1200 4 7(1-2) VI 1800 4 7(1-2) Vil 1700 8 12(1-2+) VIII 3600 2 3(1-2+) Total * definición de un ciclo: 3 infusiones consecutivas semanalmente con una semana de reposo Peores Toxicidades Por Paciente Nivel de dosis 133 266 532 800 1200 1800 2700 3600 (semanalmente x3) No. de pacientes 3 3 3 3 4 4 8 2 Nausea/vomito G2 - - - 3 - 3 2 - Reacción del Sitio de inyección G2 Astenia G2(G3) 1 (1 ) 1 (1) Mialgia (G2(G3) (D Elevación CPK Gl Traosminitis G2(G3) (1 ) 1(4)(1> Bilírrubina G3 1 (1 )(2) Fos Ale. G2(Q3) ( 1 )(2) (1 ) Hipertensión G1(G3) (1) 1 un paciente con hepatitis C; 2 casos reversibles por día y 1 DLT (2> DLT Caracterización de la Toxicidad Limitante de Dosis Reportada Pat #28 - Edinburgh con adenocarcinoma Oesofageal (sin mets de hígado) tratado con 2700 µg/m2 semanalmente ha retrasado la recuperación del aumento de las enzimas de hígado (G3 AST; G3 Bilirrubina; G3 ALP) impidiendo la administración semanalmente de dosis adicionales. Sugerencias de Actividad Pat #16 - (Edinburgh) con adenocarcinoma gástrico primario resistente a FAM. Mejora ligera en las masas del nodo linf alrededor de la curva del estómago, eje celiaco y pelvis con aplidina en 1200 µg/m2 semanalmente (3600 µg/m2). Pat#23 - (Barcelona) con carcinoma de riñon y nodulos pulmonares como el sitio de enfermedad principal, primario /esistente a VBL + alFN y a doxorubicína liposomal. La remisión parcial en nodulos de pulmón y mejora clínica con resolución de dispnea después de 2 infusiones de aplidina en 2700 µg/m2 semanalmente (8100 µg/m2). Pat#29 - (Barcelona) con carcinoma de riñon. Mejora clínica después de la 3 infusión en la evaluación de una adenopatía supraclavicular. Evaluación pendiente en 2do ciclo. Datos farmacocinéticos PK lineal de dosis hasta el nivel de dosis actual de 2700 µg/m2 Variabilidad interpaciente importante: coeficiente de variación de CL, 33% CL de plasma relativamente elevado: media (cuartillas) 329 (288-407 mL/min/m2). Media t Vz intermedia (cuartillas) 15.8 (13.3-19.5)h. Distribución extensiva: media (cuartillas) Vss, 345 (220-398) L/m2 Análisis de compartimiento preliminar: perfiles se ajustan mejor por un modelo de 3 compartimiento de primer orden con una fase inicial muy rápida (vida media promedio 0.04 h), seguida por una fase intermedia (vida media promedio 1.4 h) y una fase terminal más larga (vida media promedio 20.7 h). Conclusiones Este estudio en funcionamiento indica que la aplidida dada como una infusión de 1 hora semanalmente con una semana de descanso se clínicamente factible hasta una dosis de 3600 mcg/m2 cada semana. La toxicidad de la médula ósea no se ha reportado, La emesis manejable por antieméticos profilácticos. La toxicidad muscular consistiendo de debilidad muscular y CK incrementada se ha observado en un paciente tratado en 3600. La toxicidad del hígado en el nivel de dosis más elevado investigó que se ha reportado en varios pacientes aunque fue DLT en un paciente, la información farmacocinétíca indica que los niveles potencialmente terapéuticos son alcanzables en plasma en pacientes tratados desde 1200 µg/m2 avanzado. La factibilidad de 3600 mcg/m2 cada semana (nivel de dosis VIII) se investiga. Ejemplo 18 Un estudio farmacocinétjco y fase I de aplidina, dada comp una infusión continua de 24 h cada otra semana en pacientes con tumores sólidos y tinfoma no Hodgkin Características del paciente Número de pacientes 43 Tipo de tumor Edad promedio, años 52 (18-71 ) Pulmón 6 (rangos) Colorectal 8 Estado desempeñado Riñon 5 Por ECOG Mama 4 0 19 Páncreas 4 1 21 Linfoma 3 2 2 Ovario 2 Radioterapia previa 27 Quimioterapia Tiroides 3 Previa (no. de regímenes) Hueso 1 1 7 Melanoma 2 5 Próstata 1 >3 29 Útero 1 Mesotelioma 1 Gástrico 1 otro 2 Acumulación del Paciente y Graduación de Dosis Nivel de dosis Dosis (mcg/m^/sem) No. de pacientes No. de ciclos (rango) 1 200 3 5(1 -3) II 400 3 6(2-2) lll 800 3 9(2-4) IV 1600 6 11(1-2) V 3200 3 5(1-2) VI 4000 3 8(2-4) Vil 5000 3 6(2-2) VIH 6000 12 26(1-6+) IX 7000 7 12(1-4+) Total Peores Toxicidades por Paciente Caracterización de Toxicidad Muscular (DLT) Pat # 27 - paciente macho con carcinoma de tiroides medular tratado en 6000 µg/m2 semanalmente tuvo G3 CPK sintomático con dolor muscular G2. Toxicidad recuperada dentro de las 3 semanas después de la descontinuación del tratamiento. 3 pacientes (5000 y 6000 µg/m2) experimentaron una elevación menor de CPKs (>G2), que consiste de CPK MM incremento (muscular) sin elevación significativa de CPK MB (corazón). Una elevación paralela del nivel de aldolasa se observa. Las señales de mejora al utilizar complementos de Carnitina como protectores del músculo esquelético se reportan. Las biopsias musculares se realizan en 2 pacientes; E/M: desaparición parcial de filamentos gruesos de miosina. Datos farmacocinéticos Aplidina parece tener un perfil de PK lineal de dosis (deníro de los límites impuestos por el tamaño pequeño de la muestra) CL de plasma relativamente elevado; valor medio (cuartillas) 252 (192-415 mL/min/m2) Variabilidad CL interpaciente elevada (coeficiente de variación de CL 62%) Intermedio a largo t Vz con un valor medio (cuartillas) de 23.88 (15.7-35.0 h) Distribución amplia, Vss media (cuartillas) de 413 (274-6$8 L/m2) Análisis de compartimiento preliminar; los perfiles de plasma se ajustan mejor por un modelo de 2 compartimiento de primer orden con una fase inicial rápida (vida media promedio 0.64 h) y una fase terminal más larga (vida media promedio 25.8 h). Relación de mitotoxicidad de aplidina con farmacocinéticas Toxicidad muscular ha aparecido solamente un dosis elevadas y exposiciones después de infusión de 24 h Valores Cmax después de infusión de 1 g son más elevados que aquellas después de la infusión de 24 h. Por lo tanto, una relación Cmax puede reglarse. Los valores AUC en los pacientes con miotoxicidad son elevados pero no máximos. Afecta a pacientes con concentraciones de plasma sostenidas, elevadas de aplidina. Los 3 pacientes con toxicidad muscular clara tuvieron t Vz en exceso de 44 h en comparación con un t Vz medio de 25.8 h después de la infusión de 24 h. La figura 15a y 15 muestran la Actividad en Cáncer de Tiroides Medular: Niveles CEA Conclusiones: Cambios musculares inducidos por medicamento (esperado para ser la toxicidad limitante de dosis), reportada del niVel de dosis número lll avanzado (1800 mcg/m2 a 5000 mcg/m2) es toxicidad limitante en 6000 mcg/m2 (1/9 pts. La actividad antitumor se ha observado en pacientes con NHL Mt&j s. t . y carcinoma rehal. El estudio investiga ahora la factibilidad de 60Ó0-7000 mcg/m2 cada otra semana al utilizar complementos de carnitina como protectores de músculo esquelético.

Claims (6)

1. REIVINDICACIONES 1. Un método effoaz para tratar cáncer en un paciente que comprende administrar aplidina utilizando no más que la Dosis Recomendada consistente con los Datos de Toxicidad Limitante de Dosis.
2. 2. El método según la reivindicación 1 , caracterizado porque la dosis es de acuerdo con uno de los siguientes procedimientos: infusión de 24 horas semanalmente por tres semanas, seguid por una semana de descanso, infusión de 24 horas cada dos semanas; infusión de 1 hora de dicha 1 hora x 5 días q 3 semanas, y infusión de 3 horas cada otra semana.
3. 3. El método según la reivindicación 1 , caracterizado porque la aplidina bloquea la secreción de VEGF y el ciclo autocrino de VEGF/VEGF.
4. 4. El método según la reivindicación 1 , caracterizado porque la aplidina se administra como parte de una terapia de combinación.
5. 5. El método según la reivindicación 1 , caracterizado porque la aplidina se administra junto con un protector de músculo esquelético.
6. 6. El método según la reivindicación 1 , caracterizado porque el paciente ya ha recibido el tratamiento estándar para su enfermedad de cáncer y el tumor es refractario.