KR20140101014A - 개선된 항종양 치료 - Google Patents

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글린 토마스 패어클로쓰
마린 파블로 마누엘 아빌레스
도린 르빠쥬
미구엘 이즈퀴에르도 예수스 산
아타나시오 판디엘라
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파르마 마르 에스.에이.
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Abstract

본 발명은 아플리딘 또는 아플리딘 유사체와 다른 항종양제의 조합, 및 암의 치료, 특히 폐암, 유방암, 결장암, 전립선암, 신장암, 흑색종, 다발골수종, 백혈병, 및 림프종의 치료에 있어서 이들 조합의 용도에 관한 것이다.

Description

개선된 항종양 치료{Improved antitumoral treatments}
본 발명은 아플리딘 또는 아플리딘 유사체와 다른 항종양제의 조합, 및 암의 치료, 특히 폐암, 유방암, 결장암, 전립선암, 신장암, 흑색종, 다발골수종, 백혈병, 및 림프종의 치료에 있어서 이들 조합의 용도에 관한 것이다.
아플리딘 (Aplidine) (디히드로디뎀닌 B: Dehydrodidemnin B)은 지중해 해양 피낭류 (tunicate)인 아플리듐 알비칸스 (Aplidium albicans)로부터 분리된 시클릭 뎁시펩티드 (depsipeptide)이고, WO 9104985의 대상이다. 그것은 디뎀닌 (didemnin)으로 알려진 화합물과 연관되어 있고, 하기 구조를 갖는다:
Figure pat00001
아플리딘, 아플리딘 유사체, 그의 용도, 제제, 및 합성에 대한 추가 정보는 특허 출원 WO 99 42125, WO 01 35974, WO 01 76616, WO 02 30441, WO 02 02596, WO 03 33013 및 WO 2004 080477에서 찾을 수 있다. 이러한 PCT 문서들 각각의 내용을 구체적인 참조로 포함시킨다.
동물 전임상 실험과 사람 임상 제1단계 연구에서, 아플리딘은 백혈병 및 림프종을 포함한, 광범위한 종양 유형에 세포독성 잠재성이 있다는 것이 나타났다. 예를 들면 하기의 문헌을 참조할 수 있다:
Faircloth, G. 등: "Dehydrodidemnin B (DDB) a new marine derived anticancer agent with activity against experimental tumour models", 9th NCI-EORTC Symp. New Drugs Cancer Ther . (March 12-15, Amsterdam) 1996, Abst 111;
Faircloth, G. 등: "Preclinical characterization of aplidine, a new marine anticancer depsipeptide", Proc . Amer . Assoc . Cancer Res . 1997, 38: Abst 692;
Depenbrock H, Peter R, Faircloth GT, Manzanares I, Jimeno J, Hanauske AR.:"In vitro activity of Aplidine, a new marine-derived anti-cancer compound, on freshly explanted clonogenic human tumour cells and haematopoietic precursor cells" Br . J. Cancer , 1998; 78: 739-744;
Faircloth G, Grant W, Nam S, Jimeno J, Manzanares I, Rinehart K.: "Schedule-dependency of Aplidine, a marine depsipeptide with antitumor activity", Proc . Am. Assoc . Cancer Res. 1999; 40: 394;
Broggini M, Marchini S, D'Incalci M, Taraboletti G, Giavazzi R, Faircloth G, Jimeno J.: "Aplidine blocks VEGF secretion and VEGF/VEGF-R1 autocrine loop in a human leukemic cell line", Clin . Cancer Res . 2000; 6 (suppl): 4509;
Erba E, Bassano L, Di Liberti G, Muradore I, Chiorino G, Ubezio P, Vignati S, Codegoni A, Desiderio MA, Faircloth G, Jimeno J and D'Incalci M.: "Cell cycle phase perturbations and apoptosis in tumour cells induced by aplidine", Br . J. Cancer 2002; 86: 1510-1517;
Paz-Ares L, Anthony A, Pronk L, Twelves C, Alonso S, Cortes-Funes H, Celli N, Gomez C, Lopez-Lazaro L, Guzman C, Jimeno J, Kaye S.: "Phase I clinical and pharmacokinetic study of aplidine, a new marine didemnin, administered as 24-hour infusion weekly" Clin . Cancer Res. 2000; 6 (suppl): 4509;
Raymond E, Ady-Vago N, Baudin E, Ribrag V, Faivre S, Lecot F, Wright T, Lopez Lazaro L, Guzman C, Jimeno J, Ducreux M, Le Chevalier T, Armand JP.: "A phase I and pharmacokinetic study of aplidine given as a 24-hour continuous infusion every other week in patients with solid tumor and lymphoma", Clin . Cancer Res. 2000; 6 (suppl): 4510;
Maroun J, Belanger K, Seymour L, Soulieres D, Charpentier D, Goel R, Stewart D, Tomiak E, Jimeno J, Matthews S. :"Phase I study of aplidine in a 5 day bolus q 3 weeks in patients with solid tumors and lymphomas", Clin . Cancer Res. 2000; 6 (suppl): 4509;
Izquierdo MA, Bowman A, Martinez M, Cicchella B, Jimeno J, Guzman C, Germa J, Smyth J.: "Phase I trial of Aplidine given as a 1 hour intravenous weekly infusion in patients with advanced solid tumors and lymphoma", Clin . Cancer Res. 2000; 6 (suppl): 4509.
기전적인 연구는 아플리딘이 ALL-MOLT4 세포에서의 VEGF 분비를 차단시킬 수 있다는 것을 보여주었고, 신규 또는 재발 ALL 및 AML 소아 환자의 AML 및 ALL 시료에서 저농도 (5nM)에서의 시험관 내(in vitro) 세포독성 활성이 관찰되었다. 아플리딘은 시험관 내에서 약물로 처리된 백혈병 세포의 G1 및 G2 정지를 유도하는 것으로 보인다. VEGF 수용체의 하향조절(down regulation) 이외에, 아플리딘의 작용 방식에 대해서는 알려진 바가 거의 없다.
아플리딘의 제1단계 임상 연구에서, L-카르티닌이 골수독성을 예방하기 위해 24시간 전처리 또는 공동투여로 제공되었다 (예: WO 02 30441 참조). L-카르니틴의 공동투여는 약물유도된 근육 독성의 회복을 개선시키는 것으로 입증되었고, 아플리딘의 용량 점증(dose-escalation)를 가능하게 하였다.
종래에는, 아플리딘과 다른 항암제와의 조합에 대해 수행한 in vitro 및 in vivo 분석은 그 분석된 약물 조합이 백혈병 및 림프종을 치료하기 위한 병용요법(combination therapy)에 있어서 유용하다는 것을 보였다. WO 2004 080421에서, 아플리딘은 메토트렉세이트, 시토신 아라비노시드, 미톡산트론, 빈블라스틴, 메틸프레드니솔론, 및 독소루비신과의 조합으로서, 백혈병 및 림프종의 치료에 대하여 구체적으로 평가되었다.
암은 동물 및 인간의 대표적인 사망 원인이므로, 암에 걸린 환자들에게 투여하기에 안전하고 활성적인 항종양 치료법을 얻기 위한 여러가지 시도가 시행되어졌고 또 시행되고 있다. 본 발명이 해결하고자 하는 과제는 암의 치료에 유용한 항암 치료법을 제공하는 것이다.
아플리딘 및 아플리딘 유사체가 다른 항암제들을 강화시키고, 따라서 암 치료를 위한 병용 요법에 성공적으로 사용될 수 있다는 것을 확립하였다. 본 발명은 이들 병용 요법을 사용한 암 치료를 위한 약제학적 조성물, 약제학적 투여 제형, 키트, 방법, 및 병용 요법을 위한 의약 제조에서의 아플리딘 및 아플리딘 유사체의 용도에 대한 것이다.
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 암의 치료에 효과적인 다른 약물을 사용하는, 아플리딘 및 아플리딘 유사체에 기반한 효과적인 병용 요법을 제공한다. 바람직하게는, 상기 다른 약물 또는 다른 약물들은 폐암, 유방암, 결장암, 전립선암, 신장암, 흑색종, 다발골수종, 백혈병, 및 림프종에서 선택된 암의 치료에 효과적이다. 가장 바람직하게는, 상기 다른 약물은 파클리탁셀(탁솔®), 독소루비신, 시스플라틴, 삼산화비소, 5-플루오로우라실(5-FU), 사이토신 아라비노시드(AraC), 카르보플라틴, 7-에틸-10-히드록시캄프토테신(SN38), 에토포시드(VP16), 멜팔란, 덱사메타손, 시클로포스파미드, 보르테조밉, 에를로티닙, 트라스투주맙, 레날리도마이드(레블리미드®), 인터루킨-2(IL-2), 인터페론-α2(INF-α), 다카바진(DTIC), 베바시주맙(아바스틴®), 이다루비신, 탈리도마이드, 및 리툭시맙으로 이루어지는 군으로부터 선택된다.
*본 발명의 다른 구현예에 있어서, 본 발명은 치료적으로 유효한 양의 아플리딘 또는 아플리딘 유사체 또는 약제학적으로 허용가능한 그의 전구약물, 염, 용매화물, 또는 수화물, 및 암의 치료에 효과적인 치료적으로 유효한 양의 다른 약물 또는 약제학적으로 허용가능한 그의 전구약물, 염, 용매화물, 또는 수화물을 아플리딘 또는 아플리딘 유사체를 투여하기 전, 투여 중, 또는 투여 후에 그 치료가 필요한 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 암을 치료하는 방법을 포함한다. 본 발명의 또 다른 구현예에 있어서, 치료적으로 유효한 양의 제3의 약물이 투여되며, 아플리딘 또는 아플리딘 유사체 및 제2 약물을 투여하기 전, 투여 중, 또는 투여 후에 투여된다.
바람직하게는 상기 다른 약물 또는 다른 약물들은 폐암, 유방암, 결장암, 전립선암, 신장암, 흑색종, 다발골수종, 백혈병, 및 림프종에서 선택된 암의 치료에 효과적이다. 가장 바람직하게는 상기 다른 약물은 파클리탁셀(탁솔®), 독소루비신, 시스플라틴, 삼산화비소, 5-플루오로우라실(5-FU), 사이토신 아라비노시드(AraC), 카르보플라틴, 7-에틸-10-히드록시캄프토테신(SN38), 에토포시드(VP16), 멜팔란, 덱사메타손, 시클로포스파미드, 보르테조밉, 에를로티닙, 트라스투주맙, 레날리도마이드(레블리미드®), 인터루킨-2(IL-2), 인터페론-α 2(INF-α), 다카바진(DTIC), 베바시주맙(아바스틴®), 이다루비신, 탈리도마이드, 및 리툭시맙으로 이루어진 군에서 선택된다. 상기 다른 약물 또는 다른 약물들은 동일 조성물의 일부를 형성하거나, 동시에 또는 다른 시간에 투여를 위한 별개의 조성물로서 제공될 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태에서, 본 발명은 암의 치료에 효과적인 약물, 바람직하게는 폐암, 유방암, 결장암, 전립선암, 신장암, 흑색종, 다발골수종, 백혈병, 및 림프종에서 선택된 암의 치료에 효과적인 약물, 가장 바람직하게는 파클리탁셀(탁솔®), 독소루비신, 시스플라틴, 삼산화비소, 5-플루오로우라실(5-FU), 사이토신 아라비노시드(AraC), 카르보플라틴, 7-에틸-10-히드록시캄프토테신(SN38), 에토포시드(VP16), 멜팔란, 덱사메타손, 시클로포스파미드, 보르테조밉, 에를로티닙, 트라스투주맙, 레날리도마이드(레블리미드®), 인터루킨-2(IL-2), 인터페론-α 2(INF-α), 다카바진(DTIC), 베바시주맙(아바스틴®), 이다루비신, 탈리도마이드, 및 리툭시맙으로 이루어진 군에서 선택되는 약물, 또는 약제학적으로 허용가능한 그의 전구약물, 염, 용매화물, 또는 수화물의 치료적 효능을 증가시키는 방법으로서, 아플리딘 또는 아플리딘 유사체, 또는 약제학적으로 허용가능한 그의 전구약물, 염, 용매화물, 또는 수화물의 양을 그것이 필요한 환자에게 투여하는 단계를 포함하는 방법을 포함한다. 아플리딘 또는 아프리딘 유사체는 상기 다른 약물의 투여 이전, 도중, 또는 이후에 투여된다. 본 발명의 또 다른 구현예에 있어서, 치료적으로 유효한 양의 제3의 약물이 투여되며, 아플리딘 또는 아플리딘 유사체 및 제2의 약물의 투여 이전, 도중 또는 이후에 투여된다. 바람직하게는 상기 제3의 약물은 폐암, 유방암, 결장암, 전립선암, 신장암, 흑색종, 다발골수종, 백혈병, 및 림프종에서 선택된 암의 치료에 효과적인 약물이다. 가장 바람직하게는 상기 제3의 약물은 파클리탁셀(탁솔®), 독소루비신, 시스플라틴, 삼산화비소, 5-플루오로우라실(5-FU), 사이토신 아라비노시드(AraC), 카르보플라틴, 7-에틸-10-히드록시캄프토테신(SN38), 에토포시드(VP16), 멜팔란, 덱사메타손, 시클로포스파미드, 보르테조밉, 에를로티닙, 트라스투주맙, 레날리도마이드(레블리미드®), 인터루킨-2(IL-2), 인터페론-α2(INF-α), 다카바진(DTIC), 베바시주맙(아바스틴®), 이다루비신, 탈리도마이드, 및 리툭시맙으로 이루어진 군에서 선택되는 약물, 또는 약제학적으로 허용가능한 그의 전구약물, 염, 용매화물, 또는 수화물이다.
본 발명의 또 다른 양태에 있어서, 본 발명은 아플리딘 또는 아플리딘 유사체, 또는 약제학적으로 허용가능한 그의 전구약물, 염, 용매화물, 또는 수화물과, 암의 치료에 있어서 효과적인 다른 약물을 포함하는 약제학적 조성물을 포함한다. 본 발명의 또 다른 구현예에 있어서, 상기 약제학적 조성물은 암의 치료에 있어서 또한 효과적인 제3의 약물을 포함한다. 바람직하게는, 상기 다른 약물은 폐암, 유방암, 결장암, 전립선암, 신장암, 흑색종, 다발골수종, 백혈병, 및 림프종에서 선택된 암의 치료에 있어서 효과적이다. 가장 바람직하게는 상기 다른 약물은 파클리탁셀(탁솔®), 독소루비신, 시스플라틴, 삼산화비소, 5-플루오로우라실(5-FU), 사이토신 아라비노시드(AraC), 카르보플라틴, 7-에틸-10-히드록시캄프토테신(SN38), 에토포시드(VP16), 멜팔란, 덱사메타손, 시클로포스파미드, 보르테조밉, 에를로티닙, 트라스투주맙, 레날리도마이드(레블리미드®), 인터루킨-2(IL-2), 인터페론-α 2(INF-α), 다카바진(DTIC), 베바시주맙(아바스틴®), 이다루비신, 탈리도마이드, 및 리툭시맙으로 이루어진 군에서 선택된다.
본 발명은 또한 암의 치료 또는 예방에 사용하기 위한, 아플리딘 또는 아플리딘 유사체, 또는 약제학적으로 허용가능한 그의 전구약물, 염, 용매화물, 또는 수화물의 투여 제형, 암의 치료에 있어서 효과적인 다른 약물, 또는 약제학적으로 허용가능한 그의 전구약물, 염, 용매화물, 또는 수화물의 투여 제형, 및 암의 치료 또는 예방을 위하여 조합된 각 작용제의 용도에 대한 설명서를 포함하는 키트를 포함한다. 본 발명의 또 다른 구현예에 있어서, 상기 키트는 암의 치료에 있어서 또한 효과적인 제3의 약물 또는 약제학적으로 허용가능한 그의 전구약물, 염, 용매화물, 및 수화물의 투여 제형을 더 포함한다. 바람직하게는 상기 다른 약물 또는 다른 약물들은 폐암, 유방암, 결장암, 전립선암, 신장암, 흑색종, 다발골수종, 백혈병, 및 림프종에서 선택된 암의 치료에 있어서 효과적이다. 가장 바람직하게는 상기 다른 약물은 파클리탁셀(탁솔®), 독소루비신, 시스플라틴, 삼산화비소, 5-플루오로우라실(5-FU), 사이토신 아라비노시드(AraC), 카르보플라틴, 7-에틸-10-히드록시캄프토테신(SN38), 에토포시드(VP16), 멜팔란, 덱사메타손, 시클로포스파미드, 보르테조밉, 에를로티닙, 트라스투주맙, 레날리도마이드(레블리미드®), 인터루킨-2(IL-2), 인터페론-α 2(INF-α), 다카바진(DTIC), 베바시주맙(아바스틴®), 이다루비신, 탈리도마이드, 및 리툭시맙으로 이루어진 군에서 선택된다.
세 개의 약물, 아플리딘 및 아플리딘 유사체, 및 두 개의 추가적인 약물 (제2 약물과 제3 약물)의 사용에 기반한 효과적인 병용 요법 또한 본 발명에 포함된다.
바람직한 일 양태에 있어서, 본 발명은 상승적(synergistic) 조합에 관한 것이다.
"암(cancer)"이란 종양(tumor), 신생물(neoplasia), 및 다른 임의의 악성 조직 또는 세포를 포함하여 의미한다. 본 발명은 아플리딘 또는 아플리딘 유사체를 일반적인 암의 치료를 위해, 보다 바람직하게 폐암, 유방암, 결장암, 전립선암, 신장암, 흑색종, 다발골수종, 백혈병, 및 림프종의 치료를 위해 조합으로 사용하는 것에 관한 것이다.
다른 항암제의 아플리딘으로 가능한 강화작용를 연구하기 위해서, 우리는 상기된 암 유형에서의 잠재적 사용을 위한 약물 조합의 체계적인 연구를 개시하였다. 약물 조합 연구는 다양한 유형의 세포주에서 수행되었다. 시험관 내(In vitro) 연구는 NSCL A549, 유방 암종 MX1, 풋골수세포 백혈병 HL60, 결장 샘암종 HT29, 전립선 샘암종 PC3, 유방 샘암종 SKBR3, 및 급성 림프모세포 백혈병 (MOLT3)와 같은 암세포주를 사용하여 수행되었으며, 이들은 아플리딘에 대해 각각 다른 감수성을 갖는다 (낮음에서 높음까지). 백혈병, 림프종, 다발골수종, 및 흑색종 세포주에 대해서도 추가적인 연구가 실행되었다. 또한, 흑색종, 신장, 골수종, 및 림프종 이종이식(xenograft)을 사용한 생체 내(in vivo) 연구는 아플리딘과 다른 표준 약물과의 조합의 효과를 확립하기 위해 사용되었다. 마지막으로, 다발골수종 세포주에서 삼종 조합을 사용하여, 즉 아플리딘과 다른 추가적인 표준 작용제 (제2 및 제3 약물)와 조합된 수행되었다.
일반적인 결론으로서, 아플리딘의 암세포 내에서의 세포독성은 상기 평가에서 사용된 많은 표준 작용제들과의 조합에서 매우 향상된다는 것을 발견하였다. 주된 상승효과는 아플리딘과 파클리탁셀(탁솔®), 독소루비신, 시스플라틴, 삼산화비소, 5-플루오로우라실(5-FU), 사이토신 아라비노시드(AraC), 카르보플라틴, 7-에틸-10-히드록시캄프토테신(SN38), 에토포시드(VP16), 멜팔란, 덱사메타손, 시클로포스파미드, 보르테조밉, 에를로티닙, 트라스투주맙, 레날리도마이드(레블리미드®), 인터루킨-2(IL-2), 인터페론-α2(INF-α), 다카바진(DTIC), 베바시주맙(아바스틴®), 이다루비신, 탈리도마이드, 및 리툭시맙의 조합에서 관찰되었다. 또한, 세포독성의 향상은 아플리딘과 다른 상기된 물질과의 삼중 조합에서도 수득되었다는 것이 발견되었다.
아플리딘과 파클리탁셀의 조합은 암의 치료, 보다 상세하게는 유방암, 백혈병, 및 전립선암에서 선택되는 암의 치료에 있어서 특히 바람직하다.
아플리딘과 독소루비신의 조합은 암의 치료, 보다 상세하게는 폐암, 결장암, 전립선암, 및 다발골수종에서 선택되는 암의 치료에 있어서 특히 바람직하다.
아플리딘과 시스플라틴의 조합은 암의 치료, 보다 상세하게는 유방암 및 결장암에서 선택되는 암의 치료에 있어서 특히 바람직하다.
아플리딘과 삼산화비소의 조합은 암의 치료, 보다 상세하게는 폐암, 결장암, 및 전립선암에서 선택되는 암의 치료에 있어서 특히 바람직하다.
아플리딘과 5-플루오로우라실의 조합은 암의 치료, 보다 상세하게는 백혈병, 폐암, 유방암, 및 전립선암에서 선택되는 암의 치료에 있어서 특히 바람직하다.
아플리딘과 시토신 아라비노시드의 조합은 암의 치료, 보다 상세하게는 폐암, 유방암, 및 전립선암에서 선택되는 암의 치료에 있어서 특히 바람직하다.
아플리딘과 카르보플라틴의 조합은 암의 치료, 보다 상세하게는 결장암, 전립선암, 및 흑색종에서 선택되는 암의 치료에 있어서 특히 바람직하다.
아플리딘과 SN38의 조합은 암의 치료, 보다 상세하게는 폐암의 치료에 있어서 특히 바람직하다.
아플리딘과 에토포시드의 조합은 암의 치료, 보다 상세하게는 림프종 및 다발골수종에서 선택되는 암의 치료에 있어서 특히 바람직하다.
아플리딘과 덱사메타손의 조합은 암의 치료, 보다 상세하게는 다발골수종의 치료에 있어서 특히 바람직하다.
아플리딘과 레날리도마이드의 조합은 암의 치료, 보다 상세하게는 다발골수종의 치료에 있어서 특히 바람직하다.
아플리딘과 보르테조밉의 조합은 암의 치료, 보다 상세하게는 다발골수종의 치료에 있어서 특히 바람직하다.
아플리딘과 다카르바진의 조합은 암의 치료, 보다 상세하게는 흑색종의 치료에 있어서 특히 바람직하다.
아플리딘과 베바시주맙의 조합은 암의 치료, 보다 상세하게는 신장암의 치료에 있어서 특히 바람직하다.
아플리딘과 인터루킨-2의 조합은 암의 치료, 보다 상세하게는 신장암의 치료에 있어서 특히 바람직하다.
아플리딘과 멜팔란의 조합은 암의 치료, 보다 상세하게는 다발골수종의 치료에 있어서 특히 바람직하다.
아플리딘과 이다루비신의 조합은 암의 치료, 보다 상세하게는 백혈병의 치료에 있어서 특히 바람직하다.
아플리딘과 리툭시맙의 조합은 암의 치료, 보다 상세하게는 림프종의 치료에 있어서 특히 바람직하다.
아플리딘과 탈리도마이드의 조합은 암의 치료, 보다 상세하게는 다발골수종의 치료에 있어서 특히 바람직하다.
아플리딘과 레날리도마이드 및 덱사메타손의 삼중 조합은 암의 치료, 보다 상세하게는 다발골수종의 치료에 있어서 특히 바람직하다.
아플리딘과 보르테조밉 및 덱사메타손의 삼중 조합은 암의 치료, 보다 상세하게는 다발골수종의 치료에 있어서 특히 바람직하다.
아플리딘과 보르테조밉 및 레날리도마이드의 삼중 조합은 암의 치료, 보다 상세하게는 다발골수종의 치료에 있어서 특히 바람직하다.
아플리딘과 보르테조밉 및 탈리도마이드의 삼중 조합은 암의 치료, 보다 상세하게는 다발골수종의 치료에 있어서 특히 바람직하다.
아플리딘과 덱사메타손 및 탈리도마이드의 삼중 조합은 암의 치료, 보다 상세하게는 다발골수종의 치료에 있어서 특히 바람직하다.
아플리딘과 덱사메타손 및 멜팔란의 삼중 조합은 암의 치료, 보다 상세하게는 다발골수종의 치료에 있어서 특히 바람직하다.
아플리딘과 멜팔란 및 보르테조밉의 삼중 조합은 암의 치료, 보다 상세하게는 다발골수종의 치료에 있어서 특히 바람직하다.
본 발명의 조성물은 단일 약제학적으로 허용가능한 제제로 모든 성분(약물)을 포함할 수 있다. 다르게는, 상기 성분들이 개별적으로 제제화되고 서로 조합하여 투여될 수 있다. 당업자에게 공지된 약제학적으로 허용가능한 제제가 본 발명에서 사용될 수 있다. 본 발명에서 사용하기 위한 적절한 제제의 선택은 투여의 방식 및 상기 조성물의 성분의 용해도 특성에 따라 당업자에 의해 평상적으로 수행될 수 있다.
아플리딘 또는 아플리딘 유사체를 함유하는 약제학적 조성물의 예는 정맥 내 투여에 적절한 액체 조성물 (용액, 현탁액 또는 유액)을 포함하고, 순수 화합물 또는 임의의 담체 또는 다른 약제학적으로 활성적인 화합물과의 조합을 함유할 수 있다. 용해된 아플리딘은 열과 빛의 자극 시험 조건에서 현저한 분해를 나타내고, 동결건조된 투여 제형이 개발되었다 (참조에 의해 본 명세서에 통합된 WO 99 42125 참조)
본 발명의 아플리딘 또는 조성물의 투여는 "투여 프로토콜 (Dosing Protocol)"에 따라 바람직하게는 정맥내 주입에 의한 것이다. 72시간까지의 주입 시간을 사용하는 것이 바람직하며, 더욱 바람직하게는 1 내지 24시간, 가장 바람직하게는 약 1시간, 약 3시간, 또는 약 24시간이다. 병원에서 일박 없이 치료를 수행하게 하는 짧은 주입시간이 특히 바람직하다. 그러나, 주입은 24시간 정도 동안 또는 필요시 더 오래 수행될 수 있다. 상기 주입은, 다양한 양상으로, 예를 들어 설명하면 주당 1회, 주당 2회, 또는 주당 더 빈번하게, 선택적으로는 전형적으로 하나 또는 여러 주의 간격을 가지고 각 주마다 반복하여 적절한 간격에서 수행될 수 있다.
조합의 화합물의 올바른 투여법(dosage)은 특정 제제, 적용의 방식, 및 치료되는 특정 부위, 숙주, 및 종양에 따라 상이할 것이다. 나이, 체중, 성, 식습관, 투여 시간, 배출 속도, 숙주의 조건, 약물 조합, 반응 민감도, 및 병의 중증도와 같은 다른 요인들도 고려될 것이다. 투여는 계속적으로 또는 주기적으로 최대 수용 용량 내에서 수행될 수 있다. 아플리딘의 투여를 위한 추가적인 지침은 본 명세서에서 그 전체가 참조로서 통합되어 있는 WO 01 35974로부터 제공된다.
일 태양에 있어서, 본 발명은 아플리딘 또는 아플리딘 유사체를 사용하는 상승된 조합에 관한 것이다. 상승효과의 징조는 예를 들어 선형 회귀분석을 통해, 조합을 시험하고 결과를 분석함으로써 쉽게 얻을 수 있다.
이 점을 도시하기 위해 도 1이 참조되었다. 아이소볼로그램 분석과 같은 대안의 방법이 상승효과를 밝히기 위해 이용가능하며, 본 목적을 위해 사용될 수 있다.
적절한 아플리딘 유사체는 WO 02 02596의 제1항에 의해 정의된 화합물, 특히 제1항에 종속된 임의의 청구항에 의해 정의된 화합물을 포함한다. 청구항을 포함한 아플리딘의 유사체인 화합물의 WO 02 02596에서의 개시내용을 구체적인 원용에 의해 본 명세서에 포함시킨다.
도 1은 상승작용의 존재를 밝히기 위한 방법인 선형 회귀 분석의 일 예를 나타낸 것이다.
도 2는 아플리딘(아플리딘®)의 파클리탁셀 (탁솔®)과 조합된 SKBR3 세포에 대한 시험관 내(in vitro) 활성 데이타를 나타낸 것이다.
도 3은 아플리딘 (아플리딘®)의 파클리탁셀 (탁솔®)과 조합된 MOLT3 세포에 대한 in vitro 활성 데이타를 나타낸 것이다.
도 4는 아플리딘 (아플리딘®)의 파클리탁셀 (탁솔®)과 조합된 PC3 세포에 대한 in vitro 활성 데이타를 나타낸 것이다.
도 5는 아플리딘 (아플리딘®)의 파클리탁셀 (탁솔®)과 조합된 HL60 세포에 대한 in vitro 활성 데이타를 나타낸 것이다.
도 6은 아플리딘 (아플리딘®)의 파클리탁셀 (탁솔®)과 조합된 MX1 세포에 대한 in vitro 활성 데이타를 나타낸 것이다.
도 7은 아플리딘 (아플리딘®)의 파클리탁셀 (탁솔®)과 조합된 A549 세포에 대한 in vitro 활성 데이타를 나타낸 것이다.
도 8은 아플리딘 (아플리딘®)의 독소루비신(DOX)과 조합된 A549 세포에 대한 in vitro 활성 데이타를 나타낸 것이다.
도 9는 아플리딘 (아플리딘®)의 독소루비신(DOX)과 조합된 HT29 세포에 대한 in vitro 활성 데이타를 나타낸 것이다.
도 10은 아플리딘 (아플리딘®)의 독소루비신(DOX)과 조합된 PC3 세포에 대한 in vitro 활성 데이타를 나타낸 것이다.
도 11은 아플리딘 (아플리딘®)의 독소루비신(DOX)과 조합된 MOLT3 세포에 대한 in vitro 활성 데이타를 나타낸 것이다.
도 12는 아플리딘 (아플리딘®)의 독소루비신(DOX)과 조합된 MX1 세포에 대한 in vitro 활성 데이타를 나타낸 것이다.
도 13은 아플리딘 (아플리딘®)의 독소루비신(DOX)과 조합된 SKBR3 세포에 대한 in vitro 활성 데이타를 나타낸 것이다.
도 14는 아플리딘 (AP, 아플리딘®)의 시스플라틴(DDP)과 조합된 MX1 세포에 대한 in vitro 활성 데이타를 나타낸 것이다.
도 15는 아플리딘 (아플리딘®)의 시스플라틴(cis-DDP)과 조합된 HT29 세포에 대한 in vitro 활성 데이타를 나타낸 것이다.
도 16은 아플리딘 (APL, 아플리딘®)의 시스플라틴(cisDDP, DDP)과 조합된 SKBR3 세포에 대한 in vitro 활성 데이타를 나타낸 것이다.
도 17은 아플리딘 (아플리딘®)의 시스플라틴(cisDDP, DDP)과 조합된 MOLT3 세포에 대한 in vitro 활성 데이타를 나타낸 것이다.
도 18은 아플리딘 (아플리딘®)의 시스플라틴(cisDDP, DDP)과 조합된 A549 세포에 대한 in vitro 활성 데이타를 나타낸 것이다.
도 19는 아플리딘 (아플리딘®)의 삼산화비소(TRI)와 조합된 A549 세포에 대한 in vitro 활성 데이타를 나타낸 것이다.
도 20은 아플리딘 (아플리딘®)의 삼산화비소(TRI)와 조합된 HT29 세포에 대한 in vitro 활성 데이타를 나타낸 것이다.
도 21은 아플리딘 (아플리딘®)의 삼산화비소(TRI)와 조합된 PC3 세포에 대한 in vitro 활성 데이타를 나타낸 것이다.
도 22는 아플리딘 (아플리딘®)의 삼산화비소(TRI)와 조합된 MOLT3 세포에 대한 in vitro 활성 데이타를 나타낸 것이다.
도 23은 아플리딘 (아플리딘®)의 5-플루오로우라실(5FU)과 조합된 HL60 세포에 대한 in vitro 활성 데이타를 나타낸 것이다.
도 24는 아플리딘 (아플리딘®)의 5-플루오로우라실(5FU)과 조합된 SKBR3 세포에 대한 in vitro 활성 데이타를 나타낸 것이다.
도 25는 아플리딘 (아플리딘®)의 5-플루오로우라실(5FU)과 조합된 A549 세포에 대한 in vitro 활성 데이타를 나타낸 것이다.
도 26은 아플리딘 (아플리딘®)의 5-플루오로우라실(5FU)과 조합된 PC3 세포에 대한 in vitro 활성 데이타를 나타낸 것이다.
*도 27는 아플리딘 (아플리딘®)의 5-플루오로우라실(5FU)과 조합된 HT29 세포에 대한 in vitro 활성 데이타를 나타낸 것이다.
도 28은 아플리딘 (아플리딘®)의 시토신 아라비노시드(AraC)와 조합된 SKBR3 세포에 대한 in vitro 활성 데이타를 나타낸 것이다.
도 29는 아플리딘 (아플리딘®)의 시토신 아라비노시드(AraC)와 조합된 A549 세포에 대한 in vitro 활성 데이타를 나타낸 것이다.
도 30은 아플리딘 (아플리딘®)의 시토신 아라비노시드(AraC)와 조합된 PC3 세포에 대한 in vitro 활성 데이타를 나타낸 것이다.
도 31은 아플리딘 (아플리딘®)의 시토신 아라비노시드(AraC)와 조합된 HL60 세포에 대한 in vitro 활성 데이타를 나타낸 것이다.
*도 32는 아플리딘 (아플리딘®)의 시토신 아라비노시드(AraC)와 조합된 HT29 세포에 대한 in vitro 활성 데이타를 나타낸 것이다.
도 33은 아플리딘 (아플리딘®)의 카르보플라틴과 조합된 PC3 세포에 대한 in vitro 활성 데이타를 나타낸 것이다.
도 34는 아플리딘 (아플리딘®)의 카르보플라틴과 조합된 HT29 세포에 대한 in vitro 활성 데이타를 나타낸 것이다.
도 35는 아플리딘 (아플리딘®)의 카르보플라틴과 조합된 A549 세포에 대한 in vitro 활성 데이타를 나타낸 것이다.
도 36은 아플리딘 (아플리딘®)의 카르보플라틴과 조합된 MOLT3 세포에 대한 in vitro 활성 데이타를 나타낸 것이다.
도 37는 아플리딘 (아플리딘®)의 카르보플라틴과 조합된 MX1 세포에 대한 in vitro 활성 데이타를 나타낸 것이다.
도 38은 아플리딘 (아플리딘®)의 SN-38과 조합된 A549 세포에 대한 in vitro 활성 데이타를 나타낸 것이다.
도 39는 아플리딘 (아플리딘®)의 SN-38과 조합된 SKBR3 세포에 대한 in vitro 활성 데이타를 나타낸 것이다.
도 40은 아플리딘 (아플리딘®)의 SN-38과 조합된 HL60 세포에 대한 in vitro 활성 데이타를 나타낸 것이다.
도 41는 아플리딘 (아플리딘®)의 SN-38과 조합된 PC3 세포에 대한 in vitro 활성 데이타를 나타낸 것이다.
도 42a 및 42b는 아플리딘 (A, 아플리딘®)의 VP16(B)과 조합된 HL-60 세포에 대한 in vitro 활성 데이타를 나타낸 것이다.
도 43a 및 43b는 아플리딘 (A, 아플리딘®)의 VP16(B)과 조합된 K562 세포에 대한 in vitro 활성 데이타를 나타낸 것이다.
도 44a 및 44b는 아플리딘 (A, 아플리딘®)의 VP16(B)과 조합된 MOLT-3 세포에 대한 in vitro 활성 데이타를 나타낸 것이다.
도 45a 및 45b는 아플리딘 (A, 아플리딘®)의 VP16(B)과 조합된 MC116 세포에 대한 in vitro 활성 데이타를 나타낸 것이다.
도 46a 및 46b는 아플리딘 (A, 아플리딘®)의 VP16(B)과 조합된 RAMOS 세포에 대한 in vitro 활성 데이타를 나타낸 것이다.
도 47a 및 47b는 아플리딘 (A, 아플리딘®)의 VP16(B)과 조합된 U937 세포에 대한 in vitro 활성 데이타를 나타낸 것이다.
도 48a 및 48b는 아플리딘 (A, 아플리딘®)의 VP16(B)과 조합된 NCI-H929 세포에 대한 in vitro 활성 데이타를 나타낸 것이다.
*도 49a 및 49b는 아플리딘 (A, 아플리딘®)의 VP16(B)과 조합된 HUNS-1 세포에 대한 in vitro 활성 데이타를 나타낸 것이다.
도 50a 및 50b는 아플리딘 (A, 아플리딘®)의 VP16(B)과 조합된 U266 B1 세포에 대한 in vitro 활성 데이타를 나타낸 것이다.
도 51a 및 51b는 아플리딘 (A, 아플리딘®)의 VP16(B)과 조합된 RPMI 8226 세포에 대한 in vitro 활성 데이타를 나타낸 것이다.
도 52는 아플리딘 (아플리딘®)의 카르보플라틴과 조합된 LOX-I-MVI 세포에 대한 in vitro 활성 데이타를 나타낸 것이다.
도 53은 아플리딘 (아플리딘®)의 카르보플라틴과 조합된 UACC-257 세포에 대한 in vitro 활성 데이타를 나타낸 것이다.
도 54는 MM1S, MM1R, U266 및 U266-LR7 세포주에서 (48시간 처리 후) 아플리딘에 대한 용량 반응을 나타낸 것이다.
도 55는 MM1S 세포주에서 아플리딘(아플리딘®)과 다른 약물의 용량 효능의 비교를 나타낸 것이다(48 시간 처리).
도 56은 3일에서 아플리딘(아플리딘®)과 덱사메타손의 조합을 나타낸다. A) 용량 효과 곡선. B) Fa-CI 그래프.
도 57은 6일에서 아플리딘(아플리딘®)과 덱사메타손의 조합을 나타낸다. A) 용량 효과 곡선. B) Fa-CI 그래프.
도 58은 3일에서 아플리딘(아플리딘®)과 멜팔란의 조합을 나타낸다. A) 용량 효과 곡선. B) Fa-CI 그래프.
도 59는 6일에서 아플리딘(아플리딘®)과 멜팔란의 조합을 나타낸다. A) 용량 효과 곡선. B) Fa-CI 그래프.
도 60은 3일에서 아플리딘(아플리딘®)과 독소루비신의 조합을 나타낸다. A) 용량 효과 곡선. B) Fa-CI 그래프.
도 61은 6일에서 아플리딘(아플리딘®)과 독소루비신의 조합을 나타낸다. A) 용량 효과 곡선. B) Fa-CI 그래프.
도 62는 3일에서 아플리딘(아플리딘®)과 레날리도마이드(레블리미드®)의 조합을 나타낸다. A) 용량 효과 곡선. B) Fa-CI 그래프.
도 63은 6일에서 아플리딘(아플리딘®)과 레날리도마이드(레블리미드®)의 조합을 나타낸다. A) 용량 효과 곡선. B) Fa-CI 그래프.
도 64는 3일에서 아플리딘(아플리딘®)과 보르테조밉의 조합을 나타낸다. A) 용량 효과 곡선. B) Fa-CI 그래프.
도 65는 6일에서 아플리딘(아플리딘®)과 보르테조밉의 조합을 나타낸다. A) 용량 효과 곡선. B) Fa-CI 그래프.
도 66은 아플리딘(아플리딘®)을 단일 물질로 또는 다카르바진과 조합하여 치료를 시작한 후의 MRI-H-187 흑색종 종양 이종이식에서의 총(net) 종양 부피의 동역학을 나타낸 것이다.
도 67은 아플리딘(아플리딘®)을 단일 물질로 또는 카르보플라틴과 조합하여 치료를 시작한 후의 MRI-H-187 흑색종 종양 이종이식에서의 총 종양 부피의 동역학을 나타낸 것이다.
도 68은 아플리딘(아플리딘®)을 단일 물질로 또는 인터루킨-2(IL-2)와 조합하여 치료를 시작한 후의 MRI-H-187 흑색종 종양 이종이식에서의 총 종양 부피의 동역학을 나타낸 것이다.
도 69는 아플리딘(아플리딘®)을 단일 물질로 또는 인터페론-α2a(INF-α)와 조합하여 치료를 시작한 후의 MRI-H-187 흑색종 종양 이종이식에서의 총 종양 부피의 동역학을 나타낸 것이다.
도 70은 아플리딘(APL)을 단일 물질로 또는 다카르바진(DTIC)과 조합하여 치료를 시작한 후의 LOX-IMVI 흑색종 종양 이종이식에서의 총 종양 부피의 동역학을 나타낸 것이다.
도 71은 아플리딘(APL)을 단일 물질로 또는 카르보플라틴과 조합하여 치료를 시작한 후의 LOX-IMVI 흑색종 종양 이종이식에서의 총 종양 부피의 동역학을 나타낸 것이다.
도 72는 아플리딘(APL, 아플리딘®)을 단일 물질로 또는 인터루킨-2(IL-2)와 조합하여 치료를 시작한 후의 LOX-IMVI 흑색종 종양 이종이식에서의 총 종양 부피의 동역학을 나타낸 것이다.
도 73은 아플리딘(APL, 아플리딘®)을 단일 물질로 또는 인터페론-α 2a(INF-α)와 조합하여 치료를 시작한 후 LOX-IMVI 흑색종 종양 이종이식에서의 총 종양 부피의 동역학을 나타낸 것이다.
도 74는 아플리딘(APL)을 단일 물질로 또는 베바시주맙(아바스틴®)과 조합하여 치료를 시작한 후의 CaKi-1 신장 종양 이종이식에서의 총 종양 부피의 동역학을 나타낸 것이다.
도 75는 아플리딘(APL)을 단일 물질로 또는 인터루킨-2(IL-2)와 조합하여 치료를 시작한 후의 CaKi-1 신장 종양 이종이식에서의 총 종양 부피의 동역학을 나타낸 것이다.
도 76은 아플리딘(APL)을 단일 물질로 또는 인터페론-α2a(IFN-α 2a)와 조합하여 치료를 시작한 후의 CaKi-1 신장 종양 이종이식에서의 총 종양 부피의 동역학을 나타낸 것이다.
도 77은 아플리딘(APL)을 단일 물질로 또는 베바시주맙(아바스틴®)과 조합하여 치료를 시작한 후의 MRI-H121 신장 종양 이종이식에서의 총 종양 부피의 동역학을 나타낸 것이다.
도 78은 아플리딘(APL)을 단일 물질로 또는 인터루킨-2(IL-2)와 조합하여 치료를 시작한 후의 MRI-H121 신장 종양 이종이식에서의 총 종양 부피의 동역학을 나타낸 것이다.
도 79는 아플리딘(APL)을 단일 물질로 또는 인터페론-α2a(IFN-α)와 조합하여 치료를 시작한 후의 MRI-H121 신장 종양 이종이식에서의 총 종양 부피의 동역학을 나타낸 것이다.
도 80은 MM1S에서 아플리딘(A) + 레날리도마이드 (레블리미드®; R)+ 덱사메타손(D)의 조합으로 처리한 72시간 후를 나타낸 것이다. 아플리딘 용량은 nM 단위로 나타내며, 레날리도마이드 용량은 μM 단위, 및 덱사메타손 용량은 nM 단위로 나타낸다.
도 81은 MM1S에서 아플리딘 (A) + 보르테조밉 (B) + 덱사메타손 (D)의 조합으로 처리한 72시간 후를 나타낸 것이다. 아플리딘 용량은 nM 단위로 나타내고, 보르테조밉은 nM 단위로 나타내고, 또한 덱사메타손 용량은 nM 단위로 나타낸다.
도 82는 MM1S에서 아플리딘 (A) + 보르테조밉 (B) + 레날리도마이드(레블리미드®)의 조합으로 처리한 72시간 후를 나타낸 것이다. 아플리딘 용량은 nM 단위로 나타내고, 보르테조밉 용량은 nM 단위로 나타내며, 또한 레날로마이드는 μM 단위로 나타낸다.
도 83은 MM1S에서 아플리딘 (A) + 탈리도마이드 (T) + 덱사메타손 (D)의 조합으로 처리한 72시간 후를 나타낸 것이다. 아플리딘 용량은 nM 단위로 나타내고, 탈리도마이드 용량은 μM 단위로 나타내며, 덱사메타손 용량은 nM 단위로 나타낸다.
도 84는 MM1S에서 아플리딘 (A) + 멜팔란 (M) + 덱사메타손 (D)의 조합으로 처리한 72시간 후를 나타낸 것이다. 아플리딘 용량은 nM 단위로 나타내고, 멜팔란 용량은 μM 단위로 나타내며, 덱사메타손 용량은 nM 단위로 나타낸다.
도 85는 MM1S에서 아플리딘 (A) + 멜팔란 (M) + 보르테조밉 (B)의 조합으로 처리한 72시간 후를 나타낸 것이다. 아플리딘 용량은 nM 단위로 나타내고, 멜팔란 용량은 μM 단위로 나타내며, 보르테조밉 용량은 nM 단위로 나타낸다.
실시예 1. 아플리딘과 다른 표준 작용제의 조합의 종양세포주에 대한 효과를 결정하는 in vitro 연구.
단일 물질로서 또는 선택된 표준 화학요법제와의 조합된 아플리딘을 여러 종양 세포주에 대해 평가하여 세포독성의 차이를 측정하였다.
하기 표준 작용제가 단일제로서 및 아플리딘과의 조합에 선택되었다: 파클리탁셀(탁솔®), 독소루비신, 시스플라틴, 삼산화비소(Trisonex®), 5-플루오로우라실(5-FU), 사이토신 아라비노시드(AraC), 카르보플라틴, 및 7-에틸-10-히드록시캄프토테신(SN38).
단일 물질의 아플리딘은 여러 암 유형에 다양한 역가의 독성을 갖는다. 이러한 이유로 아플리딘에 대해 낮은, 보통, 또는 높은 감수성을 갖는 대표적인 종양세포주가 선택되었다. 사용된 종양세포주는 표 1에 열거되어 있다.
암 유형 (세포주) 아플리딘에 대한 감수성
NSCL (A549) 낮음
유방 암종 (MX1) 낮음
풋골수세포 백혈병(HL60) 보통
결장 샘암종 (HT29) 보통
전립선 샘암종 (PC3) 보통
유방 샘암종 (SKBR3) 높음
급성 림프모세포 백혈병(MOLT3) 높음
스크리닝은 두 부분으로 수행되었다:
a. 분석의 제1세트에서, 각 종양세포주에서 72시간의 약물 노출 후에 각 화합물에 대한 IC50 값을 결정하였다.
모든 세포주는 각각의 배양 배지에서 37℃, 5% CO2 및 98% 습도로 유지시켰다. 모든 배지 제제는 항생제를 함유하지 않았다. 세포를 평판(plating)하기 하루 전에 모든 배양물은 새로운 완전한 배양 배지를 공급받았다. 수확(평판)일에 트리판 블루 배제 염색법을 통해 세포를 계수하였다(기초 세포 배양). 세포들을 수확하여 웰 당 10,000개의 세포를 190㎕의 배지로 96-웰 미량 역가 플레이트에 분주하고 24시간동안 배양하여 약물 부가 전에 세포들이 부착되도록 하였다. 세포를 약물로 처리하고, 생존력있는 세포의 수를 결정하기 위한 비색분석법인 MTS 분석 (테트라졸륨)을 이용하여 세포독성 효과를 측정하였다. 72시간의 약물과 배양 후, 25㎕의 MTS+PMS 용액을 각 미량역가 웰에 첨가하고, 4시간 동안 37℃에서 배양하였다. 그 후 판들을 배양기에서 꺼내 판 진탕기 위에 5분간 두었다 (빛으로부터 보호를 위해 알루미늄 호일로 덮음). 분광광도계 플레이트 판독기 상에서 490nm에서의 광밀도를 판독하였다. 데이타는 SoftMax v 3.12 프로그램을 이용하여 분석하였다.
IG50 (50% 증식 억제가 측정된 농도)의 대략 동등량인 IC50를 계산하였다. SoftMax 프로그램을 이용한 회귀 곡선이 생성되고, 그 후 50% 억제 농도가 수동적으로 간입되고, 그 농도를 화합물의 분자질량으로 나누어 몰농도 (M)로 전환시켰다. 개별적 IC50 값(72시간 약물 노출)은 표 2에 나타내었다. 상기 IC50 값은 약물 농도의 100%를 나타낸다.
세포주 유형 약물 IC 50 ( 몰농도 )
A549 NSCL 종양 아플리딘 3.6E-04
파클리탁셀 1.3E-08
독소루비신 1.3E-06
시스플라틴 6.0E-06
삼산화비소 4.2E-04
5-FU 1.4E-03
AraC >1.0E-04
카르보플라틴 3.1E-04
SN38 1.3E-03
MX1 유방샘 암종 아플리딘 >1.0E-04
파클리탁셀 9.4E-06
독소루비신 >1.0E-04
시스플라틴 1.7E-04
삼산화비소 9.7E-05
5-FU >1.0E-04
AraC >1.0E-04
카르보플라틴 >1.0E-04
SN38 1.5E-07
Figure pat00002
Figure pat00003
b. 제2세트의 분석에서, 각각의 세포주는 하기 특유의 IC50 농도의 조합으로아플리딘과 각각의 상기 언급된 표준 작용제와의 조합과 배양되었다:
Figure pat00004
미량 역가판들을 72시간동안 5% CO2, 37℃에서 배양하였다. 세포독성 효과는 MTS 분석을 통해 측정하였다. 490nm 광학밀도를 판독하였다. 정규화된 데이터를 작도하고 상기한 방법과 같이 분석하였다. 데이터는 다음과 같이 분석되었다:
1. 프리즘 (Graphpad) 소프트웨어 프로그램을 사용하여 대조값(100% = 작용제(약물) 부재시의 세포 성장; 0% = 바탕 대조값)으로 정규화하였다.
2. 정규화된 데이터를 분산 그래프로 작도하였다. 각각의 작용제(약물)에 대한 100% IC50의 값을 연결하는 선이 그려졌다. 선을 크게 웃도는 값은 길항작용을 표시하였고, 그 아래는 상승작용을 표시하였으며, 선상은 가산성(additivity)을 표시하였다.
데이터의 통계적 처리는 Laska E. 등의 Biometrics (1994) 50:834-841 및 Greco 등의 Pharmacol Rev. (1995) 47: 331-385를 따랐다. 시험한 용량 비율에서의 조합은 세포 증식의 억제가 각각의 개별적 약물에 대한 최대 억제값 (100% IC50에서)을 초과하였을 때 상승효과가 있는 것으로 판단하였다. 이와 반대로, 억제가 양 최대값 보다 낮을 경우에는 길항작용으로 결론지었다. 조합의 효과가 양 약물의 최대값으로부터 크게 차이가 나지 않을 경우에는 가산성으로 결론지었다. 통계적 유효성은 각 용량 비율에서의 억제 대(versus) 각 약물의 최대 억제에 대하여 스튜던트의 t-테스트(Student's T-test)를 수행함으로써 평가하였다. 각 세포주에 대한 약물 조합의 전체 유효성은 용량 비율들의 50% 초과에 대한 통계적 유의성을 보이는 것에 의존하였다.
시각 교구로서, 반응 값을 분산 도면에 x-축에 용량 비율을 제공하고 y-축에 % 반응 값을 제공하여 작도하였다. 두 종점 반응 값 사이에(예: 100% IC50 아플리딘과 100% IC50 표준 화학요법제에 대한 반응 값 사이에) 수평선을 그렸다. 두 종점서의 반응 값이 대략 동등할 경우, 이 가산성의 예측선 위 또는 아래에 있는 점들은 각각 길항적 또는 상승적(synergistic) 약물 상호작용을 나타내는 것으로 해석될 수 있다.
아플리딘과 각각의 약물의 in vitro 조합은 상승적, 가산적, 또는 길항적일 가능성이 있다. 종양 세포에 대한 상승적 세포독성이 최적의 효과이며, 아플리딘과 다른 약물의 조합이 각각의 독립된 약물보다 더 효과적이라는 것을 의미한다.
이 분석에 따르면 하기 내용을 발견하였다:
a. 아플리딘과 파클리탁셀의 조합은 유방 샘암종 SKBR3 세포(도 2), 급성 림프모세포 백혈병 MOLT3 세포(도 3), 및 전립선 샘암종 PC3 세포(도 4)에서 상승효과를 나타냈다. 풋골수세포 백혈병 HL60 세포 (도 5), 유방 암종 MX1 세포 (도 6) 및 NSCL A549 세포 (도 7)에서는 가산성(additivity)의 경향을 관찰하였다.
b. 아플리딘과 독소루비신의 조합은 NSCL A549 세포 (도 8), 결장 샘암종 HT29 세포 (도 9) 및 전립선 샘암종 PC3 세포 (도 10)에서 상승효과를 나타냈다. 급성 림프모세포 백혈병 MOLT3 세포 (도 11), 유방 암종 MX1 세포 (도 12) 및 유방 샘암종 SKBR3 세포 (도 13)에서는 가산성을 관찰하였다.
c. 아플리딘과 시스플라틴의 조합은 유방 암종 MX1 세포(도 14) 및 결장 샘암종 HT29 세포 (도 15)에서 상승효과를 나타냈다. 유방 샘암종 SKBR3 세포 (도 16) 및 급성 림프모세포 백혈병 MOLT3 세포 (도 17)에서는 가산성을 관찰하였으며, NSCL A549 세포(도 18)에서는 상승적 경향을 발견하였다.
d. 아플리딘과 삼산화비소의 조합은 NSCL A549 세포(도 19), 결장 샘암종 HT29 세포(도 20) 및 전립선 샘암종 PC3 세포 (도 21)에서 상승효과를 나타냈다. 급성 림프모세포 백혈병 MOLT3 (도 22)에서는 가산성을 관찰하였다.
e. 아플리딘과 5-플루오로우라실의 조합은 풋골수세포 백혈병 HL60 세포 (도 23), 유방 샘암종 SKBR3 세포 (도 24), NSCL A549 세포 (도 25), 및 전립선 샘암종 PC3 세포 (도 26)에서 상승효과를 나타냈다. 결장 샘암종 HT29 세포 (도 27)에서는 가산성을 관찰하였다.
f. 아플리딘과 시토신 아라비노시드의 조합은 유방 샘암종 SKBR3 세포 (도 28), NSCL 유방 A549 세포 (도 29) 및 전립선 샘암종 PC3 세포 (도 30)에서 상승효과를 나타냈다. 풋골수세포 백혈병 HL60 세포 (도 31) 및 결장 샘암종 HT29 세포(도 32)에서는 가산성을 발견하였다.
g. 아플리딘과 카르보플라틴의 조합은 전립선 샘암종 PC3 세포 (도 33) 및 결장 샘암종 HT29 세포 (도 34)에서 상승효과를 나타냈다. NSCL A549 세포 (도 35), 급성 림프모세포 백혈병 MOLT3 세포 (도 36) 및 유방 암종 MX1 세포(도 37)에서는 가산성을 관찰하였다.
h. 아플리딘과 SN8의 조합은 NSCL A549 세포 (도 38)에서 상승효과를 나타냈다. 유방 샘암종 SKBR3 세포 (도 39), 풋골수세포 백혈병 HL60 세포 (도 40) 및 전립선 샘암종 PC3 세포(도 41)에서는 가산성을 관찰하였다.
실시예 2. 다른 표준 작용제와 조합된 아플리딘의 백혈병, 림프종, 다발골수종 및 흑색종 종양 세포주에 대한 효과를 결정하기 위한 시험관 내(in vitro) 연구.
실시예 1에서 개시된 것과 같은 절차에 따라서, 세포독성의 차이를 측정하기 위해 단일 물질 또는 선택된 표준 화학요법과 조합된 아플리딘을 몇몇 종양 세포주에 대해 평가하였다.
하기 표준물질을 단일 물질로서 또는 아플리딘과 조합하여 선택하였다: 에토포시드 (VP16) 및 카르보플라틴. 본 분석을 위해 선택된 상기 종양 세포주는 표 3에 나타내었다.
세포주 종양 유형
HL-60 백혈병
K562 백혈병
MOLT-3 백혈병
H9 림프종
HUT78 림프종
MC116 림프종
RAMOS 림프종
U937 림프종
NCI-H929 다발골수종
HUNS-1 다발골수종
U266B-1 다발골수종
RPMI 8226 다발골수종
LOXIMVI 흑색종
UACC-257 흑색종
세포 배양법
모든 세포주는 각각의 배양 배지에서 37℃ 5% CO2 및 98% 습도에서 유지시켰다. 모든 배지 제제는 항생제를 함유하지 않았다. 세포 평판 전날에 모든 배양물에 새로운 완전한 배양 배지를 제공하였다. 수확(평판)일에 Trypan Blue 배제 염색법을 통해 세포를 계수하였다.
세포 평판
세포를 수확하고 96-웰 미량 역가판에 190㎕의 배지에 웰 당 15,000개의 세포를 분주하고 24시간 동안 배양하여 약물 첨가 전에 세포가 부착되도록 하였다.
약물 처리
아플리딘의 배액 (stock solution)을 100% DMSO에서 5mg/ml로 제조하였다. 화학요법제 VP16 및 카르보플라틴의 배액은 100% DMSO에서 둘 다 2mg/ml의 농도로 제조하였다.
아플리딘 및 상기 다른 표준 작용제를 하기 열거된 범위로 세포를 처리하고, 개개의 약물 농도는 플레이트당 3중복(triplicate)으로 제조하였다. 사용된 시험 작용제의 상기 농도는 개개 작용제의 실시예 1에서와 같이 결정된 IC50의 백분율로 표현하였다.
Figure pat00005
각 세포주에 대한 각 작용제의 각 IC50 값은 하기 표 4에 나타내었다.
약물 세포주 IC 50 ( 몰농도 )
아플리딘 HL-60 8.0E-12
K562 2.0E-10
MOLT-3 3.2E-14
H9 4.8E-14
HUT78 10E-15
MC116 5.5E-10
RAMOS 5.0E-09
U937 4.4E-13
U266B-1 5.9E-12
RPMI 8226 1.4E-14
HUNS-1 3.4E-14
NCI-H929 5.2E-13
LOXIMVI 3.5E-09
UACC-257 4.8E-10
VP16 HL-60 2.0E-06
K562 7.6E-06
MOLT-3 2.4E-08
H9 7.3E-07
HUT78 1.4E-06
MC116 2.3E-07
RAMOS 1.1E-07
U937 4.4E-07
U266B-1 5.9E-06
RPMI 8226 3.7E-07
HUNS-1 3.1E-06
NCI-H929 2.4E-06
카르보플라틴 LOXIMVI 1.2E-04
UACC-257 1.7E-04
세포 독성 효과는 생존력있는 세포의 수를 결정하기 위한 비색법인 MTS 분석(테트라졸륨)을 통해 측정하였다.
시험 작용제와 배양 72시간 후, 25㎕의 MTS+PMS 용액을 각 미량역가 웰에 첨가하고, 4시간 동안 37℃에서 배양하였다. 그 후 플레이트를 배양기에서 꺼내 판 진탕기 위에 5분간 두었다 (빛으로부터 보호를 위해 알루미늄 호일로 덮음). 분광광도계 플레이트 판독기 상에서 490nm에서의 광밀도를 판독하였다. 데이터는 하기와 같이 분석하였다:
1. 프리즘 (Graphpad) 소프트웨어 프로그램을 사용하여 대조값(100% = 작용제(약물) 부재시의 세포 성장; 0% = 바탕 대조값)으로 정규화하였다.
2. 정규화된 데이터를 분산 그래프로 작도하였다. 각각의 작용제(약물)에 대한 100% IC50의 값을 연결하는 선을 그었다. 선을 크게 웃도는 값은 길항작용을 표시하였고, 그 아래는 상승작용을 표시하였으며, 선상은 가산성(additivity)을 표시하였다.
데이터의 통계적 처리는 Laska E. 등의 Biometrics (1994) 50:834-841 및 Greco 등의 Pharmacol Rev. (1995) 47: 331-385를 따랐다. 시험한 용량 비율에서의 조합은 세포 증식의 억제가 각각의 개별적 약물에 대한 최대 억제값 (100% IC50에서)을 초과하였을 때 상승효과가 있는 것으로 판단되었다. 이와 반대로, 억제가 양 최대값 보다 낮을 경우에는 길항작용으로 결론지었다. 조합의 효과가 양 약물의 최대값으로부터 크게 차이가 나지 않을 경우에는 가산성으로 결론지었다. 통계적 유효성은 각 용량 비율에서의 억제 대(versus) 각 약물의 최대 억제에 대하여 스튜던트의 t-테스트를 수행함으로써 평가하였다. 각 세포주에 대한 약물 조합의 전체 유효성은 용량 비율들의 50% 초과에 대한 통계적 유의성을 보이는 것에 의존하였다.
시각 교구로서, 반응 값을 분산 도면에 x-축에 용량 비율을 제공하고 y-축에 % 반응 값을 제공하여 작도하였다. 두 종점 반응 값 사이에(예: 100% IC50 아플리딘과 100% IC50 표준 화학요법제에 대한 반응 값 사이에) 수평선을 그렸다. 두 종점서의 반응 값이 대략 동등할 경우, 이 가산성의 예측선 위 또는 아래에 있는 점들은 각각 길항적 또는 상승적(synergistic) 약물 상호작용을 나타내는 것으로 해석할 수 있다.
도 42a 및 42b는 HL-60 세포에 대한 VP16과 조합된 아플리딘의 in vitro 활성 데이터를 나타낸다. 이 데이터에 따르면 가산적 효과가 수득된다.
도 43a 및 43b는 K562 세포에 대한 VP16과 조합된 아플리딘의 in vitro 활성 데이터를 나타낸다. 이 데이터에 따르면 가산성이 수득된다.
도 44a 및 44b는 MOLT-3 세포에 대한 VP16과 조합된 아플리딘의 in vitro 활성 데이터를 나타낸다. 이 데이터에 따르면 가산성이 수득된다.
도 45a 및 45b는 MC116 세포에 대한 VP16과 조합된 아플리딘의 in vitro 활성 데이터를 나타낸다. 이 데이터에 따르면 이 종양 세포주에서 가산성이 수득된다.
도 46a 및 46b는 RAMOS 세포에 대한 VP16과 조합된 아플리딘의 in vitro 활성 데이터를 나타낸다. 이 데이터에 따르면 본 종양 세포주에서 상승작용이 수득된다.
도 47a 및 47b는 U937 세포에 대한 VP16과 조합된 아플리딘의 in vitro 활성 데이터를 나타낸다. 이 데이터에 따르면 가산성이 수득된다.
도 48a 및 48b는 NCI-H929 세포에 대한 VP16과 조합된 아플리딘의 in vitro 활성 데이터를 나타낸다. 이 데이터에 따르면 상승작용이 수득된다.
도 49a 및 49b는 HUNS-1 세포에 대한 VP16과 조합된 아플리딘의 in vitro 활성 데이터를 나타낸다. 이 데이터에 따르면 가산성이 수득된다.
도 50a 및 50b는 U266B-1 세포에 대한 VP16과 조합된 아플리딘의 in vitro 활성 데이터를 나타낸다. 이 데이터에 따르면 이 종양 세포주에서 가산성이 수득된다.
도 51a 및 51b는 RPMI 8226 세포에 대한 VP16과 조합된 아플리딘의 in vitro 활성 데이터를 나타낸다. 이 데이터에 따르면 이 종양세포주에서 가산성이 수득된다.
도 52는 LOX-I-MVI 세포에 대한 카르보플라틴과 조합된 아플리딘의 in vitro 활성 데이터를 나타낸다. 이 데이터에 따르면 이 종양세포주에서 가산성이 수득된다.
도 53은 UACC-257 세포에 대한 카르보플라틴과 조합된 아플리딘의 in vitro 활성 데이터를 나타낸다. 이 데이터에 따르면 이 종양세포주에서 상승작용이 수득된다.
실시예 3: 다른 표준 작용제와 조합한 아플리딘의 다발골수종 종양 세포주에 대한 효과를 결정하기 위한 in vitro 연구.
다발 골수종(multiple myeloma: MM)은 혈장 세포의 악성 질환이며, 일반적으로 골수에서 증식 및 축적되는 혈장 세포의 클론으로부터 유래된다. 골수종 환자의 임상병리학적 특징은 혈액 또는 소변 내의 단일클론 단백질의 축적, 용균성 골병변(lytic bone lesions), 빈혈 및 신부전을 포함한다(Sirohi B. 등 Lancet (2004) 363: 875-87).
골수종의 실제 치료는 줄기세포 이식에 의해 지지된 고용량의 요법에 의존한다. 지난 10년간의 발전에도 불구하고, MM은 환자의 전체 생존기간의 중간값이 2 내지 5년으로, 오늘날에도 불치의 질환으로 남아 있다(Sirohi B. 등 Lancet (2004) 363: 875-87). 환자의 결과를 개선하기 위한 다음 세 가지 주요 연구 줄기를 따르는 새로운 치료 전략이 필요하다: a) 고용량의 사용을 통한 화학요법의 효능을 향상; b) 골수종 세포에 대한 숙주 면역 반응 향상; 및 c) 골수종 세포뿐만 아니라 골수의 미소환경을 간섭하는, 보다 특정한 표적을 갖는 신규 약물의 개발이다 (Miguel JF 등 Curr. Treat. Options Oncol. (2003) 4: 247-58). 바라건대, 이러한 치료 물질들 둘 이상의 조합은 개선된 항-MM 효능 및 더 긴 생존율을 초래할 것이다.
여기서 우리는 다발골수종의 치료의 새로운 약물로서 아플리딘의 효과에 대한 여러 연구를 기재한다. 이 연구는 하기를 포함한다:
1) 세포 생존력(MTT 분석) 및 세포사멸(아넥신 V 염색) 분석을 이용한 다수의 MM 세포주에 대한 (단독으로 또는 조합된) 아플리딘의 세포독성 효능.
2) 상기 질환의 치료에 있어서 아플리딘과 다른 기존 및 최근 개발된 약물의 조합의 세포독성 효능.
재료 및 방법
세포주 및 세포 배양 시약
네 개의 MM-유래 세포주가 본 실험에 사용되었다: S. Rudikoff 박사 (베데스다, 메릴랜드)에 의해 기꺼이 제공된 사람 다발성 골수종 세포주 MM.1 (Greenstein S. 등 Exp. Hematol (2003) 31:.271-82)의 덱사메타손-민감성 (MM.1S) 및 덱사메타손-내성(MM.1R) 변이주; 및 U266과 그의 멜팔란-내성 대응부 U266 LR7 세포주는 W. Dalton 박사(탐파 플로리다)로부터 수득되었다. 모든 MM 세포주는 10% 가열불활성화된 우태아 혈청(FBS), 100U/ml 페니실린, 100㎍/ml 스트렙토마이신 및 2mM L-글루타민으로 보충된 RPMI 1640 배지에서 배양하였다. 모든 세포 배양 배지 및 시약은 인비트로겐 주식회사(칼스바드, 캘리포니아)로부터 구매하였다.
세포 생존력 분석
MM 세포 증식의 분석은 메틸티오테트라졸(MTT; 시그마, 세인트 루이스 미주리) 비색 분석을 이용하여 평가되었다. MM 세포주를 48-웰 플레이트에 웰당 50,000 세포/200㎕ 배지의 밀도로 분주하고, 소정의 약물 용량과 시간으로 처리하였다. 상기 처리 종료 2시간 전에, MTT 용액 (PBS 중 5mg/ml; 보통 각 웰 부피의 10%)을 첨가하고 대사적 활성 세포에 의해 테트라졸륨염을 유색의 포르마잔 결정(crystal)으로 환원하였다. 이 결정을 밤새 10% SDS-HCl 용액으로 배양함으로써 용해시킨 후, 630nm로 교정하여 570nm에서 흡광도를 측정하였다. 각 조건당 4 개의 웰을 분석하고, 그 결과를 3회 이상 반복된 대표 실험의 4배중복(quadruplicate)의 평균±표준편차로서 나타내었다.
웨스턴 블롯
세포를 수집 및 PBS로 세척하고, 빙냉의 용해(lysis) 완충액(140 mM NaCl, 10 mM EDTA, 10% 글리세롤, 1% 노니데트 (Nonidet) P-40, 20 mM Tris (pH 7.0), 1μM 펩스타틴, 1 ㎍/ml 아프로티닌, 1 ㎍/ml 루펩틴, 1 mM 오르토바나데이트 나트륨)에 배양한 후 총 세포 용해물을 얻었다. 시료를 10,000g로 4℃에서 10분간 원심분리시키고 상층액 중의 동량의 단백질을 6%-12.5% SDS-PAGE로 용해시켰다. 그런 다음 단백질을 니트로셀룰로스 또는 PVDF 막으로 이동시키고, PBST 완충액 (PBS 중의 0.05%-Tween 20) 중의 5% 탈지분유에 배양에 의해 차단시키고 후속적으로 특정 일차 산타크루즈 테크놀로지, 항체 (항-p-c-jun, 항-p-Erk1/2 및 항-Erk5 항체들은 산타 크루즈 바이오테크놀로지(산타크루즈, 캘리포니아)로부터 구매한 한편, 항-p-p38은 셀 시그널링 (댄버스, 매사추세츠) 및 항-PARP 항체는 벡튼 디킨슨 바이오사이언스 (베드포드, 매사추세츠)로부터 수득하였다. 상응하는 이차 항체와 함께 이차 배양한 후, 면역블롯(immunoblot)이 강화된 화학발광(ECL; 아머샴, 알링턴 하이츠, 일리노이)에 의해 현상되었다. 활성화된 JNL 및 Erk5의 동정은 먼저 대응하는 특정 항체와 단백질 A 세파로즈로 단백질 용해물의 면역침전을 요구하였다.
이소볼로그램 ( isobologram ) 분석
아플리딘과 다른 항-MM 물질의 상호작용은 Calcusyn 소프트웨어 프로그램 (Biosoft, Ferguson, MO)을 이용하여 분석하였다. 세포 생존력 분석 (MTT)로부터의 데이터를 미처리된 세포(대조군)과 비교하여 약물처리된 세포에서 투여량(Fa)에 의해 영향을 받은 세포의 분율(fraction)로 표현하였다. 이 프로그램은 Chou-Talalay 방법 (Chou TC 등 Adv. Enzyme Regul. (1984) 22:27-55)에 기반하여 수학식 CI = (D)1/(Dx)1 + (D)1(D)2/(Dx)1(Dx)2에 따른 것이고, 여기서 (D)1과 (D)2는 독립적으로 사용되었을 때 동일한 x 효과를 갖는 약물 1과 2의 용량이다. 1.0 미만의 CI값은 상승효과를 나타내고, CI 값≒1.0은 가산 효과를 나타내는 한편, 1 초과의 값은 길항 효과에 해당한다.
결과
MM -유래 세포주의 아플리딘에 대한 용량 반응
우리는 먼저 아플리딘이 세포 생존력에 영향을 주는지 (통상의 치료법 약물에 대하여 민감성 및 내성이) MM-유래 세포주 에 대한 MTT 분석을 이용하여 결정하였다. 도 54에 나타난 바와 같이, 48시간 동안의 아플리딘 처리는 실험한 모든 세포주에서 용량의존적 방식으로 세포 생존력의 유사한 감소를 유도한다. 48시간 후의 생존력있는 세포의 50% 감소 (IC50)는 실험한 네 개의 세포주에 대해서 1-10nM 범위 내에 있었다.
아플리딘의 효능은 또한 MM의 치료에 있어서 다른 통상의 약물(멜팔란, 덱사메타손) 및 새로운 약물(보르테조밉)과 비교하였다. 도 55는 MM.1S 세포주에 대해 0.1-1nM 용량에서 48시간 동안 시험했을 때 다른 약물과 비교하여 아플리딘의 우수한 역가를 나타냈다;그 효과는 최대 용량에서의(10-100nM) 보르테조밉의 효과와 유사하였다.
아플리딘의 이중 조합에서의 상승효과의 평가
MM 화학 요법에의 지속적인 노출은 많은 경우에 독성의 증가와 신규 약물 내성의 발달과 관련이 있기 때문에, 최소한의 독성의 용량의 아플리딘과 다른 약물의 조합이 MM 세포 생존력에 영향을 미치는지를 실험하였다. 구체적으로, 아플리딘을 MM의 치료에서 (덱사메타손 또는 멜팔란과 같은) 통상적인 약물, 최근 개발된 항-골수증제(보르테조밉), 및 골수 미소환경을 특이적으로 겨냥하는 약물(레날리도마이드(레블리미드®))과 조합하였다.
1, 2, 3 및 6일에서의 시간 경과 실험도 전술한 치료제에 대하여 수행하여, 조합 실험에 대한 적절한 준최적 용량 (10% 내지 30% 증식 억제)을 결정하고, 또한 치료의 지속기간을 탐색하였다. 아플리딘과 나머지 약물들의 조합 실험은 3일 또는 6일 동안의 배양 후에 수행하였다. MM.1S 세포주의 세포 성장은 전술한 MTT 분석을 통해 측정하고, 억제 백분율을 CalcuSyn 프로그램을 통해 분석하였다. 컴퓨터로 계산된 조합 지수(CI)는 조합의 결과를 판단하기 위해 사용되었다: CI>1, CI=1 및 CI<1은 각각 길항, 가산, 및 상승 효과를 나타낸다. 데이터의 중간값-효과 원리 (median-effect principle)에 대한 순응은 중간값-효과 그래프의 선형 상관관계 계수(r)에 의해 용이하게 증명될 수 있다: log (fa/fu) = m log(D)- m log(Dm), 여기서 D는 용량, Dm은 50% 효과를 위해 필요한 용량, fa는 용량에 영향을 받은 분율, fu는 영향받지 않은 분율, 그리고 m은 용량-효과 곡선에서의 시그모이드성(sigmoidicity)의 계수이다. 각 이중 조합에 대해서 비일정 비율 조합(non-constant ratio combination)이 사용되었다. 각 실험은 3회 반복하고, 각 단독 약물 및 세 개의 조합에 대해 최소 3개의 데이터 포인트를 수행하였다.
아플리딘과 덱사메타손의 조합
3일에, 0.5nM 아플리딘/1nM 및 10nM 덱사메타손 조합(도 56)에 대하여 상승작용이 관찰되었다.
도 57에 도시된 바와 같이, 상기 조합은 6일에서 더 상승적이었다.
아플리딘과 멜팔란의 조합
상기 조합은 3일 및 6일에 가산성에 가까운 효과를 보였다(각각 도 58과 59).
아플리딘과 독소루비신의 조합
3일에, 한 조합만 적절히 상승적(도 60, 조합 1)이었고, 두 조합은 가산적이었다(도 60, 조합 3과 4).
6일에서, 두 조합만 가산적이었다 (도 61, 조합 7과 8).
아플리딘과 레날리도마이드(레블리미드®)의 조합
본 실험에서는, 아플리딘과 레날리도마이드(레블리미드®)의 조합이 조사된 다른 모든 조합보다 더 큰 폭의 상승효과를 보였다(도 62).
놀랍게도, 상기 상승효과는 6일째에 더 중요하였다(도 63).
아플리딘과 보르테조밉의 조합
상기 조합은 3일째에 길항작용을 보였다(도 64); 6일째에서는 두 개의 조합에 대해 상승작용이 발견되었다(도 65, 조합 4와 6).
실시예 4: 흑색종 및 신장 이종이식에서 아플리딘과 다른 표준 작용제의 조합의 효과를 결정하기 위한 생체 내(in vivo) 실험.
본 실험의 목적은, 항종양 표준 작용제와 투여시, 아플리딘의 항종양 활성을 평가하기 위한 것이며, 둘 다 암컷 무흉선 마우스에 여러 유형의 종양으로 이종이식한 것에 다수회 투여 스케줄을 이용하여 투여하였다.
무흉선 누드 마우스를 4-5 주 연령으로 Harlan Sprague Dawley, Madison, Wisconsin으로부터 입수하였다. 마우스는 종양 이식 전 최소 1주일 동안 실험실에 순응시켰다. 동물들은 자유롭게 허용된 음식 및 물과 함께 정적(static) 케이지에 수용하였다. 실험 동물들은 이식 수립된 사람 종양으로부터 유래된 종양 단편 또는 in vitro 배양으로부터 직접 얻은 세포로 이식하였다. 종양은 피하로 오른쪽 옆구리에 제0일에 이식하였다.
종양 크기 측정은 4일 또는 5일부터 주 2회로 버니어 밀림자(vernier calipers)를 이용하여 기록하였다. 편장한 타원에 대한 부피를 계산하기 위한 공식을 사용하여 2차원 종양 측정값으로부터 종양 부피를 예측하였다: 종양 부피(㎣)= (길이X 넓이2)÷2. 단위 밀도를 감안하여, 부피는 중량으로 전환시켰다(즉, 1㎣= 1mg). 종양이 100±15mg의 범위의 대략의 부피에 도달했을 때, 마우스들을 치료군 및 대조군으로 랜덤으로 분류하였다. 치료를 개시하고 개개의 체중에 따라 투여하였다. 용량 범위 규명 연구를 각 종양 모델에서 수행하여 조합 연구에서 사용된 각 화합물의 적절한 용량 수준을 결정하였다.
하기 다양한 암 유형(적응증; indications)에 대한 치료 표준 작용제을 아플리딘 (APL)과 조합하여 조합 요법이 두 물질이 단일요법으로 투여되었을 때의 합한 활성과 비교하였을 때 더 증대된 항종양 활성을 제공하는지를 결정하였다.
Figure pat00006
표 5-10 은 흑색종 및 신장암 이종이식에서 아플리딘 단독으로 또는 다른 표준 치료 물질과 조합하여 치료를 개시한 후 총 종양 부피(평균±S.E.M., mg)의 동역학(kinetics)을 나타낸다.
표 5 및 도 66과 67은 MRI-H187 흑색종 종양 이종이식에서 아플리딘(Aplidin®)을 단일제로 또는 DTIC와 카르보플라틴과의 조합으로 치료 개시 후 총 종양 부피의 동역학을 나타낸다. 아플리딘은 매일 9일 연속으로 복강내 (i.p.)로 주사에 의해 투여하고, 식염수 대조군(무균 식염수)도 매일 9일 연속으로 복강내로 주사하였으며, DTIC는 매일 5일 연속으로 복강내로 주사하고 카르보플라틴은 매 4일마다 1용량을 복강내 주사로 총 4회 치료하였다.
약물 투여량/ 일 총 종양 부피±S.E.M. ( mg )
20일 24일 27일 31일 34일
식염수
대조군		 139±13 221±41 292±47 420±71 571±111
아플리딘 50 ㎍/kg 141±12 265±72 317±64 442±81 601±116
DTIC 40 mg/kg 148±14 264±60 377±98 558±152 681±187
카르보플라틴 25 mg/kg 143±13 213±32 301±50 398±76 540±99
아플리딘 + DTIC 50 ㎍/kg +40 mg/kg 145±11 257±51 311±52 476±114 632±150
아플리딘 + 카르보플라틴 50 ㎍/kg + 25 mg/kg 145±14 201±46 262±55 339±76 443±104
S.E.M = 평균의 표준 오차 (standard error of the mean)
Figure pat00007
상기 이종이식 연구로부터, 흑색종 MRI-H187 세포에서는 아플리딘과 DTIC의 조합 및 아플리딘과 카르보플라틴의 조합이 통계학적으로 유의한 항종양 강화 활성을 명확히 보이며, 카르보플라틴과의 조합의 경우에 더 두드러지는 것으로 결론지어졌다.
표 6 및 도 68 및 69는 MRI-H187 흑색종 종양 이종이식에서 아플리딘(Aplidin®)을 단일제로 또는 인터루킨-2(IL-2) 및 인터페론-α 2a(IFN-α)와의 조합으로 치료 개시 후 총 종양 부피의 동역학을 나타낸다. 아플리딘은 매일 9일 연속으로 복강내 (i.p.)로 주사에 의해 투여하고, 식염수 대조군(무균 식염수)도 매일 9일 연속으로 복강내(i.p)로 주사하였으며, IL-2는 매일 평일 5일간(월요일-금요일) 3주동안 복강내로 주사하고, INF-α는 매일 평일 5일간(월요일-금요일) 3주 동안 피하 주사(s.c)를 통해 투여하였다.
약물 투여량/ 일 총 종양 부피±S.E.M. ( mg )
21일 23일 27일 30일 34일
식염수
대조군		 116±4 172±16 289±28 367±33 562±39
아플리딘 50 ㎍/kg 114±7 156±15 262±32 353±34 573±70
IL-2 2 ㎍/마우스 113±4 171±24 314±46 420±68 647±88
INF-α 200,000 U/마우스 115±5 169±19 272±40 398±54 653±99
아플리딘+ IL-2 50 ㎍/kg + 2 ㎍/마우스 113±4 206±19 307±42 399±51 673±80
아플리딘+ INF-α 50 ㎍/kg + 200,000 U/마우스 113±7 152±12 272±32 328±48 506±56
S.E.M. = 평균의 표준 오차
표 6 (계속)
Figure pat00008
상기 이종이식 연구로부터, 흑색종 MRI-H187 세포에서 아플리딘과 IL-2 및 아플리딘과 INF-α의 조합이 가산성을 보인 것으로 결론지었다.
표 7 및 도 70과 71은 LOX-IMVI 흑색종 종양 이종이식에서 아플리딘(APL)을 단일제로 또는 DTIC와 카르보플라틴과의 조합으로 치료 개시 후 총 종양 부피의 동역학을 나타낸다. 아플리딘은 매일 9일 연속으로 복강내 (i.p.)로 주사에 의해 투여하고, 식염수 대조군(무균 식염수)도 매일 9일 연속으로 복강내로 주사하였으며, DTIC는 매일 5일 연속으로 복강내로 주사하고 카르보플라틴은 4일마다 1용량을 복강내 주사로 총 4회 치료하였다.
약물 투여량/일 총 종양 부피±S.E.M. ( mg )
6일 8일 12일 14일 19일
식염수
대조군		 107±4 292±45 1356±174 3085±346 9364±1702
아플리딘 50 ㎍/kg 107±5 288±21 863±87 2261±459 8980±1085
DTIC 30 mg/kg 105±5 208±25 699±57 950±57 2695±560
카르보플라틴 25 mg/kg 107±3 347±43 1167±117 2936±543 4598±1182
아플리딘 + DTIC 50 ㎍/kg +30 mg/kg 107±4 302±16 819±57 1174±129 3397±745
아플리딘+카르보플라틴 50 ㎍/kg +25 mg/kg 107±5 253±30 909±152 1911±374 4000±1610
상기 이종이식 연구로부터, 흑색종 LOX-IMVI 세포에서 아플리딘과 DTIC의 조합은 가산적 양상을 보이고, 아플리딘과 카르보플라틴의 조합은 상승 경향을 보이는 것으로 결론지을 수 있다.
표 8 및 도 72와 73은 LOX-IMVI 흑색종 종양 이종이식에서 아플리딘(APL)을 단일제로 또는 인터루킨-2(IL-2) 및 인터페론-α 2a(IFN-α)와의 조합으로 치료 개시 후 총 종양 부피의 동역학을 나타낸다. 아플리딘은 매일 9일 연속으로 복강내 (i.p.)로 주사에 의해 투여하고, 식염수 대조군(무균 식염수)도 매일 9일 연속으로 복강내로 주사하였으며, IL-2는 매일 평일 5일간(월요일-금요일) 3주 동안 복강내로 주사하고, INF-α는 매일 평일 5일간(월요일-금요일) 3주 동안 피하(s.c) 주사를 통해 투여하였다.
약물 투여량/ 일 총 종양 부피±S.E.M. ( mg )
6일 9일 13일 16일
식염수
대조군		 111±4 532±63 1666±152 2684±303
아플리딘 50 ㎍/kg 113±4 300±15 1258±131 2436±256
IL-2 2 ㎍/마우스 111±5 357±51 1541±247 3315±614
INF-α 200,000 U/마우스 110±4 329±39 1452±252 2188±465
아플리딘 + IL-2 50 ㎍/kg + 2 ㎍/마우스 111±3 358±50 1485±274 3097±826
아플리딘 + INF-α 50 ㎍/kg + 200,000 U/마우스 112±4 260±18 1152±110 2607±472
S.E.M = 평균의 표준 오차
상기 이종이식 연구로부터, 흑색종 LOX-IMVI 세포에서 아플리딘과 IL-2 및 아플리딘과 INF-α의 조합은 가산성을 보인 것으로 결론지었다.
표 9와 도 74, 75, 및 76은 CaKi-1 신장 종양 이종이식에서 아플리딘(APL)을 단일제로 또는 베바시주맙(아바스틴®), 인터루킨-2(IL-2) 및 인터페론-α 2a(IFN-α)와의 조합으로 치료 개시 후 총 종양 부피의 동역학을 나타낸다. 아플리딘은 매일 9일 연속으로 복강내 (i.p.)로 주사에 의해 투여하고, 식염수 대조군(무균 식염수)도 매일 9일 연속으로 복강내로 주사하였으며, 베바시주맙(아바스틴®)은 복강내로 주사로 3일마다 총 4회 치료하고, IL-2는 매일 평일 5일간(월요일-금요일) 3주 동안 복강내로 주사하고, INF-α도 매일 평일 5일간(월요일-금요일) 3주 동안 피하(s.c) 주사를 통해 투여하였다.
약물 투여량/ 일 총 종양 부피±S.E.M. ( mg )
13일 15일 19일 22일 26일
식염수
대조군		 105±3 157±11 226±18 305±29 500±69
아플리딘 50 ㎍/kg 103±3 164±12 208±12 282±26 406±46
아바스틴® 5.0 mg/kg 105±3 162±14 286±49 398±53 632±79
IL-2 2 ㎍/ 마우스 103±3 143±15 224±21 324±25 484±49
INF-α 200,000 U/마우스 105±3 162±14 239±28 312±43 496±60
아플리딘+ 아바스틴® 50 ㎍/kg + 5.0 mg/kg 106±3 169±15 238±21 283±25 383±48
아플리딘 + IL-2 50 ㎍/kg + 2 ㎍/마우스 105±3 147±21 175±16 208±34 320±57
아플리딘+ INF-α 50 ㎍/kg + 200,000 U/마우스 105±4 141±12 213±27 267±29 391±39
S.E.M = 평균의 표준 오차
표 9 (계속)
Figure pat00009
상기 이종이식 연구로부터, 신장 CaKi-1 세포에서 아플리딘과 아바스틴® 및 아플리딘과 IL-2의 조합이 상승효과를 보이며, IL-2과의 조합의 경우에서 더 두드러진다. 한편, 아플리딘과 INF-α의 조합은 가산적 양상을 보인다.
표 10과 도 77, 78 및 79는 MRI-H121 신장 종양 이종이식에서 아플리딘(APL)을 단일제로 또는 베바시주맙(아바스틴®), 인터루킨-2(IL-2) 및 인터페론-α 2a(IFN-α)와의 조합으로 치료 개시 후 총 종양 부피의 동역학을 나타낸다. 아플리딘은 매일 9일 연속으로 복강내 (i.p.)로 주사에 의해 투여하고, 식염수 대조군(무균 식염수)도 매일 9일 연속으로 복강내로 주사하였으며, 베바시주맙(아바스틴®)은 복강내로 주사로 매 3일 총 4회 치료하고, IL-2는 매일 평일 5일간(월요일-금요일) 3주 동안 복강내로 주사하고, INF-α도 매일 평일 5일간(월요일-금요일) 3주 동안 피하(s.c) 주사를 통해 투여하였다.
약물 투여량/일 총 종양 부피±S.E.M. ( mg )
11일 14일 18일 19일 21일
식염수 대조군 112± 6 180± 15 253± 27 266± 33 384± 52
아플리딘 25㎍/kg 108± 6 182± 15 357± 44 345± 42 467± 68
아바스틴® 2.5 mg/kg 106± 7 171± 16 306± 27 299± 39 365± 39
IL-2 1/마우스 108± 5 201± 29 402± 60 366± 56 475± 87
INF-α 200,000 U/마우스 110± 6 166± 15 331± 32 341± 32 371± 37
아플리딘+ 아바스틴® 25㎍/kg + 2.5 mg/kg 106± 7 140± 20 247± 39 241± 30 295± 39
아플리딘 + IL-2 25㎍/kg + 1㎍/마우스 109± 5 149± 16 286± 33 336± 51 381± 79
아플리딘 + INF-α 25㎍/kg + 200,000 U/마우스 111± 7 152± 23 254± 45 301± 42 343± 52
S.E.M = 평균의 표준 오차
표 10 (계속)
Figure pat00010
상기 이종이식 연구로부터, 신장 MRI-H121 세포에서 상기 세 조합은 가산적 양상을 보이는 것으로 결론지어졌다.
실시예 5. 아플리딘과 두 표준 치료용 화학요법제 (보르테조밉과 멜팔란)의 조합의 효과를 결정하기 위해 다발 골수종 (RPMI-8226과 U266B1) 세포주에서 추가적인 in vitro 분석을 수행하였다.
단독의 또는 보르테조밉 또는 멜팔란과 조합된 아플리딘은 다발골수종 세포주, 특히 RPMI-8226과 U266B1 세포주에 대해 평가하였다.
상기 세포주들은 RPMI1640 배지에서 10% FBS와 1% L-글루타민과 함께 배양하였다. 각 세포주를 96-웰 플레이트에 웰 당 20,000개 세포로 평판하였다.
먼저 아플리딘, 보르테조밉 및 멜팔란을 독립적으로 시험하여 개별적인 IC50 값을 결정하였다. IC50 값을 결정하기 위해서 각 약물은 다양한 범위의 약물 농도에서 실시예 1에 기재된 절차에 따라 검사하였다. 표 11은 두 다발골수종 세포주에 대해 세 약물 각각으로부터 얻은 개별적인 IC50 값을 나타낸다.
　 IC 50 ( 몰농도 )
　 RPMI8226 U2661
아플리딘 2.93E-08 1.39E-09
보르테조밉 2.29E-09 1.66E-05
멜팔란 1.61E-05 3.16E-09
다음 단계에서, 보르테조밉 또는 멜팔란을 아플리딘과 조합하였다. 이 실험에서, 아플리딘의 농도는 1:10 계대 희석하여 사용하였다. 각 계대 희석물은 4개의 서로 다른 농도의 보르테조밉 또는 멜팔란과 쌍을 이루었다.
플레이트를 3일간 37℃ 및 5% CO2에서 배양하였다. 상기 플레이트를 MTS가 살아있는 세포에 의해 대사되어 490nm 파장에서 형광을 내는 포르마잔(formazan)으로 전환되는 Promega MTS 분석 시스템을 이용하여 판독하였다. 이는 세포 생존력의 간접적 척도이다. 이들은 대조군 웰의 백분율을 기준으로 세포 생존력을 결정하는 Softmax Pro 프로그램을 이용하여 분석되었다. 그런 다음 이 IC50 데이터를 CalcuSyn 프로그램으로 이동시켜 조합 지수 분석을 하였다. CalcuSyn은 알고리즘을 이용하여 각각의 단독 약물과 조합된 약물의 IC50 값을 비교하여, 조합 지수를 결정한다. 숙지해야 할 점은, 조합 지수(Combination Index: CI)는 두 약물의 조합 효과를 반영한 것이다: CI=1은 가산 효과를 표시하고; CI<1은 상승 효과를 표시하며; CI>1은 길항 효과를 표시한다.
표 12는 아플리딘과 보르테조밉의 조합에서 RPMI8226 세포주에 대해 상승효과가 관찰된 용량을 요약한 것이다.
아플리딘 농도 보르테조밉 농도 CI
0.2㎍/ml 1.0ng/ml 0.402
3.5ng/ml 0.911
6.0ng/ml 0.013
8.5ng/ml 0.014
2㎍/ml 1.0ng/ml 0.103
3.5ng/ml 0.104
6.0ng/ml 0.106
8.5ng/ml 0.107
표 13은 아플리딘과 멜팔란의 조합에서 RPMI8226 세포주에 대해 상승 효과가 관찰된 용량을 요약한 것이다:
아플리딘 농도 멜팔란 농도 CI
0.2㎍/ml 50ng/ml 0.01
30ng/ml 0.01
10ng/ml 0.01
8ng/ml 0.01
2㎍/ml 50ng/ml 0.103
30ng/ml 0.103
10ng/ml 0.103
8ng/ml 0.103
표 14는 아플리딘과 보르테조밉의 조합에서 U266B1 세포주에 대해 상승 효과가 관찰된 용량을 요약한 것이다:
아플리딘 농도 멜팔란 농도 CI
0.2pg/ml 3.5ng/ml 0.602
8.5ng/ml 0.919
20pg/ml 6.0ng/ml 0.758
0.2ng/ml 6.0ng/ml 0.852
2ng/ml 3.5ng/ml 0.588
6.0ng/ml 0.776
8.5ng/ml 0.553
20ng/ml 3.5ng/ml 0.892
8.5ng/ml 0.79
0.2㎍/ml 1.0ng/ml 0.317
3.5ng/ml 0.193
6.0ng/ml 0.251
8.5ng/ml 0.112
표 15는 아플리딘과 멜팔란의 조합에서 U266B1 세포주에 대해 상승 효과가 관찰된 용량을 요약한 것이다:
아플리딘 농도 보르테조밉 농도 CI
0.2pg/ml 30ng/ml 0.922
10ng/ml 0.064
8ng/ml 0.047
2.0pg/ml 50ng/ml 0.525
30ng/ml 0.709
10ng/ml 0.164
8ng/ml 0.127
20pg/ml 50ng/ml 0.793
10ng/ml 0.467
8ng/ml 0.845
0.2ng/ml 10ng/ml 0.472
8ng/ml 0.974
2ng/ml 50ng/ml 0.744
30ng/ml 0.504
10ng/ml 0.498
8ng/ml 0.438
20ng/ml 50ng/ml 0.888
30ng/ml 0.688
10ng/ml 0.573
8ng/ml 0.573
0.2㎍/ml 50ng/ml 0.249
30ng/ml 0.109
10ng/ml 0.145
8ng/ml 0.108
실시예 6. 이다루비신과 같은 표준 치료용 화학요법제와 조합된 아플리딘의 효과를 결정하기 위해 백혈병 (MOLT4 및 K-562) 세포주에서 추가적인 in vitro 분석을 수행하였다.
단독의 또는 이다루비신과 조합된 아플리딘을 백혈병 세포주, 특히 MOLT4와 K562 세포주에 대해 평가하였다.
상기 세포주들은 RPMI1640 배지에서 10% FBS와 2mM L-글루타민과 함께 배양하였다. 각 세포주를 96-웰 플레이트에 웰 당 20,000개 세포로 평판하였다.
먼저 아플리딘과 이다루비신을 독립적으로 시험하여 개별적인 IC50 값을 결정하였다. IC50 값을 결정하기 위해서 각 약물은 다양한 범위의 약물 농도에서 실시예 1에 기재된 절차에 따라 검사하였다. 표 16은 두 백혈병 세포주에 대해 두 약물 각각으로부터 얻은 개별적인 IC50 값을 나타낸다.
　 IC 50 ( 몰농도 )
　 MOLT4 K562
아플리딘 1.43E-08 2.35E-09
이다루비신 5.0E-11 6.33E-08
다음 단계에서 이다루비신을 아플리딘과 조합하였다. MOLT4 세포주에 관련된 실험에서는, 아플리딘의 농도를 1:10 계대 희석하여 사용하였다. 각 계대 희석은 4개의 서로 다른 농도의 이다루비신과 쌍을 이루었다. K562 세포주와 관련된 실험에서는, 아플리딘의 농도를 1:5 계대 희석하여 사용하고, 이다루비신 농도가 비율을 기준으로 결정된 각 조합에 추가되었다. 따라서, 조합 A는 1:1, 조합 B는 0.008:1, 조합 C는 6.4E-05:1 그리고 조합 D는 5.12E-07:1이었다.
플레이트를 3일간 37℃ 및 5% CO2에서 배양하였다. 상기 플레이트를 MTS가 살아있는 세포에 의해 대사되어 490nm 파장에서 형광을 발하는 포르마잔(formazan)으로 전환되는 Promega MTS 분석 시스템을 이용하여 판독하였다. 이는 세포 생존력의 간접적 척도이다. 이들은 대조군 웰의 비율을 기준으로 세포 생존력을 결정하는 Softmax Pro 프로그램을 이용하여 분석되었다. 그런 다음 이 IC50 데이터를 CalcuSyn 프로그램으로 이동시켜 조합 지수 분석을 하였다. CalcuSyn은 알고리즘을 이용하여 각각의 단독 약물과 조합된 약물의 IC50 값을 비교하여, 조합 지수를 결정한다. 조합 지수(Combination Index: CI)는 두 약물의 조합 효과를 반영한 것이라는 것을 인식하는 것이 중요하다: CI=1은 가산 효과를 표시하고; CI<1은 상승 효과를 표시하며; CI>1은 길항 효과를 표시한다.
표 17은 MOLT4 세포주에 대해 아플리딘과 이다루비신의 조합에서 상승 효과가 관찰된 용량을 요약한다:
아플리딘 농도 이다루비신 농도 CI
0.2㎍/ml 3.0ng/ml 0.28
0.7ng/ml 0.052
8.0pg/ml 0.053
2㎍/ml 3.0ng/ml 0.669
0.7ng/ml 0.269
8.0pg/ml 0.337
표 18은 K562 세포주에 대해 아플리딘과 이다루비신의 조합에서 상승효과가 관찰된 용량을 요약한다:
아플리딘 농도 이다루비신 농도 CI
조합 1:1 비율
6.4ng/ml 6.4ng/ml 0.054
32ng/ml 32ng/ml 0.051
160ng/ml 160ng/ml 0.003
0.8㎍/ml 0.8㎍/ml 0.014
4㎍/ml 4㎍/ml 0.222
조합 0.008:1 비율
256pg/ml 32ng/ml 0.687
1.28ng/ml 160ng/ml 0.025
6.4ng/ml 0.8㎍/ml 0.026
32ng/ml 4㎍/ml 0.209
조합 6.4E-05:1 비율
10.2pg/ml 160ng/ml 0.194
51.2pg/ml 0.8㎍/ml 0.677
256pg/ml 4㎍/ml 0.459
조합 5.12E-07:1 비율
81.9fg/ml 160ng/ml 0.091
0.41pg/ml 0.8㎍/ml 0.365
2.05pg/ml 4㎍/ml 0.459
실시예 7: 흑색종 이종이식에서 다른 표준 작용제와 조합된 아플리딘의 효과를 결정하기 위한 생체 내(in vivo) 연구.
본 연구의 목적은 암컷 무흉샘 NCr-nu/nu 마우스에게 피하로 이식된 UACC-257 사람 흑색종 세포에 대한, 카르보플라틴과 조합되어 투여되었을 때의 아플리딘의 항종양 효능을 평가하기 위한 것이었다.
동물들을 미세분리기(microisolator) 케이지에 최고 케이지 당 5마리로 12시간 명/암 사이클에서 수용하였다. 6주령 암컷, 무흉샘 NCr-nu / nu 마우스를 실험 전 일주일간 실험실에 순응시켰다.
각 마우스는 in vitro 세포 배양한 UACC-257 사람 흑색종 세포로 우측 옆구리 근처에 23-게이지(gauge) 주사바늘로 피하로 접종되었다. 각 마우스에게 0.2ml의 Matrigel®에 재현탁된 2 X107 개의 세포를 접종하였다. UACC-257 사람 흑색종 냉동 세포가 담긴 바이알(vial)을 해동시키고 저량의 글루코스 (2,000mg/L) 이탄산 나트륨 (1,500 mg/ml), 2mM L-글루타민, 및 10% 우태아 혈청을 함유하는 RPMI 1640 배지 (완전 배지)에 배양하고, +37℃의 습화된 분위기와 5% CO2의 배양기에서 마우스에 접종하기 위해 필요한 세포 수가 수득될 때까지 증식시켰다. 세포들은 4회 계대 배양 후 수확하였다. 세포를 플라스크로부터 꺼내어 50ml 원심분리 튜브에 담고 냉장 원심분리기에서 1,000rpm으로 10분간 원심분리하였다. 세포 펠렛을 새로운 완전 배지에 재현탁시켰다. 세포 수 및 생존력은 Beckman Coulter VI CELL XR 세포계수기 및 생존력 분석기로 결정하였다. 세포 현탁액을 원심분리하고, 세포 펠렛을 Matrigel®로 1.0 x 108 세포/ml로 재현탁시킨 다음 습윤 얼음 위에 두었다. 세포 현탁액 내의 Matrigel®의 최종 농도는 56.9%였다. 세포 수확일에서의 세포 생존력은 98.9%였다.
종양 세포 접종일을 제0일로 지정하였다. 개개의 종양은 치료 개시일인 종양세포 접종 후 제15일에 150-245 mg의 중량(150-245㎣의 크기)까지 성장하였다. 적절한 크기 범위의 종양을 투여받은 40마리의 동물을 4 개의 치료군으로 지정하여, 치료 제1일에의 종양 중량의 중간값들이 가능한 한 서로 근접하도록 하였다.
실험은 치료 제1일인 종양세포 접종 후 제13일에 총 40마리의 마우스에 대해 10마리의 비히클(vehicle)로 치료된 대조군과, 군당 10마리의 세 약물치료 군으로 이루어졌다. 제1군의 동물들은 복강내로 매일 9일 연속으로 (제13-21일) 식염수로 희석된 아플리딘의 비히클로 치료하였다. 아플리딘은 매일 복강내로 9일동안 (제13-21일) 60㎍/kg/용량의 투여량으로 단독으로(제2군) 또는 카르보플라틴과 조합하여(제4군) 투여하였다. 카르보플라틴은 정맥내(i.v.)로 매 4일 총 3회의 치료(제13, 17, 및 21일)로 50mg/kg/용량으로 단독으로(제3군) 또는 아플리딘과 조합하여 (제4군) 투여하였다. 제4군에서 두 화합물 모두가 투여되는 날에는, 아플리딘을 군의 10마리 모두에 먼저 주입한 후, 곧바로 카르보플라틴을 투여하였다(제4군).
제1군을 0.18% 크레모포 EL(cremophor EL)/0.18% 에탄올/0.84% WFI(주사용 증류수)/98.8% 식염수(주사 부피: 0.1ml/10g 체중)로 복강내로 치료하였다. 아플리딘을 15% 크레모포 EL/15% 에탄올/70% WFI를 함유하는 비히클로 재구성하고, 식염수로 희석하였다 (주사 부피: 0.1ml/10g 체중). 카르보플라틴은 WFI에서 조제하였다(주사 부피: 0.1ml/10g 체중).
동물들을 매일 관찰하고 임상적 징후를 기록하였다. 피하주사된 종양을 측정하고, 동물들의 체중을 치료 첫날인 제13일부터 시작하여 주 2회 측정하였다. 종양 부피는 밀림자 측정(mm)을 통해 타원형 구에 대한 공식을 이용하여 결정하였다:
L x W2/2=mm3,
상기 식 중, L과 W는 각 측정에서 수집된 길고 짧은 수직의 치수를 의미한다. 상기 공식은 단위 밀도를(1㎣=1mg) 감안하여 종양의 중량을 계산하는 데에도 사용되었다.
제23일(치료 종료 2일 후)에 그리고 제70일(연구 종료일)에 대조군의 종양 중량에 대한 치료군의 종양 중량의 중간값(T)의 비교(T/C x 100%)를 통해 항종양 효능을 평가하였다. 각 치료의 %T/C를 표 19에 보고한다.
군 번호 물질 투여량 및 단위 경로 스케줄 해당일의 % T/C
23 70
1 비히클 0 ㎍/kg/용량 IP 1일1회 x 9
2 아플리딘 60 ㎍/kg/용량 IP 1일1회 x 9 90 91
3 카르보플라틴 50 mg/kg/용량 IV 4일1회 x 3 95 60
4 아플리딘/카르보플라틴 60 ㎍/kg/용량/
50 mg/kg/용량		 IP
IV		 1일1회 x 9
4일1회 x 3		 95 53
스케줄 비히클:1일1회 x 9 제13일
스케줄 아플리딘: 1일1회 x 9 제13일
스케줄 카르보플라틴: 4일1회 x 3 제13일
스케줄 아플리딘/카르보플라틴: 1일1회 x 9 제13일/ 4일1회 x 3 제13일
아플리딘과 카르보플라틴의 조합 치료는 사망 없이 허용 되었다. 상기 조합 치료는 제23일 및 제70일에 각각 95% 및 53%의 T/C값을 얻었다.
실시예 8: 골수종 이종이식에서 다른 표준 작용제와 조합된 아플리딘의 효과를 결정하기 위한 생체 내(in vivo) 연구.
본 연구의 목적은 수컷 SCID 마우스에 피하 이식된 RPMI 8226 사람 골수종 세포에 대한 보르테조밉과 조합하여 투여되었을 때의 아플리딘의 항종양 효능을 평가하기 위한 것이다.
동물들은 미세분리기 케이지에 케이지당 최고 5마리까지 12시간의 명/암 사이클로 수용되었다. 6주령 수컷 SCID 마우스를 실험실에서 실험 전 일주일동안 순응시켰다.
각 마우스에 우측 옆구리 근처에 in vitro 세포 배양된 RPMI 8226 사람 골수종 세포를 23-게이지 주사바늘을 이용하여 피하로 접종하였다. 각 마우스에게 0.2ml의 Matrigel®에 재현탁된 2 X107 개의 세포를 접종하였다. RPMI 8226 사람 골수종 세포는 최초에 ATCC(ATCC 번호: CCL-155)에서 구매하였다. 냉동된 세포가 담긴 바이알을 해동시키고 고량의 글루코스 (4,500mg/L) 이탄산 나트륨 (1,500 mg/ml), 2mM L-글루타민, 10mM Hepes, 1mM 피루브산 나트륨, 및 10% 우태아 혈청을 함유하는 RPMI 1640 배지 (완전 배지)에 배양하고, +37℃의 습화된 분위기와 5% CO2의 배양기에서 마우스에 접종하기 위해 필요한 세포 수가 얻어질 때까지 증식시켰다. 세포들은 4회 계대 배양 후 수확하였다. 세포를 플라스크로부터 꺼내어 50ml 원심분리 튜브에 담고 냉장 원심분리기에서 1,000rpm으로 10분간 원심분리하였다. 세포 펠렛을 새로운 완전 배지에 재현탁시켰다. 세포 수 및 생존력은 Beckman Coulter VI CELL XR 세포계수기 및 생존력 분석기로 결정하였다. 세포 현탁액을 재원심분리하고, 세포 펠렛을 Matrigel® 로 1.0 x 108 세포/ml로 재현탁시킨 다음 습윤 얼음 위에 두었다. 세포 현탁액 내의 Matrigel®의 최종 농도는 78.3%였다. 세포 수확일에서의 세포 생존력은 89.3%였다.
종양 세포 접종일을 제0일로 지정하였다. 개개의 종양은 치료 개시일인 종양세포 접종 후 제18일에 75-188 mg의 중량(75-188㎣의 크기)에까지 성장하였다. 적절한 크기 범위의 종양을 투여받은 동물들을 4 개의 치료군으로 지정하여, 치료 제1일에의 종양 중량의 중간값들이 가능한 한 서로 근접하도록 하였다.
실험은 치료 제1일인 종양세포 접종 후 제18일에 총 40마리의 마우스에 대해 10마리의 비히클(vehicle) 치료된 대조군과, 군당 10마리의 세 약물치료 군으로 이루어졌다. 제1군의 동물들은 복강내로 매일 9일 연속으로 2회 (제18-26일 및 제38-46일) 식염수로 희석된 아플리딘의 비히클로 치료하였다. 아플리딘은 매일 복강내로 9일동안 2회 (제18-26일 및 제38-46일) 60㎍/kg/용량의 투여량으로 단독으로(제2군) 또는 보르테조밉과 조합하여(제4군) 투여하였다. 보르테조밉은 제18일부터 시작하여 정맥내(i.v.)로 0.35mg/kg/용량의 투여량으로 3일마다 4주 동안 총 2회의 치료 후 제46일에 1회 더 정맥 주사를 단독으로(제3군) 또는 아플리딘과 조합하여 (제4군) 투여하였다. 제4군에서 두 화합물 모두 투여되는 날은, 아플리딘을 군의 10마리 모두에 먼저 주입한 후, 곧바로 보르테조밉을 투여하였다(제4군).
제1군을 0.18% 크레모포 EL/0.18% 에탄올/0.84% WFI/98.8% 식염수(주사 부피: 0.1ml/10g 체중)로 복강내로 치료하였다. 아플리딘을 15% 크레모포 EL/15% 에탄올/70% WFI를 함유하는 비히클로 재구성하고, 식염수로 희석하였다 (주사 부피: 0.1ml/10g 체중). Velcade®(보르테조밉)을 WFI에서 조제하였다(주사 부피: 0.1ml/10g 체중).
동물들을 매일 관찰하고 임상적 징후를 기록하였다. 피하 종양을 측정하고, 동물들의 체중을 치료 첫날인 종양세포 접종 후 제18일부터 시작하여 주 2회 측정하였다. 종양 부피는 밀림자 측정(mm)을 통해 실시예 7에 기술한 바에 따라 타원형 구에 대한 공식을 이용하여 결정하였다.
제27일(제1회의 아플리딘 치료의 종료 1일 후) 및 제48일(아플리딘과 보르테조밉으로의 치료 종료 2일 후)에서 대조군의 종양 중량의 중간값에 대한 치료군의 종양 중량의 중간값(T)의 비교(T/C x 100%)를 통해 항종양 효능을 평가하였다. 각 치료의 %T/C가 표 20에 보고한다.
군 번호 작용제 투여량 & 단위 경로 해당일의 % T/C
27 48
1 비히클 0 ㎍/kg/용량 IP
2 아플리딘 60 ㎍/kg/용량 IP 76 63
3 보르테조밉 0.35 mg/kg/용량 IV 70 67
4 아플리딘/
보르테조밉		 60 ㎍/kg/용량/
0.35 mg/kg/용량		 IP
IV		 49 31
스케줄 비히클: 1일1회 x 9 제18,38일
스케줄 아플리딘: 1일1회 x 9 제18,38일
스케줄 보르테조밉: 3일1회 x 2 제18,25, 32, 39일; 1일1회 x 1 제46일
스케줄 아플리딘/보르테조밉: 1일1회 x 9 제18,38일; 3일1회 x 2 제18,25,32,39일; 1일1회 x 1 제46일
아플리딘과 보르테조밉의 조합 치료는 사망 없이 허용되었다. 상기 조합 치료는 RPMI 8226 골수세포의 성장의 억제에 있어서 효과적이었고, 제27, 48일에 각각 49%와 31%의 T/C 값을 얻었다. 상기 조합 치료의 항종양 활성은 각 화합물을 단독으로 투여하여 발생된 항종양 활성과 비교하여 가산성보다 더 높았다.
실시예 9: 림프종 이종이식에서 다른 표준 작용제와 조합된 아플리딘의 효과를 결정하기 위한 생체 내(in vivo) 연구.
본 연구의 목적은 암컷 SCID 마우스에 피하 이식된 RL 사람 림프종 세포에 대한 리툭시맙과 조합하여 투여되었을 때의 아플리딘의 항종양 효능을 평가하기 위한 것이다.
동물들은 미세분리기 케이지에 케이지당 최고 5마리까지 12시간의 명/암 사이클로 수용되었다. 6주령 수컷 SCID 마우스를 실험실에서 실험 전 일주일동안 순응시켰다.
각 마우스에 우측 옆구리 근처에 in vitro 세포 배양된 RL 사람 림프종 세포를 23-게이지 주사바늘을 이용하여 피하로 접종하였다. 각 마우스에게 0.2ml의 Matrigel®에 재현탁된 1 X107 개의 세포를 접종하였다. 냉동된 세포가 담긴 바이알을 해동시키고 고량의 글루코스 (4,500mg/L), 이탄산 나트륨 (1,500 mg/ml), 2mM L-글루타민, 10mM Hepes, 1mM 피루브산 나트륨, 및 10% 우태아 혈청을 함유하는 RPMI 1640 배지 (완전 배지)에 배양하고, +37℃와 5% CO2의 습화된 분위기의 배양기에서 마우스에 접종하기 위해 필요한 세포 수가 얻어질 때까지 증식시켰다. 세포들은 6회 계대 배양 후 수확하였다. 세포를 플라스크로부터 꺼내어 50ml 원심분리 튜브에 담고 냉장 원심분리기에서 1,000rpm으로 10분간 원심분리하였다. 세포 펠렛을 새로운 완전 배지에 재현탁시켰다. 세포 수는 Coulter 모델 Z1 세포계수기로 결정하고 생존력은 프로피듐 요오드화물로 염색 후 Beckman Coulter EPICS XL 유세포분석기로 분석함으로써 측정하였다. 세포 현탁액을 재원심분리하고, 세포 펠렛을 Matrigel®로 5.0 x 107 세포/ml로 재현탁시킨 다음 습윤 얼음 위에 두었다. 세포 현탁액 내의 Matrigel®의 최종 농도는 73.0%였다. 세포 수확일에서의 세포 생존력은 98.9% 였다.
종양 세포 접종일을 제0일로 지정하였다. 개개의 종양은 치료 개시일인 종양세포 접종 후 제15일에 100-196 mg의 중량(100-196㎣의 크기)에까지 성장하였다. 적절한 크기 범위의 종양을 가진 40마리의 동물들을 4 개의 치료군으로 지정하여, 치료 제1일에의 종양 중량의 중간값들이 가능한 한 서로 근접하도록 하였다.
실험은 치료 제1일인 종양세포 접종 후 제15일에 총 40마리의 마우스에 대해 10마리의 비히클(vehicle) 치료된 대조군과, 군당 10마리의 세 약물치료 군으로 이루어졌다. 제1군의 동물들은 복강내로 매일 9일 연속으로 2회 (제15-23일 및 제28-36일) 식염수로 희석된 아플리딘의 비히클로 치료하였다. 아플리딘은 매일 복강내로 9일동안 2회 (제15-23일 및 제28-36일) 60㎍/kg/용량의 투여량으로 단독으로(제2군) 또는 리툭시맙과 조합하여(제4군) 투여하였다. 리툭시맙은 제15일부터 시작하여 복강내로 20mg/kg/용량의 투여량으로 3일마다 4주 주기의 총 2회 치료(3일1회 x 2 스케줄)를 단독으로(제3군) 또는 아플리딘과 조합하여 (제4군) 투여하였다. 제4군에서 두 화합물 모두 투여되는 날은, 아플리딘을 군의 10마리 모두에 먼저 주입한 후, 곧바로 리툭시맙을 투여하였다(제4군).
제1군을 0.18% 크레모포 EL/0.18% 에탄올/0.84% WFI/98.8% 식염수(주사 부피: 0.1ml/10g 체중)로 복강내로 치료하였다. 아플리딘을 15% 크레모포 EL/15% 에탄올/70% WFI를 함유하는 비히클로 재구성하고, 식염수로 희석하였다 (주사 부피: 0.1ml/10g 체중). 리툭산®(리툭시맙)을 WFI에서 조제하였다(주사 부피: 0.1ml/10g 체중).
동물들을 매일 관찰하고 임상적 징후를 기록하였다. 피하 종양을 측정하고, 동물들의 체중을 치료 첫날인 종양세포 접종 후 제15일부터 시작하여 주 2회 측정하였다. 종양 부피는 밀림자 측정(mm)을 통해 실시예 7에 기술한 바에 따라 타원형 구에 대한 공식을 이용하여 결정하였다.
제24일(아플리딘 치료의 첫번째 9일 주기의 종료 1일 후) 및 제38일(아플리딘 치료의 두번째 9일 주기의 종료 2일 후)에 대조군의 종양 중량의 중간값에 대한 치료군의 종양 중량의 중간값(T)의 비교 (T/C x 100%)를 통해 항종양 효능을 평가하였다. 각 치료의 %T/C를 표 21에 보고한다.
군 번호 작용제 투여량 & 단위 경로 해당일 % T/C
24 38
1 비히클 0 ㎍/kg/용량 IP
2 아플리딘 60 ㎍/kg/용량 IP 84 84
3 리툭시맙 20 mg/kg/용량 IP 95 102
4 아플리딘/
리툭시맙		 60 ㎍/kg/용량/
20 mg/kg/용량		 IP
IP		 69 74
스케줄 비히클: 1일1회 x 9 제15, 28일
스케줄 아플리딘: 1일1회 x 9 제15, 28일
스케줄 리툭시맙: 3일1회 x 2 제15, 22, 29, 36일
스케줄 아플리딘/리툭시맙: 1일1회 x 9 제15, 28일; 3일1회 x 2 제15, 22, 29, 36일
아플리딘과 리툭시맙의 조합 치료는 사망 없이 허용되었다. 상기 조합 치료는 RL 림프종 세포의 성장의 억제에 있어서 효과적이었고, 제24일, 제38일에 각각 69%와 74%의 T/C 값을 얻었다. 따라서, 아플리딘을 리툭시맙과 조합하면 항종양 활성이 강화되는 것을 관찰하였다.
실시예 10: 다발 골수종 종양 세포주에서 다른 표준 작용제(삼중 조합)와 조합된 아플리딘의 효과를 결정하기 위한 in vivo 연구.
본 연구에서는 항종양제의 삼중 조합이 분석되었다. 모든 조합은 매우 민감한 MM 세포주인 MM.1S 세포주에서의 세포 생존력 분석(MMT)를 이용하여 시험하였다. 결과는 Calcusyn 소프트웨어를 이용하여 분석하였다.
세포주 및 세포 배양 시약
텍사메타손-민감형 MM 세포주인 MM.1S는 S. Rudikoff 박사 (베데스다, 메릴랜드)에 의해 기꺼이 제공되었다. 상기 세포주는 10% 가열불활성화된 우태아 혈청, 100U/ml 페니실린 100㎍/ml 스트렙토마이신 및 2mM L-글루타민으로 보충된 RPMI 1640 배지에서 배양하였다. 모든 세포 배양 배지 및 시약은 인비트로겐 주식회사 (Carlsbad CA)로부터 구매하였다.
세포 생존력 분석
MM 세포 증식의 분석은 메틸티오테트라졸 (MTT; 시그마, 세인트루이스, 미주리) 비색 검사(colorimetric assay)를 이용하여 평가하였다. MM 세포주는 웰 당 50000 세포/200㎕ 배지의 밀도로 48-웰 플레이트에 분주하고, 소정의 약물 투여량 및 시간으로 처리되었다. 처리 종료 2시간 전에, MTT 용액 (PBS 중의 5mg/ml; 보통 각 웰의 부피의 10%)을 첨가하고 테트라졸륨염을 대사적 활성 세포에 의해 유색의 포르마잔 결정으로 환원시켰다. 이들 결정을 10% SDS-HCl 용액과 밤새 인큐베이션을 통해 용해한 후, 570nM에서 630nM로 보정하여 흡광도를 측정하였다. 각 조건당 4개의 웰을 분석하고, 그 결과를 3회 이상 반복된 대표 실험의 4배중복의 평균±표준편차로서 나타내었다.
이소볼로그램 ( isobologram ) 분석
아플리딘과 다른 항-MM 작용제의 상호작용은 Calcusyn 소프트웨어 프로그램 (Biosoft, Ferguson, MO)을 이용하여 분석하였다. 세포 생존력 분석 (MTT)으로부터의 데이터를 미처리된 세포(대조군)과 비교하여 약물처리된 세포에서 용량(Fa)에 의해 영향을 받은 세포의 분율(fraction)로 표현하였다. 이 프로그램은 Chou-Talalay 방법 (Chou TC 등 Adv. Enzyme Regul. (1984) 22:27-55)에 기반하여 수학식 CI = (D)1/(Dx)1 + (D)1(D)2/(Dx)1(Dx)2에 따른 것이고, 여기서 (D)1과 (D)2는 독립적으로 사용되었을 때 동일한 x 효과를 갖는 약물 1과 2의 용량이다.
조합의 결과를 판단하기 위해 컴퓨터 계산된 조합 지수 (CI)가 사용되었다: CI>1, CI=1, 및 CI<1는 각각 길항, 가산, 및 상승 효과를 표시한다. 중간값-효과 원칙에 대한 데이터의 순응은 중간값-효과 그래프의 선형 상관관계 계수(r)에 의해 용이하게 증명될 수 있다: log (fa/fu) = m log(D)- m log(Dm), 여기서 D는 용량, Dm은 50% 효과를 위해 필요한 용량, fa는 용량에 영향을 받은 분율, fu는 영향받지 않은 분율, 그리고 m은 용량-효과 곡선에서의 시그모이드성의 계수이다. 각 이중 조합에 대해서 비일정 비율 조합이 사용되었다.
결과
아플리딘 + 레날리도마이드 ( 레블리미드 ®)+ 덱사메타손의 조합
아플리딘과 레날리도마이드의 조합에 덱사메타손의 첨가는 민감형 세포주 (MM1S)에서 실험된 모든 조합에서 중요한 상승효과를 보였다 (도 80). 도 80에서 아플리딘 용량은 nM의 단위로 표현되고, 레날리도마이드 용량은 μM의 단위로 표현되며, 덱사메타손 용량은 nM 단위로 표현된다.
아플리딘 + 보르테조밉 + 덱사메타손의 조합
아플리딘과 보르테조밉의 조합에 덱사메타손의 첨가는 명백한 상승 경향을 갖는 다수의 용량의 결과를 낳았다(도 81). 도 81에서 아플리딘 용량은 nM의 단위로 표현되고, 보르테조밉 용량은 nM의 단위로 표현되며, 덱사메타손 용량은 nM 단위로 표현된다.
아플리딘 + 보르테조밉 + 레날리도마이드 ( 레블리미드 ®)
아플리딘과 레날리도마이드와 같은 면역조절제와의 조합에 보르테조밉의 첨가는 항종양 효과를 명백히 상승시켰으며 MM1S에서 CI가 상승작용의 범위에 있었다 (도 82). 도 82에서 아플리딘 용량은 nM의 단위로 표현되고, 보르테조밉 용량은 nM의 단위로 표현되며, 레날리도마이드 용량은 μM의 단위로 표현된다.
아플리딘 + 탈리도마이드 + 덱사메타손의 조합
상기 조합은 도 83에서 보여지듯이 삼중 조합에서 명백한 상승효과를 나타내었다. 도 83에서 아플리딘 용량은 nM의 단위로 표현되고, 탈리도마이드 용량은 μM의 단위로 표현되며, 덱사메타손 용량은 nM 단위로 표현된다.
아플리딘 + 멜팔란 + 덱사메타손의 조합
상기 조합은 주로 고용량의 약물에서 명백한 상승작용의 범위를 보였다(도 84). 도 84에서 아플리딘 용량은 nM의 단위로 표현되고, 멜팔란 용량은 μM의 단위로 표현되며, 덱사메타손 용량은 nM 단위로 표현된다.
아플리딘 + 멜팔란 + 보르테조밉의 조합
상기 조합은 고용량을 사용할 때 CI가 상승작용의 범위인 결과를 낳았다 (도 85). 도 85에서 아플리딘 용량은 nM의 단위로 표현되고, 멜팔란 용량은 μM의 단위로 표현되며, 보르테조밉은 nM 단위로 표현된다.
아플리딘에 대한 상기 발견은 아플리딘 유사체, 유도체 및 관련 화합물에까지 연장될 수 있다. 예를 들어, 본 발명은 WO 02 02596에서와 같은 화합물의 항암제와의 조합, 바람직하게는 파클리탁셀(탁솔®), 독소루비신, 시스플라틴, 삼산화비소, 5-플루오로우라실 (5-FU), 시토신 아라비노시드 (AraC), 카르보플라틴, 7-에틸-10-히드록시캄프토테신(SN38), 에토포시드(VP16), 멜팔란, 덱사메타손, 시클로포스파미드, 보르테조밉, 에를로티닙, 트라스투주맙, 레날리도마이드(레블리미드®), 인터루킨-2(IL-2), 인터페론-α 2(INF-α), 다카바진(DTIC), 베바시주맙(아바스틴®), 이다루비신, 탈리도마이드, 및 리툭시맙과의 조합을 제공한다.
아플리딘 자체를 대신하여 사용될 수 있는 아플리딘의 유사체의 예는 WO 02 02596에 기재된 바람직한 화합물을 포함하며, 특히 WO 02 02596에 기재된 바람직한 화합물과 관련 양태를 본 명세서에 도입(import)시킨다. 더 바람직하게는, 상기 유사체들은 아플리딘과 구조적으로 근접하며, 보통 하나의 아미노산 또는 말단의 측쇄에 있어서 아플리딘과 차이가 있다. 상기 상이한 아미노산은 상기 분자의 환(cyclic) 부분 또는 측쇄에 있을 수 있다. 이러한 화합물의 많은 예들이 WO 02 02596에 기재되어 있으며, 이들은 본 발명에서의 사용 후보물질들이다.

Claims (27)

  1. 아플리딘 또는 아플리딘 유사체를 다른 약물과 함께 사용한 조합 요법에 의하여 암을 치료하기 위한 의약의 제조에 있어서의, 아플리딘 또는 아플리딘 유사체의 용도.
  2. 제1항에 있어서, 상기 다른 약물은 폐암, 유방암, 결장암, 전립선암, 신장암, 흑색종, 다발골수종, 백혈병, 및 림프종에서 선택된 암의 치료에 효과적인 것인 용도.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 아플리딘 또는 아플리딘 유사체 및 다른 약물은 동일한 조성물의 일부를 형성하는 것인 용도.
  4. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 아플리딘 또는 아플리딘 유사체 및 다른 약물은 동시에 또는 상이한 시간에 투여하기 위한 별개의 조성물로 제공되는 것인 용도.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 다른 약물은 파클리탁셀, 독소루비신, 시스플라틴, 삼산화비소, 5-플루오로우라실, 사이토신 아라비노시드, 카르보플라틴, 7-에틸-10-히드록시캄프토테신, 에토포시드, 멜팔란, 덱사메타손, 시클로포스파미드, 보르테조밉, 에를로티닙, 트라스투주맙, 레날리도마이드, 인터루킨-2, 인터페론-α 2, 다카바진, 베바시주맙, 이다루비신, 탈리도마이드, 및 리툭시맙으로 이루어진 군에서 선택되는 것인 용도.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 아플리딘 또는 아플리딘 유사체는 아플리딘인 것인 용도.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 제3의 약물이 투여되는 것을 특징으로 하는 용도.
  8. 제7항에 있어서, 상기 제2 및 제3 약물은 파클리탁셀, 독소루비신, 시스플라틴, 삼산화비소, 5-플루오로우라실, 사이토신 아라비노시드, 카르보플라틴, 7-에틸-10-히드록시캄프토테신, 에토포시드, 멜팔란, 덱사메타손, 시클로포스파미드, 보르테조밉, 에를로티닙, 트라스투주맙, 레날리도마이드, 인터루킨-2, 인터페론-α 2, 다카바진, 베바시주맙, 이다루비신, 탈리도마이드, 및 리툭시맙으로 이루어진 군에서 선택되는 것인 용도.
  9. 치료적으로 유효한 양의 아플리딘 또는 아플리딘 유사체 및 암의 치료에 효과적인 치료적으로 유효한 양의 다른 약물을 그 치료가 필요한 환자에게 투여하는 단계를 포함하는, 암을 치료하는 방법.
  10. 제9항에 있어서, 상기 치료될 암은 폐암, 유방암, 결장암, 전립선암, 신장암, 흑색종, 다발골수종, 백혈병, 및 림프종에서 선택된 암인 것인 방법.
  11. 제9항 또는 제10항에 있어서, 상기 다른 약물은 파클리탁셀, 독소루비신, 시스플라틴, 삼산화비소, 5-플루오로우라실, 사이토신 아라비노시드, 카르보플라틴, 7-에틸-10-히드록시캄프토테신, 에토포시드, 멜팔란, 덱사메타손, 시클로포스파미드, 보르테조밉, 에를로티닙, 트라스투주맙, 레날리도마이드, 인터루킨-2, 인터페론-α 2, 다카바진, 베바시주맙, 이다루비신, 탈리도마이드, 및 리툭시맙으로 이루어지는 군으로부터 선택된 것인 방법.
  12. 아플리딘 또는 아플리딘 유사체의 양을 치료가 필요한 환자에게 투여하는 단계를 포함하는, 암의 치료에 효과적인 약물의 치료적 효능을 증가시키는 방법.
  13. 제12항에 있어서, 상기 치료할 암은 폐암, 유방암, 결장암, 전립선암, 신장암, 흑색종, 다발골수종, 백혈병, 및 림프종에서 선택된 암인 것인 방법.
  14. 제12항 또는 제13항에 있어서, 상기 약물은 파클리탁셀, 독소루비신, 시스플라틴, 삼산화비소, 5-플루오로우라실, 사이토신 아라비노시드, 카르보플라틴, 7-에틸-10-히드록시캄프토테신, 에토포시드, 멜팔란, 덱사메타손, 시클로포스파미드, 보르테조밉, 에를로티닙, 트라스투주맙, 레날리도마이드, 인터루킨-2, 인터페론-α 2, 다카바진, 베바시주맙, 이다루비신, 탈리도마이드, 및 리툭시맙으로 이루어지는 군으로부터 선택된 것인 방법.
  15. 제9항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 아플리딘 또는 아플리딘 유사체 및 다른 약물은 동일 조성물의 일부를 형성하는 것인 방법.
  16. 제9항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 아플리딘 또는 아플리딘 유사체 및 다른 약물은 동시에 또는 상이한 시간에 투여하기 위한 별개의 조성물로 제공되는 것인 방법.
  17. 제9항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 아플리딘 또는 아플리딘 유사체는 아플리딘인 것인 방법.
  18. 제9항 또는 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 치료적으로 유효한 양의 제3의 약물이 투여되는 것인 방법.
  19. 제18항에 있어서, 상기 제2 및 제3 약물은 파클리탁셀, 독소루비신, 시스플라틴, 삼산화비소, 5-플루오로우라실, 사이토신 아라비노시드, 카르보플라틴, 7-에틸-10-히드록시캄프토테신, 에토포시드, 멜팔란, 덱사메타손, 시클로포스파미드, 보르테조밉, 에를로티닙, 트라스투주맙, 레날리도마이드, 인터루킨-2, 인터페론-α 2, 다카바진, 베바시주맙, 이다루비신, 탈리도마이드, 및 리툭시맙으로 이루어진 군에서 선택되는 것인 방법.
  20. 아플리딘 또는 아플리딘 유사체의 투여 제형, 암 치료에 효과적인 다른 약물의 투여 제형 및 암의 치료 및 예방을 위해 조합된 각 작용제의 용도에 대한 설명서를 포함하는, 암의 치료 또는 예방에 사용하기 위한 키트.
  21. 제20항에 있어서, 상기 키트는 폐암, 유방암, 결장암, 전립선암, 신장암, 흑색종, 다발골수종, 백혈병, 및 림프종에서 선택된 암의 치료 또는 예방에 사용하기 위한 것인 키트.
  22. 제20항 또는 제21항에 있어서, 상기 다른 약물은 파클리탁셀, 독소루비신, 시스플라틴, 삼산화비소, 5-플루오로우라실, 사이토신 아라비노시드, 카르보플라틴, 7-에틸-10-히드록시캄프토테신, 에토포시드, 멜팔란, 덱사메타손, 시클로포스파미드, 보르테조밉, 에를로티닙, 트라스투주맙, 레날리도마이드, 인터루킨-2, 인터페론-α 2, 다카바진, 베바시주맙, 이다루비신, 탈리도마이드, 및 리툭시맙으로 이루어진 군에서 선택되는 것인 키트.
  23. 제20항 또는 제21항에 있어서, 암 치료에 효과적인 제3의 약물의 투여 제형을 더 포함하는 것인 키트.
  24. 제23항에 있어서, 상기 제2 및 제3 약물은 파클리탁셀, 독소루비신, 시스플라틴, 삼산화비소, 5-플루오로우라실, 사이토신 아라비노시드, 카르보플라틴, 7-에틸-10-히드록시캄프토테신, 에토포시드, 멜팔란, 덱사메타손, 시클로포스파미드, 보르테조밉, 에를로티닙, 트라스투주맙, 레날리도마이드, 인터루킨-2, 인터페론-α 2, 다카바진, 베바시주맙, 이다루비신, 탈리도마이드, 및 리툭시맙으로 이루어진 군에서 선택되는 것인 키트.
  25. 아플리딘 또는 아플리딘 유사체 및 암 치료에 효과적인 다른 약물을 포함하는 약제학적 조성물.
  26. 제25항에 있어서, 상기 다른 약물은, 폐암, 유방암, 결장암, 전립선암, 신장암, 흑색종, 다발골수종, 백혈병, 및 림프종에서 선택된 암의 치료에 효과적인 것인 약제학적 조성물.
  27. 제25항 또는 제26항에 있어서, 상기 다른 약물은 파클리탁셀, 독소루비신, 시스플라틴, 삼산화비소, 5-플루오로우라실, 사이토신 아라비노시드, 카르보플라틴, 7-에틸-10-히드록시캄프토테신, 에토포시드, 멜팔란, 덱사메타손, 시클로포스파미드, 보르테조밉, 에를로티닙, 트라스투주맙, 레날리도마이드, 인터루킨-2, 인터페론-α 2, 다카바진, 베바시주맙, 이다루비신, 탈리도마이드, 및 리툭시맙으로 이루어진 군에서 선택된 것인 약제학적 조성물.
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